專利名稱：特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜rt73的標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73的標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因作物在解決全世界日益嚴(yán)重的糧食危機(jī)的同時(shí)，也帶來了食品安全和環(huán)境安全問題。因此，世界各國(guó)政府和相關(guān)國(guó)際組織非常重視轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的監(jiān)督和管理。作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管的重要技術(shù)支撐之一，核酸檢測(cè)技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)的最主要和常用的方法。而不論采用基于核酸或蛋白質(zhì)的方法，在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)均必須使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Reference materials)作為陽性對(duì)照或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)[1_2]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有一種或多種足夠穩(wěn)定、均一和確定的特性值，用于對(duì)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)、對(duì)測(cè)量方法進(jìn)行評(píng)價(jià)或?yàn)椴牧隙ㄖ档奈镔|(zhì)和材料M。目前實(shí)際檢測(cè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多來源于國(guó)外研究機(jī)構(gòu)，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不僅價(jià)格昂貴，購(gòu)買周期長(zhǎng)，而且商業(yè)化品種不全， 很難滿足日常檢測(cè)需求。標(biāo)準(zhǔn)分子(Referencemolecule)是一種重組質(zhì)粒分子，其一般包含轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的外源基因或品系特異性片段以及物種特異性片段。由于操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本低、容易獲得高純度和高濃度DNA樣品，且在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子中可容納多個(gè)目標(biāo)序列等突出優(yōu)點(diǎn)，近年來，標(biāo)準(zhǔn)分子被認(rèn)為是解決轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的有效途徑之一，已作為新型DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)和定量分析[4_5]。但是，目前為止，本領(lǐng)域并沒有在很多的轉(zhuǎn)基因植物中普及開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)分子，且開發(fā)出分析結(jié)果穩(wěn)定、良好的標(biāo)準(zhǔn)分子還存在難度。難度之一主要在于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)分子的序列的選擇，既要保證所選的序列具有代表性、序列片段長(zhǎng)度合適，又要保證可準(zhǔn)確地用于分析檢測(cè)。另一方面難度在于合適的載體的選擇，如載體的大小會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)分子的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系由孟山都公司研發(fā)，是全球種植最廣泛的轉(zhuǎn)基因油菜品系， 占全球油菜種植面積的45%左右[6]。RT73品系已先后在加拿大、日本、美國(guó)和澳大利亞批準(zhǔn)環(huán)境釋放，并在中國(guó)、歐盟等9個(gè)國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)用于食品或飼料加工原料[7]。中國(guó)每年進(jìn)口幾百萬噸油菜籽，主要來自加拿大等國(guó)，而其中大部分為轉(zhuǎn)基因油菜籽，并以RT73品系為主。為了給中國(guó)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐，有必要開發(fā)適于轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系特異性檢測(cè)的、穩(wěn)定可靠的標(biāo)準(zhǔn)分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73的標(biāo)準(zhǔn)分子、其構(gòu)建方法及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組質(zhì)粒，其包含(較佳地為5’ 一 3’)以下序列片段轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列，油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段，油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP序列片段。在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA 的3，端鄰接區(qū)序列如SEQ ID NO 1所示。在另一優(yōu)選例中，所述的油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。在另一優(yōu)選例中，所述的油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。在另一優(yōu)選例中，所述的重組質(zhì)粒的大小為3000-5000bp。在另一優(yōu)選例中，所述的重組質(zhì)粒的骨架質(zhì)粒是pEASY-T3載體。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組質(zhì)粒的用途，用于作為標(biāo)準(zhǔn)分子，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的方法，所述方法包括以所述的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)分子，測(cè)定待測(cè)油菜樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的存在與否以及存在量。在另一優(yōu)選例中，采用PCR的方法擴(kuò)增待測(cè)油菜及其來源樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73 品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列以及油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段或PEP序列片段；將獲得的擴(kuò)增結(jié)果與同樣擴(kuò)增條件下擴(kuò)增的重組質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較，從而獲得待測(cè)油菜及其來源樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的存在與否以及存在量。