專利名稱：水稻miR192在增加植物鎘脅迫敏感性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及功能基因組學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻miR192在增加植物鎘脅迫敏感性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，我國重金屬(鎘、砷、汞等)引起的土壤污染形勢已相當(dāng)嚴(yán)峻。2006年全國受重金屬污染的耕地約有1. 5億畝；全國每年受重金屬污染的糧食達(dá)1200萬噸，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過200億元；在未來的中國農(nóng)產(chǎn)品安全問題中，重金屬污染將取代農(nóng)藥，成為主要的公共衛(wèi)生問題。水稻是世界上最重要的農(nóng)作物，全球一半以上的人口以稻米為主食， 我國是世界上第一種稻大國，目前我國稻米中重金屬超標(biāo)現(xiàn)象已引起了國家各部委的高度重視。重金屬一旦進(jìn)入土壤-水稻系統(tǒng)中就很難排除。過量的重金屬在水稻的根、莖、葉以及籽粒中積累，不僅影響水稻的產(chǎn)量和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，并可通過食物鏈進(jìn)入人體，引發(fā)各種疾病，最終危害人體健康。因此，探明水稻對重金屬吸收、轉(zhuǎn)運規(guī)律及重金屬耐性的生理和分子機(jī)理，在輕度重金屬污染的土壤中進(jìn)行農(nóng)作物的安全生產(chǎn)，并利用植物進(jìn)行大規(guī)模污染土壤的修復(fù)，將對保障農(nóng)產(chǎn)品安全和生態(tài)安全，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。植物重金屬毒害是多方面的，其對重金屬的抗性機(jī)制也十分復(fù)雜，包括植物限制重金屬離子吸收，重金屬與體外分泌物結(jié)合，重金屬的外排，根系富集，細(xì)胞壁束縛， 跨質(zhì)膜、液泡膜轉(zhuǎn)運，抗氧化響應(yīng)等。其中，有機(jī)酸、氨基酸、含氮化合物，植物螯合肽 (Phytochelatin, PC)和金屬硫蛋白(MT)等在植物對重金屬的解毒作用中發(fā)揮了重要功能。一些與植物重金屬耐性相關(guān)的基因也得到了鑒定與功能的描述，它們基本為直接參與代謝與生理變化的效應(yīng)基因，通過控制代謝小分子或蛋白的表達(dá)參與抗逆過程。一般認(rèn)為植物的重金屬脅迫應(yīng)答機(jī)理可能是由多基因控制的，植物的重金屬毒害及其耐受性是多種生理過程的綜合反應(yīng)，但迄今為止其中何為關(guān)鍵因子并不清楚。微RNA(microRNA，或miRNA)是一種新型的調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。植物中miRNA通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)，廣泛參與植物的生長發(fā)育、細(xì)胞代謝、器官形態(tài)建成、激素分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫應(yīng)答等過程。近年來的研究表明，miRNA在植物重金屬脅迫響應(yīng)過程中扮演著重要角色。在豆科的模式植物蒺藜苜蓿中，部分miRNA的表達(dá)可受重金屬鎘、汞、鋁的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)(Zhao，S. Ζ.，Si，Q. H.，Zhi, Μ. Y. Bioinformatic identification and expression analysis of new microRNAs from Medicago truncatula. Biochem. Biophys. Res. Commun, 2008, 374 :538-542.)。
菜中，miR156、miR171、miR393 以及 miR396a 的表達(dá)受到鎘的抑制(Xie，F(xiàn). L. , Huang, S. Q.， Guo, K. , Xiang, A. L. , Zhu, Y. Y. , Nie, L. , Yang, Ζ. M. Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus. FEBS Lett，2007，581 :1464—1474.)。 Huang等Q009)構(gòu)建鎘脅迫下水稻幼苗的small RNA文庫，克隆了 19個新的miRNA，并發(fā)現(xiàn)其中多數(shù)miRNA在鎘脅迫下表達(dá)發(fā)生變化。水稻幼苗根中miR604在鎘處理下表達(dá)下調(diào)，其靶基因脂轉(zhuǎn)移蛋白表達(dá)上升。而脂轉(zhuǎn)移蛋白參與植物多種抗逆性反應(yīng)并介導(dǎo)植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過禾呈(Huang, S. Q. , Peng, J. , Qiu, C. Χ. , Yang, Ζ. Μ. Heavy metal-regulated new microRNAs from rice. J. Inorg. Biochem，2009，103 :282e287.)。Kong 等(2010)在擬南芥中克隆得到8個與缺鐵脅迫相關(guān)的miRNA，它們在缺鐵條件下均表達(dá)上調(diào)，并且其中5個MIRNA基因上游的啟動子區(qū)經(jīng)預(yù)測存在缺鐵誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控元件(IDEl/IDE》(Kong, W. , Yang, Ζ. Μ. Identification of iron-deficiency responsive microRNA genes and cis-elements in Arabidopsis. Plant Physiol. Biochem,2010,48 :153el59.)