專(zhuān)利名稱(chēng)：一種增殖甲型流感病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甲型HlNl流感病毒的分離鑒定及該病毒在MDCK細(xì)胞上的穩(wěn)定增殖的方法。
背景技術(shù)：
2009年3月墨西哥首次發(fā)現(xiàn)甲型HlNl流感病例，自此疫情開(kāi)始在世界各地迅速蔓延，席卷全球。截止2009年8月6目，已有170多個(gè)國(guó)家報(bào)告病例177457例，造成1462人死亡；2009年8月14日我國(guó)報(bào)告確診2429例、2009年6月11日，世界衛(wèi)生組織(WHO)將該流感大流行警告級(jí)別提高至6級(jí)。我國(guó)衛(wèi)生部于2009年4月30日宣布將其納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類(lèi)傳染病，并采用甲類(lèi)傳染病的預(yù)防、控制措施，同時(shí) 將其納入《中華人民共和國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫法》規(guī)定的檢疫傳染病管理。2009年3月墨西哥此次疫情的病原為變異后的新型甲型HlNl流感病毒。各國(guó)流行的甲型HlNl流感病毒目前在氨基酸水平上是高度同源的，而在這次流感病毒的基因組內(nèi)存在四源重組，其中該病毒的PB2和PA基因源自禽流感HlNl病毒，PBl基因源自人季節(jié)性流感H3N2病毒，HA、NP和NS基因源自古典型豬流感HlNl病毒，NA及M基因源自歐亞系豬流感HlNl病毒(殷建華等，2009，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，第30卷，第6期，637-640)。由于甲型HlNl流感病毒的5個(gè)主要基因片段與豬流感病毒同源性很高，豬是豬、禽、人流感病毒共同的易感宿主，是流感病毒基因重組或重配的“混合器”(顧春英等，2009，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，第30卷，第6期，605-609)流感病毒新流行毒株“孵育器”。SI在人和動(dòng)物流感的病原學(xué)、生態(tài)學(xué)及流行病學(xué)中占有舉足輕重的地位。因此，豬流感的影響不僅在于其顯而易見(jiàn)的獸醫(yī)傳染病學(xué)意義，更在于其深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生學(xué)意義。豬流感(SI)是一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病，其臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭和死亡為特征。SI呈地方性流行，世界性分布，可發(fā)生于各年齡和各品種豬，發(fā)病率高達(dá)100%。SI在養(yǎng)豬場(chǎng)中普遍存在，難以根除。SI能引起病豬生產(chǎn)性能下降，肉料比降低，直接影響豬群健康狀態(tài)及質(zhì)量，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害很大；更值得重視的是，豬流感病毒(SIV)感染豬后可導(dǎo)致胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、豬2型鏈球菌、豬呼吸道冠狀病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等的繼發(fā)或混合感染，使疫情變得復(fù)雜、病情加重，造成飼料、人工的巨大浪費(fèi)及藥物的無(wú)謂消耗，死亡率增高，由此引起的經(jīng)濟(jì)損失更無(wú)法估量(李海燕等，2002，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，第24卷，第I期，12-17)。SIV與其它病原體共感染或繼發(fā)感染所造成的損害，已成為制約豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益的主要原因之一。雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行流感病毒分離是流感病原檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。雞胚是流感病毒最為常用的一種培養(yǎng)基質(zhì)，常用它來(lái)分離流感病毒和制備疫苗。但用雞胚尿囊液分離或傳代流感病毒易引起抗原變異；大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)還存在雞胚數(shù)量不足和潛在外源病毒污染的問(wèn)題。一哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)制備疫苗具有無(wú)外源因子污染、易于規(guī)?；a(chǎn)、能較好的維持病毒抗原穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。鑒于此，本發(fā)明著手于利用細(xì)胞分離培養(yǎng)新型甲型HlNl流感病毒的，及新型甲型HlNl流感病毒在MDCK細(xì)胞上穩(wěn)定增殖。通過(guò)最佳感染劑量、最適TPCK胰酶濃度、最適培養(yǎng)液PH值等培養(yǎng)條件的優(yōu)化，確定最佳的新型甲型HlNl流感病毒增殖培養(yǎng)方法，為建立甲型流感疫苗生產(chǎn)新體系奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服 現(xiàn)有技術(shù)缺陷，從發(fā)生呼吸道疾病的某豬場(chǎng)中分離到一株HlNl亞型新的流感病毒。本發(fā)明的第二個(gè)目的是在MDCK細(xì)胞上大量增殖HlNl亞型新的流感病毒，為后續(xù)開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明從中國(guó)某地發(fā)生呼吸道疾病的某豬場(chǎng)中分離到一株HlNl亞型新的流感病毒，經(jīng)鑒定該病毒為A/swine/Nanchang/F9/2010 (HlNl)，簡(jiǎn)稱(chēng)甲型Hl亞型流感病毒。對(duì)該病毒本身包含的8個(gè)基因片段(Genbank登錄號(hào)為JF275925-JF275932)的全序列測(cè)定和遺傳進(jìn)化分析表明，本發(fā)明分離的該甲型Hl亞型流感病毒的8個(gè)基因片段與2009年4月報(bào)道的甲型HlNl流感病毒A/California/04/2009 (HlNl)的基因同源性高達(dá)99%。