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的試劑盒，含有所述的重組質(zhì)粒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列、油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段和/或油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP序列片段的引物。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還含有選自以下的試劑PCR擴(kuò)增試劑(如DNA 聚合酶)，電泳相關(guān)試劑(如瓊脂糖)，DNA分子量標(biāo)記，使用說明書等。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY-RT73結(jié)構(gòu)示意圖和插入序列(A)標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY-RT73結(jié)構(gòu)示意圖。RT733，，表示RT733，端品系特異性序列； HMG，表示油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMG片段；PEP，表示油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PEP片段；SpeI和McI分別表示對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)；AmpK，表示氨芐青霉素抗性基因。(B)標(biāo)準(zhǔn)分子PEASY-RT73中插入序列。RT73，轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系3，端旁鄰序列(SEQ ID NO 1) ；HMG,內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMG片段(SEQ ID NO 2) ；PEP,內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PEP片段 (SEQ ID NO :3)。序列兩端斜體字母標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建中所用引物位置；下劃線和雙下滑線分別標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)分子測(cè)試中普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物位置；字母加灰部分表示普通 PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物共用序列。圖2、標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY-RT73用于普通PCR擴(kuò)增的特異性和靈敏度。
(A)以標(biāo)準(zhǔn)分子DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；(B)分別以對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因油菜品系DNA為模板進(jìn)行的擴(kuò)增；泳道1為空白對(duì)照； 泳道 2-12 分別為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 HMG(219bp)、PEP (248bp)、油菜 RT73 (204bp)、MSl (194bp)、 MS8(159bp)、RFl(200bp)、RF2(200bp)、RF3(282bp)、0xy235(331bp)、Topasl9/2(IlObp)和 T45(233bp)品系特異性序列的擴(kuò)增。(C)RT73品系特異性片段擴(kuò)增；(D)PEP片段擴(kuò)增；(E)HMG片段擴(kuò)增。泳道1為空白對(duì)照；泳道2-8分別為50000、 5000、500、100、50、10和5拷貝標(biāo)準(zhǔn)分子DNA的擴(kuò)增。箭頭示擴(kuò)增產(chǎn)物大??；M為DL2000分
子量標(biāo)記。圖3、以標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和R2值。(A)轉(zhuǎn)基因油菜RT733’端品系特異性序列；(B)油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP片段；(C)油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG片段。
具體實(shí)施例方式針對(duì)目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，構(gòu)建了適于轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系特異性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)分子(即本發(fā)明的重組質(zhì)粒)，其包含轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系3’端旁鄰序列，油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMG和PEP片段。對(duì)所述標(biāo)準(zhǔn)分子在定性和定量檢測(cè)中的適用性進(jìn)行驗(yàn)證表明，所述的標(biāo)準(zhǔn)分子高度特異于轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系。特異性序列為了構(gòu)建特異性好、穩(wěn)定性高、靈敏度高、適用性廣的標(biāo)準(zhǔn)分子，本發(fā)明人經(jīng)過了反復(fù)的研究，找到了合適的基因片段。所述的基因片段是轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列。較佳地，還克隆了油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG和 PEP片段。三種序列片段共同構(gòu)建入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒(載體)中，從而用于轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的特異性鑒定。如本文所用，所述的“外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列”、“3’ 端鄰接區(qū)序列”或“3’端旁鄰序列片段”可互換使用。其中“3’端鄰接區(qū)序列”或“3’端旁鄰序列片段”是“外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列”的簡(jiǎn)稱。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3，端鄰接區(qū)序列的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用如SEQ ID NO :1所示序列的片段作為檢測(cè)的目的片段，不僅PCR擴(kuò)增效果良好，而且檢測(cè)結(jié)果最為準(zhǔn)確，其全面地涵蓋了轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系檢測(cè)所需的特異性檢測(cè)區(qū)域，適用性廣。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP序列片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。重組質(zhì)粒上述的三種序列片段插入到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒(載體)中，構(gòu)成重組質(zhì)粒(重組載體)，作為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)分子。所述的重組質(zhì)粒的骨架質(zhì)粒可以有多種的選擇，可以是一些商業(yè)化的質(zhì)粒。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的骨架質(zhì)粒的大小約為2000-5000bp ；較佳地約為2000-4000bp ； 較佳地約為2500-4000bp ；較佳地約為2500-3500bp。