。Sunkar 等 (2006)研究發(fā)現(xiàn)miR398在擬南芥抵抗強(qiáng)光、重金屬CuJe等氧化脅迫中發(fā)揮作用在氧化脅迫條件下，miR398的表達(dá)量被誘導(dǎo)降低，miR398調(diào)控的Cu/Si超氧化物歧化酶(CSDs) mRNA的表達(dá)量升高，Cu/Si超氧化物歧化酶可快速地將超氧化物轉(zhuǎn)變成過氧化物和分子氧，組成了抵抗高毒性超氧化物的第一道防線，導(dǎo)致擬南芥對重金屬脅迫的耐受性也大大增力口(Sunkar, R. , Kapoor, A. , Zhu, J. K. Posttranscriptional induction of two Cu/ Zn superoxide dismutase genes in Arab idopsis is mediated by downregulation of miR398 and important for oxidative stress tolerance. Plant Cell,2006,18 2051-2065.)。因此，深入研究植物miRNA在重金屬脅迫應(yīng)答中的功能及其作用機(jī)制，將有助于闡明植物對重金屬吸收、轉(zhuǎn)運規(guī)律及其生理和分子機(jī)理，也可為通過小分子RNA的遺傳操作改良作物的抗逆性，培育優(yōu)良重金屬可食部分低積累型或者優(yōu)良重金屬超積累型植物，為土壤重金屬污染的植物修復(fù)技術(shù)提供材料。Lindow等Q007)利用miRNA與靶基因的互補性等特征，預(yù)測水稻中可能存在 2100 條成熟miRNA序列(Lindow M, Jacobsen A,Nygaard S,Mang Y, Krogh A Intragenomic matching reveals a huge potential for miRNA-mediated regulation in plants. PLoS Comput Biol 2007，3 :2379-2390.)。這些miRNA的靶基因及其具體的生物學(xué)功能以及是否在水稻重金屬脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用并不清楚。因此，對于水稻miRNA的深入研究將有助于我們解答重金屬耐性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，提出避免植物重金屬毒害和提高植物抗重金屬脅迫能力的有效措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻miR192在增加植物鎘脅迫敏感性中的應(yīng)用。一種水稻miR192在增加植物鎘脅迫敏感性中的應(yīng)用，所述miR192的堿基序列如 SEQ ID NO. 1 所示。優(yōu)選的，所述植物為水稻。具體方法為將包含所述水稻miRNA的前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，篩選，培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因株系。由于miRNA本身序列很短，只有20幾個bp，而前體序列相對較長，連接到載體上， 有利于轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，優(yōu)選的，所述前體基因的堿基序列如SEQ ID N0. 2所示。本發(fā)明通過將水稻miR192轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，獲得的T2代種子播種在含鎘培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR192的水稻植株對鎘敏感。


圖1為7天齡水稻幼苗60uM Cd脅迫Mi根的miRNA芯片圖譜，(Cy3對照；Cy5處理樣品)；圖2為7天齡水稻幼苗60 μ M Cd脅迫下6h根中miR192的RT-PCR圖(Control 對照；Cd處理樣品；tubulin作為內(nèi)參)；圖3為miR192過表達(dá)載體構(gòu)建的過程凝膠圖譜。a. miR192前體PCR擴(kuò)增凝膠圖譜；b.pMD19-T-miR192質(zhì)粒酶切鑒定圖；c. pl301_miR192重組質(zhì)粒菌液PCR擴(kuò)增凝膠圖譜；d. pl301-miR192重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖4為miR192過表達(dá)水稻種子在60uM Cd處理下萌發(fā)7d后表型，(WT對照；35S MIR192轉(zhuǎn)基因水稻)；
具體實施例方式實施例1基因的獲得以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，取60uM CdCl2處理Mi和對照組 (未處理)的根0. lg，用液氮研磨并加入Iml TrizoKInvitrogen生產(chǎn))繼續(xù)研磨至勻漿， 轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，12000 Xg離心lOmin，收集上清至新離心管中。室溫放置5min，加入 0. 2ml氯仿用力震蕩15s，使溶液充分混勻。室溫放置5min，12000Xg離心15min，收集上清。加兩倍上清體積的異丙醇，_20°C過夜沉淀。12000 Xg離心lOmin，去上清，加ImL預(yù)冷的75%乙醇(DEPC-H2O配制)洗沉淀。12000 Xg離心lOmin，倒盡液體，室溫干燥5min，沉淀重溶于50 μ L DEPC (焦碳酸二乙酯)水。取2 μ g Total RNA進(jìn)行電泳檢測，并稀釋樣品測 OD 260/280, OD 260/230 及濃度。