專利名稱：短小芽孢桿菌及其飼料添加劑、預混料和飼料防霉劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于飼料科學與飼料添加劑技術領域，具體涉及一種短小芽孢桿菌及其飼料添加劑、預混料和飼料防霉劑。
背景技術：
飼料被霉菌及霉菌毒素污染是目前飼料業(yè)和畜牧業(yè)生產中不可忽視的一個問題。 據(jù)聯(lián)合國糧食組織估算全世界每年大約有5% 7%的糧食、飼料等農產品受霉菌的侵害， 從而造成了巨大的經濟損失。被霉菌污染的飼料，其營養(yǎng)物質被分解，適口性下降，并產生多種霉菌毒素，動物吃了發(fā)霉變質的飼料，會發(fā)生急性或慢性中毒癥狀，造成畜禽的生長速度緩慢，采食量下降，消化率降低，繁殖能力與免疫力下降，嚴重危害動物健康，甚至造成中毒死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的危害。為了預防飼料霉變，經常采用控制飼料原料含水量和添加防霉劑的辦法，防霉劑的作用在于能破壞霉菌細胞壁及細胞內的酶，使酶蛋白變性而無法參與催化作用，有效地防止霉變。常見的防霉劑有有機酸類、有機酸鹽及有機酸酯類以及一些復合防霉劑，但是這些都是化學防霉劑，本身對飼料品質沒有改善，同時在使用過程中對動物有刺激性，在適口性、安全性及抑菌方面存在不足。另外，隨著人們對抗生素飼料添加劑帶來負面效應的意識不斷提高，飼料微生態(tài)制劑是作為一種新型的抗生素替代品的添加劑，具有無毒副作用、無耐藥性、無殘留、效果顯著等諸多優(yōu)點，受到了養(yǎng)殖業(yè)的歡迎。但是，目前短小芽孢桿菌在中國還不是可作為直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌株，對其研究也較少。目前國內關于短小芽孢桿菌的應用主要集中在其產堿性蛋白、脂肽及預防植物疾病方面，關于短小芽孢桿菌在動物飼料、預混料、飼料添加劑方面的應用未見報道，在飼料防霉劑的應用中也尚未有人提出。

發(fā)明內容
(一)要解決的技術問題本發(fā)明的目的是提供一種短小芽孢桿菌Bacillus pumilus。本發(fā)明的另一目的是提供一種包含該短小芽孢桿菌Bacillus pumilus的飼料添加劑及包含該飼料添加劑的預混料。本發(fā)明還提供一種包含該短小芽孢桿菌Bacillus pumilus的飼料防霉劑。(二)技術方案本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種短小芽孢桿菌Bacillus pumilus，其保藏編號為CGMCC No. 4756。本發(fā)明還提供一種包含該短小芽孢桿菌Bacillus pumilus CGMCC No. 4756的飼料添加劑，其特征在于短小芽孢桿菌Bacillus pumilus活菌數(shù)為lX101(lCfu/g lX1012cfu/g。
本發(fā)明提供包含上述飼料添加劑的預混料，其特征在于飼料添加劑的添加比例是 2.5%，此比例為體積與質量比(體積/質量)。本發(fā)明還提供包含上述短小芽孢桿菌Bacillus pumilus CGMCCNo. 4756的飼料防霉劑，但所述飼料為包含玉米、麩皮或豆粕的動物飼料。本發(fā)明的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus為申請人首次在國內分離到的一株來源于動物消化道的新的短小芽孢桿菌，為申請人從牛的瘤胃中分離得到的一株芽孢桿菌優(yōu)勢菌株，經過生理生化及16s RNA分析鑒定，表明該菌屬于短小芽孢桿菌，其分類命名為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus,已于2011年4月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，簡稱 CGMCC，保藏編號為 CGMCCNo. 4756。(三)有益效果(1)本發(fā)明的保藏編號為CGMCC No. 4756的短小芽孢桿菌BaciIlus pumilus為申請人首次在國內分離到的一株來源于動物消化道的新的短小芽孢桿菌，并將其作為飼料添加劑應用于動物預混料中，同時首次應用于飼料防霉劑方面；且此菌株具有耐高溫的特點， 因而具有不需要包被，可直接制粒的優(yōu)點；(2)本發(fā)明的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus作為一種飼料添加劑添加到預混料中，能夠改善飼料品質，提高飼料中粗蛋白的含量，降低飼料中粗纖維的含量，是一種新型安全可靠、無污染的純發(fā)酵多功能的新的微生態(tài)制劑產品；(3)本發(fā)明的飼料防霉劑較常規(guī)防霉劑除了安全、無污染、直接制粒之外，不含化學藥劑，不僅防霉效果好，抑菌力強，而且可以改善飼料品質，適口性強，同時具有用量少， 可大大節(jié)約生產成本；(4)本發(fā)明的飼料防霉劑和添加劑的制備方法簡單，操作容易。


