專利名稱：用于檢測人類egfr基因20號基因外顯子突變的引物組合物、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于檢測人類 EGFR基因20號基因外顯子突變的引物組合物、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
肺癌是較為常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率較高，男性肺癌占各種癌病死因第一位，女性則僅次于乳腺癌占第二位。按傳統(tǒng)的組織病理學(xué)分類，肺癌可分小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell carcinoma，NSCLC)即“非小細(xì)胞癌”，包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌，與小細(xì)胞癌相比其癌細(xì)胞生長分裂較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對較晚，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80-85%。上皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)是上皮生長因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。EGFR屬于ErbB受體家族的一種，該家族包括EGFR (ErbB-I)，HER2/c-neu (ErbB-2)，Her 3 (ErbB-3)和 Her 4 (ErbB-4)。EGFR 也被稱作 HERUErbBl,突變或過表達(dá)一般會弓I發(fā)腫瘤。EGFR是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體。 研究表明，EGFR突變基因與酪氨酸激酶抑制類藥物使用有療效關(guān)聯(lián)，這些藥物包括Iressa (易瑞沙)和Tarceva (特羅凱)。EGFR基因突變影響著EGn 酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的臨床療效，目前發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變90%以上的突變位于外顯子19-21。EGFR外顯子20的點(diǎn)突變或者堿基插入突變，點(diǎn)突變主要是790位密碼子出現(xiàn)C-T轉(zhuǎn)換，引起EGFR蛋白中該位點(diǎn)的氨基酸由蘇氨酸轉(zhuǎn)變突變?yōu)榧琢虬彼?T790M)，僅見于藥物治療后復(fù)發(fā)者，突變使腫瘤對藥物產(chǎn)生抗性。堿基插入突變發(fā)生在770-775位密碼子，在GACAACCCCCACGTGTGTGC序列間，存在8種不同的插入方式，插入片段為3 9個(gè)堿基。目前EGFR突變基因的檢測方法有DNA測序法、特異性位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳分析。相對于DNA測序，其它分子生物學(xué)方法盡管靈敏度和/或特異度有所提高，但是大多數(shù)方法仍對組織的取材要求較高， 需要較多的腫瘤組織和有較高的腫瘤細(xì)胞含量。此外，有的方法，如熒光實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、高效液相色譜和毛細(xì)管電泳等，需要特殊的儀器設(shè)備，因而仍然不能在臨床上進(jìn)行大范圍推廣。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)，盡管只能做定性的分析，但通過條件優(yōu)化，臨床上可以作為一種初篩突變的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測人類EGFR基因20號基因外顯子突變的引物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用上述的引物組合物制備的試劑盒，以及該試劑盒在檢測非小細(xì)胞肺癌藥物療效相關(guān)的EGFR基因20號基因外顯子突變中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種檢測人類EGFR基因20號基因外顯子突變的方法，該方法利用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行檢測，檢測耗時(shí)少、靈敏度高、特異性好、檢測結(jié)果穩(wěn)定。本發(fā)明的上述技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)施的
一種用于檢測人類EGFR基因20號基因外顯子突變的引物組合物，是由具有如下所述的核苷酸序列的引物組成
5’ - ACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCA-3’ SEQ ID No :1， 5’ - TCCAAAATAAAGGAATGTGTGTGTG-3‘ SEQ ID No :2， 5’ - AAGCCACACTGACGTGCCTCTC-3， SEQ ID No :3， 5’ - TAGTCCAGGAGGCAGCCGAA -3， SEQ ID No :4。該引物組合物包括用于檢測EGFR基因外顯子20突變的引物，其中用于檢測EGFR 基因外顯子20的上游引物核苷酸序列為SEQ ID NO :1，下游引物核苷酸序列為SEQ ID NO 2，另外包含一條EGFR基因外顯子19內(nèi)部的上游引物SEQ ID NO :3，下游SEQ ID No :4。一種試劑盒，至少包括上述的引物組合物和PCR反應(yīng)液。作為優(yōu)選，所述的PCR反應(yīng)液包括以下組分pH 8. 4 的 Tris-HCl 40 mM, MgCl2 15 24 mM, KCl 50 mM, (MM)2SO4 10 mM, dNTP 0. 5mM，終濃度0. 06 0. 10 U/μ 1的Taq DNA聚合酶；所述的引物組合物包括各 IOyMWSEQ ID No: USEQ ID No:2,SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:4 所示的引物。本試劑盒針對外顯子20的突變類型的檢測，設(shè)計(jì)了特異性的引物，當(dāng)EGFR外顯子20基因突變時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物將出現(xiàn)4條擴(kuò)增產(chǎn)物，而野生型的只出現(xiàn)2條擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還提供一種所述的試劑盒在檢測非小細(xì)胞肺癌藥物療效相關(guān)的EGFR基因 20號基因外顯子突變中的應(yīng)用。