專利名稱：一種兼具SOD和GPx活性的65肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于人工模擬酶領域，具體涉及一種通過基因重組技術制備的具有超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)雙活性的含硒金屬65肽化合物。背景資料機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡直接影響著人類重大疾病的發(fā)生與發(fā)展，抗氧化酶間的相互協(xié)同作用能夠維持這個系統(tǒng)間的平衡。其中SOD和GI5x是生物體天然抗氧化酶系的重要成員，大量的研究已經(jīng)從分子、細胞、組織及活體的水平上證明，SOD和GI^x相互協(xié)同作用清除和人類多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關的高濃度的ROS(reactive oxygen species, R0S)，并且這種協(xié)同對機體的正常代謝至關重要。因此，開展具有SOD和GPx協(xié)同抗氧化效應的模擬化合物的研究至關重要。而且，較大分子量的模擬物普遍透膜性差，在機體內(nèi)不易吸收，勢必會限制其結(jié)構功能的探索及藥用前景。而短肽作為模擬酶，由于其一級結(jié)構較短，且只有單一的催化位點，不能形成和天然酶活性部分類似的精巧三級結(jié)構，勢必造成不穩(wěn)定、非特異的底物結(jié)合能力和低的催化效率。因此，開發(fā)小分子量肽酶模擬物，尤其是利用基因工程法制備肽酶，更有利于肽酶的獲得及改造，具有極大的基礎研究及應用前景?；谝陨显?，我們另辟蹊徑，以剛剛獲得晶體結(jié)構的S0D3為模板，保留了其活性必須的氨基酸序列，引入了 SOD活性中心的Cu2+和穩(wěn)定活性基團的Si2+，同時插入了一段具有GI5x底物GSH特異性結(jié)合位點的15肽，又通過結(jié)構模擬，在特定部位引入了除GI5x活性殘基Sec以外的對穩(wěn)定活性部位起到至關重要的氨基酸殘基Gln和Trp組成催化三聯(lián)體， 并利用Cys營養(yǎng)缺陷型表達系統(tǒng)，獲得一種具有精巧的雙酶活性中心結(jié)構域的銅鋅含硒65 肽即Se-Cuai-65P。Se-Cuai-65是一種具有雙酶活性，位點清晰，結(jié)構穩(wěn)定，催化機理明確的具有抗氧化協(xié)同效應的小分子65肽，這不僅對闡明酶的催化機理以及相互間協(xié)同作用有重要意義，而且還有廣闊的藥用前景。本發(fā)明的特色在于和以往的引入一個或幾個催化基團不同，是引入系列催化氨基酸群，建立具有SOD和GPx催化活性中心的結(jié)構域，構建新型雙功能模擬酶。把SOD活性中心結(jié)構域和GI5x活性中心結(jié)構域有機的整合在一起，使它們能夠在各自發(fā)揮活性的基礎上又能相互協(xié)同作用。本發(fā)明的具體制備步驟I. Se-CuZn-65P氨基酸和核酸序列的設計依據(jù)天然SODl，S0D3和bovine erythrocyte SOD的活性部位的同源序列比對， 以晶體結(jié)構更清晰的S0D3為模板，保留了其同源性最高的氨基酸序列，刪除了同源性低且對活性中心沒有貢獻的氨基酸殘基，引入了 SOD活性中心的Cu2+，同時也引入了穩(wěn)定活性基團的Si2+，并在正確位置安放了一些關鍵氨基酸殘基，如Hisl，His3, Hisl8, His26, His29, His61 Asp32, Asp65，這些氨基酸殘基能夠和Cu2+，Si2+形成正確的和天然SOD相似的三維結(jié)構。同時插入了一段具有GI5x底物GSH特異性結(jié)合位點的15肽，并通過結(jié)構模擬，在催化殘基Sec58的附近引入了 Gln2和Trp33，使形成和天然GPx相似的催化三聯(lián)體結(jié)構，而且在其周圍圍繞了 Leu8、Phe36、Phe5、Leu43、Leu47、Trp44、Phe46 和 Tyr52 等一些輸水氨基酸穩(wěn)定催化三聯(lián)體結(jié)構，構建了一段具有SOD和GI^x雙活性部位的含金屬離子的65P。由于 Sec的三聯(lián)體密碼子是作為終止子的UGA，而它的正常摻入需要復雜的調(diào)控機制，因此利用 傳統(tǒng)的基因工程方法很難表達硒蛋白，而利用Cys缺陷E. coli自身不能合成Cys的特點， 使其在缺少Cys而富含Sec的培養(yǎng)基中表達，可使Sec(U)代替Cys(C)被細菌利用于合成 新生蛋白質(zhì)。因此，表達前的％(58的初始氨基酸是Cys58，需要通過Cys營養(yǎng)缺陷型表達 將Sec摻入。其初始氨基酸序列如Table 1:
