專利名稱：減少經(jīng)處理的精子樣品中的dna斷裂的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明實施方式總體涉及用于減少各種經(jīng)處理的細(xì)胞和精子細(xì)胞的群體中的DNA斷裂事件的數(shù)量的方法和系統(tǒng)，更具體而言，涉及用于改變細(xì)胞處理和精子分選過程以減少各種細(xì)胞和精子懸浮液中的DNA斷裂事件、用于減少各種細(xì)胞和精子樣品中的DNA的斷裂發(fā)生率以及用于改善輔助生殖技術(shù)和操作的整體成功率的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
精子和性別分選的精子(基于攜帶X或者Y染色體分選的精子)對輔助生殖技術(shù)，特別是畜牧繁殖業(yè)具有重大意義的生物材料。但是，損傷的和/或死亡的精子缺乏通過人工授精(Al)、體外受精(IVF)、胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)、胚胎移植(ET)或者其它輔助生殖技術(shù)產(chǎn)生后代的活力。損傷的細(xì)胞可以包括膜改變的細(xì)胞、經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞、以及具有DNA斷裂的細(xì)胞。損傷的精子，當(dāng)其存在于輔助生殖技術(shù)中使用的有活力的精子群體中時，可能能夠使卵子受精，但是可能無法產(chǎn)生有活力的胚胎或者產(chǎn)生的胚胎具有基因異常(其不會正常發(fā)育或稍后死亡)。以這種方式，具有DNA斷裂的精子和有活力的精子競爭，減少了成功妊娠的總體可能性，增加了產(chǎn)生畸變后代的可能性。Simon等(Human Reproduction, Vol. 25No. 7pp. 1594-1608(2010))證明了 精子DNA斷裂比率的增大對采用例如IVF和ICSI等輔助生殖技術(shù)的妊娠率和胚胎發(fā)育具有不利影響。因此，需要這樣的涉及精子和其他生殖細(xì)胞處理的方法和系統(tǒng)，其能減少經(jīng)處理的生殖細(xì)胞或分選的精子亞群體，特別是用于輔助生殖過程中的分選的亞群體中的DNA斷裂水平或DNA的斷裂率。更具體而言，對于處理常規(guī)的精子和性別分選精子存在該需求。性別分選的精子是性別富集的精子亞群體，其以攜帶X染色體或Y染色體為特征并基于此進(jìn)行分選。利用所述性別分選的精子，可以以高度確定性產(chǎn)生具有所期望的性別的后代，因而特別有利于乳制品和牛肉工業(yè)。絕大多數(shù)的精子分選方法采用流式細(xì)胞分析和過程，其通常結(jié)合非毒性DNA結(jié)合熒光染料，該染料在適宜的條件下透過細(xì)胞膜，以化學(xué)計量方式和細(xì)胞的DNA相關(guān)聯(lián)。與各精子關(guān)聯(lián)的染料的量與包含在每個細(xì)胞中的DNA的量密切相關(guān)，其根據(jù)激光激發(fā)可使得帶有Y染色體的精子和帶有X染色體的精子產(chǎn)生可區(qū)分的熒光模式。美國專利5，135，759,6, 357，307,7, 371，517和7，758，811 (其中每個都通過引用的方式并入本文)提供了基于X染色體和Y染色體差異的適于精子分選的系統(tǒng)和方法。雖然所有動物的新鮮精液本身含有一定基準(zhǔn)數(shù)量的具有DNA斷裂的精子，來自各個捐助者的精液中的DNA斷裂的總體水平卻可隨著以下因素的不同而變化，如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、組蛋白-魚精蛋白的無法替代、和其他與精液產(chǎn)生相關(guān)的環(huán)境因素等。在隨后的精子處理過程中，這些DNA損傷因子的一部分可以被復(fù)合。除此之外，鑒于精子通常是易損的細(xì)胞，那么體外射精后得到的精子樣品在大多數(shù)精子處理過程(同時準(zhǔn)備授精樣品)中可能會遭受到額外的醫(yī)源性的損傷。特別是，精子性別分選的方法學(xué)包括幾個步驟，對細(xì)胞制造應(yīng)力刺激，其不僅是損傷，還可以有助于和加強潛在的醫(yī)源性損傷。