專利名稱：檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量rt-pcr檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明所涉及的一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其應用，屬于病毒核酸檢測領域，適用于臨床及科研中對于牛病毒性腹瀉病毒感染的快速定量檢測，還涉及應用于疫苗生產(chǎn)用牛血清及牛睪丸細胞源豬瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中 BVDV污染的檢測。
背景技術(shù)：
牛病毒性腹瀉是由黃病毒科瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉病毒引起的一種在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的牛羊傳染病。BVDV是危害養(yǎng)牛業(yè)、養(yǎng)羊業(yè)和養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，能引起感染動物產(chǎn)生一系列復雜的臨床癥狀，包括病毒性腹瀉、粘膜病、持續(xù)感染與免疫耐受、 繁殖障礙、血小板減少與出血綜合征等[沈敏，王新華，鐘友剛.牛病毒性腹瀉病毒致病機理研究進展.動物醫(yī)學進展，2002，23 ) 1-4] 0歐洲國家在20世紀60年代牛肉和奶牛中 BVDV的陽性率就已經(jīng)達到了 53% -73%，90年代以來要找到BVDV陰性的牛已是難事了。而近年來，我國各地幾乎都有該病的報道，并且患病動物包括豬、牛、牦牛、羔羊、山羊和鹿等多種動物。目前，疫病的早期特異性診斷及疫苗接種等是有效預防控制牛病毒性腹瀉的重要手段。同時隨著生物制品研究及生產(chǎn)過程中對牛血清的使用量日益加大，牛血清中BVDV 的檢測也成為疫苗生產(chǎn)、質(zhì)控過程中十分重要的一個環(huán)節(jié)。檢測BVDV的方法很多，常采用的檢測方法主要包括血清學中和試驗、細胞分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、PCR技術(shù)等。血清學方法多存在費時、費力、準確率低等缺點。我國診斷BVDV國家標準技術(shù)采用培養(yǎng)細胞分離病毒的方法，但該方法費時費力，加之病毒分離率低，有些非致細胞病變型BVDV在細胞培養(yǎng)中不出現(xiàn)細胞病變，因而不利于大規(guī)模應用檢測。而分子生物學的常規(guī)方法雖然在某些方面可以彌補，但假陽性、環(huán)境污染、重復性不高等不足限制了推廣應用。近年來逐漸發(fā)展起來的實時熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR技術(shù)的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物和一個特異性的熒光探針或熒光染料， 利用能夠?qū)崟r監(jiān)測的熒光PCR儀來檢測病原體靶核苷酸序列的技術(shù)。它不但克服了傳統(tǒng) PCR技術(shù)的缺點，而且具有結(jié)果直觀可靠、特異性強、靈敏度高、快速簡單等優(yōu)點，因而成為一種越來越重要的檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該PCR試劑盒不僅可適用于目前市場上所有類型的熒光定量PCR儀，更重要的是能夠快速準確的對牛病毒性腹瀉病毒進行定量檢測。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的應用，包括臨床及科研中對于牛病毒性腹瀉病毒感染的快速定量檢測和對牛血清及豬瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染牛病毒性腹瀉病毒進行監(jiān)測。
基于上述目的，本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案有1.引物探針設計通過分析牛病毒性腹瀉病毒各基因片段保守性，并結(jié)合熒光PCR引物探針設計特點，確定牛病毒性腹瀉病毒的5’UTR序列片段作為本方法中熒光PCR引物探針設計的模板。從GenBank數(shù)據(jù)庫下載所有已知牛病毒性腹瀉病毒的5，UTR序列，利用DNAMar 軟件進行同源性排序分析比較，選出在牛病毒性腹瀉病毒5’ UTR序列中種內(nèi)保守種間特異的核苷酸片段，然后利用I^imer Express及DNAMar軟件設計多對檢測牛病毒性腹瀉病毒的引物和探針，進一步實驗篩選出最佳引物和探針組合，確定為本方法中所使用的引物和探針。其中引物探針序列如下上游引物PF :5，-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3，(SEQ ID NO 1)下游引物PR :5，-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，(SEQ ID NO 2)熒光探針PB :5，F(xiàn)AM-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-BHQ 13，(SEQ ID NO 3)2.病毒RNA的提取2. 1組織樣品RNA的提取取待檢樣本50 IOOmg于無菌1. 5ml離心管中，按1 5 比例加入PBS液，勻漿儀充分勻漿，4000rpm離心lOmin，取上清液200 μ L于新的無菌1. 5mL
