專利名稱：一種細(xì)胞dna損傷檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞DNA損傷檢測技術(shù)，特別涉及一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒及其 檢測方法。
背景技術(shù)：
DNA是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳信息傳遞作用的一種重要的生物大分子，是生物化學(xué)與分 子生物學(xué)的重要研究對象。DNA分子由反向平行的兩條多聚核苷酸鏈經(jīng)由堿基配對原則構(gòu) 成雙螺旋結(jié)構(gòu)，其所攜帶的遺傳信息由多核苷酸鏈上的堿基的種類、數(shù)量以及排列次序決 定，堿基序列深藏于DNA雙螺旋的內(nèi)部，兩條多核苷酸鏈組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)形成了穩(wěn)定的 DNA分子并使其能夠正確傳遞遺傳信息。生物的生存環(huán)境中有多種因子，如物理因子電離輻射、紫外線、電磁輻射等；化學(xué) 因子氮氧化物、煤煙、汽車尾氣等；生物因子細(xì)菌、病毒等；它們都能夠引起細(xì)胞的DNA損 傷。DNA損傷的形式有DNA鏈的斷裂、嘧啶二聚體的形成、DNA加合物、點(diǎn)突變、DNA交聯(lián)等。 環(huán)境因子造成的DNA損傷可能會影響細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，并可能對后代產(chǎn)生影響，如引起 流產(chǎn)、死胎、畸胎和某些遺傳性疾病，也可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生(1、Fairbairn D W，Olive P L， 0' Neill K L The Comet assay :a comprehensive review, Mutation Research. 1995, 339 (1)，37-59 ；2、謝成英· DNA損傷與腫瘤發(fā)生的研究進(jìn)展，《中國癌癥雜志》，2006，16 (4)， 313-317.)。由于細(xì)胞的DNA損傷會造成疾病，威脅人類和動(dòng)物健康，因此對細(xì)胞DNA損傷 進(jìn)行檢測，并研究其作用機(jī)制就顯得十分重要。目前，世界上通用的DNA損傷的檢測方法可以分為兩類一是從損傷導(dǎo)致的生物 學(xué)效應(yīng)來檢測，如微核實(shí)驗(yàn)，染色體畸變，姐妹染色體交換實(shí)驗(yàn)等。二是直接檢測DNA損 傷，如洗脫技術(shù)，沉降技術(shù)，單細(xì)胞凝膠電泳檢測等。單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)，也稱彗星實(shí)驗(yàn)(comet assay)，是指在單細(xì)胞水平進(jìn)行DNA損傷 和修復(fù)檢測的熒光檢測方法(3、Liao W,McNutt MA,Zhu WG The comet assay :a sensitive method for detecting DNAdamage in individual cells. Methods. 2009,48(1) :46-53.), 該方法具有簡單、快速、靈敏、原位等特點(diǎn)。細(xì)胞經(jīng)過裂解、解旋、電泳后，斷裂的DNA會在 電場力的作用下從核內(nèi)移出，熒光染料染色后，在熒光顯微鏡下，可觀察到受損細(xì)胞核的彗 星狀圖像，呈現(xiàn)一個(gè)具有亮的彗星頭部和一個(gè)彌散的彗星尾部。通過對該圖像進(jìn)行測量與 計(jì)算機(jī)圖形分析即可判斷單細(xì)胞水平上的DNA損傷程度。目前單細(xì)胞凝膠電泳已被認(rèn)為 是研究低劑量遺傳毒理效應(yīng)的有效工具(4、Sirota NP, Kuznetsova EA. The comet assay application in radiobiological investigations. Radiats Biol Radioecol. 2010, 50(3) :3^-339.)。單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)是在核沉淀技術(shù)基礎(chǔ)上演化而來，最早期采用的是中性微凝 膠技術(shù)，然而在中性條件下裂解和電泳只能檢測雙鏈DNA斷片，不能測定單鏈斷片，而許多 遺傳毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的DNA單鏈斷片數(shù)量比雙鏈斷片高5 2000倍。