上述的骨架質(zhì)粒在構(gòu)建成本發(fā)明的重組質(zhì)粒后，重組質(zhì)粒的大小范圍約在3000-6000bp ；較佳地約為3000-5000bp ；較佳地約為 3500-4500bp。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)大小的重組質(zhì)粒，穩(wěn)定性好，PCR擴(kuò)增效果良好， 有利于獲得準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。一些具體的骨架質(zhì)粒例如但不限于pEASY系列的載體、T系列載體、pUC系列載體、PBR系列載體等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的骨架質(zhì)粒是pEASY系列的載體(如 PEASY-T3 載體)。以上的三種序列片段較佳地插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，形成串聯(lián)的形式。三種序列片段在載體上的前后次序可以是變化的。只要它們能夠被引物識(shí)別和擴(kuò)增。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，三種序列片段在載體上的次序，從5’ 一3’端，為轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系3’ 端旁鄰序列，油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG和PEP片段。檢測(cè)方法本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的方法，所述方法包括以所述的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)分子，測(cè)定待測(cè)油菜樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的存在與否以及存在量。在獲得了本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)分子后，本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解如何進(jìn)行待測(cè)油菜樣品進(jìn)行檢測(cè)。以本發(fā)明的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)分子，通常采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法來進(jìn)行品系的鑒定，也可采用基于核酸的其它檢測(cè)方法，如芯片檢測(cè)。一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的方法是采用PCR的方法擴(kuò)增待測(cè)油菜或其來源樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列以及轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的HMG序列片段或PEP序列片段；將獲得的擴(kuò)增結(jié)果與同樣擴(kuò)增條件下擴(kuò)增的重組質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較，從而獲得待測(cè)油菜或其來源樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73 品系的存在與否以及存在量。利用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)分子，可以構(gòu)建出標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算三種片段量(拷貝數(shù))。使用標(biāo)準(zhǔn)分子DNA和轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，兩者之間的反應(yīng)效率可能存在差異，因此可以通過測(cè)定校正系數(shù)(Conversion factor, Cf)進(jìn)行校準(zhǔn)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，制備了標(biāo)準(zhǔn)分子PEASY-RT73，其高度特異于轉(zhuǎn)基因油菜 RT73品系。以標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)品的普通PCR擴(kuò)增中，三個(gè)目標(biāo)片段的檢測(cè)下限(LOD)均為 10拷貝。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的LOD均為25拷貝，定量下限(LOQ)均為50拷貝。以標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)效率介于0. 96 1. 02間，相關(guān)系數(shù)均大于0. 999。分別以PEP和HMG為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)?個(gè)盲樣的測(cè)試結(jié)果顯示測(cè)量值與設(shè)定值間偏差(Bias)介于-14. 13% 14. 29%間，SD 小于 0. 20，RSD 小于 18. 0%o因此，本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)分子可很好的替代植物來源陽性標(biāo)準(zhǔn)品用于轉(zhuǎn)基因油菜RT73 及其來源產(chǎn)品品系特異性檢測(cè)。試劑盒一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的試劑盒，含有所述的重組質(zhì)粒(通常包含在容器中)。
所述的試劑盒還可含有擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列、轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的HMG序列片段和/或轉(zhuǎn)基因油菜RT73 品系的PEP序列片段的特異性引物。以便于進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測(cè)。所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、電泳等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、DNA聚合酶、擴(kuò)增液、雜交液、限制性酶、對(duì)照液、洗液、電泳相關(guān)試劑(如瓊脂糖)、DNA分子量標(biāo)記等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或核酸序列分析軟件等。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因油菜RT73[1CI]、MS1 XRFl[11]、MS1 XRF2[12]、MS8XRF3[13]、T45[15]、0xy235[14]和 Topas 19/2[16]品系均為商品化的品系，且有文獻(xiàn)公開。非轉(zhuǎn)基因油菜籽樣品為我國(guó)廣泛推廣的常規(guī)品種“秦優(yōu)7號(hào)”。油菜籽DNA提取和制備用冷凍研磨機(jī)(美國(guó)SPEX公司FREEZER MILL 6850型)各各品系油菜籽樣品分別研磨成均勻的粉末。使用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，Cat:#DP305-02)并按其操作步驟提取樣品基因組DNA。用核酸蛋白含量測(cè)定儀(德國(guó) Eppendorf公司)測(cè)定濃度后，置_20°C保存。標(biāo)準(zhǔn)分子(質(zhì)粒)構(gòu)建根據(jù)轉(zhuǎn)基因油菜RT733’端品系特異性序列和油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG、PEP片段設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建用引物(表1)，這些引物的擴(kuò)增區(qū)域涵蓋了轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系檢測(cè)所涉及的較為全面的檢測(cè)區(qū)域。以轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的基因組DNA為模板，以L2-RT73-3-F和L2-RT73-3-R為引物，擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系3’端鄰接區(qū)序列(316bp)。以轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的基因組DNA為模板，以HMG-F和HMG-R為引物，擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系HMG片段(31 Ibp)。以轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的基因組DNA為模板，以PEP-F和PEP-R為引物，擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系PEP(307bp)片段。采用pEASY_T3(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)為基礎(chǔ)載體，將轉(zhuǎn)基因油菜 RT73品系外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列(316bp)采用T-A克隆方式連接到載體中，得到PEASY-RT73-1。進(jìn)一步將PEP(307bp)和HMG片段(311bp)通過重疊 PCR技術(shù)整合為一個(gè)重組片段，并通過SpeI和McI酶切位點(diǎn)克隆到pEASY-RT73-l中，得到標(biāo)準(zhǔn)分子PEASY-RT73。標(biāo)準(zhǔn)分子分別送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司和鼎安生物技術(shù) (上海)有限公司進(jìn)行質(zhì)粒全基因測(cè)序。表1、標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建中設(shè)計(jì)的引物
目標(biāo)片段引物序列(5’-3’)產(chǎn)物大小(bp)RT73 3，端旁鄰L2- RT73-3-FCGA CGG ATC GTA ATT TGT CGT T (SEQ ID NO: 4)316序列L2- RT73-3-RTAG CCG TCG ATT TCC ACA TG (SEQ ID NO: 5)HMGHMG-FCGA AGC CTC AGG GAG AGT CA (SEQ ID NO: 6)311HMG-RCGA TTT GCT ACA GCG TCA ACT (SEQ ID NO: 7)PEPPEP-FCGG CGT TTC AGA CAT TCC TG (SEQ ID NO: 8)307PEP-RTTT CCC ACT CAG CTC GGA TAA (SEQ ID NO: 9)重疊PCRHMG+PEP-1-FTGCGACGACTAGTCGAAGCCTCAGGGAGAGT CAAGCCACG (SEQ ID NO: 10)644HMG+PEP-1-RCAGGAATGTCTGAAACGCCGCGATTTGCT ACAGCGTCAACTT (SEQ ID NO: 11)HMG+PEP-2-FAGTTGACGCTGTAGCAAATCGCGGCGTTT CAGACATTCCTGA (SEQ ID NO: 12)HMG+PEP-2-RTGCGATGCGAGCTCTTTCCCACTCAGCTC GGATAATAGCCA (SEQ ID NO: 13)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)粒DNA提取和制備培養(yǎng)4mL已達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的pEASY_RT73大腸桿菌菌液，采用Axygen質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司，Cat :#AP-MN-P-50)并按其操作步驟提取和純化質(zhì)粒DNA。用核酸蛋白含量測(cè)定儀(德國(guó)Eppendorf公司)測(cè)定濃度后，置_20°C 保存。標(biāo)準(zhǔn)分子適用性鑒定(a)標(biāo)準(zhǔn)分子用于普通PCR檢測(cè)的適用性鑒定標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY-RT73中僅包含轉(zhuǎn)基因油菜RT733，端品系特異性序列，油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG和PEP片段，因此標(biāo)準(zhǔn)分子應(yīng)特異于上述三個(gè)片段的檢測(cè)。利用我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMGw和PEPm檢測(cè)引物，轉(zhuǎn)基因油菜RT73_、MS1[11]、RF1[11]、RF2[12]、 MS8m、RF3m、0xy235[14]、T45[15]和Topasl9/2[16]品系特異性檢測(cè)引物分別擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)分子 DNA以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子的特異性。為了鑒定PEASY-RT73用于普通PCR檢測(cè)的靈敏度，本發(fā)明采用兩種PCR體系和三種不同型號(hào)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行了三位研究人員參與的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證。試劑包括 TakaRa Premix Ex iTaq (大連寶生物公司，Cat. 033 和BocaiTaq (上海申能博彩生物技術(shù)有限公司，Cat. B31)；使用儀器包括MastercyclerGradient PCR儀(德國(guó)Eppendorf■公司)，AB Thermal Cycler PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和PTC-225PCR儀(美國(guó)MJ Reserarsh 公司)。將標(biāo)準(zhǔn)分子DNA稀釋至104、103、102、20、10、2和1拷貝/ μ L，使用普通PCR檢測(cè)引物(表2)分別擴(kuò)增RT733，端品系特異性序列(204bp)，HMG片段(219bp)和PEP片段 Q48bp)，確定以標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)品在普通PCR檢測(cè)中的LOD值。采用 25 μ L 體系進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，包括 1 X Premix Ex Taq (TakaRa Premix ExTaq 體系)或 IXPCR 緩沖液，0. 40mM dNTPs, 1. 25U Taq DNA 聚合酶(Bocai Taq 體系)；0.20 μ M 上下游引物，以及5μ L DNA模板。反應(yīng)條件為 95°C IOmin ；95°C 30s,60°C /55°C 40s(RT73, HMG片段60°C ；PEP片段55°C )，72°C 40s，40個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。所有反應(yīng)重復(fù)3次， PCR產(chǎn)物利用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(b)標(biāo)準(zhǔn)分子用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的適用性鑒定將標(biāo)準(zhǔn)分子0嫩稀釋至106、105、104、103、102和10拷貝/1^。