專利名稱：基因OsERL在降低植物氣孔密度方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因OsERL通過降低植物氣孔密度，從而導(dǎo)致干旱脅迫耐性增強(qiáng)方面的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干旱已是世界性的問題，世界干旱、半干旱地區(qū)已占陸地面積的1/3以上，干旱對(duì)植物的影響在諸多自然逆境因素中占首位。旱災(zāi)造成的糧食損失要占全部自然災(zāi)害糧食損失的一半以上。國(guó)務(wù)院第二次全國(guó)農(nóng)業(yè)普查領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室、國(guó)土資源部和國(guó)家統(tǒng)計(jì)局 2008年2月四日發(fā)布第二次全國(guó)農(nóng)業(yè)普查主要數(shù)據(jù)公報(bào)(第六號(hào))顯示，截至2006年10 月31日，全國(guó)耕地面積一半以上是旱地。在自然條件下，干旱脅迫不僅嚴(yán)重影響了作物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，而且限制了植物的分布。我國(guó)大部分地區(qū)耕地是干旱和半干旱地區(qū)，因此水資源的缺乏和水稻需水量大的矛盾嚴(yán)重影響水稻種植面積的推廣。因此培育高抗農(nóng)作物新品種成了一個(gè)高度緊迫的重大問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程已成為當(dāng)今種質(zhì)資源創(chuàng)新和改良的強(qiáng)有力的武器。目前用于抗旱基因工程的基因主要包括以下幾類。第一，參與滲透保護(hù)物質(zhì)(如脯氨酸、甘露醇、甜菜堿、海藻糖等)合成的基因。這樣能夠使植物在水分脅迫下能合成更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如，以提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)植物的抗旱性。如在水稻中過量表達(dá)脯氨酸生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因(P5CS，deltal-pyrroline-5-carboxylate synthase)提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性(Zhu等，1998，Plant Sci，199 :41-48)；第二，編碼晚期胚胎富含蛋白(LEA)的基因。如在水稻中組成型地過量表達(dá)大麥的HVAl基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株耐旱性增強(qiáng)(Xu等，1996，Plant Physiol, 110 :249-257)；第三，調(diào)控基因。這類基因包括與ABA生物代謝相關(guān)的基因(如NCED和ΑΒΑ0Χ)及ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的基因(如編碼bZIP類、Myb類、zinc-finger類轉(zhuǎn)錄因子的基因)。最近多個(gè)bZIP類轉(zhuǎn)錄因子被證明影響干旱脅迫耐性，如 0sbZIP23，0sbZIP72 和 TRABl 等(Xiang 等，2008，Plant Physiol, 148 :1938-1952 ；Lu 等，Planta,2009, 229:605-615 ；Hobo 等，1999，Proc Natl Acad Sci USA,96 :15348-15353)。第四，調(diào)控氣孔密度(單位葉面積上氣孔數(shù)目)的基因。目前這類基因在抗旱基因工程中的應(yīng)用還沒有報(bào)道。高等開花植物葉片的表皮上有大量的氣孔，它們由兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞圍成一孔形成。 氣孔作為植物與外界環(huán)境進(jìn)行氣體交換(主要是二氧化碳和水蒸汽)的重要通道，在調(diào)節(jié)植物光合作用、蒸騰作用以及水分利用中扮演著至關(guān)重要的角色(Chaerle et al. , Trend in Biotechnology2005,23 :308-315)。我們知道植物通過蒸騰散失的水分中90%以上是通過氣孔散失的。而氣孔密度是影響植物蒸騰量大小的重要因素之一。因此通過植物基因工程合理降低氣孔密度、從而減少單位葉面積水分蒸騰量，是提高植物水分利用率和耐旱性的重要手段。氣孔密度的大小由兩個(gè)因素決定一是在氣孔發(fā)育過程中分化為氣孔的表皮細(xì)胞數(shù)目；二是由于表皮細(xì)胞體積的變化而導(dǎo)致單位葉面積上氣孔數(shù)目(氣孔密度)的變化?？刂茪饪装l(fā)育相關(guān)基因的缺失不僅影響氣孔密度，而且往往導(dǎo)致氣孔的畸形分布，這樣的植株往往不健壯的(相關(guān)研究參考最新綜述，Peterson et al. , Plant Cell,2010, 22 296-306)。