專利名稱：用脂肪酶水解酯鍵的制作方法
用脂肪酶水解酯鍵本申請是申請日為2005年10月05日，申請?zhí)枮?00580034405. 6 (國際申請?zhí)枮?PCT/DK2005/000639)，名稱為“用脂肪酶水解酯鍵”的發(fā)明專利申請的分案申請。發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及用脂肪酶處理而水解底物中的酯鍵的方法。還涉及用于所述方法的脂肪酶和編碼所述脂肪酶的多核苷酸。
背景技術(shù)：
菌株熱硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)DSM 7021、布氏嗜熱厭氧桿菌布氏亞種(Thermoanaerobacter brockii subsp. brockii)DSM 1457 禾口 Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis DSM15242 是公眾可獲得的。Thernoanaerobacter tengcongensis 的全部基因組序歹Ij己經(jīng)公開(Bao et al., Genome Res. 12，689-700，2002 (GenBank AE008691))。SWALL :Q8R921 顯示 258 個氨基酸的序列，描述為〃 hydrolases of the alpha/beta superfamily ( α / β 超家族的水解酶)〃 (ΑΑΜ25001. 1)。發(fā)明概述發(fā)明人已鑒定了厭氧嗜熱細(xì)菌中具有脂肪酶活性的多肽。因此，本發(fā)明提供水解底物中的酯鍵的方法，包括用脂肪酶(具有脂肪酶活性的多肽)處理所述底物。本發(fā)明還提供用于所述方法的脂肪酶和編碼所述脂肪酶的多核苷酸。所述多肽可以具有序列SEQ ID Ν0:2或4，或者與其中之一具有高度同一性 (identity)，或者可以通過取代、缺失、和/或插入一個或多個氨基酸而從其中之一獲得。所述多核苷酸可以具有序列SEQ ID NO :1或3，或者與其中之一具有高度同一性或者可以與其中之一雜交，或者可以是存在于菌株DSM 702UDSM 1457、或DSM 15242中的基因組的一部分，其可以用引物對LipCtTb-For LipCtTb-Rev(SEQ ID NO :5_6)或用引物對 LipTtg-for 和 LipTtg-rev(SEQ ID NO 7-8)擴增。本發(fā)明具體涉及如下方面1.水解底物中酯鍵的方法，其包括用脂肪酶處理所述底物，所述脂肪酶a)具有與SEQ ID NO :2或4具有至少70%同一性的氨基酸序列；b)由中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1或3的互補鏈雜交的核酸序列所編碼；c)具有能夠自SEQ ID NO :2或4通過取代、缺失、和/或插入一個或多個氨基酸而獲得的氨基酸序列；或者d)由存在于菌株DSM 7021、DSM 1457、或DSM 15242中的基因組的脂肪酶編碼部分編碼，并且能夠用SEQ ID NO :5和6或用SEQ ID NO :7和8擴增。2.項1的方法，其中所述酯鍵是仲醇酯鍵，特別是甘油三酯2-位的鍵。3.脂肪酶，其a)具有與SEQ ID NO 2具有至少90%同一性的氨基酸序列；
b)由中等或高嚴(yán)緊條件下與核酸序列SEQ ID NO :1的互補鏈雜交的核酸序列所編碼；c)具有能夠自SEQ ID NO 2通過取代、缺失、和/或插入一個或多個氨基酸而獲得的氨基酸序列；或者d)由存在于菌株DSM 7021或DSM 1457中基因組的脂肪酶編碼部分所編碼，并且能夠用SEQ ID NO :5和6擴增。4.編碼前述項的脂肪酶的多核苷酸。5.包含選自下組序列的多核苷酸a)編碼脂肪酶并與之具有至少90%同一性的多核苷酸；b)編碼脂肪酶并在高嚴(yán)緊條件下與核苷酸SEQ ID NO=I的互補鏈雜交的多核苷酸；c)存在于菌株DSM 7021或DSM 1457中的基因組的脂肪酶編碼部分，其能夠用SEQ ID NO 5和6擴增，或者d) a)、b)或c)的多核苷酸的互補鏈。6.生產(chǎn)多肽的方法，包括a)獲得編碼多肽的多核苷酸，所述多肽具有來自厭氧細(xì)菌的脂肪酶的活性；b)用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬細(xì)胞；c)在有助于生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和d)回收所述多肽。發(fā)明詳述基因組DNA來源編碼脂肪酶的DNA序列可以從CaldanaercAacter、熱厭氧桿菌屬 (Thermoanaerobacter)、熱厭氧菌屬(Thermoanaerobium)或梭菌屬(Clostridium)的厭氧嗜熱菌株分離。因此，序列表中所示DNA序列和多肽從以下所述生物體分離。如以下所指出的，從兩種生物體獲得了相同的序列。
系統(tǒng)分類基原異名(Basonym)保藏號DNA序列多月太序列熱石充化氫熱厭氧桿菌熱石▲化氫梭菌(Cbstridium thermo- hydrosiilfiiriciim)DSM 7021SEQID NO: 1SEQID NO: 2布氏嗜熱厭氧桿菌布氏亞種布氏嗜熱反氧細(xì)菌 ( hermoanaerobium brockii)DSM 1457SEQID NO: 1SEQID NO: 2Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensisThermoanaerobacter tengcongensisDSM 15242SEQID NO: 3SEQID NO: 4所述菌株商業(yè)上可由德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg lb,38124 Braunschweig,德國獲得。序列同一性