圖1.菌株WL86的細胞形態(tài)及菌落形態(tài)圖2.短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) CGMCC No. 4756 營養(yǎng)瓊脂平板(37°C，培養(yǎng)2天菌落形態(tài))圖3. PCR擴增16s rRNA序列分瓊脂糖凝膠電泳分析(M. Marker ；1,2.短小芽孢桿菌 CGMCC No. 4756)圖4.短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756抑制發(fā)酵飼料中霉菌的生長(1為對照，2為地衣芽孢桿菌，3為枯草芽孢桿菌，4為短小芽孢桿菌)A.接種短小芽孢桿菌與空白對照12天的發(fā)酵飼料；B.接種45天的發(fā)酵飼料圖5.短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756的生化反應(API 50CHB試驗條生化譜)
具體實施例方式通過下列實施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756的分離及鑒定1、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756 的分離
(1)取少量采自北京市昌平牛場牛的瘤胃樣本，加入無菌水稀釋到一定濃度，沸水中煮lOmin，再用LB培養(yǎng)基進行芽孢桿菌的分離，共分離到89株芽孢桿菌。(2)將分離到的89株芽孢桿菌進行耐酸實驗將LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的短小芽胞桿菌制成濃度為1 X 108cfu/mL的菌懸液， 分別加入ImL pH為2. 5,3. 0,3. 5的無菌生理鹽水溶液，37°C靜止培養(yǎng)4h收集菌體并用ImL 無菌生理鹽水重新懸浮，使用梯度稀釋法進行活菌計數(shù)，測其存活率，共挑選出耐受PH值為2. 5的11株芽孢桿菌。(3)將從步驟O)中篩選出的11株芽孢桿菌進行耐膽鹽實驗將LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1 的芽胞桿菌制成濃度為1 X IO8CfuAiL的菌懸液，分別加 Λ ImL 濃度為 0%,0. 1%,0.5%,0.8%, 1.0%, 1.2%, 1.5% 的無菌豬膽鹽溶液，37°C靜止培養(yǎng)他。收集菌體用無菌生理鹽水重新懸浮，使用梯度稀釋法進行活菌計數(shù)，測其存活率， 挑選出其中耐受膽鹽濃度為1. 5%的2株芽孢桿菌。(4)將從步驟(3)中篩選出的2株芽孢桿菌進行耐蛋白酶實驗a.制備終濃度為3g/L胃蛋白酶溶液，并且調pH值到2. 0，取0. 5mL菌懸液加入到 4. 5mL模擬胃液中(10倍稀釋)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計算存活率。b.將濃度約IO6CfuAiL的菌液按2%的接種量接種于含有胰蛋白酶的液體培養(yǎng)基中，胰蛋白酶濃度分別為(W/V%)0.8，1.2，1.6，37°C培養(yǎng)16h，平板計數(shù)法進行菌落計數(shù)， 并計算菌株的存活率。共篩選出1株性能耐胃蛋白酶0.4%和胰蛋白酶0.8%的性能較好的菌株，編號為
虬86。2、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756 的鑒定(1)菌株WL86的細胞形態(tài)及菌落形態(tài)(圖1，2)。營養(yǎng)瓊脂平板，37 °C，培養(yǎng)2天細胞形態(tài)及菌落形態(tài)菌體呈桿狀， 0. 47 μ mX 1. 86 2. 67 μ m,單個、成對排列；芽孢次端生，柱狀，孢囊不膨大；革蘭氏染色陽性。菌落微黃色、圓形、扁平、蠟狀、不透明、邊緣不整齊。(2)生化反應采用法國梅里埃生物公司API50細菌鑒定系統(tǒng)，鑒定結果表明WL86 菌株為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，其生化反應結果如圖5所示。(3) 16s rRNA序列分析顯示該菌株為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，瓊脂糖凝膠電泳如圖3，其保藏編號為CGMCC No. 4756。實施例2 防霉劑的制備及應用(1)短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌各自于LB液體培養(yǎng)基37°C好氧培養(yǎng)12h，調整菌體濃度達到1 X IO8,將各菌液按照10 %的接種量接種于未經滅菌的玉米渣中進行發(fā)酵12天；以接種量相同的無菌水接種到發(fā)酵飼料中作為空白對照。結果表明，短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756與枯草芽孢桿菌對于飼料發(fā)酵過程中霉菌的生長有顯著的抑制作用，地衣芽孢桿菌的效果差一些，對照瓶中都長了大量的霉菌 (圖 4-A)(2)繼續(xù)發(fā)酵45天之后，出現(xiàn)與步驟1同樣的實驗效果(圖4-B)。