由于所述分選過程某些步驟中所制造的損傷可以整個分選過程中耐受的化學(xué)和物理應(yīng)力而復(fù)合，因此特別需要最大限度地減少在精子群體被處理、分選和存儲時該群體中DNA斷裂事件的發(fā)生。因而，需要通過減少分選的精子群體中的DNA斷裂的發(fā)生來改善經(jīng)處理的精子樣品的活力的方法和系統(tǒng)，該方法和系統(tǒng)用于改善使用性別分選的精子的人工生殖授精技術(shù)和后代健康發(fā)育的成功率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實施方式通常涉及使用流式細(xì)胞儀和微流體裝置的細(xì)胞分選方法，所述方法用于分選精子和其他生殖細(xì)胞，并且與初始的細(xì)胞或者使用常規(guī)的分選方法產(chǎn)生的經(jīng)分選的精子樣品相比，所述方法產(chǎn)生的精子群體顯示出減少的DNA斷裂量或減少的DNA斷裂率。這些具有減少的DNA斷裂量或減少的DNA斷裂率的精子群體有利于改善使用輔助授精和/或受精技術(shù)(如Al、ICSI、IVF、ET及其他相關(guān)技術(shù))的成功的出生率。 因此，本文中所公開的實施方式提供了用于減少經(jīng)處理的細(xì)胞和分選的精子樣品中的DAN斷裂的總體水平的方法和系統(tǒng)。在一個方面中，本文中所公開的實施方式提供了通過減少初始細(xì)胞、精液或經(jīng)處理的細(xì)胞樣品中的細(xì)菌污染(在本公開中也稱為細(xì)菌感染(BI))來減少細(xì)胞或精子群體中的DNA斷裂的方法和系統(tǒng)。在另一個方面中，本文中所公開的實施方式涉及通過以逐步的方式控制樣品的酸度來減少經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，如精子樣品或性別分選的精子樣品中的DNA斷裂率的方法和系統(tǒng)。在又一個方面中，本文中所公開的實施方式提供了用于性別分選精子的方法和系統(tǒng)，相比于此前的分選和處理方法，所述方法和系統(tǒng)具有減少了 DNA斷裂的水平的改進(jìn)步驟。在再一個方面中，本文中所公開的實施方式涉及改進(jìn)的精子染色步驟，其通過添加具有較高pH的淬滅染料從而減少DNA的斷裂并保存精子活力。在另一個方面中，本文中所公開的實施方式涉及采用新淬滅染料改進(jìn)染色過程。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，黃色食品染料，更具體而言黃色6 (yellow 6)在分離精子時提供了有關(guān)分辨率的益處，并且需要較少的Hoechst染色劑。由于需要較少的染色劑，在分選過程結(jié)束時改善了精子的健康。


圖IA示出了流式細(xì)胞儀中精子的前向角熒光V. s.側(cè)向角熒光的代表性繪圖。圖IB示出了染色質(zhì)擴散實驗中含有精子的一側(cè)，其中所述精子收集自特殊分選區(qū)域。圖IC示出了染色質(zhì)擴散實驗中含有精子的一側(cè)，其中所述精子收集自特殊分選區(qū)域。圖2A示出了流式細(xì)胞儀中精子的前向角熒光v. s.側(cè)向角熒光的代表性繪圖。圖2B示出了流式細(xì)胞儀中精子的選通部分(gated portion)，其繪制為前向熒光V. s.積分的前向熒光的圖。圖3A示出了常規(guī)的精子樣品中隨時間推移的DNA斷裂的示意圖。圖3B示出了性別分選的精子樣品中隨時間推移的DNA斷裂的示意圖。圖3C示出了在常規(guī)樣品和性別分選的精子樣品中隨時間推移的平均DNA斷裂的示意圖。圖4示出了根據(jù)本文提出的某些實施方式的流式細(xì)胞儀。
圖5A示出了描繪未表現(xiàn)出細(xì)菌感染的樣品中在不同時間的精子樣品中的DNA斷裂的百分率的線箱圖。圖5B示出了描繪未表現(xiàn)出細(xì)菌感染的樣品中在不同時間的精子樣品中的DNA斷裂的百分率的示意圖。圖5C示出了描繪表現(xiàn)出細(xì)菌感染的樣品中在不同時間的精子樣品中的DNA斷裂的百分率的線箱圖。圖示出了描繪表現(xiàn)出細(xì)菌感染的樣品中在不同時間的精子樣品中的DNA斷裂的百分率的示意圖。圖6示出了幾種不同的Red TALP處理的DNA斷裂隨時間推移的圖示。圖7A和B示出了樣品精液的前向熒光V. s.側(cè)向熒光的繪圖。圖8A和B分別示出了選通樣品7A和7B的Rl區(qū)域產(chǎn)生的流式細(xì)胞儀中峰值前向熒光的直方圖。
