專利名稱：連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailandepsin A的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及伯克氏菌發(fā)酵與大孔吸附樹脂連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sin A的方法。
背景技術(shù)：
伯克氏菌似64(.Burkholderia thailandensis E264, ATCC 700388)能夠合成組蛋白去乙?；敢种苿?HDAC inhibitor)類抗癌物質(zhì)Hiailand印sin A。作為與已被美國 FDA批準上市的抗癌藥物Π(228 (格洛斯特醫(yī)藥公司，商品名Istodax)有不同的選擇性抑制特點的結(jié)構(gòu)類似物，Thailand印sin A具有特殊的縮酯環(huán)肽結(jié)構(gòu)，可有效透過細胞膜，通過抑制組蛋白去乙酰酶而顯示良好的抗腫瘤活性。美國國家癌癥研究所NCI60數(shù)據(jù)顯示， Thailandespin A有著廣泛的抑制癌細胞增殖活性，特別對結(jié)腸癌、黑色素瘤、卵巢癌和腎癌有明顯作用，對皮膚T細胞淋巴瘤的療效尤為顯著。它被錄入美國國家癌癥研究所(NCI) 的發(fā)展治療學項目(Developmental Therapeutics Program)，用于篩選NCI60人類癌癥細胞系，編號為NSC D751510。目前，Thailand印sin A已進入臨床試驗階段。作為一種極具開發(fā)前景的抗癌藥物，Thailand印sin A有望在不遠的將來作為商品藥物推廣，但是目前Thailand印sin A的發(fā)酵產(chǎn)量很低，而且人工合成非常困難，因此如何實現(xiàn)jThai land印sin A的高產(chǎn)有重要需求，也是目前Thai land印sin A應(yīng)用的障礙之一。 目前，關(guān)于如何提高Thailand印sin A的發(fā)酵產(chǎn)量鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn) Thailand印sin A的方法。該方法通過連續(xù)吸附耦合裝置，原位吸附分離Thailand印sin A 產(chǎn)物，從而解除Thailand印sin A的產(chǎn)物負反饋抑制，提高產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)量，簡化生產(chǎn)工藝流程。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
本發(fā)明涉及的一種連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sin A的方法，包括以下步驟
(a)將產(chǎn)生Thailand印sinA的伯克氏菌經(jīng)種子活化培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵；
(b)當發(fā)酵罐中Thailand印sinA和菌體濃度達到一定程度，即發(fā)酵30-48小時， 處于對數(shù)生長的中后期，將發(fā)酵液連續(xù)輸入吸附柱，利用吸附柱中的大孔吸附樹脂吸附 Thailand印sin A，經(jīng)吸附后的發(fā)酵液返回發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵；
(c)以流加方式向發(fā)酵罐中補充葡萄糖，維持Thailand印sinA的不斷合成；
(d)在Thailand印sinA合成速率下降，即菌體濃度達到最大，繼續(xù)發(fā)酵12-36小時后， 終止發(fā)酵，取出大孔吸附樹脂，萃取分離，提純，得到Thailand印sin A。優(yōu)選的，步驟(a)中，所述發(fā)酵罐中，加入放大培養(yǎng)基的體積占發(fā)酵罐罐體裝液量體積的分數(shù)為50 80%。優(yōu)選的，步驟(a)中，所述放大培養(yǎng)基每升含以下質(zhì)量的各組分葡萄糖10 20g、胰蛋白胨20 40g、氯化鈉0 5g、K2HP04. 3H20 15 30g、KH2P04 2 6g和檸檬酸鈉2 20mgo優(yōu)選的，步驟(a)中，所述發(fā)酵的發(fā)酵溫度為28 37°C。