利用 2-5 μ g 總 RNA 樣品，通過 YM-100 (Millipore)微離心過濾柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分離到的小RNA 3'端加上 poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標(biāo)記與這個poly(A)尾巴連接，(ligation)用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。用兩個不同的標(biāo)記物Cy3和Cy5來標(biāo)記處理組和對照組的兩個RNA樣品。利用Lindow等O007)預(yù)測的2100條miRNA序列以及水稻miRNA數(shù)據(jù)庫(miRBase Release 11. 0, http //microrna. sanger. ac. uk) ψ W miRNA Jf^lJ, J^^^j^ miRNA , 檢測生長第七天的水稻在重金屬鎘脅迫他根組織中miRNA的表達(dá)情況。經(jīng)60 μ M鎘處理 Mi后的7天齡水稻幼苗的根，采用Trizol法提取總RNA，提純miRNA后，熒光標(biāo)記，與miRNA 芯片雜交，經(jīng)芯片掃描，數(shù)據(jù)采集分析，尋找表達(dá)水平上調(diào)或者下調(diào)較顯著的miRNA。芯片結(jié)果顯示(圖1)，一個來自于Lindow等(2007)預(yù)測的miRNA序列(Lindow M, Jacobsen A,Nygaard S,Mang Y,Krogh A Intragenomic matching reveals a huge potential for miRNA-mediated regulation in plants. PLoS Comput Biol 2007,3 :2379-2390.),艮P miR192在Cd處理他后表達(dá)量比對照(未處理)下降2倍以上。根據(jù)TIGR數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)水稻miR192位于1號染色體，來源于基因間區(qū)域。成熟序列如SEQ ID NO. 1所示，前體序列如SEQ ID N0. 2所示。根據(jù)miRU靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR192靶向ATP結(jié)合(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白。文獻(xiàn)報道 ATP結(jié)合(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白是重要的重金屬轉(zhuǎn)運體，對重金屬耐性發(fā)揮重要作用(Clemens， S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta,2001, 212 :475-486.)。我們并且采用RT-PCR方法初步驗證芯片分離得到的miR192，具體操作如下以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，取60uM CdCl2處理他和對照組(未處理)的根采用iTrizol法提取RNA，并用RNase-free DNaseI (TaKara)消化以去除 DNA 污染。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara) 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。反應(yīng)體系為 20μ 1，分別為 2μ gRNA，ly 1 Oligo dT Primer (50 μ Μ), 1 μ 1 dNTP Mixture(IOmM)和 RNase free H2O 至 10 μ 1，65°C 5min，冰上急冷，然后依次加 Λ 4 μ 1 5XPrimeScript Buffer,0. 5 μ 1 RNase Inhibitor (40U/μ 1),1 μ 1 PrimeScript RTase (200U/μ 1)和 4· 5 μ 1 RNase free dH20，輕微混合均勻，42°C 60min,70°C 15min，最后-20°C保存。然后以第一鏈cDNA為摸板擴(kuò)增目的基因miR192，所用擴(kuò)增配對引物miR192-F, 5 ’ -AGAGACCGTGTCGTTGT-3 ’，miR192-R, 5，-GGTTTGGATCTTTGGAT-3，，RT-CPR結(jié)果如圖2所示，該結(jié)果驗證了芯片結(jié)果，表明miR192在鎘脅迫下表達(dá)下調(diào)。實施例2基因克隆與轉(zhuǎn)化以野生型水稻中花11七天苗齡幼苗DNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增到miR192前體基因的序列。具體操作如下首先，提取野生型水稻中花11七天齡幼苗DNA。取約0.2g水稻葉片用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移粉末到加有500 μ 1提取液(IOOmM Tris-HCl,pH 8. 0 ；20mM EDTA ； 500mMNaCl)的離心管中，輕輕混勻。向管中加入ΙΟΟμΙ 10% SDS溶液，混勻，65°C保溫20min。然后加氯仿/異戊醇/乙醇QO 1 4)混合液600 μ 1，室溫靜止lOmin。4°C， 12000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中。加入Iml預(yù)冷的無水乙醇充分混勻，_20°C 沉淀DNA20min。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，加70 %乙醇500 μ 1進(jìn)行洗滌。4°C， 12000rpm離心lOmin，棄上清。輕微離心，用移液器將殘留液體吸干。吹干DNA沉淀后，溶于 100μ 1 含 RNase 酶(10μ g/ml)TE 中，37°C 水浴 30min，_20°C 保存。