SinghNP(5、Singh N P,McCoyMT,Tice R R et al. A simple technique for the puantitation of low levelsof DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 1988，175 :184-191.)等首次提出堿 性電泳技術(shù)，可檢測出單鏈DNA斷片，使單細(xì)胞凝膠電泳敏感性大大提高。當(dāng)pH> 13時(shí)， 除了 DNA雙鏈和單鏈斷裂外，還能檢測到DNA的堿性不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。標(biāo)準(zhǔn)的彗星實(shí)驗(yàn)不易檢 測出DNA交聯(lián)現(xiàn)象，包括DNA-蛋白交聯(lián)以及DNA-DNA交聯(lián)，但如果在處理細(xì)胞時(shí)同時(shí)加入 交聯(lián)劑和DNA鏈斷裂劑，化學(xué)物質(zhì)引起的DNA交聯(lián)作用就可以通過測定DNA斷裂而間接被 檢測到。經(jīng)過不斷改進(jìn)，彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)得到了重要發(fā)展和應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)可概括為1)可以 提供單個(gè)細(xì)胞DNA的異質(zhì)性信息；2)基本上適用于所有的真核細(xì)胞；3)更加靈敏，可檢驗(yàn) 0. 1DNA/109道爾頓斷裂；4)所需細(xì)胞樣本量小(< 10000) ；5)無需放射性示蹤劑等?；?此，目前，單細(xì)胞凝膠電泳已經(jīng)廣泛地用于有核細(xì)胞的DNA損傷與修復(fù)研究，如基因毒性檢 測和分子流行病學(xué)、遺傳毒理學(xué)、腫瘤發(fā)病機(jī)理及診斷與治療、環(huán)境生物監(jiān)測、衰老和細(xì)胞 凋亡機(jī)制、放射生物學(xué)、藥物篩選等。目前，用于單細(xì)胞凝膠電泳分析的樣品制備的基本步驟包括(6、Cemeli E， BaumgartnerA, Anderson D. Antioxidants and the Comet assay. Mutat Res. 2009， 681(1) :51-67.)樣品凝膠載玻片的制備、細(xì)胞裂解、解旋、電泳、中和洗滌、熒光染色。制 備好的樣品玻片即可在熒光顯微鏡下攝錄和利用相關(guān)圖像軟件分析熒光圖像，對DNA的損 傷程度進(jìn)行評價(jià)。傳統(tǒng)單細(xì)胞凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)室方法步驟繁瑣，需要單獨(dú)配置裂解試劑，需 要提前對樣品DNA進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)周期長，而且每次檢測樣品有限，凝膠玻片要鋪2層或3 層凝膠，制作工藝較繁瑣，而且在后期電泳和洗滌中易脫片造成實(shí)驗(yàn)失敗，影響了單細(xì)胞凝 膠電泳的推廣和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速簡便、工藝簡單、靈敏度高的基于單細(xì)胞凝 膠電泳技術(shù)的細(xì)胞DNA損傷檢測方法。所述一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒設(shè)有盒體和試劑，所述試劑包括低熔點(diǎn)瓊脂 糖、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞解旋液和DNA染色劑。所述細(xì)胞裂解液由溶液A和溶液B組成，所述溶液A的配方為2 3mol/LNaCl， 0. 1 0. 2mol/L EDTA-Na2, 5 100mmol/L Tris，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 5% 1. 5%肌氨酸鈉，余為 去離子水；所述溶液B的配方為體積分?jǐn)?shù)為1 % 2% Triton-100, 5% 15%二甲基亞砜 (Dimethyl sulfoxid，DMS0)，余為去離子水；所述溶液A與溶液B按體積比1 1混合即得 細(xì)胞裂解液；所述細(xì)胞解旋液的配方為0. 2 0. 