優(yōu)選的，步驟(b)中，所述大孔吸附樹脂使用前經(jīng)過預(yù)處理，所述預(yù)處理為將所述大孔吸附樹脂浸沒在體積分數(shù)為30 60%的乙醇溶液中12 Mh。優(yōu)選的，步驟(b)中，所述大孔吸附樹脂的體積占所述吸附柱內(nèi)容物總體積的分數(shù)為4 20%O優(yōu)選的，步驟(b)中，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂，平均孔徑AVE為150 300。優(yōu)選的，步驟(b)中，所述吸附柱的使用方式為多個并聯(lián)使用、單獨使用或者交替使用。優(yōu)選的，步驟(b)中，所述吸附柱的材質(zhì)為可高溫滅菌處理的材料。優(yōu)選的，所述可高溫滅菌處理的材料為金屬、陶瓷或玻璃。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將大孔樹脂吸附和伯克氏菌發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sin A 相結(jié)合，產(chǎn)物的發(fā)酵合成和吸附分離同時進行，具有以下有益效果
(1)通過Thailand印sin A產(chǎn)物的吸附原位分離，可以有效解除產(chǎn)物對發(fā)酵過程的負反饋抑制，大幅提高iThailand印sin A的發(fā)酵產(chǎn)量。(2)將發(fā)酵產(chǎn)物Thailand印sin A吸附到大孔吸附樹脂上，節(jié)省了后續(xù)分離工藝的時間和資源，產(chǎn)物的后處理更為簡單、方便。(3)連續(xù)發(fā)酵過程中容易實現(xiàn)培養(yǎng)基及營養(yǎng)成分的流加，有助于產(chǎn)量的提高。(4)連續(xù)吸附耦合發(fā)酵裝置制作較為簡單、成本低，循環(huán)順暢，操作方便，易于實現(xiàn)自動化，可以有效降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率；本工藝適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。(5)連續(xù)吸附耦合發(fā)酵過程將吸附過程和發(fā)酵過程分離，從而便于進一步對吸附過程和發(fā)酵過程分別進行精細化控制，從而具有進一步提高生產(chǎn)效率的潛力。


圖1為連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)抗癌物質(zhì)Thailand印sin A的工藝流程其中1、發(fā)酵罐，2、吸附柱，3、空氣壓縮機，4、流加補料瓶，5、酸堿平衡補料瓶，6、恒流泵，7、三通閥。
具體實施例方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例做進一步的闡述
實施例1，不同循環(huán)流速條件下Hiailandepsin A的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵 (一)儀器設(shè)備及原材料
德國賽多利斯BIOSTAT A plus 5L機械攪拌發(fā)酵罐、上海錦欣SunSource OLFlOOAFm 噪音無油空氣壓縮機、保定蘭格BT-100恒流泵、日本三洋電子MLS-3780高壓蒸汽滅菌器、 德國諾爾(KNAUER) Smartline 1000高效液相色譜儀(HPLC)。發(fā)酵菌株為伯克氏菌似64(.Burkholderia thailandensis E264,ATCC 700388)， 大孔吸附樹脂選用三菱化學大孔吸附樹脂HP-20。
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( 二 )伯克氏菌E264連續(xù)吸附耦合發(fā)酵
如圖1所示，連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sin A的方法，包括以下步驟
(1)伯克氏菌E264種子活化培養(yǎng)伯克氏菌E264種子經(jīng)過一級固體種子保種、二級液體種子活化、三級液體發(fā)酵種子活化，活化用于發(fā)酵罐放大發(fā)酵所用的伯克氏菌E264菌種；