擬南芥中有一類富含亮氨酸的受體激酶ERECTA家族(在擬南芥中包括ER， ERLl，ERL2三個(gè)基因)，其中ER基因能夠影響表皮細(xì)胞增大從而調(diào)控氣孔密度(Masle et al.，Nature 2005，436 :866_870)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，從水稻日本晴中分離克隆到一個(gè)編碼類受體蛋白激酶的OsERL基因(該基因編碼的氨基酸序列與擬南芥的ERECTA蛋白質(zhì)同源性為 71 %，故命名為ERECTA-like，簡(jiǎn)稱為OsERL)，該基因在煙草過量表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株單位面積上的氣孔數(shù)目明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株，葉片失水速率和蒸騰速率降低、水分利用率提高，干旱脅迫耐性提高。因此，在植物中過量表達(dá)OsERL基因?qū)τ谔岣咦魑锔珊得{迫耐性具有重要意義，這為作物高抗旱性育種提供新的思路。本發(fā)明申請(qǐng)人在一個(gè)氣孔密度降低的水稻突變體中，利用基因表達(dá)圖譜鑒定到一個(gè)序列號(hào)為AK060260的、編碼類受體蛋白激酶的OsERL基因的信使RNA序列。水稻OsERL 基因信使RNA序列為1688個(gè)堿基，編碼392個(gè)氨基酸。本發(fā)明是通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻品種日本晴的OsERL基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，包含1179個(gè)堿基，正向連接在植物表達(dá)載體 pCAMBIA1390-ubi上；再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至煙草中，提高OsERL基因的表達(dá)，得到OsERL基因表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。在轉(zhuǎn)基因的T3代植株中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性煙草植株的干旱脅迫耐性明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明用于構(gòu)建過量表達(dá)OsERL基因的植物表達(dá)載體、增強(qiáng)OsERL基因表達(dá)的DNA 序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明利用水稻品種日本晴的OsERL基因的cDNA片段作為應(yīng)用基因，將該基因正向轉(zhuǎn)入煙草中，提高OsERL基因的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出表皮細(xì)胞擴(kuò)大、氣孔密度降低、水分利用率提高和較強(qiáng)的干旱脅迫耐性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明提供了一種通過降低氣孔密度而提高水分利用率和干旱脅迫耐性的水稻基因OsERL的應(yīng)用。申請(qǐng)人在煙草中過量表達(dá)OsERL基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的氣孔密度降低、水分利用率和干旱脅迫耐性明顯提高。(2)本發(fā)明首次分離克隆了水稻OsERL基因，并首次在煙草中過量表達(dá)了 OsERL基因。為培育高抗旱煙草品種提供了新的思路，也為其它作物利用異源基因技術(shù)提高抗旱性提供了理論支持。(3)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為水稻等禾谷類作物以及其它作物抗旱性研究提供支持。


圖1為本發(fā)明的OsERL基因表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。將克隆在pMD18_T載體上的OsERL基因利用BamHI和SpeI酶切，替換pCAMBIA1390_ubi植物表達(dá)載體上BamHI 和SpeI之間的DNA片段，這樣OsERL基因正向插入玉米泛素基因啟動(dòng)子(Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-ERL 植物表達(dá)載體。