所述的藥物為Iressa (易瑞沙)或Tarceva (特羅凱)。本發(fā)明的試劑盒用于輔助臨床醫(yī)生診斷出可受益于Iressa (易瑞沙)和Tarceva (特羅凱)等特效藥的肺癌患者，適合于非小細(xì)胞肺癌患者在進(jìn)入個(gè)體化靶向治療療程之前使用，可為病者個(gè)體用藥提供用藥科學(xué)依據(jù)，降低治療風(fēng)險(xiǎn)以及患者負(fù)擔(dān)。一種檢測人類EGFR基因20號基因外顯子突變的方法，包括以下步驟(1)待測樣本處理和模板DNA提取；(2)使用本發(fā)明所述的試劑盒對步驟(1)得到的DNA進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增；(3)檢測步驟(2)所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。作為優(yōu)選，步驟(1)中的樣本為手術(shù)切除的新鮮病理組織、石蠟包埋病理組織、全血、血漿、血清或胸腔積液。作為優(yōu)選，步驟(3)中的檢測方法為微流體芯片檢測法。作為優(yōu)選，本發(fā)明的檢測方法與微流體芯片檢測法相結(jié)合，具體包括以下步驟
(1)用本發(fā)明所述的引物組合物對被測樣本的DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，純野生型、純突變型和雜合突變型的擴(kuò)增產(chǎn)物不同；
(2)擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流體芯片進(jìn)行檢測；
(3)通過對各檢測峰的數(shù)量及檢測峰位置的判斷，確定檢測到的片段數(shù)量及大小，從而確定被檢測的基因，判斷臨床樣本EGFR基因20號外顯子的突變情況；
(4)結(jié)果判斷a)出現(xiàn)422bp和152bp兩個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明臨床樣本的EGFR基因 20號外顯子未出現(xiàn)突變情況，為純野生型；b)出現(xiàn)422bp和152bp兩個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以及其他兩個(gè)條帶，說明臨床樣本的EGFR基因20號外顯子發(fā)生突變。本發(fā)明以人類EGFR基因20號外顯子突變?yōu)闄z測對象，利用特異引物組的巢式PCR反應(yīng)，通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行微流體芯片檢測，實(shí)現(xiàn)快速、簡單、準(zhǔn)確、敏感的診斷人類EGFR基因突變。與現(xiàn)有的檢測方法和試劑盒相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明采用SPCR—SSCP (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析)技術(shù)，定向?qū)θ祟怑GFR基因20號外顯子缺失突變進(jìn)行檢測，與微流體芯片檢測法的結(jié)合，具有靈敏度高、 特異性好、速度快、結(jié)果直觀、可信性好的優(yōu)點(diǎn)。(2)本發(fā)明的檢測方法與微流體芯片檢測法聯(lián)合，具有自動(dòng)化程度高、人機(jī)界面良好的優(yōu)點(diǎn)，避免了諸多人為因素所帶來的誤差，所需時(shí)間和費(fèi)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常規(guī)測序技術(shù)，符合臨床上的需要。


圖1為EGFR基因20號外顯子純野生型DNA樣品的微流體芯片檢測圖。圖2為EGFR基因20號外顯子突變型DNA樣品的微流體芯片檢測圖。圖3為EGFR基因20號外顯子突變型的基因測序圖。圖4為EGFR基因20號外顯子純野生型的基因測序圖。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例及附圖來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中所使用的技術(shù)，除非特別說明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用的儀器設(shè)備、試劑等，除非是本說明書特別說明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過公共途徑獲得的。本發(fā)明所述的“PCR”是指聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性-退火-DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增的一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)。本發(fā)明微流體芯片檢測法使用的檢測儀器是寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的AMA2100型全自動(dòng)微流芯片分析儀，該儀器的專利申請?zhí)枮镃N200910272437. X、CN200920230097. X、CN200910272874. X、CN200910273037.0、CN200920288540.9、 CN200910272436. 5。實(shí)施例1 試劑盒的組成與配制
本發(fā)明的試劑盒由PCR反應(yīng)液、引物和內(nèi)參引物混合液、陰性對照物、陽性對照物和滅菌雙蒸水組成。1.配制 PCR 反應(yīng)液Tris-HCl CpH 8.4)40 mM，MgCl2 15 24mM，KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 m Μ, dNTP 0.5 mM, Taq DNA 聚合酶的終濃度為 0· 06 0· 10 U/μΙ。其中 MgCl2最佳的濃度為20 mM, Taq DNA多聚酶的最佳終濃度為0. 08 U/μ 1。2.配制引物組合物的混合液各 10 μ M的SEQ ID No:USEQ ID No:2,SEQ ID Νο:3 和SEQ ID Νο:4所示的引物，SEQ ID No 1所示的引物、SEQ ID No2所示的引物、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物的體積比值為1:1:1:1;
3.滅菌雙蒸水(ddH20)；
4.陽性對照物20號外顯子發(fā)生突變的臨床樣本DNA；
5.陰性對照物ddH20。