5mol/LNa0H, 1 2mm0l/LEDTA-Na2，余為 去離子水；所述DNA染色劑為碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)、溴化乙錠(EB)、Hoechst 33342、hoechst33358 或 DAPI 等。所述溶液A 的優(yōu)選配方為2. 5mol/LNaCl，0. Imol/LEDTA-Na2, IOmmol/LTris (pH =10)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為肌氨酸鈉，余為去離子水。所述溶液B的優(yōu)選配方為體積分?jǐn)?shù)為Triton-100和10% 二甲基亞砜，余為
去離子水。所述細(xì)胞解旋液的優(yōu)選配方為0.3mol/L NaOH和 lmmol/L EDTA-Na2 (pH = 13. 0)， 余為去離子水。
所述碘化丙啶的濃度可為1 5 μ g/ml，所述溴化乙錠的濃度可為10 100 μ g/ ml ο所述細(xì)胞DNA損傷檢測方法包括以下步驟1)將細(xì)胞DNA損傷樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻得混合液，再將混合液點(diǎn)樣 到凝膠板樣品孔中；2)將點(diǎn)樣后的凝膠板浸入細(xì)胞裂解液中避光裂解；3)將裂解后的凝膠板浸入細(xì)胞解旋液中解旋，解旋完畢后電泳；4)往電泳后的凝膠板樣品孔滴加DNA染色劑染色，在熒光顯微鏡下分析檢測結(jié)
果 ο在步驟1)中，所述低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可為0.8% 1.5%，所述細(xì)胞 DNA損傷樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的體積比可為1 O 10)；所述點(diǎn)樣的體積可為 10 25 μ 1/樣品孔；所述凝膠板可采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板蓋，所述板蓋上的凹陷可用 作樣品孔；所述凹陷底部可刻有劃痕。在步驟幻中，所述細(xì)胞裂解液可在使用之前進(jìn)行4°C預(yù)冷；所述裂解的條件可為 溫度4 10°C，時(shí)間1 1.證；所述裂解完成后可用PBS洗滌凝膠板1 3次，每次5 IOmin0在步驟3)中，所述解旋的條件可為溫度4 10°C，時(shí)間30 45min ；所述電泳的 條件可為溫度4 10°C，時(shí)間30 60min，電流50 150mA。所述電泳完成后可用Tris 緩沖液洗滌凝膠板1 3次，每次5 lOmin。在步驟4)中，所述染色的條件可為溫度4 10°C，時(shí)間5 20min。與現(xiàn)有單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明可用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板蓋作為凝膠板代替載玻片用于單細(xì)胞凝膠電 泳，與傳統(tǒng)的單細(xì)胞凝膠電泳的樣品玻片要鋪2、3層膠的工藝相比，本發(fā)明將鋪膠點(diǎn)樣步 驟合二為一，使得本發(fā)明的樣品制備工藝簡單，容易操作，不脫膠，成功率高。2)本發(fā)明可采用自制的凝膠板直接點(diǎn)樣，與傳統(tǒng)的載玻片相比，熒光衰減減少，提 高了熒光亮度，從而提高了實(shí)驗(yàn)的靈敏度和圖像質(zhì)量。3)本發(fā)明提供用于細(xì)胞DNA損傷快速檢測的試劑盒，可用其直接進(jìn)行DNA細(xì)胞損 傷樣品的檢測，整個(gè)檢測過程可在2. 5 池完成，方便快捷。


圖1為采用本發(fā)明中的試劑盒檢測人肝癌SMMC7721細(xì)胞的單細(xì)胞凝膠電泳 的熒光顯微鏡圖。在圖1中，control為空白對照，所用藥物為依托泊甙，其濃度依次為 12. 5ymol/L、25ymol/L、50ymol/L，作用時(shí)間為 12h，所用細(xì)胞為肝癌 SMMC7721。圖2為采用本發(fā)明中的試劑盒檢測人肝癌MHCC97-H細(xì)胞的單細(xì)胞凝膠電泳 的熒光顯微鏡圖。在圖2中，control為空白對照，所用藥物為依托泊甙，其濃度依次為 12. 5 μ mol/L、25 μ mol/L、50 μ mol/L,作用時(shí)間為 12h,所用細(xì)胞為肝癌 MHCC97-H。圖3為采用本發(fā)明的試劑盒對人肝細(xì)胞Changliver的單細(xì)胞凝膠電泳的熒光顯 微鏡圖。