為了滿(mǎn)足專(zhuān)利上的充分公開(kāi)，申請(qǐng)人將上述分離得到的甲型Hl亞型流感病毒A-influ JML-F9，于2011年I月27日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為CCTCC N0:V201105。將上述甲型Hl亞型流感病毒在MDCK細(xì)胞上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，確定了其增殖培養(yǎng)的相關(guān)條件和方法，結(jié)果表明，本發(fā)明甲型Hl亞型流感病毒增殖的血凝效價(jià)平均達(dá)到71og2，最聞達(dá)到91og2。申請(qǐng)人:提供了一種甲型流感病毒的增殖方法，其步驟如下所述I)將疑似豬流感感染的氣管拭子樣品接種含有2 μ g/mL的TPCK-胰酶的細(xì)胞維持液分離病毒；2)對(duì)步驟I)判定的血凝陽(yáng)性樣品用Hl亞型豬流感的通用引物M684和甲型Hl流感的通用引物H1-292進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行流感病毒亞型鑒定，其步驟如下反轉(zhuǎn)錄用的引物Unil2的核苷酸序列(單鏈)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’ ；流感病毒cDNA的合成步驟如下在20 μ L反轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行，依次加入以下組分
AMV Reverse Transcriptase XL (50U/pL ) I .Ομ RNase inhibitor(40U/pL )0.5pL
5xRNA PCR Buffer4.0μ
Uni 12 prime(10pmol)r1.5pL
dNTPs (I Ommol)2\xL
RNA 模板Ι μ 將上述組分混勻后置PCR儀上于42°C下60min，95°C 5min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于PCR或4°C保存?zhèn)溆?；M-684和H1-292弓丨物核苷酸序列M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC ； M-684L AAGACGATCAAGAATCCACAA,擴(kuò)增得到的片段大小為 684bp ；
H 1-292U CATTAATGATAAAGG ；H1-292L :TCCAGCATTTCTTTC，擴(kuò)增得到的片段大小為 292bp ；PCR反應(yīng)體系在25 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，依次加入以下組分
Trans-Taq 聚合酶(2 U)0·5μ
IOxBuifer2.5pL
dNTP (2mmol)2μ
正向引物Ιμ
反向引物
cDNA3 μι
ddH2016μ PCR反應(yīng)參數(shù)M684 95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；Hl-292 95°C 5min ；94°C 30s, 42. 5°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18-T載體，選取陽(yáng)性病料克隆M684和H1-292測(cè)序，判定是否為甲型Hl流感；3)對(duì)甲型Hl流感病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序，其步驟如下以步驟2)所述的cDNA為模板，擴(kuò)增甲型Hl流感病毒8個(gè)基因，即PB2，PBl，PA，HA, NP, NA，M和NS，擴(kuò)增上述8個(gè)基因的特異引物的核苷酸序列如下擴(kuò)增PB2基因P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；擴(kuò)增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，，P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3’ ；擴(kuò)增PA基因 P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，，P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3’ ；擴(kuò)增HA基因P15，AGCAAAAGCAGGGG 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3，；擴(kuò)增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ；擴(kuò)增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25， AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3，；
擴(kuò)增M基因P15 ’ AGCAAAAGCAGGTAG 3 ’，P25， AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ；擴(kuò)增NS基因P15，GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ；按步驟2)的方法提取甲型Hl流感病毒RNA，合成甲型Hl流感病毒cDNA ；甲型Hl流感病毒cDNA的PCR擴(kuò)增
在PCR反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0 μ L，LA Taq DNA聚合酶(5U/μ L) O. 5 μ L，10XLA Taq DNA Buffer5 μ L, dNTPsMixture (各 2mM) 2· O μ L，各基因的正向引物和反向引物各2. O μ L，用ddH20調(diào)終體積至50 μ L，混勻后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增程序預(yù)變性95 V 5min,變性94 V 30sec,退火52 °C 30sec,延伸72°C 4min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后于72°C延伸lOmin。