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本發(fā)明的多肽和多核苷酸與SEQ ID NO :1-4中任一個可以具有70%以上、80%以上、90 %以上或95 %以上的同一性?？梢匀鏤S 6162628所述完成兩個序列的比對和氨基酸或核苷酸同一性的計算。脂肪酶特性脂肪酶對大量酯，特別是水不溶性底物包括三?；视?甘油三酯)和對硝基苯基棕櫚酸酯是活性的。脂肪酶對甘油三酯中的2-位酯鍵顯示異乎尋常的偏好。脂肪酶是S-對映體選擇性(anantioselective)的，將消旋酯形成( -醇。工業(yè)用途脂肪酶可以用作洗滌劑的添加劑，如WO 2002062973所述。脂肪酶可用于從甘油三酯和甘油生產(chǎn)甘油二酯。脂肪酶可通過水解消旋酯混合物，用于對映體選擇性酯水解。一個例子是 (S) - (-) -3- 丁炔-2-醇((S) - (-) -3-butyn-2-ol)，其可用作藥物中間體?？赏ㄟ^將脂肪酶添加到生面團用于烘烤制備基于生面團的產(chǎn)品，特別是焙烤產(chǎn)品，如 WO 9826057, WO 0032758、WO 2003100044、WO 2004064537 或丹麥專利申請 PA 200301762 中所述。脂肪酶可用于甘油三酯的酯交換，如WO 9522606或WO 9933964所述。脂肪酶可用于酯合成例如生物柴油(biodiesel)的生產(chǎn)。脂肪酶可用于聚合反應(yīng)例如二酸和二醇的縮合。
實施例實施例1 完整脂肪酶基因的擴增用如下所示引物擴增來自熱硫化氫熱厭氧桿菌DSM7021和布氏嗜熱厭氧菌布氏亞種DSM 1457的完整脂肪酶基因
權(quán)利要求
1.水解底物中酯鍵的方法，其包括用脂肪酶處理所述底物，所述脂肪酶a)具有與SEQID NO 4具有至少95%同一性的氨基酸序列；b)由中等嚴(yán)緊條件下與SEQID NO :3的互補鏈雜交的核酸序列所編碼；c)具有能夠自SEQID NO :4通過取代、缺失、和/或插入一個或多個氨基酸而獲得的氨基酸序列；或者d)由存在于菌株DSM15242中的基因組的脂肪酶編碼部分編碼，并且能夠用SEQ ID NO 7禾口 8擴增。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酶具有SEQID NO 4的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述脂肪酶是自SEQID NO :4通過取代、缺失、和/或插入一個氨基酸而獲得的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述酯鍵是仲醇酯鍵。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述仲醇酯鍵是甘油三酯2-位的鍵。
6.脂肪酶，其a)具有與SEQID NO 4具有至少95%同一性的氨基酸序列；b)由中等嚴(yán)緊條件下與核酸序列SEQID NO :3的互補鏈雜交的核酸序列所編碼；c)具有能夠自SEQID NO :4通過取代、缺失、和/或插入一個或多個氨基酸而獲得的氨基酸序列；或者d)由存在于菌株DSM15242中基因組的脂肪酶編碼部分所編碼，并且能夠用SEQ ID NO 7禾口 8擴增。
7.權(quán)利要求6的脂肪酶，其中所述脂肪酶具有SEQID NO :4的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6的脂肪酶，其中所述脂肪酶是自SEQID NO :4通過取代、缺失、和/或插入一個氨基酸而獲得的氨基酸序列。
9.編碼權(quán)利要求6-8任一項的脂肪酶的多核苷酸。
10.生產(chǎn)多肽的方法，包括a)獲得編碼權(quán)利要求6所述脂肪酶的多核苷酸，所述脂肪酶具有來自厭氧細(xì)菌的脂肪酶的活性；b)用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬細(xì)胞；c)在有助于生產(chǎn)所述脂肪酶的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和d)回收所述脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及用脂肪酶水解酯鍵。發(fā)明人已鑒定了厭氧嗜熱細(xì)菌中具有脂肪酶活性的多肽。因此，本發(fā)明提供水解底物中的酯鍵的方法，包括用特定脂肪酶(具有脂肪酶活性的多肽)處理所述底物。本發(fā)明還提供用于所述方法的脂肪酶和編碼所述脂肪酶的多核苷酸。
文檔編號C12N15/75GK102212509SQ20111008104
公開日2011年10月12日 申請日期2005年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月8日
發(fā)明者加拉貝德.安特拉尼基安, 托馬斯.謝弗, 瑪麗納.羅伊特, 蒂納.霍夫 申請人:諾維信公司