在圖3中，control為空白對照，所用藥物為新制癌菌素，作用濃度為lOng/ml、 lOOng/ml，作用時(shí)間為12h，所用細(xì)胞為肝細(xì)胞Changliver。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1凝膠板的制作本發(fā)明所用凝膠板不必使用載玻片，可使用實(shí)驗(yàn)室常見的細(xì)胞培養(yǎng)用96孔培養(yǎng) 板的板蓋代替載玻片用于單細(xì)胞凝膠電泳，96孔板板蓋上的每一個(gè)凹陷均可用于作為樣品 孔。取一塊96孔板板蓋，用鋒利的裁紙刀裁掉四周凸起部分，根據(jù)樣品的數(shù)量裁剪成大小 合適的凝膠板，如可裁剪成含有12、24、36、48、64、96個(gè)凹陷的凝膠板，每一個(gè)樣品孔可劃 痕，使得瓊脂糖凝膠不易脫膠。實(shí)施例2細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒的制備試劑溶液的配置采用常規(guī)方法，可進(jìn)行400個(gè)樣品DNA損傷檢測的試劑盒包括1) Ig低熔點(diǎn)瓊脂糖。2) 150ml 溶液 A 和 150ml 溶液 B。溶液 A 的配方為2. 0 3. Omol/L NaCl，0. 1 0. anol/LEDTA-N￡i2，5 100mmol/L Tris，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5% 1. 5%肌氨酸鈉，余為去離子水。 溶液 A 的優(yōu)選配方為2. 5mol/L NaCl, 0. lmol/L EDTA-Na2,10m mol/L Tris (pH = 10. 0)， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%肌氨酸鈉，余為去離子水。所述溶液B的配方為體積分?jǐn)?shù)為1. 0% 2. 0% iTriton-IOOj. 0% 15. 0%二 甲基亞砜(Dimethyl sulfoxid, DMS0)，余為去離子水。溶液B的優(yōu)選配方為體積分?jǐn)?shù)為 1% Triton-100和10%二甲基亞砜，余為去離子水。3) 150ml 細(xì)胞解旋液，其配方可為0. 2 0. 5mol/LNa0H, 1 2mmol/LEDTA-Na2,余 為去離子水。優(yōu)選配方為:0. 3mol/L NaOH和Im mol/L EDTA-Na2 (pH = 13. 0)，余為去離子 水。4) DNA染色劑2. 5ml 2 μ g/ml的碘化丙啶。實(shí)施例31)肝癌SMMC7721細(xì)胞樣品的制備肝癌SMMC7721細(xì)胞培養(yǎng)在10%新生小牛血 清、lOOu/ml青霉素、lOOu/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37°C、(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳代時(shí)傾去 培養(yǎng)液，以PBS洗兩次，0. 25%胰酶進(jìn)行消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng) 24h至80%的匯合度，然后設(shè)12. 5 μ mol/L、25 μ mol/L、50 μ mol/L 3個(gè)濃度的DNA雙鏈斷 裂試劑依托泊甙作用12h，另設(shè)空白對照組。作用時(shí)間結(jié)束，PBS洗滌兩次，lOOOr/m離心 5min收集細(xì)胞，再用PBS洗滌1次后用DMEM培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞懸液待用。2)點(diǎn)膠取待測的肝癌細(xì)胞SMMC7721細(xì)胞懸液20 μ 1與在37°C下預(yù)熱的0. 8% 瓊脂糖凝膠60μ 1混勻后，取15μ 1點(diǎn)樣到本發(fā)明試劑盒里已制作好的凝膠板樣品孔中，每 個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)以上。3)細(xì)胞裂解在細(xì)胞裂解之前，將適量的溶液A和溶液B按1 1混合制成細(xì)胞 裂解液，將上述點(diǎn)樣好的凝膠板浸入4°C預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，4°C環(huán)境中避光裂解Ih后用 PBS避光浸洗2次，每次5min。4)解旋和電泳將浸洗好的凝膠板浸入4°C預(yù)冷的細(xì)胞解旋液中，4°C環(huán)境中避光 解旋30min后，4°C環(huán)境中150mA穩(wěn)流電泳30min。