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD18_T載體，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將判定為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行測(cè)序；4)將甲型Hl亞型流感病毒10—1 10_3稀釋接種12孔板的MDCK細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，換上細(xì)胞維持液；5)將甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋接種12孔板的MDCK細(xì)胞，在細(xì)胞維持液分別加入終濃度為O 4 μ g/mL的TPCK胰酶；6)將甲型Hl亞型流感病毒10_3稀釋?zhuān)尤隩PCK胰酶使終濃度為2μ g/mL，接種于12孔板的MDCK細(xì)胞，然后分別加入pH值為7. O 8. O的細(xì)胞維持液，觀(guān)察細(xì)胞病變；7)將甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋?zhuān)尤隩PCK胰酶使終濃度為2 μ g/mL ;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為160cm2的SOOmL的細(xì)胞瓶進(jìn)行病毒增殖；8)將甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋?zhuān)尤隩PCK胰酶使終濃度為2 μ g/mL;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為2350cm2的IOL的轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行病毒增殖；其中步驟I)和4)所述的細(xì)胞維持液配方如下取商購(gòu)的DMEM粉劑(購(gòu)自武漢佰歐樂(lè)基生物科技有限公司)一小包，再取HEPES，F(xiàn)REEACID 4. Hg, NaHC037. 4g，溶于ddH20中，待完全溶解后用ddH20定容至1L，再用2M的NaOH調(diào)溶液的pH至7. 4，無(wú)菌過(guò)濾后儲(chǔ)存于4°C條件下備用；其中步驟4)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液配方如下在細(xì)胞維持液中加入按V/V計(jì)10%的滅活新生牛血清；其中步驟5)所述的細(xì)胞維持液的配方如下將TPCK胰酶粉劑配制成100 μ g/mL的母液，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾備用；其中終濃度為O μ g/mL TPCK濃度的維持液=IOOmL維持液中不加入TPCK胰酶母液；終濃度為O. 5 μ g/mL TPCK濃度的維持液100mL維持液中加入50 μ L的TPCK胰酶母液；終濃度為I μ g/mL TPCK濃度的維持液IOOmL維持液中加入100 μ L的TPCK胰酶母液；終濃度為2 μ g/mL TPCK濃度的維持液IOOmL維持液中加入200 μ L的TPCK胰酶母液；終濃度為4 μ g/mL TPCK濃度的維持液IOOmL維持液中加入400 μ L的TPCK胰酶母液；其中步驟5)所述的細(xì)胞維持液的配比如下pH值為7. O的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 0，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾備用；pH值為7. 2的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 2，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾備用；pH值為7. 4的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 4，用孔徑為 O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾備用；pH值為7. 6的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 6，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾備用；pH值為7. 8的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至7. 8，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾備用；pH值為8. O的維持液的配方100mL維持液用2M NaOH調(diào)pH值至8. 0，用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過(guò)濾備用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)用細(xì)胞系代替雞胚組織培養(yǎng)制造流感病毒，可解決雞胚自身及所受外源病毒污染的問(wèn)題，通過(guò)原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制，保證生產(chǎn)出來(lái)的病毒的純凈性。本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，不會(huì)受制于原料供應(yīng)，而且生產(chǎn)周期短，每個(gè)生產(chǎn)周期僅需4天，相比雞胚培養(yǎng)法的13天以上大大縮短。應(yīng)用轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行病毒增殖，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，易操作、產(chǎn)量大占用地小、無(wú)需反復(fù)照胚，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。應(yīng)用本方法生產(chǎn)的的病毒液，環(huán)境污染少且易于處理。而現(xiàn)有的雞胚生產(chǎn)法會(huì)產(chǎn)生的大量廢胚等廢物，且處理難度大，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問(wèn)題。本發(fā)明的實(shí)施案例中，申請(qǐng)人提供了這種新型甲型HlNl流感病毒的分離培養(yǎng)方法，及全基因組測(cè)序過(guò)程。并描述了該毒株在MDCK細(xì)胞上各種條件的優(yōu)化過(guò)程。更詳細(xì)的技術(shù)方案如《具體實(shí)施方式
》所述。