圖2為檢測(cè)T3代轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株中OsERL基因轉(zhuǎn)錄本水平結(jié)果圖。其中 OsERL-OE表示轉(zhuǎn)OsERL基因的植株，15#、16#、23#、24#和25#代表不同陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系； ACTIN是煙草的一個(gè)肌動(dòng)蛋白基因，作為煙草的內(nèi)參基因；SR代表野生型煙草植株。圖3為轉(zhuǎn)OsERL基因煙草植株和野生植株的干旱脅迫耐性比較圖。其中15#和 16#是2個(gè)不同的轉(zhuǎn)OsERL基因的陽(yáng)性株系；SR代表野生型煙草植株。圖4為轉(zhuǎn)OsERL基因煙草植株和野生型植株的離體葉片失水速率比較圖。其中 15#、16#和24#是3個(gè)不同的轉(zhuǎn)OsERL基因的陽(yáng)性株系；SR代表野生型煙草植株。圖5為轉(zhuǎn)OsERL基因煙草植株和野生型植株的光合速率、蒸騰速率和水分利用率比較圖。A圖表示光合速率，B圖表示蒸騰速率，C圖表示水分利用率。其中15#、16#和24# 是3個(gè)不同的轉(zhuǎn)OsERL基因的陽(yáng)性株系；SR代表野生型煙草植株。*表示轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比t-test差異顯著(P < 0. 05)。圖6為轉(zhuǎn)OsERL基因煙草植株和野生型植株的下表皮細(xì)胞和氣孔密度比較圖。A 圖微分干涉顯微鏡觀察煙草植株第六葉的氣孔和表皮細(xì)胞形態(tài)，拍攝于400倍。B圖表示氣孔密度。分別選取野生型和各個(gè)轉(zhuǎn)基因植株各5棵，每棵植株觀察10個(gè)視野，圖中數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差，**表示轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比t-test差異極顯著(P < 0. 01)。 其中15#、16#和24#是3個(gè)不同的轉(zhuǎn)OsERL基因的陽(yáng)性株系；SR代表野生型煙草植株。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆用于構(gòu)建OsERL基因植物表達(dá)載體的DNA片段，以及驗(yàn)證功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其使用不同的用途和條件。實(shí)施例1 分離克隆用于構(gòu)建OsERL基因植物表達(dá)載體的DNA片段采用TRIZOL試劑(Invitrogen)從水稻品種日本晴(公開報(bào)道的一個(gè)品種)的葉片中提取總RNA。具體步驟如下將20毫克葉片放至液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末，將粉末裝入1. 5ml離心管中，迅速加入Iml Trizol (Invitrogen)顛倒混勻，室溫靜置 5分鐘。在4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1. 5ml離心管中。加入200 μ 1 氯仿，用手劇烈搖動(dòng)15秒鐘，室溫靜置2-3分鐘。4°C，12000rpm離心15分鐘。取無(wú)色水相至一新的1. 5ml離心管中，加入250 μ 1異丙醇，250 μ 1高鹽溶液，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。40C，12000rpm離心10分鐘，吸除上清液。加入Iml冰冷的75%乙醇，上下倒置幾次，然后4°C，7500rpm離心5分鐘，棄上清，在室溫干燥至沉淀變透明。加入適量的DEPC水(一般為60 μ 1)溶解沉淀，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript II (Invitrogen)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟如下 依次加入 1 μ 1 500 μ g/ml oligo(dT) 12_18、2 μ g總 RNA、1 μ 1 IOmM dNTP混合物和DEPC水至12μ 1，在65°C水浴中5分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍微離心收集樣品于管底。然后依次加 Λ 4μ 1 5 X 第一鏈緩沖液、2 μ 1 0. IM DTTiPlyl RNaseOUT (40U/μ 1)，42°C，2 分鐘。然后加入1 μ ISuperScript II，輕微混合均勻，42°C反應(yīng)50分鐘，然后70°C水浴15分鐘使酶失活，這樣就合成了第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。用帶有酶切位點(diǎn)的上游引物 0sERLF(5’ -CGG GAT CCA TGA TCC TAG CTG CTG CTT G_3，，SEQ ID N0:3)，序列特異引物外加BamHI位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基)和下游引物OsERLR(5，-AAC TAGTCTACT CTGTGT TCT GTG ATA TCA C_3，，SEQ ID NO :4)，序列特異引物外加SpeI位點(diǎn)和一個(gè)保護(hù)堿基)。利用 PrimerSTARHS DNA polymerasewith GC buffer (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性1分鐘；980C 10 #, 680C 4分鐘，30個(gè)循環(huán)。