根據(jù) miR192 前體序列，在database中查閱其所在基因組位點的兩端的序列，分別在前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩端約50bp 處設(shè)計引物，所設(shè)引物如下miR192-F, 5 ’ -CGGGGTACCGGGAGTAAGAGATAAAAGAT-3 ’miR192-R,5' -AACTGCAGGCTAATACAAAAGTAGAATT-3‘接著以DNA為摸板，利用所設(shè)引物擴(kuò)增miRl92前體基因。PCR反應(yīng)體系為 50μ 1，依次加入 DNA 模板 1 μ 1U0XPCR buffer 5 μ 1、IOmMdNTPs 4μ1、10μΜ 正向引物(miR192-F) 0. 8 μ 1、10 μ M 反向引物(miR192_R) 0. 8 μ 1、TaKaRa Taq (5U/ μ 1)聚合酶 0. 5μ 1，最后加ddH20補至50μ 1。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min，變性94°C 30s，退火 59°C 30s，延伸72°C 30s，30個循環(huán)，最后延伸72°C 10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物凝膠圖譜如圖 3. a所不。擴(kuò)增后將miR192前體基因DNA產(chǎn)物，利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，操作如下將DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入1. 5ml的 Eppendorf管中，稱取重量。加入6倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置30min。將溶膠液加入吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。加入600 μ 1漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。12000rpm離心2min，室溫放置數(shù)分鐘徹底晾干。將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，加入40 μ 1洗脫緩沖液EB，12000rpm離心 2min收集DNA溶液。將回收的miR192前體基因DNA與pMD19-T載體CTakaRa)進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系10 μ 1，分別加入 0. 5 μ 1 PMD19-T 載體、4. 5μ 1 純化的 miR192 前體的 DNA、5y 1 Solution I。16°C下連接池后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。通過Amp篩選，挑取陽性克隆，經(jīng)PCR反應(yīng)驗證及測序鑒定正確后，選取正確的菌液提取質(zhì)粒pMD19-miR192。 利用天根公司生產(chǎn)的普通質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒操作如下取3ml菌液加入離心管中，12000rpm離心lmin，盡量吸出上清液。向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ 1的溶液Pl (含RNaseA)，徹底懸浮細(xì)菌沉淀。加入250 μ 1溶液 Ρ2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。加入350 μ 1溶液Ρ3，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)6_8 次，充分混勻，12000rpm離心lOmin。收集上清液，轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12000rpm離心60s， 倒掉廢液。加入600 μ 1已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉廢液并漂洗兩次。將吸附柱CP3放入收集管，12000rpm離心2min，置于室溫徹底晾干。加入55 μ 1洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。將提取的質(zhì)粒pMD19-miR192和DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA1301同時都用iTakafci 公司生產(chǎn)的KpnI和I3StI進(jìn)行雙酶切。酶切體系50μ 1，包括5μ 1 IOXM buffer, 28 μ 1 pMD19-miR192 質(zhì)粒(或 pCAMBIA1301 質(zhì)粒)、1μ 1 KpnIU μ 1 PstI 禾口 15μ1 ddH20，37°C 水浴過夜。pMD19-miR192質(zhì)粒酶切結(jié)果如圖3. b所示。將DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA1301 和克隆質(zhì)粒pMD19-miR192酶切后，割膠回收DNA片段。接著用T4連接酶連接，連接體系 10口1,包括1“1 pCAMBIA1301 載體、7· 5μ 1 miR192DNA、1 μ 1 10 X Τ4 連接酶 buffer 和 0.5μ1 Τ4連接酶，16°C連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中， 進(jìn)行菌液PCR，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3. c和圖3. d所示。