電泳緩沖液采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)TAE緩沖液。5)中和洗滌將解旋好的凝膠板用4°C預(yù)冷的0. 4mon/L Tris緩沖液(pH = 7. 5)避光浸洗2次，每次5min。6)熒光染色將中和洗滌過的凝膠板中每個(gè)樣品孔滴加10μ 1 PI，4°C環(huán)境中避 光染色I(xiàn)Omin后，用4°C預(yù)冷的0. 4mon/L Tris緩沖液(pH = 7. 5)沖洗多余的染液。7)觀察拍照熒光顯微鏡下200倍觀察，激發(fā)波長515 560nm。本實(shí)施例制備的樣品顯示的圖像清晰，有很高的熒光亮度，且與背景有很高的對 比度和分辨率(參見圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示損傷的肝癌SMMC7721細(xì)胞DNA碎片均定向脫離 細(xì)胞核形成典型的彗星圖像，而且拖尾的長度與DNA雙鏈斷裂試劑依托泊甙呈現(xiàn)劑量依賴 性，表明肝癌SMMC7721細(xì)胞DNA損傷程度與依托泊甙有很好的量效關(guān)系。實(shí)施例41)肝癌MHCC97-H細(xì)胞樣品的制備肝癌MHCC97-H細(xì)胞培養(yǎng)在10%新生小牛血 清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的RPM1640培養(yǎng)液中，37°C、C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳代時(shí) 傾去培養(yǎng)液，以PBS洗兩次，0. 25%胰酶進(jìn)行消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要將細(xì)胞接種于6孔板中 培養(yǎng)24h至80%的匯合度，然后12. 5 μ mon/L、25 μ mon/L、50 μ mon/L三個(gè)濃度的依托泊甙 作用12h，另設(shè)空白對照組。作用時(shí)間結(jié)束，PBS洗滌兩次，1000r/m離心5min收集細(xì)胞，再 用PBS洗滌1次后用DMEM培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞懸液待用。2)點(diǎn)膠取待測的肝癌MHCC97-H細(xì)胞的懸液20μl與在37°C下預(yù)熱的預(yù)熱的1 % 瓊脂糖凝膠混勻后，取10μ 1點(diǎn)樣到本發(fā)明試劑盒里已制作好的凝膠板樣品孔中，每個(gè)樣 品重復(fù)3個(gè)以上。3)細(xì)胞裂解在細(xì)胞裂解之前，將適量的溶液A和溶液B按1 1混合制成細(xì)胞 裂解液，將上述點(diǎn)樣好的凝膠板浸入4°C預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，4°C環(huán)境中避光裂解1. 5h后 用PBS避光浸洗2次，每次5min。4)解旋和電泳將浸洗好的凝膠板浸入4°C預(yù)冷的細(xì)胞解旋液中，4°C環(huán)境中避光 解旋45min后，4°C環(huán)境中150mA穩(wěn)流電泳30min。電泳緩沖液采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)TAE緩沖液。5)中和洗滌將解旋好的凝膠板用4°C預(yù)冷的0. 4mon/L Tris緩沖液(pH = 7. 5) 避光浸洗2次，每次5min。6)熒光染色將中和洗滌過的凝膠板中每個(gè)樣品孔滴加10μ 1 PI，4°C環(huán)境中避 光染色I(xiàn)Omin后，用4°C預(yù)冷的0. 4mon/L Tris緩沖液(pH = 7. 5)沖洗多余的染液。7)觀察拍照熒光顯微鏡下200倍觀察，激發(fā)波長515 560nm。本實(shí)施例制備的樣品顯示的圖像清晰，有很高的熒光亮度，且與背景有很高的對 比度和分辨率(參見圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示損傷的肝癌MHCC97-H細(xì)胞DNA碎片均定向脫 離細(xì)胞核形成典型的彗星圖像，而且拖尾的長度與依托泊甙呈現(xiàn)劑量依賴性，表明肝癌 MHCC97-H細(xì)胞DNA損傷程度與依托泊甙有很好的量效關(guān)系。