利用TArget CloneTM-Plus 試劑盒(Τ0Υ0Β0)在PCR產(chǎn)物末端加A。然后連接到pMD 18-T載體(TaKaRa)。篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO :1所示)，將該克隆命名為pMD18_0sERL cDNA。實(shí)施例2 =OsERL基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好地分析OsERL的功能，申請(qǐng)人通過過量表達(dá)技術(shù)使OsERL基因在煙草中表達(dá)水平提高。根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株的表型和生理特征研究該基因的功能。OsERL基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下首先將實(shí)施例1中得到的陽(yáng)性克隆pMD18-0sERL cDNA用BamHI和SpeI雙酶切，回收插入片段；同樣，用同樣的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表達(dá)載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片段做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue。通過酶切篩選陽(yáng)性克隆，獲得植物表達(dá)載體，命名為 pCAMBIA1390-ubi-ERL(見圖1)。pCAMBIA1390_ubi是在國(guó)際常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體(見圖 1)。將 pCAMBIA1390-ubi 轉(zhuǎn)化至 EHA105 宿主菌。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化體系(參見本發(fā)明后面的實(shí)施例)將其導(dǎo)入到煙草品種SR中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、移苗得到轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)化共獲得30株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因煙草植株。具體步驟(1)煙草葉盤預(yù)培養(yǎng)用剪刀將無(wú)菌SR品種煙草葉片剪成1. OX 1. Ocm的葉盤，放在Tl培養(yǎng)基(成分見后)上28°C光照預(yù)培養(yǎng)Id。(2)農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌(含有植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-ubi_ERL)單克隆菌落，在含有Km的LB液體培養(yǎng)基(成分見后)中于28 °C培養(yǎng)30h。之后，將菌液按1 %的接種量接種至50ml LB液體培養(yǎng)基中(含Km)，培養(yǎng)6_8h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；取25ml菌液(根據(jù)菌液濃度選擇所取體積)4000rpm,4°C，離心lOmin，再將菌體用30ml 1/2MS液體培養(yǎng)基 (成分見后)懸浮。(3)農(nóng)桿菌侵染將步驟(1)經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的煙草葉盤浸泡在步驟(2)中的農(nóng)桿菌菌懸液中5min，之后轉(zhuǎn)至無(wú)菌濾紙上吸干菌液。(4)共培養(yǎng)在Tl培養(yǎng)基上加濾紙一張，將浸泡過農(nóng)桿菌的葉盤轉(zhuǎn)至濾紙上，28°C 黑暗共培養(yǎng)2d。(5)選擇培養(yǎng)把經(jīng)過共培養(yǎng)的葉盤轉(zhuǎn)至T2培養(yǎng)基(成分見后)上，28°C光照培養(yǎng) 24h。(6)分化培養(yǎng)將葉盤轉(zhuǎn)至T3培養(yǎng)基(成分見后)上，28°C光照培養(yǎng)15-20d后， 在葉緣處可見愈傷組織和芽分化。葉盤繼續(xù)在T3中培養(yǎng)，每隔20d在繼代T3培養(yǎng)基(成分見后)繼代一次。1.5-2.0個(gè)月后，待小芽長(zhǎng)至3-5cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基T4。(7)壯苗、移栽在T4培養(yǎng)基(成分見后)中培養(yǎng)0.5-1.0個(gè)月開始生根，繼續(xù)培養(yǎng) 40d，可形成發(fā)達(dá)的根系，移至土壤中栽培。試劑配方