具體實施例方式在詳述所述方法和系統(tǒng)之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述方法并不限于本文中所公開的特定的實施方式，而是可以以多種方式實施。此外，被描述的方法和系統(tǒng)是以通常的方式公開，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員一旦理解了這種一般性的規(guī)律，這些方法就能運用于具體的系統(tǒng)中。一些實施方式涉及產(chǎn)生不連續(xù)的亞群體的細(xì)胞分選方法，其中一些亞群體富含特定的特征，并且相比于通過此前的方法分選的精子，所分選的亞群體包含較少的細(xì)胞DNA斷裂。通常，精子樣品直接或間接地獲自哺乳動物，包括但不限于Wilson，D.E.和Reeder, D. M. , Mammal Species of the World, Smithsonian Institute Press (1993)中列出的那些，該文獻(xiàn)的文本整體以引用的方式特此并入本文中。這些哺乳動物包括但不限于牛、馬、豬、犬、貓、海豚、山羊、綿羊和烏鴉。在一個實施方式中，純精液(新鮮采集的精液)可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的增量劑(extender)或緩沖溶液進(jìn)行稀釋或離心分離來處理，從而保存增容的精子樣品中精子的活動力和生殖力。在另一個實施方式中，精子樣品也可以通過解凍此前凍存的和/或此前處理的精子(來自精子儲存管)來建立。在又一個實施方式中，精子樣品可包含分別去除其精子尾部的精子頭部。在一個實施方式中，諸如喹諾酮等抗菌劑可以與細(xì)胞或精子樣品結(jié)合以最大限度地減少精漿中和精子表面上的細(xì)菌及其他微生物的生長。喹諾酮是一組萘啶酸和/或氯喹衍生物，其包括但不限于環(huán)丙沙星、吡哌酸、噁喹酸和西諾沙星。抑制精子樣品中的細(xì)菌生長已經(jīng)與精子樣品中DNA分裂的水平相關(guān)聯(lián)。在一些實施方式中，喹諾酮可以是來自氟喹諾酮組的環(huán)丙沙星，并且作為主要的抗菌化合物添加。在其他的實施方式中，包含一種或多種抗生素的具有至少一種喹諾酮的喹諾酮混合物可以直接添加至精子或精液樣品中，緩沖溶液中，增容的精子樣品中，染色介質(zhì)中，或者在處理精子時使用的另外介質(zhì)中。通過孵育、混合或通過其他的方法可以平衡并均勻地分散包含抗生素或抗微生物劑的精子懸浮液。選擇的喹諾酮在目標(biāo)細(xì)胞或精子懸浮液中可以以約O. 05 μ g/πιΓ約20 μ g/ml、約O. 2 μ g/ml 約5 μ g/ml和/或約O. I μ g/ml 約2 μ g/ml存在。兩種以上的喹諾酮可以各自以指定的濃度添加。經(jīng)處理的或分選的精子可以被直接收集到包含喹諾酮或喹諾酮混合物的介質(zhì)中。作為選擇，喹諾酮或喹諾酮混合物也可以隨后添加，包括在分選前，在分選后，乃至在分選、冷凍和解凍之后。緩沖溶液可包括一種或多種的緩沖體系，可以選自非窮盡性的目錄，包括TRIS、檸檬酸鈉、卵黃、奶、TALP、MOPS、HEPES類的緩沖劑、磷酸鹽、硼酸鹽、碳酸氫鹽、氟化物、包含BSA的緩沖液及其組合。 所述方法或系統(tǒng)可進(jìn)一步包括基于所給定的精子樣品的具體組成來調(diào)節(jié)或優(yōu)化喹諾酮的組合的機制，從而調(diào)節(jié)喹諾酮的水平以最大限度地抑制特定的精子樣品中的細(xì)菌的生長。該調(diào)節(jié)或優(yōu)化的一個實例可涉及到監(jiān)測并調(diào)節(jié)特定的精子樣品的酸度以減少精子懸浮液中的DNA斷裂的水平。所得到的精子樣品于是可以預(yù)先凍存和/或預(yù)先性別分選。在該實施方式中，喹諾酮或喹諾酮的混合物可以在解凍后步驟中添加，或者在分選處理后步驟中添加。在一個實施方式中，可以將凍存的精子解凍并將喹諾酮添加至解凍的精子樣品中。這可以與分選(如性別分選)相結(jié)合，并在分選(如性別分選)之前或之后進(jìn)行。在另一個實施方式中，在加入喹諾酮之后可以凍存精子樣品。在每一種情況中，經(jīng)處理的精子可用于建立授精樣品，無論其是常規(guī)的還是性別分選的。