實(shí)施例51)肝細(xì)胞Changliver樣品的制備肝細(xì)胞Changliver培養(yǎng)在10%新生小牛血 清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的RPM1640培養(yǎng)液中，37 °C、C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳代時(shí) 傾去培養(yǎng)液，以PBS洗兩次，0. 25%胰酶進(jìn)行消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要將細(xì)胞接種于6孔板中 培養(yǎng)24h至80%的匯合度，然后lOng/mlUOOng/ml新制癌菌素作用12h，另設(shè)空白對照組。 作用時(shí)間結(jié)束，PBS洗滌兩次，1000r/m離心5min收集細(xì)胞，再用PBS洗滌1次后用DMEM培 養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞懸液待用。
2)點(diǎn)膠取待測的肝細(xì)胞Changliver的懸液20 μ 1與在37°C下預(yù)熱的預(yù)熱的 1. 5%瓊脂糖凝膠60 μ 1混勻后，取25 μ 1點(diǎn)樣到本發(fā)明試劑盒里已制作好的凝膠板樣品孔 中，每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)以上。3)細(xì)胞裂解在細(xì)胞裂解之前，將適量的溶液A和溶液B按1 1混合制成細(xì)胞 裂解液，將上述點(diǎn)樣好的凝膠板浸入4°C預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，4°C環(huán)境中避光裂解1. 5h后 用PBS避光浸洗2次，每次5min。4)解旋和電泳將浸洗好的凝膠板浸入4°C預(yù)冷的細(xì)胞解旋液中，4°C環(huán)境中避光 解旋45min后，4°C環(huán)境中150mA穩(wěn)流電泳30min。電泳緩沖液采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)TAE緩沖液。5)中和洗滌將解旋好的凝膠板用4°C預(yù)冷的0. 4mon/L Tris緩沖液(pH = 7. 5) 避光浸洗2次，每次5min。6)熒光染色將中和洗滌過的凝膠板中每個(gè)樣品孔滴加10μ 1試劑IV，4°C環(huán)境中 避光染色I(xiàn)Omin后，用4°C預(yù)冷的0. 4mon/L Tris緩沖液(pH = 7. 5)沖洗多余的染液。7)觀察拍照熒光顯微鏡下200倍觀察，激發(fā)波長515 560nm。本實(shí)施例制備的樣品顯示的圖像清晰，有很高的熒光亮度，且與背景有很高的對 比度和分辨率(參見圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示損傷的肝細(xì)胞ChangliverDNA碎片均定向脫離 細(xì)胞核形成典型的彗星圖像，而且拖尾的長度與新制癌菌素呈現(xiàn)劑量依賴性，表明肝細(xì)胞 Changliver DNA損傷程度與新制癌菌素有很好的量效關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒，其特征在于設(shè)有盒體和試劑，所述試劑包括低熔點(diǎn) 瓊脂糖、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞解旋液和DNA染色劑；所述細(xì)胞裂解液由溶液A和溶液B組成，所述溶液A的配方為2 3mol/LNaCl，0. 1 0. 2mol/L EDTA-Na2, 5 IOOmmol/L Tris，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 5% 1. 5%肌氨酸鈉，余為去離子 水；所述溶液B的配方為體積分?jǐn)?shù)為 2%I~riton-100，5% 15%二甲基亞砜，余為去 離子水，所述溶液A與溶液B按體積比1 1混合；所述細(xì)胞解旋液的配方為0. 2 0. 5mol/L NaOH, 1 2mmol/L EDTA-Na2，余為去離子水；所述DNA染色劑為碘化丙啶、溴化乙錠、Hoechst 33342, hoechst 33358或DAPI。
2.如權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒，其特征在于所述溶液A的配方 為2. 5mol/L NaCl,0. lmol/LEDTA_Na2，lOmmol/LTris，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 肌氨酸鈉，余為去離 子水；所述溶液B的配方為體積分?jǐn)?shù)為Triton-IOO和10%二甲基亞砜，余為去離子 水。