(3)短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌各自于LB液體培養(yǎng)基37°C有氧培養(yǎng)12h，調整其菌體濃度達到1X108，將上述菌液按照10%的接種量各自接種于未經滅菌的含玉米、麩皮及豆粕的發(fā)酵飼料原料中進行發(fā)酵12天。結果表明，短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌對于飼料發(fā)酵過程中霉菌的生長有顯著的抑制作用，空白對照瓶中都長了大量的霉菌。實施例3 飼料添加劑的制備及其特性(1)短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌各自于LB液體培養(yǎng)基37°C好氧培養(yǎng)12h，調整其菌體濃度達到1 X IO8,將上述菌液按照5%的接種量各自接種于未經滅菌的玉米渣中進行發(fā)酵3天，以接種量相同的無菌水接種到發(fā)酵飼料中作為空白對照。取一定量樣品烘干，用無菌水溶解，進行稀釋平板菌落計數(shù)分析。結果表明，短小芽孢桿菌CGMCC No. 4756與枯草、地衣芽孢桿菌活菌數(shù)沒有顯著差異，達到1 X IO10-I X 1012cfu/g,但短小芽孢桿菌發(fā)酵飼料瓶中散發(fā)出對照瓶及枯草、地衣芽孢桿菌發(fā)酵飼料瓶中所不具有的發(fā)酵飼料的香味。(2)將步驟(1)中發(fā)酵三天的飼料烘干進行粗蛋白、粗纖維素含量檢測，粗蛋白檢測方法依據(jù)GB/T 6432-1994，粗纖維檢測方法依據(jù)GB/T 6434-2006。結果表明，與對照相比，接種短小芽孢桿菌的發(fā)酵飼料中蛋白含量顯著增加，粗纖維含量顯著下降，蛋白含量由原來的43%增加到50%，粗纖維含量由6. 21%降至5. 32% ； 枯草芽孢桿菌發(fā)酵飼料中，蛋白含量由原來的43%增加到47. 51%，粗纖維含量由6. 21% 降至5. 84% ；地衣芽孢桿菌發(fā)酵飼料中，蛋白含量由原來的43%增加到50. 13%，粗纖維含量由6. 21%降至5. 72%。因此，接種短小芽孢桿菌的發(fā)酵飼料中蛋白含量高于對照發(fā)酵飼料以及接種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵飼料，而接種短小芽孢桿菌的發(fā)酵飼料中粗纖維含量顯著低于對照及接種枯草、地衣芽孢桿菌的發(fā)酵飼料。因此。在總體改善飼料品質方面，優(yōu)于枯草、地衣芽孢桿菌。(4)將步驟(3)中發(fā)酵7 的飼料烘干進行粗蛋白、粗纖維素含量檢測，粗蛋白檢測方法依據(jù)GB/T 6432-1994，粗纖維檢測方法依據(jù)GB/T 6434-2006。結果顯示，與對照相比，接種短小芽孢桿菌的發(fā)酵飼料中蛋白含量顯著增加，粗纖維含量顯著下降，蛋白含量由原來的43%增加到50. 13%，粗纖維含量由6. 21%降至
5.13% ；枯草芽孢桿菌發(fā)酵飼料中，蛋白含量由原來的43%增加到50. 12%，粗纖維含量由
6.21%降至5. 55% ；地衣芽孢桿菌發(fā)酵飼料中，蛋白含量由原來的43%增加到49. 32%，粗纖維含量由6. 21%降至5. 65%。因此，在改善飼料品質方面，短小芽孢桿菌優(yōu)于枯草、地衣芽孢桿菌。
權利要求
1.一種短小芽孢桿菌Bacillus pumiIus，其保藏編號為CGMCCNo. 4756。
2.一種包含權1所述的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus的飼料添加劑，其特征在于短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus 的活菌數(shù)為 lX1010cfu/g~ lX1012cfu/g。
3.一種包含權2所述的飼料添加劑的預混料，其特征在于飼料添加劑的添加比例是 2. 5%。
4.一種包含權1所述的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus的飼料防霉劑，其特征在于所述飼料為包含玉米、麩皮或豆粕的動物飼料。
全文摘要
本發(fā)明屬于飼料科學與飼料添加劑技術領域，具體涉及一種短小芽孢桿菌及其飼料添加劑、預混料和飼料防霉劑。本發(fā)明的短小芽孢桿菌作為一種飼料添加劑添加到飼料中，能夠改善飼料品質，提高飼料中粗蛋白的含量，降低飼料中粗纖維的含量，是一種新型安全可靠、無污染的純發(fā)酵多功能的新的微生態(tài)制劑產品。本發(fā)明的飼料防霉劑較常規(guī)防霉劑除了安全、無污染、直接制粒之外，不含化學藥劑，不僅防霉效果好，抑菌力強，而且可以改善飼料品質，適口性強，同時具有用量少，可大大節(jié)約生產成本。
文檔編號C12N1/20GK102229902SQ20111014092
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權日2011年5月27日
發(fā)明者劉瀅, 劉鵬, 吳慧玲, 周娜, 龐潔, 汪攀, 王安如, 閆軼潔 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 漳州大北農農牧科技有限公司