在另一個實施方式中，喹諾酮或喹諾酮混合物可應(yīng)用于IVF過程或培養(yǎng)基以減少胚胎懸浮液中的細(xì)菌污染。在一些實施方式中，添加喹諾酮以實現(xiàn)顯示出DNA斷裂的細(xì)胞數(shù)的減少，其可以減少細(xì)胞懸浮液中的DNA斷裂的整體水平。所述細(xì)胞懸浮液可以是任何類型的精液樣品，如新鮮的、冷凍的、常規(guī)的、分選的，也可以是卵母細(xì)胞或卵母細(xì)胞衍生物的懸浮液，包括但不限于卵母細(xì)胞、去核細(xì)胞及其經(jīng)注射的衍生物、經(jīng)胞內(nèi)注射的卵母細(xì)胞，冷凍胚胎以及其他相關(guān)的生殖細(xì)胞懸浮液。本文中的一些方面涉及增容的精子樣品，該樣品可包含精子、喹諾酮和/或緩沖溶液。在一個實施方式中，喹諾酮可包括氟喹諾酮，例如環(huán)丙沙星，不過也可以使用其他的喹諾酮。所述喹諾酮可以以約O. 05 μ g/ml 約20 μ g/ml、約O. 2 μ g/ml 約5 μ g/ml和/或約O. I μ g/πιΓ約2 μ g/ml的范圍存在于新鮮的或增容的精子樣品中。所述緩沖溶液可以是前述的任何一種，以及它們的任意組合。增容精子樣品中的精子可包括以生殖力特征(例如X染色體或Y染色體的存在)而分選的精子。在另一個方面中，某些實施方式涉及消除或減少受到污染的細(xì)胞樣品或細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)菌及其他微生物的水平的方法。該方法可包括下述步驟獲得包含生殖細(xì)胞的細(xì)胞樣品，并將一種或多種喹諾酮施用至細(xì)胞樣品或細(xì)胞培養(yǎng)基以恢復(fù)具有最少可檢測水平的細(xì)菌污染或不具有可檢測水平的細(xì)菌污染的細(xì)胞系。所述生殖細(xì)胞可包括精子、卵母細(xì)胞、卵子、具有或不具有注入的DNA的去核配子、胚胎、可通過添加一種或多種喹諾酮來進(jìn)行處理并孵育以實現(xiàn)喹諾酮的抗微生物效果的培養(yǎng)的胚胎。在另一個方面中，某些實施方式涉及用于產(chǎn)生胚胎的方法，該方法可以包括以下步驟獲得精子樣品、使精子樣品與喹諾酮結(jié)合、抑制精子樣品中的細(xì)菌生長和用精子使卵子受精。所述精子可以利用各種染色和分選方法來進(jìn)行性別分選，所述方法包括但不限于如前所述的本領(lǐng)域中的那些標(biāo)準(zhǔn)方法。在另一個方面中，所述方法可涉及用改進(jìn)的染色過程來處理精子樣品的方法。該方法的第一步為獲得精子，所述精子可以是前述的任一種精子懸浮液，包括此前被冷凍的精子樣品。所述精子懸浮液然后用第一培養(yǎng)基中的DNA選擇性染料染色，隨后通過添加可含有第二染料的第二培養(yǎng)基來染色。可調(diào)整第二染料的PH配合第一染料的pH，或第二染料 的pH配合第一染料的pH與精子樣品的pH的組合，以維持或調(diào)整pH至所需范圍。調(diào)整第二染料的pH進(jìn)行配合應(yīng)當(dāng)理解為例如包括以下操作使第二培養(yǎng)基的pH與第一培養(yǎng)基的PH相配；用適宜的緩沖系統(tǒng)改變第一培養(yǎng)基的pH以實現(xiàn)染色效果，然后再次調(diào)整pH至更合適的pH，從而將細(xì)胞損傷減至最少；或通過添加精子樣品改變第一培養(yǎng)基的PH以達(dá)到所需的最終pH。通過減少對待染色的精子的潛在的pH的變化和沖擊，或通過達(dá)到或接近最終的目標(biāo)PH，可以完成調(diào)整第二培養(yǎng)基的pH進(jìn)行配合的步驟。第二培養(yǎng)基或緩沖系統(tǒng)可包含第二淬滅染料以便于分選。調(diào)整第二培養(yǎng)基的步驟可包括調(diào)整第二培養(yǎng)基的pH至5. 5以上，在約5. 5 約7. 4之間，至約6. Γ約7. 4之間，約6. 4和約7. 4。第二培養(yǎng)基的pH可被調(diào)整為在第一培養(yǎng)基的2pH單位之內(nèi)，第一培養(yǎng)基的IpH單位之內(nèi)，或者基本上具有與第一培養(yǎng)基相同的pH。類似地，第二培養(yǎng)基也可以被調(diào)整為達(dá)到最終的精子樣品的pH，即約6. 6 約7. 2。此前，沒有認(rèn)識到應(yīng)用包含第二染料的pH 5. 