3.如權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒，其特征在于所述細(xì)胞解旋液的 配方為0. 3mol/L NaOH和lmmol/L EDTA-Na2，余為去離子水。
4.如權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒，其特征在于所述碘化丙啶的濃 度為1 5 μ g/ml，所述溴化乙錠的濃度為10 100 μ g/ml。
5.一種細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)將細(xì)胞DNA損傷樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻得混合液，再將混合液點(diǎn)樣到凝 膠板樣品孔中；2)將點(diǎn)樣后的凝膠板浸入細(xì)胞裂解液中避光裂解；3)將裂解后的凝膠板浸入細(xì)胞解旋液中解旋，解旋完畢后電泳；4)往電泳后的凝膠板樣品孔滴加DNA染色劑染色，在熒光顯微鏡下分析檢測結(jié)果。
6.如權(quán)利要求5所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于在步驟1)中，所述低 熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 8% 1. 5%，所述細(xì)胞DNA損傷樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖 凝膠的體積比為1 2 10 ；所述點(diǎn)樣的體積為10 25 μ 1/樣品孔；所述凝膠板采用96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板蓋，所述板蓋上的凹陷用作樣品孔。
7.如權(quán)利要求6所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于所述凹陷底部刻有劃痕。
8.如權(quán)利要求5所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于在步驟2)中，所述細(xì) 胞裂解液在使用之前進(jìn)行4°C預(yù)冷；所述裂解的條件為溫度4 10°C，時(shí)間1 1.證；所 述裂解完成后采用PBS洗滌凝膠板1 3次，每次5 lOmin。
9.如權(quán)利要求5所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于在步驟；3)中，所述 解旋的條件為溫度4 10°C，時(shí)間30 45min ；所述電泳的條件為溫度4 10°C，時(shí)間 30 60min，電流50 150mA ；所述電泳完成后采用Tris緩沖液洗滌凝膠板1 3次，每 次 5 IOmin。
10.如權(quán)利要求5所述的一種細(xì)胞DNA損傷檢測方法，其特征在于在步驟4)中，所述染 色的條件為溫度4 10°C，時(shí)間5 20min。
全文摘要
一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒及其檢測方法。涉及細(xì)胞DNA損傷檢測技術(shù)，提供一種細(xì)胞DNA損傷檢測試劑盒及其檢測方法。包括低熔點(diǎn)瓊脂糖、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞解旋液和DNA染色劑。檢測方法為將細(xì)胞DNA損傷樣品懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻，混合液點(diǎn)樣到凝膠板樣品孔中；凝膠板浸入細(xì)胞裂解液中避光裂解；裂解后的凝膠板浸入細(xì)胞解旋液中解旋，解旋完畢后電泳；電泳后滴加DNA染色劑染色，在熒光顯微鏡下分析檢測結(jié)果。用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板蓋作為凝膠板代替載玻片用于單細(xì)胞凝膠電泳，與傳統(tǒng)的單細(xì)胞凝膠電泳的樣品玻片要鋪2、3層膠的工藝相比，將鋪膠點(diǎn)樣步驟合二為一，使得樣品制備工藝簡單，容易操作，不脫膠，成功率高。
文檔編號C12Q1/68GK102146455SQ20111002686
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者宋剛, 王偉偉, 胡天惠, 陳以旺 申請人:廈門大學(xué)