離心管中，編號備用。取若干個1.5mL滅菌(因待檢樣品份數(shù)而定)無RNA酶污染的離心管，作好標記。各加入600yL RNA提取液，然后分別加入上述相應編號的樣本以及試劑盒中的陰、 陽性對照各200 μ L，吸打混勻；加入200 μ L氯仿，振蕩混勻，靜置5min，12，OOOrpm離心 IOmin ；分別吸取各管中的上層液相(切勿吸入下層液體)轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml無RNA酶污染的離心管中，加入200 μ L-20°C預冷的異丙醇，作好標記，顛倒混勻。靜置5min，12，OOOrpm 離心IOmin ；輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入600 μ L 75%乙醇，顛倒洗滌，12，OOOrpm離心5min ；輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體，4，OOOrpm離心 lOsec，用微量加樣器盡量將殘余液體吸干，室溫干燥1 5min ；加入20 μ L DEPC水，輕彈混勻，溶解管壁上RNA，保存-18°C以下備用。2. 2液體樣品RNA的提取(如全血，血清，鼻咽拭子，細胞培養(yǎng)上清等)直接取 200 μ L樣本于無菌1. 5ml離心管中，作好標記，分別加入600 μ L RNA提取液，然后再按上述組織RNA的提取方法進行。3. RT-PCR反應體系的配制配制25 μ L 的反應體系BVDV RT-PCR Mix 21 μ L、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ L、Taq DNA 聚合酶0. 5 μ L、RNA模板3 μ L。4. RT-PCR反應參數(shù)的設置第一步:42°C，20min,95°C，3min, Icycle ；第二步:95°C，5sec,60°C，40sec(收集熒光信號)，40cycles。5.結(jié)果判定結(jié)果分析條件設定點擊分析界面，取3 10或3 15個循環(huán)的熒光信號確定基線(baseline)。閾值(threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品及陰性樣本的擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點，不出現(xiàn)Ct值并且與陽性對照的指數(shù)期相交為準。
結(jié)果判定檢測樣本Ct值<30.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，測定結(jié)果有效，可直接報告樣本陽性；檢測樣本30. 0 < Ct值< 40時，需重復一次，如果Ct值仍小于40，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，可報告樣本陽性，否則報告樣本陰性；檢測不到樣本Ct值或Ct 值為40，報告樣本陰性。6.待檢樣本的定量通過比較待檢樣本和標準品的閾值循環(huán)數(shù)對待檢標本的起始拷貝數(shù)進行定量。本發(fā)明的主要技術(shù)原理實時熒光定量PCR技術(shù)是通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。Ct值(cycle threshold, Ct)是指PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)，它與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，模板DNA量越多，熒光到達閾值的循環(huán)數(shù)越少，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。該技術(shù)包括染料法和探針法兩種。染料法是利用能與雙鏈DNA結(jié)合的染料(如STOR Green)結(jié)合到雙鏈DNA產(chǎn)物內(nèi)部從而根據(jù)檢測到的熒光信號實現(xiàn)定量的目的，然而這種方法無法區(qū)分引物二聚體及非特異產(chǎn)物信號；探針法是在常規(guī)的PCR基礎上加入一條特異性的熒光探針(如TaqMan探針)，根據(jù)探針兩邊標記的報告熒光基團和淬滅熒光基團之間產(chǎn)生的熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，釋放的熒光信號強度與擴增產(chǎn)物的量呈正比關系，從而達到定量的目的。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 感染的熒光定量RT-PCR快速檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括用于擴增BVDV5’UTR 的引物對。在其他實施方案中，ΜΒ 丨物對的上游弓丨物序列為5，-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3，， 下游引物序列為 5’ -CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，。在其他實施方案中，所述試劑盒還包括用于檢測擴增產(chǎn)物的TaqMan探針。 在其他實施方案中，所述探針的序列為5，-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-3 ’，5 ’端標記熒光報告基團FAM，3，端標記熒光淬滅基團BHQ1。在其他實施方案中，所述引物對和TaqMan探針被包括在RT-PCR反應液中，所述 RT-PCR反應液包括以下組分1 X RT-PCR緩沖液、ImM dNTP混合物、0. 1 μ M TaqMan探針、 0. 2 μ M上游引物和0. 2 μ M下游引物。在其他實施方案中，所述試劑盒還包括如下組分RNA提取試劑、DEPC水、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、陽性對照和陰性對照。在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了上述熒光定量RT-PCR快速檢測試劑盒的應用，其特征在于該試劑盒使用時包括如下步驟提取樣品的RNA ；—步法RT-PCR，利用反轉(zhuǎn)錄過程將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時進行熒光定量PCR ；對數(shù)據(jù)進行處理和分析。在一個實施方案中，所述應用不用于診斷目的。在其他實施方案中，所述應用可用于臨床及科研領域，包括對BVDV感染進行快速定量檢測，以及對牛血清、牛血白蛋白、牛睪丸細胞源豬瘟兔化弱毒活疫苗等生物制品的 BVDV污染監(jiān)測。本發(fā)明的優(yōu)點