5的培養(yǎng)基將殺死懸浮液內(nèi)的精子。在pH 5. 5TALP接觸部分溶液并開始混合時，但在懸浮液達(dá)到平衡之前，局部的濃度更偏酸性，具有較低PH的混合物實際上接觸了很少的局部的精子亞群體，并損傷或殺死這些局部的精子，從而減少了精子樣品的整體的精子活動性和活力。這樣，添加PH 5. 5的培養(yǎng)基的處理步驟會對精子產(chǎn)生意想不到的負(fù)面效果。令人驚訝的是，該效果可能比施用更高PH的淬滅染料更具破壞性。傳統(tǒng)上認(rèn)為在較高的PH下施用淬滅染料將導(dǎo)致最終的懸浮液的pH對于精子的健康而言過高。對于本公開的目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到指定PH(例如5. 5pH)意味著與pH 5. 5相同。第一培養(yǎng)基可包括TALP類緩沖液，或另外的緩沖液，與DNA選擇性染料(如發(fā)熒光的DNA選擇性染料、Hoechst 33342或諸如本文中所描述的那些的其他染料)的組合。第二培養(yǎng)基可包含紅色TALP，其可包括TALP類的緩沖液和紅色食品染料。第二培養(yǎng)基可包含淬滅染料。所述淬滅染料可以是紅色食品染料、黃色食品染料、percoll (經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆?；鞈乙?、碘化丙啶、臺盼藍(lán)或已知滲透受損的細(xì)胞膜用于淬滅發(fā)熒光的染料的其他染料。如前所述，處理過的精子隨后進(jìn)行性別分選，并在選自以下緩沖液的緩沖液中進(jìn)行增容TRIS、檸檬酸鈉、卵黃、牛奶、TALP, MOPS、HEPES、磷酸鹽、KMT、硼酸鹽、碳酸氫鹽、包含BSA的緩沖液和/或氟化物、以上物質(zhì)的組合或其他用于精子處理或存儲的已知的緩沖液。在一個實施方式中，以第一培養(yǎng)基和第二培養(yǎng)基染色的步驟可在單獨的pH調(diào)整事件中完成。在另一個實施方式中，染色的精子可以被性別分選，然后凍存。在一些可能希望對精子樣品進(jìn)行性別分選的實施方式中，精子樣品可以用熒光染料等標(biāo)記來染色。所述標(biāo)記可以是DNA選擇性染料,如Hoechst 33342、Hoechst 33258、BBC,SYBR-14,SYBR Green I、雙苯酰亞胺染料，或其組合。為了使精子均勻地且在合理的時間內(nèi)吸收DNA選擇性染料(如Hoechst 33342)，染色過程需要升高精子的溫度和pH。溫度可以升至34°C 39°C，pH升至約7. 2^7. 4。通過第一染色步驟可以對精子施加這些條件，在第一染色步驟中引入的第一培養(yǎng)基具有所需的pH、克分子滲透壓濃度和DNA選擇性染料的濃度。僅舉一個實例來說，該第一培養(yǎng)基可以是補充有BSA(牛血清清蛋白)、卵黃、抗生素和其他添加劑的TALP類的或HEPES類的溶液。 在一些實施方式中，所述精子可以用淬滅染料來染色，紅色食品染料、碘化丙啶或具有淬滅性質(zhì)的另外的染料等。習(xí)慣上，制備第二培養(yǎng)基使其具有與第一培養(yǎng)基類似的組成，區(qū)別在于其中添加了淬滅染料并處于較低的pH以使總體樣品的pH恢復(fù)至對精子的損害較低的水平。本發(fā)明的一個實施方式涉及以與第一培養(yǎng)基相同或相近的較高的PH提供第二培養(yǎng)基中的第二染料的方法。一個方面涉及用改進(jìn)的淬滅染料來染色精子。該方法的起始步驟為獲得精子。精子獲自新鮮的精液、純精液乃至解凍的此前冷凍的精液。精子隨后在受控的染色條件下用熒色物染料孵育。受控的染色條件可包括在30°C 39°C的溫度、在7. (Γ7. 4的pH孵育20分鐘 I小時的時間。所述熒色物染料可以是諸如Hoechst 33342等熒光染料。淬滅染料可以在孵育步驟之后或在孵育期間加入到精子中。所述淬滅染料可以是黃色食品染料、橙色食品染料、綠色食品染料乃至藍(lán)色飾品染料。更具體而言，所述淬滅染料可以是6號黃色食品染料。無論選擇哪一種淬滅染料都應(yīng)選擇其展示改進(jìn)的分選應(yīng)用(如微流體分選或流式細(xì)胞儀)的分辨率。在一個實施方式中，使染色的精子隨后流經(jīng)諸如流式細(xì)胞儀或微流體裝置等分選器，然后曝露于輻射能量。