專利名稱：微生物發(fā)酵合成阿卡波糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一種微生物發(fā)酵合成阿卡波糖的方法，特別涉及一種在發(fā)酵過程中通過添加腺苷蛋氨酸來提高阿卡波糖合成產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
阿卡波糖(Acarbose)是一種有效的α -糖苷酶抑制劑，它通過競爭性地抑制小腸壁上參與碳水化合物降解的α -葡萄糖苷酶的活性，延遲碳水化合物的分解消化，延緩和減少葡萄糖的吸收，從而達(dá)到控制人體內(nèi)餐后的血糖水平，是臨床上用于治療II型糖尿病的口服藥物。阿卡波糖分子式為C25H43NO18,分子量645. 6，pKal值為5. 1。上世紀(jì)70年代初 Frommer等人于從放線菌Actinoplanes utahensis的培養(yǎng)液中首先分離得到阿卡波糖，后經(jīng)德國拜耳(Bayer)制藥公司研制開發(fā)，1990年阿卡波糖首先在德國上市，1996年獲得FDA 批準(zhǔn)在美國上市。根據(jù)文獻(xiàn)和專利報(bào)道，目前國內(nèi)外阿卡波糖的生產(chǎn)都是利用微生物發(fā)酵法制備而得到，其中游動(dòng)放線菌應(yīng)用的最為廣泛。為獲得高時(shí)空得率的產(chǎn)物，降低生產(chǎn)成本，以往大多數(shù)的研究多集中在高產(chǎn)菌株的誘變選育(包括采用物理、化學(xué)等常規(guī)方法進(jìn)行誘變，也包括利用分子生物學(xué)技術(shù)改造菌種)、發(fā)酵培養(yǎng)基(包括碳源、氮源、金屬離子等)的優(yōu)化、 發(fā)酵條件(包括溫度、PH、溶氧、滲透壓、攪拌等條件)的優(yōu)化以及對阿卡波糖生物合成途徑中相關(guān)基因簇的研究等方面。對于發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化策略，目前主要是通過選擇合適的碳氮源，并控制發(fā)酵液中葡萄糖和麥芽糖的適當(dāng)比例以及設(shè)計(jì)合理的補(bǔ)料策略來提高阿卡波糖的發(fā)酵單位。Lee 等研究發(fā)現(xiàn)，添加麥芽糖比添加葡萄糖更有利于阿卡波糖的生產(chǎn)，示蹤研究結(jié)果表明，阿卡波糖的麥芽糖基團(tuán)是直接從麥芽糖、麥芽三糖或較高分子的麥芽寡糖中得到；高敬紅等用Actinoplanes sp AC-17發(fā)酵生產(chǎn)阿卡波糖時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖和麥芽糖的質(zhì)量比為 2 1時(shí)最有利于被菌體攝取用于阿卡波糖的生物合成。而對于發(fā)酵條件的優(yōu)化策略，研究者發(fā)現(xiàn)，除了常規(guī)發(fā)酵參數(shù)，如溫度、PH、溶氧等條件會(huì)對發(fā)酵產(chǎn)量造成一定的影響，同時(shí)在微生物發(fā)酵中通常不考慮的一個(gè)參數(shù)-滲透壓，對阿卡波糖發(fā)酵的最終收率也具有明顯的影響作用，因而滲透壓參數(shù)在發(fā)酵過程中也常被控制在一個(gè)合理的范圍內(nèi)。Beunink等研究發(fā)現(xiàn)，Actinoplanes sp. SE50/110生產(chǎn)阿卡波糖時(shí)，培養(yǎng)液的滲透壓值在300 500m0sm/ kg之間有助于阿卡波糖的生產(chǎn)，其最適宜的滲透壓值為400m0sm/kg ；Choi和Siin的研究表明，Actinoplanes sp. ATCC31044突變株CKD485-16最適宜的滲透壓值為500m0sm/kg，發(fā)酵水平達(dá)到3200mg/L，提高了 39%。阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物是阿卡波糖發(fā)酵液中的常見雜質(zhì)，阿卡波糖的結(jié)構(gòu)(如式I 所示)及其同系物的結(jié)構(gòu)如表1所示。歐洲藥典對雜質(zhì)組分的含量有嚴(yán)格的限制，特別是雜質(zhì)組分C，其與阿卡波糖分子的結(jié)構(gòu)差異僅在于末端糖苷鍵的不同，致使產(chǎn)品提取分離難度大，成本高。歐洲最新藥典要求雜質(zhì)組分C的含量小于1.5%。因此，在生產(chǎn)過程中如何有效控制并降低雜質(zhì)C的含量是工業(yè)化生產(chǎn)阿卡波糖的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在現(xiàn)有的阿卡波糖生產(chǎn)工藝中，使用凝膠、大孔樹脂等可以去除雜質(zhì)C或使其含量下降。但是，使用以上工藝在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中存在著上樣量小，收率低、成本高、質(zhì)量低等諸多缺陷。
權(quán)利要求
1. 一種微生物發(fā)酵合成阿卡波糖的方法，所述的方法為將阿卡波糖產(chǎn)生菌CCTCC NO =M 209022，接種至適用于所述菌株的含碳源、氮源、無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度 20 32°C進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)96 192小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后，得發(fā)酵液提取分離，得到所述阿卡波糖，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行0 60h之間，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中腺苷蛋氨酸的濃度為1 300 μ mol/L ；