對(duì)三個(gè)目標(biāo)片段 (RT733’端旁鄰序列、HMG、PEP)分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每次設(shè)3個(gè)平行重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算R2和反應(yīng)效率(E)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)效率E計(jì)算公式E = 10_VK_1 (K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)。以10、5和2拷貝/ μ L標(biāo)準(zhǔn)分子DNA為模板，擴(kuò)增25次反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分子用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的LOD和L0Q。采用Hot Start qPCR Master Mix I試劑盒(上海睿誠(chéng)生物科技有限公司)和 AB PRISM 7300定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，引物和探針序列見表2。采用25 μ L體系，包括IXHot Start qPCR MasterMix Ι;0.40μΜ引物和 0· 32 μ M 探針(RT73、PEP 片段)或 0· 40 μ M 引物和 0· 20 μ M 探針(HMG 片段)；5 μ L DNA 模板。擴(kuò)增條件為 95°C, IOmin ；95°C，15s，60°C，60s，45 個(gè)循環(huán)。(c)以標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)使用標(biāo)準(zhǔn)分子DNA和轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，兩者之間的反應(yīng)效率可能存在差異，因此需要測(cè)定校正系數(shù)(Cf)進(jìn)行校準(zhǔn)。采用400、200、100、50和25叫純合轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系基因組DNA測(cè)定Cf值。設(shè)置3次平行重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算三個(gè)片段拷貝數(shù)。Cf = RT73品系特異性序列拷貝數(shù)/HMG或PEP片段拷貝數(shù)。將研磨好的純合RT73油菜籽和非轉(zhuǎn)基因油菜籽干粉按照質(zhì)量百分比進(jìn)行混合， 配制四個(gè)含有不同轉(zhuǎn)基因油菜RT73百分比含量樣品，包括10 %、5 %、1 %和0. 5 % (w/w)。 對(duì)各樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，獲得樣品內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和RT73品系特異性序列的Ct值， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算拷貝數(shù)，并根據(jù)以下公式計(jì)算各樣品轉(zhuǎn)基因油菜RT73成分百分比， 通過Bias，SD和RSD值分析測(cè)定百分比結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確度。轉(zhuǎn)基因成分含量(％ ) = RT73品系特異性序列拷貝數(shù)/(HMG或PEP片段拷貝數(shù) *Cf)。表2普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)引物及探針
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權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，其包含以下序列片段轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列，油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段，油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP序列片段。
2.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3，端鄰接區(qū)序列如SEQ ID NO 1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP序列片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
5.如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒的大小為 3000-5000bp。
6.權(quán)利要求1-5任一所述的重組質(zhì)粒的用途，用于作為標(biāo)準(zhǔn)分子，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜 RT73品系。
7.—種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的方法，其特征在于，所述方法包括以權(quán)利要求1 所述的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)分子，測(cè)定待測(cè)油菜樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的存在與否以及存在量。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，采用PCR的方法擴(kuò)增待測(cè)油菜及其來源樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列以及油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段或PEP序列片段；將獲得的擴(kuò)增結(jié)果與同樣擴(kuò)增條件下擴(kuò)增的重組質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較，從而獲得待測(cè)油菜及其來源樣品中轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的存在與否以及存在量。
9.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還含有擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列、油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因HMG序列片段和/或油菜內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因PEP序列片段的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因油菜RT73的標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。構(gòu)建了適于轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系特異性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)分子，其包含轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系外源插入片段與油菜基因組DNA的3’端鄰接區(qū)序列，油菜內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因HMG和PEP片段，所述的標(biāo)準(zhǔn)分子高度特異于轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102168103SQ201110045148
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月24日
發(fā)明者劉月明, 呂蓉, 張舒亞, 李想, 潘良文, 高琴 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局