使用諸如Hoechst 33342等熒光染料時，輻射能量源可以是在UV波長操作的激光器。該激光激發(fā)可基于由染色精子所發(fā)出的熒光能來區(qū)分帶X染色體和Y染色體的精子。在許多實施方式中，使用流式細(xì)胞儀或基于熒光或可見光發(fā)射的另外的分析技術(shù)，可對各染色精子進(jìn)行評估。在流式細(xì)胞術(shù)中，精子被夾帶在液體流中，然后該液體流被分裂成液滴，每個液滴理想地含有單個精子，其在檢查區(qū)用激光等能量源單獨地照射。激光是能量源的一個實例，不過弧光燈和其它輻射能源可以用來輻射被染色的精子。所述DNA選擇性染料將吸收來自激光的能量并響應(yīng)于激發(fā)而發(fā)出不同波長的光。這種發(fā)射光的量可以定量，以測定與樣品中的其他精子相比的DNA選擇性染料的相對量。DNA選擇性染料的量隨后可用于確定精子的特性，更具體地可用于確定是否單個精子含有X染色體或Y染色體。用于分選精子的系統(tǒng)可包括定位以用于檢測在檢查區(qū)內(nèi)的輻射能量與和各精子相關(guān)聯(lián)的DNA選擇性染料的相互作用的傳感器。該傳感器可以是光電倍增管，其可基于這些發(fā)射的水平產(chǎn)生信號，并能夠與用于處理信號且對各事件進(jìn)行分選確定的分析器聯(lián)通。評估該信號，以評估樣品中的各精子的DNA特性。DNA特性可包括在各精子核中X染色體或Y染色體的存在。一旦通過所述分析器進(jìn)行確定，信號可以傳送至分離器以將樣品分離為不同群體。例如，在一些使用流式細(xì)胞術(shù)的精子分選系統(tǒng)中，基于所述分析器產(chǎn)生的信號，通過對夾帶精子的流體進(jìn)行充電可以分離精子。構(gòu)成液體流并與液體流分離的帶電的液滴然后保持該電荷，并通過偏轉(zhuǎn)平板而發(fā)生電磁偏轉(zhuǎn)，從而引導(dǎo)所述液滴進(jìn)入幾個容器中的一個。分離的精子然后根據(jù)其DNA特性被分選到多個收集元件中。在經(jīng)分詵的精子中的DNA斷裂本文中提供的四個實驗例示了將死亡的和DNA損傷的精子與有活力的精子樣品分離的分選技術(shù)。死亡的和將死的精子群體中的精子有較高的DNA斷裂頻率，而分入有活 力的亞群體中的精子則存在較低水平的精子DNA斷裂。通過組合多種分選技術(shù)(如使用流式細(xì)胞術(shù)的性別分選)，可以檢測具有高水平的精子損傷，由此將該精子分選到死亡的亞群體中，而其余部分可包含活的亞群體，例如攜帶活的X染色體和/或活的Y染色體的亞群體。死亡的亞群體與活的亞群體均可包括受損傷的或者經(jīng)歷DNA斷裂的細(xì)胞，但是其在活的亞群體細(xì)胞中的比率分布是最小的。證明DNA的損傷減少的實驗在接下來的實驗中，在3歲至9歲之間的年齡選擇5只Jersey公牛和15只Holstein公牛，制備精子樣品。每種性別分選的樣品使用MoFlo SX TM (BeckmanCoulter, Miami, Florida)進(jìn)行分選?；谑褂?Hoechst 33342 (MolecularProbes, Eugene, Oregon)和紅色食品染料(FD&C#40, Molecular Probes Eugene, Oregon)而產(chǎn)生的熒光信號的差異來分選精子。具有較高DNA含量的細(xì)胞，即X-染色體攜帶群體的熒光信號比具有較低DNA含量的細(xì)胞，即Y-染色體攜帶群體的熒光信號更強。紅色食品染料通常被排除在具有健康完整的胞膜的那些精子之外，但其保留在具有受損的胞膜(其淬滅了那些細(xì)胞中的相當(dāng)大量的熒光信號)的精子內(nèi)。 在每個實驗中，基于熒光信號的差異選擇攜帶X-和攜帶Y-染色體的分選的精子，其使用 16. 2mM Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA),該染料在由 20%卵黃-TRIS擴增劑構(gòu)成的捕捉液中稀釋。使用與常規(guī)精液制備相同的標(biāo)準(zhǔn)，以及被選擇用于要處理的精液的標(biāo)準(zhǔn)精液特征的截止值。