(2)連續(xù)吸附耦合裝置裝料、組裝和滅菌往吸附柱2中倒入預(yù)處理(所述預(yù)處理方法為浸沒于30%乙醇溶液中12h)過的大孔吸附樹脂(為非極性大孔樹脂，平均孔徑AVE為 200)，添加量為4%，接口密封連接；往發(fā)酵罐1罐體中倒入發(fā)酵罐放大培養(yǎng)基(所述發(fā)酵罐放大培養(yǎng)基包括葡萄糖10g/L、胰蛋白胨35g/L、氯化鈉lg/L，K2HPO4. 3H20 15g/L，KH2PO4 2g/L，檸檬酸鈉ang/L)，裝液量50% ；將發(fā)酵罐1分別和流加補料瓶4和酸堿平衡補料瓶5 連接，將發(fā)酵罐1和吸附柱2連接，使整個裝置內(nèi)部形成循環(huán)通路；將裝置進行高溫蒸汽滅菌。(3)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)將活化后的伯克氏菌E264菌種通過注射法接種于發(fā)酵罐 1中，整個過程保證無菌操作；開啟通氣、攪拌、溫控等發(fā)酵罐放大培養(yǎng)過程。發(fā)酵溫度為 28°C。(4)吸附耦合循環(huán)開啟當發(fā)酵罐中Thailand印sin A和菌體濃度達到一定程度， 即發(fā)酵30小時，處于對數(shù)生長的中后期，開啟循環(huán)用的恒流泵6，以一定流速將發(fā)酵液從發(fā)酵罐1輸出，通過管路自下而上通過吸附柱2，從而實現(xiàn)產(chǎn)物和細胞及發(fā)酵液的分離，解除產(chǎn)物對發(fā)酵的抑制作用，細胞和發(fā)酵液通過管路返回發(fā)酵罐1，保持循環(huán)流暢。根據(jù)需要， 通過恒流泵6和流加補料瓶4以及酸堿平衡補料瓶5，定時向發(fā)酵罐補料和保持酸堿平衡。 發(fā)酵過程中可通過三通閥7取樣分析，判斷生長速率。(5)發(fā)酵結(jié)束，回收產(chǎn)物經(jīng)較長時間(5天)連續(xù)發(fā)酵后，發(fā)酵接近終點 (Thailand印sin A合成速率下降，即菌體濃度達到最大，繼續(xù)發(fā)酵12 36小時后)時，將吸附柱2中樹脂取出烘干，用于后處理進行提取制備；用有機溶劑將產(chǎn)物Thailand印sin A萃取析出，供后續(xù)檢測或使用；亦可將烘干的樹脂保存，以保藏發(fā)酵產(chǎn)物抗癌物質(zhì) Thailandepsin A0在本實施例中，種源條件接種量1%，活化后的二級液體種子；通氣條件 8. 38 X IO"3 S-1 ；罐壓 0. OlMPa ；循環(huán)流速分別采用 20ml/min、40ml/min 和 60ml/min 的變
量梯度。發(fā)酵結(jié)束后，取出吸附柱中吸附有Thailand印sin A產(chǎn)物的樹脂，烘干后取樣用氯仿萃取，量取部分萃取液蒸干。采用高效液相色譜法(HPLC)取樣檢測，流動相為乙腈0. 1% 乙酸水=40 :60，流速為1. OmL/min，檢測波長為210nm，進樣20 μ L0實驗結(jié)果為，循環(huán)流速20ml/min實驗組Thai land印sin A產(chǎn)量為106 mg/L，是間歇發(fā)酵對照組45 mg/L的2. 3倍，平均生產(chǎn)效率為0. 63 mg/L^T1，是對照組0. SSmg/L^1 的1. 8倍；循環(huán)流速40ml/min實驗組Thai land印sin A產(chǎn)量為85 mg/L,是間歇發(fā)酵對照組45 mg/L的1. 9倍，平均生產(chǎn)效率為0. 51 mg/L^T1，是對照組0. SSmg/L^1的1. 5倍；循環(huán)流速60ml/min實驗組Thai land印sin A產(chǎn)量為86 mg/L,是間歇發(fā)酵對照組45 mg/L的 1. 90倍，平均生產(chǎn)效率為0. emg/L^T1，是對照組0. 35mg/L*h^的1. 5倍。實施例2，不同吸附開始時間條件下Thailandepsin A的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵本實施例同實施例1，所不同之處在于在伯克氏菌E264連續(xù)吸附耦合發(fā)酵
步驟(2)中往吸附柱2中倒入預(yù)處理過的大孔吸附樹脂，添加量為12%，往發(fā)酵罐1罐體中倒入發(fā)酵罐放大培養(yǎng)基，裝液量65% ；所述發(fā)酵罐放大培養(yǎng)基包括葡萄糖20g/L、胰蛋白胨 20g/L、氯化鈉 2. Og/L，K2HPO4. 3H20 22. 5g/L、KH2PO4 4g/L、檸檬酸鈉 llmg/L ；所述預(yù)處理方法為浸沒于45%乙醇溶液中18h ；所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂，平均孔徑 AVE 為 200。步驟(3)中發(fā)酵溫度為32°C ；