(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中作用到的植物激素的縮寫表示如下 Cb (Cabenicillin,羧節(jié)青霉素)；NAA(Napthalene acetic acid,萘乙酸)； 6-BA(6_Benzylaminopurine，6-芐氨基嘌呤)；Km(Kanamycin，卡那霉素)；DMSO (Dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜)。(2)用于煙草遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1) Tl培養(yǎng)基MS大量，MS微量，30g/L蔗糖，lml/LMS維生素，MS-鐵鹽，瓊脂粉，pH 5. 8。2)T2培養(yǎng)基MS大量，MS微量，30g/L蔗糖，lml/L MS維生素，MS-鐵鹽，2mg/L 6-BA (細(xì)胞分裂素)，0. lmg/LNAA(萘乙酸)，500mg/L羧芐青霉素，瓊脂粉，pH 5. 8。3)T3培養(yǎng)基MS大量，MS微量，30g/L蔗糖，lml/L MS維生素，MS-鐵鹽，2mg/L 6-BA (細(xì)胞分裂素)，0. lmg/LNAA (萘乙酸)，500mg/L羧芐青霉素，30mg/L潮霉素B，瓊脂粉， pH 5. 8。4)繼代用T3培養(yǎng)基MS大量，MS微量，30g/L蔗糖，lml/L MS維生素，MS-鐵鹽， 2mg/L 6-BA (細(xì)胞分裂素)，0. lmg/LNAA (萘乙酸)，400mg/L羧芐青霉素，30mg/L潮霉素B， 瓊脂粉，PH 5. 8。5)T4培養(yǎng)基MS大量，MS微量，30g/L蔗糖，lml/L MS維生素，MS-鐵鹽，2mg/L 6-BA (細(xì)胞分裂素)，0. lmg/LNAA (萘乙酸)，200mg/L羧芐青霉素，30mg/L潮霉素B，瓊脂粉， pH 5. 8。6) 1/2MS液體培養(yǎng)基1/2MS大量，1/2MS微量，MS維生素，MS-鐵鹽，30g/L蔗糖.7) LB 液體培養(yǎng)基胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/ L，氯化 5g/L，pH 7. O0(3)主要溶液配方1)MS 大量(IOX)
權(quán)利要求
1.基因OsERL在提高植物干旱脅迫耐性方面的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的基因OsERL在提高植物干旱脅迫耐性方面的應(yīng)用，其特征是，所述植物為煙草。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基因OsERL在提高植物干旱脅迫耐性方面的應(yīng)用，其特征是，所述應(yīng)用是通過促進(jìn)植物表皮細(xì)胞的擴(kuò)大，降低植物氣孔密度，從而導(dǎo)致植物蒸騰速率和失水速率降低來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
4.基因OsERL在提高煙草干旱脅迫耐性方面的應(yīng)用方法，其特征是，通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻品種日本晴的OsERL基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，正向連接在植物表達(dá)載體 pCAMBIA1390-ubi上；再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至煙草中，提高OsERL基因的表達(dá)，得到OsERL基因表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
5.如權(quán)利要求4所述的基因OsERL在提高煙草干旱脅迫耐性方面的應(yīng)用方法，其特征是，PCR擴(kuò)增的上游引物OsERLF如SEQ ID NO 3所述，下游引物OsERLR如SEQID NO 4所述。
全文摘要
本發(fā)明公開了基因OsERL在降低植物氣孔密度方面的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻品種日本晴的OsERL基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，正向連接在植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-ubi上；再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至煙草中，提高OsERL基因的表達(dá)，得到OsERL基因表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。本發(fā)明通過試驗(yàn)證明OsERL在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的擴(kuò)大，從而導(dǎo)致氣孔密度下降、蒸騰速率和失水速率降低，干旱脅迫耐性增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102226197SQ201110139978
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者劉婧, 周晉軍, 王瑩瑩, 謝先芝, 錢鳳芹 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心