在所有的實驗中，用于常規(guī)的或性別分選的精子儲存管精液的公牛精液只有滿足以下標(biāo)準(zhǔn)時才能被使用1)55%的最小活動力；2)900xIO6 個精子/mL 的最小濃度，使用 SPl-Cassette, Reagent SlOO 和NuckH)(’(uintcr'K SP-lOO 系統(tǒng)(ChemoMetec A/S, Gydevang 43, DK-3450 Allerod, Denmark)測定，不過也可以使用其他相當(dāng)?shù)南到y(tǒng)；和3) 15%的初級形態(tài)，15%的次級形態(tài)，以及總形態(tài)計數(shù)不超過25%。此外，用于解凍后分析的樣品必須滿足以下的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制條件1)前向運動活動力在Oh時至少45%，在3h時為至少30% ;和2)在3h時包括至少50%的完整的頂體。對于解凍3小時后的活動力以及頂體的測定，所有的樣品在加濕室中于37°C孵育3h。對于所有精液的質(zhì)量評估，使用 75x25mm 玻璃顯微載玻片(Andwin, Addison, Illinois,美國)和 22x22mm#l. 5 蓋玻片(Thomas Scientific, Swedesboro, New Jersey,USA)。使用明視野顯微術(shù)進(jìn)行所有的活動力評估，使用微分干涉對比(DIC)顯微術(shù)(放大倍數(shù)為x400)進(jìn)行后期的完整頂體和形態(tài)評估。實驗中所用的全部擴增劑均具有相同的配方，其具有6. 8的pH，和在300m0sm時與TRIS擴增劑平衡的克分子滲透壓濃度。對于凍存，使用甘油通過兩步增容對分選的和常規(guī)的精子樣品進(jìn)行處理。實驗中所用的所有冷凍-解凍的性別分選樣品包含2. Ix IO6個精子/精子儲存管(O. 25cc)，而常規(guī)的樣品則具有25x IO6至30x IO6個精子/精子儲存管(O. 5cc)的范圍。來自每只單獨公牛的純精液被分成兩等分試樣。一個等分試樣被性別分選，之后使用諸如MVDigitcool· (IMV, Ce dex, France)等自動冷凍裝置將精子在低溫穩(wěn)定化后冷凍，并保存在液氮中。第二個等分試樣被直接凍存，以用于解凍后的DNA斷裂水平的后續(xù)分析。在進(jìn)行了 X染色體和Y染色體的性別選擇后對不同的亞群體進(jìn)行精子DNA斷裂分析，同時比較每只公牛的兩份等分試樣。在各實驗中，使用Sperm-Halomax 試劑盒(Halotech DNA, Madrid, Spain)測定 DNA斷裂。每個精子樣品被裂解，然后制備在載玻片上的瓊脂糖中。所述載玻片然后用SYBRI (Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon)或者GELRED (Biotium, Hayward, California)染色，使染色質(zhì)染色，其在具有DNA斷裂和沒有DNA斷裂的被裂解的精子周圍的分散不同。然后具有斷裂的DNA的細(xì)胞和具有完整的DNA的細(xì)胞在每個載玻片上被可視化地識別。關(guān)于圖1，可以看到在流式細(xì)胞儀中分選的精子的前向熒光對于側(cè)向熒光的圖(圖1A)。該圖上一個亞群體包含大比率的死亡或?qū)⑺赖木?圖IA中的R2)，其他組包含活精子(圖IA中的Rl)。在商購的流式細(xì)胞儀(例如MoFlo SX或者M(jìn)oFlo SX XDP (BeckmanCoulter, Miami, Florida))上顯示的分選參數(shù)的區(qū)域被標(biāo)示出來,其示出了基于前向突光和側(cè)向熒光來選通精子細(xì)胞的圖。圖IB示出了來自Rl的精子細(xì)胞的原位熒光顯微照片，使用了 Sperm-Halomax試劑盒，其中細(xì)胞具有小而緊密的暈環(huán)表明精子沒有經(jīng)歷DNA斷裂。在該載玻片上，可以看到單個的精子，其染色質(zhì)松散地分散于膜的周圍，表明該精子已經(jīng)或正在經(jīng)歷DNA斷裂。關(guān)于圖1C，示出了來自R2的精子，可以看到其中的幾個精子具有很寬的分散的染色質(zhì)的暈環(huán)，表明了 DNA斷裂。關(guān)于圖2A和2B，一個亞群體包括主要是死亡的精子(圖2A中的R2)，其余兩組主要由活精子(圖2A中的Rl)亞群體組成，所述活精子亞群體包含攜帶X-染色體(圖2B中的R3)和攜帶Y-染色體(圖2B中的R4)的精子，純度為約95%。