SEQIDNO 1是擴(kuò)增的HA基因片段，序列長(zhǎng)度為1780bp。SEQIDNO 2是擴(kuò)增的M基因片段，序列長(zhǎng)度為1028bp。SEQIDNO 3是擴(kuò)增的NA基因片段，序列長(zhǎng)度為1459bp。SEQIDNO 4是擴(kuò)增的NP基因片段，序列長(zhǎng)度為1566bp。SEQIDNO 5是擴(kuò)增的NS基因片段，序列長(zhǎng)度為890bp。SEQIDNO 6是擴(kuò)增的PA基因片段，序列長(zhǎng)度為2234bp。SEQIDNO 7是擴(kuò)增的PBl基因片段，序列長(zhǎng)度為2342bp。SEQIDNO 8是擴(kuò)增的PB2基因片段，序列長(zhǎng)度為2341bp。圖I:是甲型Hl亞型流感病毒接種MDCK細(xì)胞后，使細(xì)胞聚集，部分脫落，并出現(xiàn)拉網(wǎng)的現(xiàn)象(見(jiàn)圖Ib :出現(xiàn)病變細(xì)胞，且不整齊)和一個(gè)未接種前述病毒的MDCK細(xì)胞對(duì)照(見(jiàn)圖la，細(xì)胞正常)。圖2 :是本發(fā)明通過(guò)中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心公布的M684(H1亞型豬流感的通用引物)和Hl-292(新型甲型Hl流感的通用引物)為引物，進(jìn)行流感病毒亞型鑒定的結(jié)
果O圖3 :是本發(fā)明通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增甲型Hl亞型流感病毒的8個(gè)基因片段，O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道 2-9 分別為 PB22341bp，PB12342bp，PA 2234bp, HA 1780bp, NP1566bp, NA 1459bp, M 1028bp, NS 890bp。圖4 :甲型Hl亞型流感病毒HA、NA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)。圖4a HA基因；圖4b NA基因。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :新型甲型HlNl流感病毒的分離鑒定樣品的采集采集中國(guó)江西省某豬場(chǎng)疑似豬流感感染的病豬的氣管棉拭子，將采樣后的棉拭子置于含100U/mL的青、鏈霉素滅菌生理鹽水中。采集樣本立即置2 8°C保存，并在24h內(nèi)送檢，長(zhǎng)期保存放_(tái)70°C。病毒分離與鑒定80%成片細(xì)胞的準(zhǔn)備，用40倍鏡觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞，輕輕倒出細(xì)胞生長(zhǎng)液，用滅菌生理鹽水分別清洗細(xì)胞2次，以清除細(xì)胞表面的新生牛血清。加入含有2 μ g/mL的TPCK-胰酶的細(xì)胞維持液。細(xì)胞培養(yǎng)孔的接種，標(biāo)本在送檢后的24h內(nèi)用MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。用無(wú)菌帶濾膜的槍頭吸取200 μ I的臨床樣品置于細(xì)胞培養(yǎng)孔中，放置于37°C含5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀(guān)察細(xì)胞病變情況。(細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落。)在24h內(nèi)出現(xiàn)的CPE很可能是標(biāo)本中的非特異性成分導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。取100 μ I陽(yáng)性分離物傳2代，繼續(xù)觀(guān)察。細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲，當(dāng)75%以上的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)進(jìn)行收獲，沒(méi)有細(xì)胞病變的于第7天收獲并進(jìn)行盲傳，收獲之前將細(xì)胞凍融2次。用I %的雞紅細(xì)胞進(jìn)行初步的鑒定。血凝陽(yáng)性培養(yǎng)液進(jìn)行RT-PCR鑒定，RNA的提取參照Invitrogen公司Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以流感反轉(zhuǎn)通用引物U12合成cDNA后，可以通過(guò)中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心公布的Μ684(Η1亞型豬流感的通用引物)和Hl-292(甲型Hl流感的通用引物)為引物，進(jìn)行流感病毒亞型鑒定。血凝試驗(yàn)(HA)在96孔V型反應(yīng)板上，每孔加入25 μ I O. OlM pH7. 2PBS，吸取25 μ I待檢病毒液于第I孔內(nèi)，充分混均后吸25 μ I于第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，棄去25 μ I ;第12孔作為O. OlM pH7. 2PBS對(duì)照孔。然后每孔加入I %雞紅細(xì)胞懸液25 μ 1，在微量振蕩器上搖勻，室溫靜置30min后觀(guān)察結(jié)果。在O. OlM pH7. 2PBS對(duì)照孔不發(fā)生紅細(xì)胞凝集的條件下，即可進(jìn)行對(duì)試驗(yàn)組的結(jié)果判讀。待檢病毒的血凝價(jià)為紅細(xì)胞發(fā)生100%凝集的最高病毒稀釋倍數(shù)。
++++ :凝集的紅細(xì)胞呈薄膜狀均勻覆蓋孔底，強(qiáng)烈凝集時(shí)則皺縮成團(tuán)；+++ :凝集的紅細(xì)胞比較均勻覆蓋孔底，有非常少紅細(xì)胞沉降；++:凝集的紅細(xì)胞覆蓋孔底,但中央有少量紅細(xì)胞沉降成小圓點(diǎn)；+ :紅細(xì)胞沉于孔底中央，但周?chē)杂猩⒃诘募t細(xì)胞凝集；-:紅細(xì)胞全部沉于孔底中央，周?chē)鸁o(wú)散在的紅細(xì)胞凝集。病毒RNA的提取I)在I. 5mL的印pendorf管中加入反復(fù)凍融的病毒培養(yǎng)物500ul，再加入TRIzolLS 500ul，充分混勻，室溫放置lOmin。2)加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管(溶液充分乳化，成乳白狀，無(wú)分相現(xiàn)象)，室溫放置IOmin (由于氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)離心管可能爆開(kāi)，小心)。3)離心4°C、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管(切忌吸動(dòng)白色中間相)。4)加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置lOmin。5)離心4°C、13000r/min、15min,用槍小心吸去所有上清。6) ImL 75%乙醇洗一遍,離心4°C、8000r/min、lOmin,用槍小心吸去所有上清,在超凈臺(tái)中干燥5min。7)加入適量25ul DEPC處理水。立即做RT。病毒cDNA的合成