步驟(4)中分別在發(fā)酵進行到48h、3^!后，開啟循環(huán)用的恒流泵6 ； 步驟(5)中較長的連續(xù)發(fā)酵時間為8. 5天；
種源條件接種量1%，三級液體發(fā)酵種子；通氣條件8. 38 ΧΙΟ"3 s—1 ；罐壓0. OlMPa ；連續(xù)吸附循環(huán)流速20ml/min。實驗結(jié)果為，循環(huán)開啟時間48h實驗組Thailand印sin A產(chǎn)量為108 mg/L，是間歇發(fā)酵對照組45 mg/L的2. 4倍，平均生產(chǎn)效率為0. 71 mg/L^T1，是對照組0. Slmg/L^1的 2. 3倍；循環(huán)開啟時間3 實驗組Thailand印sin A產(chǎn)量為116 mg/L，是間歇發(fā)酵對照組46 mg/L的2. 5倍，平均生產(chǎn)效率為0. Ibmg/L·^1,是對照組0. 35mg/L*h^的2. 4倍。^MM 3，不同葡萄糖流加條件下Thailandepsin A的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵本實施例同實施例1，所不同之處在于
在伯克氏菌E264連續(xù)吸附耦合發(fā)酵
步驟(2)中往吸附柱2中倒入預(yù)處理過的大孔吸附樹脂，添加量為20%，往發(fā)酵罐1罐體中倒入發(fā)酵罐放大培養(yǎng)基，裝液量80% ；所述發(fā)酵罐放大培養(yǎng)基包括葡萄糖15g/L、胰蛋白胨 40g/L、氯化鈉 4g/L、K2HPO4. 3H20 30g/L、KH2PO4 6g/L、檸檬酸鈉 20mg/L ；所述預(yù)處理方法為浸沒于60%乙醇溶液中Mh ；所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂，平均孔徑AVE為 290-300。步驟(3)中發(fā)酵溫度為37°C ；
步驟(4)中在發(fā)酵進行到3 后，開啟循環(huán)用的恒流泵6 ； 步驟(5)中較長的連續(xù)發(fā)酵時間為12天；
發(fā)酵條件為種源條件接種量1%，三級液體發(fā)酵種子；通氣條件8. 38 X ΙΟ"3 s—1 ；罐壓 0. OlMPa ；循環(huán)流速20ml/min ；葡萄糖流加條件采用兩組變量梯度從60h起，每1 流加 lg/L的葡萄糖，直至發(fā)酵結(jié)束；從60h起，每1 流加2g/L的葡萄糖，直至發(fā)酵結(jié)束。實驗結(jié)果為，60h起每12h補糖lg/L實驗組Thailand印sin A產(chǎn)量為224 mg/L, 是不補糖對照組115 mg/L的1. 9倍，平均生產(chǎn)效率為1. 10 mg/L^T1，相比不補糖對照組 0. 74mg/L*h_1 提高了 48. 6% ； 60h 起每 12h 補糖 2g/L 實驗組 Thailand印sin A 產(chǎn)量為 219 mg/L，是不補糖對照組115 mg/L的1. 9倍，平均生產(chǎn)效率為1. 07 mg/L^T1，相比不補糖對照組 0. 74 mg/I^h-1 提高了 44. 6%。在本發(fā)明中，吸附柱采用可進行高溫滅菌處理的材料，優(yōu)選金屬、陶瓷或玻璃，其還可以根據(jù)發(fā)酵液處理量大小，可以多個并聯(lián)，或單獨使用，或交替使用。結(jié)合上述實施例的實驗結(jié)果可知，本發(fā)明的方法可實現(xiàn)Thailand印sin A的連續(xù)、 高密度吸附耦合發(fā)酵，且設(shè)備制作簡單、成本低，操作方便，易于實現(xiàn)自動化，具有良好的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sin A的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將產(chǎn)生Thailand印sinA的伯克氏菌經(jīng)種子活化培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵；(b)當發(fā)酵罐中Thailand印sinA和菌體濃度達到一定程度，即發(fā)酵30 48小時， 處于對數(shù)生長的中后期，將發(fā)酵液連續(xù)輸入吸附柱，利用吸附柱中的大孔吸附樹脂吸附 