為方便描述本發(fā)明的效果，以下各實(shí)施例均采用本試劑盒的最優(yōu)配比，即本發(fā)明的試劑盒包括
1.PCR 反應(yīng)液Tris-HCl (pH 8.4)40 mM, MgCl2 20 mM, KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 m Μ, dNTP 0. 5 mM, Taq DNA 多聚酶的終濃度為 0. 08 U/μ 1 ；
2.引物組合物的混合液各10μM的SEQ ID No:l、SEQ ID No :2, SEQ ID No:3和 SEQ ID No:4所示的引物混合配制而成，SEQ ID No 1所示的引物、SEQ ID No:2所示的引物、SEQ ID No:3所示的引物和SEQ ID No:4所示的引物的體積比值為1 :1 :1 :1 ；
3.滅菌雙蒸水(ddH20)；
4.陽性對照物20號外顯子發(fā)生突變的臨床樣本DNA；
5.陰性對照物ddH20。實(shí)施例2 臨床樣本DNA的提取
臨床樣本適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織、石蠟包埋病例組織、全血、血漿、血清、胸腔積液等，DNA提取試劑盒使用寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的血液/組織基因組提取試劑盒(注冊號浙甬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第1400013號)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。本實(shí)施例使用此試劑盒分別提取1個(gè)正常生理組織樣本及四個(gè)臨床非小細(xì)胞肺癌新鮮病理組織樣本基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明，提取的正常生理組織樣本DNA編號為1號，其它病理組織DNA樣本依次編號為2-30號。實(shí)施例3 用引物組合物混合液擴(kuò)增DNA樣本
實(shí)施例為采用本發(fā)明所提供的引物組合物序列擴(kuò)增實(shí)施例2所提取的1-30號共30個(gè) DNA樣品，引物的序列見表2。
表2 PCR擴(kuò)增混合弓I物序列
權(quán)利要求
1.一種用于檢測人類EGFR基因20號基因外顯子突變的引物組合物，其特征在于其是由具有如下所述的核苷酸序列的引物組成5’ - ACGTATTTTGAAACTCAAGATCGCA-3’ SEQ ID No:l, 5' - TCCAAAATAAAGGAATGTGTGTGTG-3‘ SEQ ID No:2, 5’ - AAGCCACACTGACGTGCCTCTC-3， SEQ ID No:3，禾口 5’ - TAGTCCAGGAGGCAGCCGAA -3， SEQ ID No:4。
2.一種試劑盒，其特征在于至少包括如權(quán)利要求1所述的引物組合物和PCR反應(yīng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的PCR反應(yīng)液包括以下組分pH8.4 的 Tris-HCl 40 mM, MgCl2 15 24 mM, KCl 50 mM, (MM)2SO4 10 mM, dNTP 0. 5mM，終濃度 0.06 0. 10 U/μ L的Taq DNA聚合酶；所述的引物組合物包括各10 μ M的SEQ ID Νο:1、 SEQ ID No:2, SEQ ID Νο:3 和 SEQ ID Νο:4 所示的引物。
4.一種權(quán)利要求2或3所述的試劑盒在檢測非小細(xì)胞肺癌藥物療效相關(guān)的EGFR基因 20號基因外顯子突變中的應(yīng)用。
5.一種檢測人類EGFR基因20號基因外顯子突變的方法，其特征在于包括以下步驟(1)待測樣本處理和模板DNA提?。?2)使用權(quán)利要求2或3所述的試劑盒對步驟(1)得到的DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增；(3)檢測步驟(2)所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)中的樣本為手術(shù)切除的新鮮病理組織、石蠟包埋病例組織、全血、血漿、血清或胸腔積液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(3)中的檢測方法為微流體芯片檢測法。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于包括以下步驟(1)用權(quán)利要求1所述的引物組合物對被測樣本的DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，純野生型、 純突變型和雜合突變型的擴(kuò)增產(chǎn)物不同；(2)擴(kuò)增產(chǎn)物通過微流體芯片進(jìn)行檢測；(3)通過對各檢測峰的數(shù)量及檢測峰位置的判斷，確定檢測到的片段數(shù)量及大小，從而確定被檢測的基因，判斷臨床樣本EGFR基因20號外顯子的突變情況；(4)結(jié)果判斷a)出現(xiàn)422bp和152bp兩個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明臨床樣本的EGFR基因 20號外顯子未出現(xiàn)突變情況，為純野生型；b)出現(xiàn)422bp和152bp兩個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以及其他兩個(gè)條帶，說明臨床樣本的EGFR基因20號外顯子發(fā)生突變。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于檢測人類EGFR基因20號基因外顯子突變的引物組合物、試劑盒及方法。該引物組合物包括用于檢測EGFR基因外顯子20突變的引物，其中用于檢測EGFR基因外顯子20的上游引物核苷酸序列為SEQIDNO1，下游引物核苷酸序列為SEQIDNO2，另外包含一條EGFR基因外顯子19內(nèi)部的上游引物SEQIDNO3，下游SEQIDNo4。本發(fā)明以人類EGFR基因20號外顯子突變?yōu)闄z測對象，利用特異引物組的巢式PCR反應(yīng)，通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行微流體芯片檢測，實(shí)現(xiàn)快速、簡單、準(zhǔn)確、敏感的診斷人類EGFR基因突變。
文檔編號C12N15/11GK102199663SQ20111007051
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者倪劍鋒, 徐輝, 戚琳玲, 楊文輝, 潘承斌 申請人:寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司