1.本發(fā)明使用一對特異性的引物和一條高特異性的Taqman熒光探針，具有很高的準確性，特異性良好，假陽性率極低。2.本試劑盒可檢測低至103COpieS/mL的病毒量，說明檢測靈敏度較高。3.本發(fā)明所用的TaqMan探針5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記了本身不發(fā)光的熒光淬滅基團BHQl，降低了背景熒光信號，提高信噪比，使得實驗結(jié)果更加精確。4.整個擴增和檢測過程均在同一個封閉管內(nèi)進行，有效避免了氣溶膠污染而造成的假陽性。同時反轉(zhuǎn)錄和PCR過程一步完成，操作簡單、自動化，整個檢測過程僅需1 2 個小時。與病毒分離和常規(guī)PCR方法相比，大大提高了檢測時間和效率。


圖1是顯示了本發(fā)明方法特異性的動力學曲線。如圖所示，牛病毒性腹瀉病毒樣品和試劑盒中的陽性對照品檢測結(jié)果為陽性，而豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和試劑盒中的陰性對照品均為陰性。其中A是陽性對照品，B是牛病毒性腹瀉病毒，C是豬瘟病毒，D是豬繁殖與呼吸綜合征病毒，E是陰性對照品。圖2是顯示了本發(fā)明方法靈敏度的動力學曲線。如圖所示，在IO1 IO7拷貝/μ L 的范圍內(nèi)可以得到良好的動力學曲線。其中A G分別為107、106、105、104、IO3UO2UO1拷貝數(shù)目的檢測動力學曲線。圖3是顯示了本發(fā)明方法靈敏度的標準曲線。
具體實施例方式實施例1牛病毒性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的組成與試劑配制1. RT-PCR 反應液每個反應包括 10XRT-PCR Buffer 2. 5μ L,25mM dNTP Mix 1 μ LUOy MTaqMan 探針 PB 0· 25 μ L、10 μ M 上游引物 PF 0. 5 μ L、10 μ M 下游引物 PR 0. 5 μ L、DEPC 水 16. 25 μ L，共 21 μ L。48 個反應共計 1008 μ L，分裝至 1 管。2. RNA提取液30mL/瓶，分裝至棕色瓶中，4°C保存。3. DEPC水在去離子水中加入終濃度0. 1 %的焦碳酸二乙酯，室溫過夜，15磅高壓 20min，分裝至1. 5mL離心管中，ImL/管。4. DNA 聚合酶Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 25 μ L/ 管分裝，_20°C保存。5.反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/ μ L) 25 μ L/管分裝，-20°C保存。6.陽性對照品為含有牛病毒性腹瀉病毒特異性目的片段的克隆質(zhì)粒進行體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA，300 μ 1/管分裝，-20°C保存。7.陰性對照品為健康豬血清，PBS稀釋后300 μ L/管分裝，_20°C保存。實施例2牛病毒性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR快速檢測試劑盒的應用方法1樣本的核酸提取1. 1取若干個1.5mL滅菌(因待檢樣品份數(shù)而定)無RNA酶污染的離心管，作好標記。各加入600μ L RNA提取液，然后分別加入樣本以及試劑盒中的陰、陽性對照各200μ L， 吸打混勻；再加入200 μ L氯仿，振蕩混勻。靜置5min, 12，OOOrpm離心IOmin0
6
1. 2分別吸取各管中的上層液相(切勿吸入下層液體)轉(zhuǎn)移至新的1. 5ml無RNA 酶污染的離心管中，加入200 μ L-20°C預冷的異丙醇，作好標記，顛倒混勻。靜置5min， 12，OOOrpm 離心 IOmin01. 3輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入600 μ L 75%乙醇，顛倒洗滌。12，OOOrpm離心5min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。1. 44，OOOrpm離心lOsec，用微量加樣器盡量將殘余液體吸干，室溫干燥1 5min。1. 5加入20 μ L DEPC水，輕彈混勻，溶解管壁上RNA，保存_18°C以下備用。2反應體系的配制從試劑盒中取出RT-PCR反應液，室溫融化并顛倒混勻，2000rpm離心lOsec。取出Taq酶及反轉(zhuǎn)錄酶，第一次使用時2000rpm離心lOsec，以收集粘在管壁的酶貯液，每個測試反應體系配制如下牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR反應液21 μ L，Taq酶0. 5 μ L，反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L，計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心管中，完全顛倒混勻，2000rpm離心lOsec，向設定的PCR反應管中分別加入22 μ L。將步驟1中制備好的樣本RNA以及陰、 陽性對照品各取3 μ L加入相應的反應管中，蓋緊管蓋，置于熒光PCR儀上，并記錄好樣本擺放孔位。3熒光PCR反應條件設置第一步:42°C:20min,95°C :3min，1 個循環(huán)；第二步95°C:5sec,60°C :40sec (收集熒光 FAM)，40 個循環(huán)。4特異性試驗在相同的條件下，同時提取牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬瘟病毒(CSFV)以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的RNA。