將正確的植物表達(dá)載體pl301-miR192導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，操作如下取200 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入1 μ gpl301-miR192質(zhì)粒，混勻，冰浴5min，液氮中速凍5min，37°C水浴5min，然后加入Iml YM培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)4h。IOOOOg離心30s，棄上清，吸200 μ 1菌液涂布于含有 50mg/L卡那霉素和40 μ g/1利福平的YM平板，培養(yǎng)，約4 后長出農(nóng)桿菌單菌落。搖菌，提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA重新轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，再提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性質(zhì)粒pl301_miR192，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到水稻愈傷。操作如下首先活化農(nóng)桿菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培養(yǎng)基上劃線，28°C暗培養(yǎng)。收集農(nóng)桿菌菌體，將其懸浮于含有200 μ M己酰丁香酮(As)的AAM液體懸浮培養(yǎng)基中。調(diào)整菌體濃度至0D600為0. 8 1. 0，倒入含繼代培養(yǎng)1周的水稻愈傷組織的無菌三角瓶，侵染lOmin，并不時晃動。然后將愈傷組織置于無菌的濾紙上浙干30min后，置于鋪有一層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)3天。將共培養(yǎng)后的愈傷組織用無菌水清洗5-6次，再用含500mg/L頭孢拉定的無菌水清洗1 2遍，置于無菌濾紙上浙干lh。 將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇， ^°C，暗培養(yǎng)14天。然后將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到新的含500mg/L頭孢拉定和50mg/ L潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇，280C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有潮霉素的分化培養(yǎng)基上，于25°c，1 光照/1 黑暗條件下培養(yǎng)。待再生小苗長成約Icrn高時，將其移到生根培養(yǎng)基上壯苗，25°C，iai光照 /12h黑暗條件下培養(yǎng)。最后將轉(zhuǎn)基因苗挑出，加入適量蒸餾水煉苗3天至一周左右，洗去瓊脂，培養(yǎng)箱水培1周，移栽到溫室的土缽中生長。挑選生長正常的植株，進(jìn)行潮霉素PCR篩選和⑶S染色，獲得陽性TO代植株，共10個株系。收獲Tl代種子繁種并鑒定至T2代，獲
7得水稻轉(zhuǎn)基因株系。實施例3 miRNA鎘脅迫應(yīng)答的調(diào)控功能鑒定取T2代轉(zhuǎn)基因株系種子和中花11野生型的種子，稀HNO3破休眠處理16h。倒去稀HNO3,10% NaClO(有效氯約1 1. 2% )消毒20min后用蒸餾水沖洗。將種子浸泡在水中，37°C暗處催芽約兩天，再在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一天至露白。挑選生長一致的露白的轉(zhuǎn)基因株系和野生型的種子，同時轉(zhuǎn)移入0uM、100uM CdCl2W瓊脂培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中(白天/黑夜^TC/22°C，i;3h/llh)。培養(yǎng)7天后，觀察轉(zhuǎn)基因株系與野生型幼苗在鎘脅迫下的表型。如圖4所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在IOOuM CdCl2處理下，miR192過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因幼苗相比野生型幼苗，生物量、葉長度、根的數(shù)目及和長度都顯著降低，說明miR192超量表達(dá)增加了對鎘脅迫的敏感性。
權(quán)利要求
1.一種水稻miR192在增加鎘脅迫敏感性中的應(yīng)用，所述水稻miR192的堿基序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將包含所述水稻miR192的前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，篩選，培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因株系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述前體基因的堿基序列如SEQID NO. 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻miR192在增加植物鎘脅迫敏感性中的應(yīng)用，所述miR192的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明通過將水稻miR192轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，獲得的T2代種子播種在含鎘培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)miR192超量表達(dá)增加了對鎘的敏感性。
文檔編號C12N15/82GK102250901SQ20111019391
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者丁艷菲, 劉海麗, 朱誠, 江瓊, 潘家榮, 王飛娟 申請人:中國計量學(xué)院