在20 μ L反轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行，依次加入以下組分
AMV Reverse Transcriptase XL (50U/pL ) I _0pL RNase inhibitor(40U/pL )0.5μ￡
5xRNA PCR Buffer4.0μ
Uni 12 prime(10pmol)rΙ·5μΙ>
dNTPs (I Ommol)2\\L
RNA 模板IlpL混勻后置PCR儀42°C 60min,95°C 5min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于PCR或4°C保存?zhèn)溆谩-684和H1-292弓丨物序列上游引物M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC下游引物M-684L AAGACGATCAAGAATCCACAA 預(yù)期片段大小為 684bp上游引物H1-292U CATTAATGATAAAGG下游引物H1-292L TCCAGCATTTCTTTC預(yù)期片段大小為292bpPCR反應(yīng)體系在25 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行，依次加入以下組分Trans-Taq 聚合酶(2 U) 0.5 μ L IOXBuffer2.5 μ L
dNTP (2mmol)2uL
上游引物IuL
下游引物IwL
cDNA3 μ L
ddH2016 U LPCR 反應(yīng)參數(shù)95 °C 5min ；94°C 30s，55°C 30s (Hl-292 退火溫度42. 5 °C 30s)，72°C lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18_T載體，選取陽(yáng)性病 料克隆M684和(或)H1-292送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，以進(jìn)一步鑒定。PCR產(chǎn)物回收采用上海生工生物工程技術(shù)有限公司的UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA片段，按照UNIQ-IO柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行，具體操作如下I)用O. 8%的瓊脂糖膠電泳，使目的DNA片段與其它DNA盡可能分開(kāi)，在長(zhǎng)波紫外燈下，用在酒精燈火焰上燒過(guò)的手術(shù)刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂塊，放入I. 5mL滅菌
離心管中。2)按每 IOOmg 瓊脂糖膠加入 400 μ L Binding Buffer,置 50_60°C水浴中 lOmin,使瓊脂糖凝膠徹底融化(加熱溶膠時(shí)，每2min混勻一次)。3)將UNIQ-IO柱放入收集管中，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到UNIQ-IO柱中，室溫靜置2min,室溫 8000rpm 離心 lmin。4)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一個(gè)收集管中，力口A 500 μ L WashSolution,室溫 8000rpm 離心 lmin。5)重復(fù)步驟4，取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一個(gè)收集管中，室溫12000rpm離心15sec。6)將UNIQ-IO柱放入一個(gè)滅菌的I. 5mL離心管中，根據(jù)PCR產(chǎn)物量的相對(duì)多少，在柱子底部的膜中央加10-20 μ L Elution Buffer或ddH20，室溫或37°C放置2min室溫12000rpm離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于_20°C備用。PCR產(chǎn)物的克隆用TaKaRa公司的PCR產(chǎn)物克隆試劑盒進(jìn)行，取4μ L PCR回收產(chǎn)物(經(jīng)O. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定過(guò)有目的片段存在)，1μ L載體DNA(PMDlS-T)JyL Ligation SlutionI，16 °C反應(yīng)過(guò)夜。連接pMD18-T 載體連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取感受態(tài)細(xì)胞DH5a 100μ I加入到I. 5mL EP管中，將連接后的以pMD18_T為載體的重組質(zhì)粒10 μ I加入并混勻。置冰上30min后，42°C熱激90sec，冰浴3min_5min。加Λ 400 μ I LB,于37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)45min使其復(fù)蘇。復(fù)蘇后的重組大腸桿菌懸液于40C 5000rpm離心lOmin，棄去400 μ I上清，用剩余的100 μ I重懸沉淀涂布于含有25 μ g/mL Amp的LB瓊脂平板。37°C增殖lh，再將平板翻過(guò)來(lái)，倒置37°C培養(yǎng)14h_16h至菌落出現(xiàn)。分別挑取5個(gè)單菌落用H1-292的引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定的陽(yáng)性結(jié)果可以送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果分析江西省的拭子樣品接種MDCK細(xì)胞后第一代就觀(guān)察到明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞間隙增寬，拉成網(wǎng)狀，并有部分細(xì)胞脫落。(如圖1，圖Ia為正常的MDCK細(xì)胞，圖Ib為接毒后的MDCK細(xì)胞。)進(jìn)行血凝檢測(cè)HA效價(jià)達(dá)到23，進(jìn)行第二次傳代HA效價(jià)達(dá)到26。對(duì)第二次傳代的樣品進(jìn)行RT-PCR鑒定，M684(如圖2a)和Hl_292(如圖2b)均擴(kuò)增出陽(yáng)性目的條帶。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性樣品送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示甲型Hl亞型流感病毒同A/California/04/2009 (HlNl)有99%的同源性。說(shuō)明中國(guó)豬群中已經(jīng)存在新型北美流行株豬流感病毒。實(shí)施例2 :新型甲型HlNl流感病毒的全基因組測(cè)序