應用牛病毒性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR快速檢測試劑盒檢測上述病毒，同時設立陰陽性對照，以驗證本試劑盒的特異性。檢測結(jié)果顯示，牛病毒性腹瀉病毒樣品和試劑盒中的陽性對照品檢測結(jié)果為陽性(結(jié)果見附圖1)，而豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和試劑盒中的陰性對照品均為陰性。證明該試劑盒能特異性的檢測出牛病毒性腹瀉病毒。5靈敏度試驗以十倍系列稀釋的標準品(3. IX IO1 3. IX IO7拷貝/μ L)作為模板，應用牛病毒性腹瀉病毒熒光定量RT-PCR快速檢測試劑盒進行檢測，結(jié)果顯示，在IO1 IO7拷貝/ μ L 的范圍內(nèi)可以得到良好的動力學曲線(見附圖2)且標準曲線較為理想(見附圖3)。標準曲線的線性相關系數(shù)(R2)在0.99以上，提示誤差較小，可信度較高。說明本試劑盒可檢測低至103copies/mL的病毒量。6重復性試驗用該試劑盒對3組不同病毒含量的樣品進行重復性測定，所得檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理后，計算組內(nèi)的變異系數(shù)(C. V)，結(jié)果顯示C. V值均小于3%，說明差異不顯著，該檢測方法重復性較好(見表1)。表1樣品組間重復性檢測
權(quán)利要求
1.檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括用于擴增BVDV 5，UTR的引物對。
2.如權(quán)利要求1的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述引物對的上游引物序列為 5，-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3，，下游引物序列為 5，-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，。
3.如權(quán)利要求2的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括用于檢測擴增產(chǎn)物的iTaqMan探針。
4.如權(quán)利要求3的熒光定量RT-PC檢測試劑盒，其中所述探針的序列為 5，-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-3 ’，5 ’端標記熒光報告基團FAM，3，端標記熒光淬滅基團 BHQl。
5.如權(quán)利要求4的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于所述引物對和TaqMan 探針被包括在RT-PCR反應液中，所述RT-PCR反應液包括以下組分1 XRT-PCR緩沖液、 ImMdNTP混合物、0. 1 μ M TaqMan探針、0. 2 μ M上游引物和0. 2 μ M下游引物。
6.如權(quán)利要求5的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其中所述試劑盒還包括如下組分 RNA提取試劑、DEPC水、DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、陽性對照和陰性對照。
7.如權(quán)利要求1-6任一項的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的應用，其特征在于該試劑盒使用時包括如下步驟提取樣品的RNA ；—步法PCR，利用反轉(zhuǎn)錄過程將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA， 同時進行熒光定量PCR ；對數(shù)據(jù)進行處理和分析；其中所述應用不用于診斷目的。
8.如權(quán)利要求7的應用，其特征在于用于臨床及科研領域，包括對BVDV感染進行快速定量檢測，以及對牛血清、牛血白蛋白、牛睪丸細胞源豬瘟兔化弱毒活疫苗等生物制品的 BVDV污染監(jiān)測。
9.不用于診斷目的的用于檢測BVDV的方法，其特征在于包括應用熒光定量RT-PCR 方法檢測待測樣本中是否存在BVDV的RNA的步驟，其中所述RT-PCR方法應用了以下引物對和TaqMan探針序列為5 ’ -GAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGG-3 ’的上游引物，序列為 5，-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3，的下游引物，以及序列為 5，-AGATGCCACGTGGACGAGGGC-3，的 TaqMan 探針。
10.不用于診斷目的的用于檢測BVDV的方法，其特征在于包括應用權(quán)利要求1-6任一項的熒光定量RT-PCR快速檢測試劑盒檢測待測樣本中是否存在BVDV的RNA的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測牛病毒性腹瀉病毒的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及其應用，該試劑盒用于臨床及科研領域，包括對BVDV感染進行快速定量檢測，以及對牛血清、牛血白蛋白、牛睪丸細胞源豬瘟兔化弱毒活疫苗等生物制品的BVDV污染監(jiān)測。本發(fā)明還提供了不用于診斷目的的用于檢測牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染的熒光定量RT-PCR方法。
文檔編號C12Q1/68GK102268488SQ201110207848
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月25日
發(fā)明者劉漢平, 孫慶歌, 張萍, 溫文生, 漆世華, 薛霜, 謝紅玲, 陳其兵 申請人:武漢中博生物股份有限公司