Thailand印sin A，經(jīng)吸附后的發(fā)酵液返回發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵；(c)以流加方式向發(fā)酵罐中補充葡萄糖，維持Thailand印sinA的不斷合成；(d)在Thailand印sinA合成速率下降，即菌體濃度達到最大，繼續(xù)發(fā)酵12 36小時后，終止發(fā)酵，取出大孔吸附樹脂，萃取分離，提純，得到Thailand印sin A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(a)中，所述發(fā)酵罐中，加入放大培養(yǎng)基的體積占發(fā)酵罐罐體裝液量體積的分數(shù)為 50 80%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(a)中，所述放大培養(yǎng)基每升含以下質(zhì)量的各組分葡萄糖10 20g、胰蛋白胨 20 40g、氯化鈉 0 5g、K2HPO4. 3H20 15 30g、KH2PO4 2 6g、檸檬酸鈉 2 20mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(a)中，所述發(fā)酵的發(fā)酵溫度為觀 37°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(b)中，所述大孔吸附樹脂使用前經(jīng)過預(yù)處理，所述預(yù)處理為將所述大孔吸附樹脂浸沒在體積分數(shù)為30 60%的乙醇溶液中12 Mh。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(b)中，所述大孔吸附樹脂的體積占所述吸附柱內(nèi)容物總體積的分數(shù)為4 20%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(b)中，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔樹脂，平均孔徑AVE為150 300。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(b)中，所述吸附柱的使用方式為多個并聯(lián)使用、單獨使用或者交替使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，步驟(b)中，所述吸附柱的材質(zhì)為可高溫滅菌處理的材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)Thailand印sinA的方法，其特征在于，所述可高溫滅菌處理的材料為金屬、陶瓷或玻璃。
全文摘要
本發(fā)明公開了連續(xù)吸附耦合發(fā)酵生產(chǎn)ThailandepsinA的方法，步驟為產(chǎn)生抗癌物質(zhì)ThailandepsinA的伯克氏菌經(jīng)種子活化培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐發(fā)酵；在發(fā)酵罐中ThailandepsinA和菌體濃度達到一定程度，即發(fā)酵30～48小時，處于對數(shù)生長的中后期時，將發(fā)酵液連續(xù)通過吸附柱，利用其內(nèi)部的大孔吸附樹脂吸附ThailandepsinA，經(jīng)吸附后的發(fā)酵液返回發(fā)酵罐繼續(xù)發(fā)酵；以流加方式往所述發(fā)酵罐中補充葡萄糖，維持ThailandepsinA的不斷合成；最后終止發(fā)酵；取出大孔吸附樹脂，萃取分離、提純ThailandepsinA。本發(fā)明實現(xiàn)ThailandepsinA的連續(xù)、高密度發(fā)酵，提高發(fā)酵產(chǎn)量，延長發(fā)酵周期，同時由于可從大孔吸附樹脂中有效回收產(chǎn)物ThailandepsinA，簡化后處理工藝，大大降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P21/04GK102321713SQ201110271108
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者張雪洪, 程義強, 鐘鳴 申請人:上海交通大學, 清安醫(yī)藥科技武漢有限公司