對(duì)甲型Hl流感病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序，其步驟如下以步驟2)所述的cDNA為模板，擴(kuò)增甲型Hl流感病毒8個(gè)基因序列全長(zhǎng)，即HA，M，NA，NP, NS, PA，PBl和PB2，和擴(kuò)增得到如序列表SEQ ID NO :1_8所示的核苷酸序列(其序列如(Genbank登錄號(hào)為JF275925-JF275932相對(duì)應(yīng)))，擴(kuò)增上述8個(gè)基因的特異引物的核苷酸序列如下所示擴(kuò)增HA基因P15，AGCAAAAGCAGGGG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’ ；擴(kuò)增M基因P15，AGCAAAAGCAGGTAG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ；擴(kuò)增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25’ AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’ ；擴(kuò)增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ；擴(kuò)增NS基因P15，GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25， AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3，；擴(kuò)增PA基因P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，，P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3，；擴(kuò)增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，，P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3，；擴(kuò)增PB2基因
P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；甲型Hl流感病毒RNA的提取，其病毒的cDNA的合成，同實(shí)施案例I所述。甲型Hl流感病毒cDNA的PCR擴(kuò)增在PCR反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2. Oii L，LA Taq DNA聚合酶(5U/ii L) 0. 5 ii L，10XLA Taq DNA Buffer5 u L, dNTPs Mixture (各 2mM) 2. 0 y L，各基因的上下游引物各2. OuL,最后用ddH20將終體積調(diào)至50 u L，混勻后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95°C 5min，變性94°C 30sec，退火52°C 30sec，延伸72°C 4min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后于72°C延伸lOmin。同時(shí)設(shè)未加模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物各取5 y L，在0. 8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，剩余置4°C保存?zhèn)溆谩?duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性樣品送 上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。同實(shí)施案例I。將測(cè)得的HA和NA基因序列經(jīng)過(guò)DNAStar軟件包中的SeqMan校對(duì)正確后，經(jīng)Blast比較，從Genbank選取具有代表性毒株以及核苷酸同源性高的毒株序列，應(yīng)用ClustalX繪制HA和NA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和進(jìn)行遺傳分析。因?yàn)镠A和NA蛋白是穿過(guò)雙層脂膜突出在病毒表面，形成流感病毒的主要抗原，在誘導(dǎo)宿主動(dòng)物的抗體反應(yīng)中具有非常重要的作用。HA、NA 二者在免疫壓力下保持高度的變異性，而NP、M等內(nèi)部蛋白則具有較強(qiáng)的保守性。結(jié)果分析本實(shí)施例成功擴(kuò)增了甲型Hl亞型流感病毒的8個(gè)基因片段，8個(gè)片段的0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳圖(如圖3，泳道2-9分別為PB22341bp, PB12341bp, PA 2233bp, HA1778bp, NP 1556bp, NA 1413bp, M 1027bp, NS 890bp)所示。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，從豬病料中分離的甲型Hl亞型流感病毒的HA(如圖4a)和NA (如圖4b)基因同A/California/04/2009 (HlNl)處于同一進(jìn)化分支；HA基因與中國(guó)報(bào)道的A/swine/Guangxi/13/2006 (H1N2)進(jìn)化關(guān)系較近，NA基因同A/swine/Zhejiang/1/2007 (HlNl)進(jìn)化關(guān)系較近，與 A/swine/Tianjin/01/04 (HlNl)、A/swine/Henan/01/06 (HlNl)處于不同進(jìn)化分支。