權利要求
1.一種具有抗氧化效應的含硒金屬肽化合物，結(jié)構中含有Cu2+和ai2+，同時含有被稱為第21種氨基酸的硒代半胱氨酸(Sec)，其氨基酸序列為His-Gln-His-Gln-Phe-Gly-Asp-Le u-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro-His-Pro -Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Sec-Val-Val-His-Ala-Gly-Glu-Asp ο
2.如權利要求1所述的具有抗氧化效應的含硒金屬肽化合物，其特征在于在正確位置安放了一些關鍵氨基酸殘基，如 Hisl、His3、Hisl8、His洸、His^、His61、Asp32 和 Asp65， 這些氨基酸殘基能夠和Cu2+，Si2+形成正確的和天然超氧化物歧化酶(SOD)相似的三維結(jié)構，具有SOD的活性。
3.如權利要求1所述的具有抗氧化效應的含硒金屬肽化合物，其特征在于具有以 Sec作為催化殘基的谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性，在催化殘基^^58的附近引入了 Gln2和Trp33，能夠形成和天然GPx相似的催化三聯(lián)體結(jié)構，而且其周圍圍繞了 Wie5、LeuS、 Phe36、Leu43、Trp44、Phe46、Leu47和Tyr52等一些輸水氨基酸殘基穩(wěn)定催化三聯(lián)體結(jié)構。
4.如權利要求1所述的具有抗氧化效應的含硒金屬肽化合物，同時具有天然SOD的活性中心Cu2+和天然GPx的催化三聯(lián)體結(jié)構，是一種兼具SOD和GPx活性的具有抗氧化協(xié)同效應的含硒65肽模擬物。
5.如權利要求1所述的具有抗氧化效應的含硒金屬肽化合物，其特征在于通過營養(yǎng)缺陷型表達將Cys58替換成Sec58摻入，替換前的氨基酸序列為His-Gln-His-Gln-Phe-Gl y-Asp-Leu-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro -His-Pro-Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Cys-Val-Val-His-Ala-Gly-G Iu-Asp0
6.如權利要求1所述的具有抗氧化效應的含硒金屬肽化合物，其特征在于通過PCR 技術擴增出目的蛋白氨基酸編碼的DNA片段，插入表達載體pPelB中并轉(zhuǎn)化于Cys營養(yǎng)缺陷型表達菌株BL21(DE3)selB: :kan cys51E中缺陷表達，再通過DEAE陰離子柱交換層析純化。
全文摘要
本發(fā)明屬于人工模擬酶領域，提供了一種具有抗氧化協(xié)同效應的含硒金屬65肽化合物，氨基酸序列為HQHQFGDLSQGAESTGPHYNPLAVPHPQHPGDWGNFAVRDGSLWPFLRHNVYG RPRAUVVHAGED，其特征是具有超氧化物歧化酶(SOD)催化活性中心和天然谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的催化三聯(lián)體結(jié)構，因此，兼具SOD和GPx協(xié)同抗氧化能力。此酶在結(jié)構模擬的基礎上，通過基因重組技術構建并通過Cys營養(yǎng)缺陷型表達系統(tǒng)可溶表達，其不但具有雙活性位點清晰、結(jié)構穩(wěn)定、催化機理明確的優(yōu)點，而且分子量小、易吸收且具有較高的SOD和GPx的活力，在因自由基紊亂誘發(fā)的疾病的藥物應用中具有極大的潛力。
文檔編號C12R1/19GK102373188SQ201110287018
公開日2012年3月14日 申請日期2011年9月26日 優(yōu)先權日2011年9月26日
發(fā)明者呂紹武, 徐亞維, 沈娜, 牟穎, 王程, 羅貴民, 賀博, 趙剛, 趙楊, 閆崗林, 閆飛, 龔平生 申請人:吉林大學