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述腺苷蛋氨酸的水溶液的濃度為0.25 50mmol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行0 3 之間，加入如式II 所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，所述腺苷蛋氨酸的水溶液的加入方式為下列之一 (1) 一次性加入；( 分批間歇加入；(；3)流動(dòng)連續(xù)加入。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行0 60h之間，加入如式II所示的腺苷蛋氨酸的水溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中腺苷蛋氨酸的濃度為10 100 μ mol/L。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的碳源為下列之一或幾種任意組合葡萄糖、乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、糖蜜、秸稈水解液或菊芋水解液；所述的氮源為下列之一或幾種任意組合肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、 玉米漿、蛋白胨、尿素或氨鹽；所述的無機(jī)鹽為下列之一或幾種任意組合Na鹽、K鹽、Ca鹽、 Mg鹽、Fe鹽、Mn鹽、Zn鹽、Co鹽或Ni鹽。
6.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為pH6. 0 8. 0。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下麥芽糖80.Og/ L，葡萄糖 20. Og/L,黃豆餅粉 10. 0，g/L，玉米漿 5. Og/L, FeCl3O. lg/L，CaCl22. Og/L, CaC036 . 0g/L，溶劑為水，初始 pH 7.0。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法為將置于低溫保存的阿卡波糖產(chǎn)生菌CCTCC NO =M 209022轉(zhuǎn)移到新鮮、無菌固體平板上，活化2 3天，挑取菌落接種至種子培養(yǎng)基，在溫度^°C，通風(fēng)攪拌或震蕩下培養(yǎng)M 96小時(shí)，得到種子液；將種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基以體積比1 10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度^°C，通風(fēng)攪拌或震蕩下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)96 192小時(shí)，在培養(yǎng)至0 60小時(shí)期間，加入0. 25 50mmol/L腺苷蛋氨酸的水溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中腺苷蛋氨酸的濃度為1 300 μ mol/L ；發(fā)酵結(jié)束后，得發(fā)酵液提取分離，得所述阿卡波糖。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進(jìn)行(1)將置于低溫保存的阿卡波糖產(chǎn)生菌CCTCC NO =M 209022轉(zhuǎn)移到新鮮、無菌固體平板上，28°C活化2 3天，挑取菌落接種至種子培養(yǎng)基，在溫度^°C，通風(fēng)攪拌或震蕩下培養(yǎng)M 96小時(shí)，得到種子液，所述種子培養(yǎng)基組成如下玉米淀粉15. Og/L，黃豆餅粉40. Og/L，甘油20. Og/L, K2HPO4O. lg/L，CaC032. Og/L，溶劑為水，初始 ρΗ7· 0 ；(2)將種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基以體積比1 10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度觀！，通風(fēng)攪拌或震蕩下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)96 192小時(shí)，在培養(yǎng)至0 60小時(shí)期間， 加入0. 25 50mmol/L腺苷蛋氨酸的水溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中腺苷蛋氨酸的濃度為1 300 μ mol/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下麥芽糖80. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L,黃豆餅粉10. 0， g/L，玉米漿 5. 0g/L, FeCl3O. lg/L, CaCl22. 0g/L, CaC036. 0g/L，溶劑為水，初始 pH 7. 0 ；(3)發(fā)酵結(jié)束后，得發(fā)酵液提取分離，得所述阿卡波糖。
10.如權(quán)利要求1或9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵液提取分離的方法為發(fā)酵液調(diào)節(jié)PH值至3，然后進(jìn)行離心或過濾，得到澄清的阿卡波糖濾液；采用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂吸附、洗脫；收集液經(jīng)脫鹽、高分辨率陽離子交換樹脂精制，中和，冷凍干燥，制得阿卡波糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵合成阿卡波糖的方法，所述的方法為將阿卡波糖產(chǎn)生菌CCTCC NOM 209022，接種至適用于所述菌株的含碳源、氮源、無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度20～32℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)96～192小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后，得發(fā)酵液提取分離，得到所述阿卡波糖，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行0～60h之間，加入腺苷蛋氨酸的水溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中腺苷蛋氨酸的濃度為1～300μmol/L。本發(fā)明通過在阿卡波糖發(fā)酵過程中補(bǔ)加腺苷蛋氨酸，提高了阿卡波糖的發(fā)酵水平。
文檔編號(hào)C12R1/045GK102399837SQ201110293699
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者孫麗慧, 李明剛, 沈寅初, 王遠(yuǎn)山, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)