實(shí)施案例3不同感染劑量對(duì)甲型Hl亞型流感病毒在MDCK細(xì)胞中增殖的影響I)在12孔板中進(jìn)行不同感染劑量的甲型Hl亞型流感病毒在MDCK細(xì)胞中的增殖試驗(yàn)，取長(zhǎng)滿(mǎn)MDCK細(xì)胞的12孔板(每孔直徑2. 2cm，表面積為3. 8cm2)，細(xì)胞密度約為2 X IO5個(gè)/cm2，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗3次，以除去殘留的培養(yǎng)基。甲型Hl亞型流感病毒粒子濃度約為 I X 107PFU/mLo 按病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplication of Infection, MOI)MOI =(0. 3,0. 03,0. 003)分別接種MDCK細(xì)胞，相當(dāng)于HA效價(jià)為81og2病毒原液稀釋到10-1，10_2，10_3每孔250 u L，每個(gè)劑量接3個(gè)孔，在CO2培養(yǎng)箱中37°C條件下吸附I. 5h，棄去病毒液，加入維持液(含2 ii g/mL的TPCK胰酶，不含血清的DMEM培養(yǎng)基，加入青霉素終濃度IO2IU/ml、鏈霉素終濃度IO2il g/mL) ImL,同時(shí)留I孔不接毒只換維持液做空白對(duì)照。觀(guān)察接毒后細(xì)胞病變情況，在接毒后每12h收取12孔板中每個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清60 u L，放在4°C冰箱保存。直至接毒孔的細(xì)胞全部脫落為止。按照(同實(shí)施例I中血凝試驗(yàn))檢測(cè)各時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)上消的血凝價(jià)。結(jié)果分析
接種不同MOI病毒對(duì)病毒HA效價(jià)的影響，當(dāng)接種病毒的MOI為0. 3，0. 03，0. 003時(shí)，相當(dāng)于HA效價(jià)為81og2病毒原液稀釋到10—1，10_2，10_3，在MDCK細(xì)胞中均可大量增殖病毒，HA效價(jià)最高值可達(dá)29。當(dāng)MOI = 0. 3時(shí)，病毒HA效價(jià)最高只能達(dá)到27，而在MOI =0. 03 (HA效價(jià)為81og2病毒原液稀釋到10_2)和MOI = 0. 003 (HA效價(jià)為81og2病毒原液稀釋到10_3)時(shí)，HA效價(jià)最高值均可達(dá)29。而且MOI = 0. 003 (HA效價(jià)為81og2病毒原液稀釋到10_3)時(shí)細(xì)胞上清保持HA效價(jià)為29的時(shí)間較長(zhǎng)，因此選擇MOI = 0. 003 (HA效價(jià)為81og2病毒原液稀釋到10_3)作為之后試驗(yàn)的病毒感染劑量，相當(dāng)于病毒原液稀釋成10_3進(jìn)行接種。表I接種不同MOI病毒后病毒HA滴度(Iog2)
權(quán)利要求
1.一種增殖甲型流感病毒的方法，其步驟包括 1)將疑似豬流感感染的氣管拭子樣品接種含有2ii g/mL的TPCK-胰酶的細(xì)胞維持液分離病毒并進(jìn)行判定； 2)對(duì)步驟I)判定的血凝陽(yáng)性樣品用Hl亞型豬流感的通用引物M684和甲型Hl流感的通用引物H1-292進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行流感病毒亞型鑒定，其步驟如下 反轉(zhuǎn)錄用的引物Unil2 :其核苷酸序列(單鏈)如下5’ -AGCAAAAGCAGG-3’ ； 流感病毒cDNA合成 在20ii L反轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行，依次加入以下組分 AMV Reverse Transcriptase XL (50U/|iL ) I .O^iLRNase inhibitor(40U/|iL )0.5|iL5xRNA PCR Buffer4.0|aLUni12 prime(10pmol)r1.5[iLdNTPs (I Ommol)2juLRNA 模板IlpL 將上述組分混勻后置PCR儀中，42°C 60min,95°C 5min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于PCR反應(yīng)；其中PCR反應(yīng)的引物序列如下M-684 和 H1-292M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC ； M-684L :AAGACGATCAAGAATCCACAA，擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度為 684bp ；H1-292U CATTAATGATAAAGG ； H1-292L :TCCAGCATTTCTTTC，擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度為292bp ； PCR反應(yīng)體系 在25 y L反應(yīng)體系中進(jìn)行，依次加入以下組分Trans-Taq 聚合酶(2 U) 0.5^iLIOxBuffer2.5(iLdNTP (2mmol)2|xL上游引物IHL下游引物IpLcDNA3 ^iLddH2016^L PCR反應(yīng)參數(shù) M684 95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；Hl-292 95°C 5min ；94°C 30s, 42. 