專利名稱：雙重聚合酶鏈反應方法檢測海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境科學水體病原微生物檢測領域，是應用聚合酶鏈式反應(全稱Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)技術,將微量目的DNA片段擴增,快速檢測水樣中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，評價并預警海洋環(huán)境這兩種致病菌的污染情況。
背景技術：
創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是一種革蘭氏陰性弧菌，能通過傷口、飲食不衛(wèi)生的海產品而感染人體，導致腹瀉嘔吐、心動過速、肌炎、肌肉壞死，引發(fā)敗血癥，甚至危及生命。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),又稱嗜鹽菌,也是革蘭氏陰性菌,能分泌制熱性溶血素以及類似溶血毒，具有溶血活性、腸毒素和致死作用，能引起人類腹痛腹 瀉、嘔吐、胃黏膜炎，甚至內臟淤血。2003年和2005年，據我國食源性疾病爆發(fā)的監(jiān)測資料分析，微生物性食源疾病爆發(fā)中，均以副溶血弧菌引起的疾病暴發(fā)為首，分別為21.0%和40. 1%。這兩種致病菌在海洋中均廣泛分布，許多海產品中也含有這兩種病原微生物，威脅人類的生命健康安全。用常規(guī)的生物學方法對樣品進行檢測，比較費時費力，一般需要5-7天。隨著PCR(聚合酶鏈反應)技術的發(fā)展，因其操作簡便、特異性強、靈敏度高的特性，已有學者進行了將PCR技術應用于樣品檢測方面的研究，以期達到快速、準確地檢測病原微生物。雙重PCR在常規(guī)PCR基礎上，向同一反應體系中加入兩對引物，同時擴增出兩段DNA片段，這樣更加節(jié)省了時間和成本。因此建立雙重PCR方法快速檢測海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌具有重要的實際意義和應用價值，適于推廣。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠準確快速地檢測海水樣品中創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的檢測方法。雙重PCR的關鍵是針對兩種細菌的保守序列設計兩對退火溫度相同的引物，檢測時間只需6-8個小時。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的I、用于雙重PCR的兩對引物核苷酸序列如下Vv-F ATGTTTATGGTGAGAACGGTVv-R GGGGTTACTTGAACATTACGVp-F AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTGVp-R GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC2、DNA模板的準備將創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌分別接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩18小時(創(chuàng)傷弧菌于28°C，副溶血弧菌于37°C )，所得的菌液用已過濾的無菌海水稀釋一定的倍數，用試劑盒提取兩種細菌的基因組DNA。
3、雙重PCR反應(I)反應的液體總體積為25 μ 1，體系組成如下
權利要求
1.雙重聚合酶鏈反應方法檢測海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，其特征在于將這兩種致病菌的引物加入到同一體系中，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的 1)、用于雙重PCR的兩對引物核苷酸序列如下Vv-F ATGTTTATGGTGAGAACGGTVv-R GGGGTTACTTGAACATTACG Vp-F AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTGVp-R GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC 2)、DNA模板的準備 將創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌分別接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩18小時(創(chuàng)傷弧菌于28°C，副溶血弧菌于37°C )，所得的菌液用已過濾的無菌海水稀釋一定的倍數，用試劑盒提取兩種細菌的基因組DNA。
3)、雙重PCR反應 (1)反應的液體總體積為25μ 1，體系組成如下
2.權利要求I所述的雙重聚合酶鏈反應方法檢測海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，可用于檢測海水樣品以及其他水樣中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌。
全文摘要
雙重聚合酶鏈反應方法檢測海水樣品中的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，屬于環(huán)境科學水體病原微生物檢測領域。根據創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的保守序列，設計兩對退火溫度基本相同的引物。將兩對引物和兩種細菌的DNA模板加入到同一個反應體系中，經過幾十次變性、退火、延伸的循環(huán)，使目的基因擴增幾十甚至幾百萬倍，即可很容易檢測到目的基因的存在，從而同時檢測水樣中是否存在創(chuàng)傷弧菌或副溶血弧菌。相比于傳統(tǒng)方法，本發(fā)明特異性強、靈敏度高，且操作簡便快捷，又節(jié)省時間人力和成本。除此之外，本發(fā)明檢測的兩種細菌都是海洋中十分常見的病原微生物，使這項技術具有實際意義和應用價值，適于推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102732599SQ201110090819
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權日2011年4月12日
發(fā)明者明紅霞, 朱琳, 王林同, 王軻 申請人:南開大學