5°C 30s, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ； 將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18-T載體，選取陽(yáng)性病料克隆M684和H1-292測(cè)序，判定是否為甲型Hl流感病毒； 3)對(duì)甲型Hl流感病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序，其步驟如下 以步驟2)所述的cDNA為模板，擴(kuò)增甲型Hl流感病毒8個(gè)基因HA，M，NA, NP, NS, PA，PBl和PB2，得到如序列表SEQ ID NO :1_8所示的核苷酸序列，其中擴(kuò)增上述8個(gè)基因的特異引物的核苷酸序列如下所示 擴(kuò)增HA基因 P15，AGCAAAAGCAGGGG 3'P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ； 擴(kuò)增M基因P15，AGCAAAAGCAGGTAG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’ ； 擴(kuò)增NA基因P15，AGCAAAAGCAGGAGT 3，P25’ AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’ ； 擴(kuò)增NP基因P15，AGCAAAAGCAGGGTA 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’ ； 擴(kuò)增NS基因P15， GCAAAAGCAGGGTG 3，，P25’ AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’ ； 擴(kuò)增PA基因P15，AGCAAAAGCAGGTAC 3，， P25，AGTAGAAACAAGGTACTT 3，； 擴(kuò)增PBl基因P15，AGCAAAAGCAGGCA 3，， P25，AGTAGAAACAAGGCATTT 3，； 擴(kuò)增PB2基因P15，AGCAAAAGCAGGTC 3，，P25， AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3，；按步驟2)的方法提取甲型Hl流感病毒RNA，合成甲型Hl流感病毒cDNA ； 甲型Hl流感病毒cDNA的PCR擴(kuò)增 在PCR反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2. Oii L，LA TaqDNA聚合酶(5U/u L) 0. 5 u L, 10 X LATaq DNA Buffer5 u L, dNTPs Mixture (各2mM) 2. 0 y L，上述8個(gè)基因的正向引物和反向引物各2. 0 ii L，用ddH20調(diào)終體積至50 u L，混勻后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增； PCR 擴(kuò)增程序預(yù)變性 95 0C 5min，變性 94°C 30sec，退火 52 °C 30sec，延伸 72 °C 4min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)后于72°C延伸lOmin。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD18_T載體，轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將判定為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行測(cè)序； 4)將HA效價(jià)為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10—1 10_3稀釋?zhuān)臃N12孔板的MDCK細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，換上細(xì)胞維持液； 5)將HA效價(jià)為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋?zhuān)臃N12孔板的MDCK細(xì)胞，在細(xì)胞維持液分別加入終濃度為O 4 ii g/mL的TPCK胰酶；6)將HA效價(jià)為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋?zhuān)尤隩PCK胰酶使終濃度為2 U g/mL,接種于12孔板的MDCK細(xì)胞，然后分別加入pH為7. O 8. O的細(xì)胞維持液，觀(guān)察細(xì)胞病變； 7)將HA效價(jià)為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋?zhuān)尤隩PCK胰酶使終濃度為2 u g/mL ;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為160cm2的800mL的細(xì)胞瓶進(jìn)行甲型Hl亞型病毒增殖；8)將HA效價(jià)為81og2的甲型Hl亞型流感病毒以10_3稀釋?zhuān)尤隩PCK胰酶使終濃度為2 u g/mL ;在pH = 7. 6的條件下，用表面積為2350cm2的IOL的轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行甲型Hl亞型病毒增殖； 其中步驟I)和4)所述的細(xì)胞維持液配方如下 先取 DMEM 粉劑一小包，再取 HEPES，F(xiàn)REE ACID 4. 77g，NaHC037. 4g，溶于 ddH20 中，待完全溶解后再用ddH20定容至1L，最后用2M的NaOH調(diào)溶液的pH至7. 4，無(wú)菌過(guò)濾后儲(chǔ)存于4°C條件下備用； 其中步驟4)所述的細(xì)胞生長(zhǎng)液配方如下 在細(xì)胞維持液中按V/V計(jì)加入10%的滅活新生牛血清。
2.適用于權(quán)利要求I所述方法的專(zhuān)用菌株，其特征在于，所述的專(zhuān)用菌株是甲型Hl亞型流感病毒A-influJML-F9，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCCNO V201105o
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甲型H1流感病毒的分離鑒定及該病毒在MDCK細(xì)胞上穩(wěn)定增殖的方法。本發(fā)明通過(guò)分離鑒定得到一株甲型H1流感病毒A-Influ/JML-F9，其保藏編號(hào)為CCTCC NOV201105。通過(guò)優(yōu)選方法、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件將該甲型H1流感病毒在MDCK細(xì)胞上的穩(wěn)定增殖，大規(guī)模增殖該病毒的平均血凝效價(jià)達(dá)到7log2，其最高血凝效價(jià)達(dá)到9log2。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102796708SQ20111013724
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者金梅林, 楊影, 陳煥春, 徐高原, 李國(guó)紅, 郭學(xué)波, 張安定, 周紅波, 陳章表 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司