MoFlo SX XDP可構(gòu)造為將R3、R4和R2中的每一個選入分開的容器中，而MoFlo SX可以用于從R2精子中分離出Rl精子° 使用 STS Sexed Semen Purity Analyzer (Sexing Technologies, Navasota, TX),其提供了攜帶X和Y染色體的精子群體的高分辨率的峰，并依據(jù)2000個精子設(shè)立每次分析的基礎(chǔ)，從而測定樣品的性別比率純度。相對于各分選前的樣品(該樣品獲取自染色和孵育后而在分選之前)中得到的水平，分析并比較所有這些亞群體的DNA斷裂的水平。各樣品分選總計2x IO6個精子?；趫D2A中的區(qū)域2分選死亡的精子，排除落在該區(qū)域之外的所有其他細(xì)胞。分選前精液樣品中死亡細(xì)胞的比例平均為13%，由此提供的平均分選速度是800至900個死亡精子/秒。因此，通過該過程從初始樣品中除去了約85%的包含斷裂的DNA的精子。實施傲I-進(jìn)行第一個實驗以分析性別分選前、后DNA斷裂量的差異。精子樣品取自5只Jersey公牛，每個樣品被分成兩份等分試樣。第一組等分試樣被性別分選然后凍存。第二組等分試樣被直接凍存。表I示出了在每只公牛的分選前及分選后獲得的DNA斷裂的水平。表I (DNA斷裂％，性別分選)
權(quán)利要求
1.一種用于抑制細(xì)胞樣品中細(xì)菌的生長的方法，所述方法包括以下步驟 a.獲得生殖細(xì)胞樣品或精子樣品； b.使所述生殖細(xì)胞樣品或精子樣品與喹諾酮結(jié)合；和 c.抑制所述生殖細(xì)胞樣品或精子樣品中的細(xì)菌生長。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述喹諾酮包括氟喹諾酮。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述氟喹諾酮包括環(huán)丙沙星。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括凍存所述精子樣品的步驟。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括用緩沖溶液增容所述精子樣品以形成增容的精子樣品的步驟。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，使所述精子樣品與喹諾酮結(jié)合的步驟還包括對選自由所述精子樣品、所述增容的精子樣品和所述緩沖液組成的組中的一種施用所述喹諾酮。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述緩沖溶液選自由TRIS、檸檬酸鈉、卵黃、奶、TALP、HEPES、磷酸鹽、硼酸鹽、碳酸氫鹽、MOPS、含有BSA的緩沖液及其組合組成的組。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，使所述生殖細(xì)胞樣品或精子樣品與喹諾酮結(jié)合的步驟還包括用喹諾酮孵育所述生殖細(xì)胞樣品或精子樣品。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，使所述精子樣品與喹諾酮結(jié)合的步驟基本上發(fā)生在收集精子的時候。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，所述方法還包括將凍存的所述精子樣品解凍的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，使所述精子樣品與喹諾酮結(jié)合的步驟發(fā)生在將凍存的所述精子樣品解凍的步驟之后。
12.如權(quán)利要求I所述的方法,其中，以約O.05 μ g/πιΓ約20 μ g/ml、約O. 2 μ g/mf約5 μ g/ml和/或約O. I μ g/mf約2 μ g/ml的濃度提供所述喹諾酮。
13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，形成抗菌培養(yǎng)基的步驟還包括對IVF培養(yǎng)基和/或IVF過程施用喹諾酮以減少或抑制卵子和/或胚胎的細(xì)菌污染的步驟。
14.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括以下步驟 a.基于所需的生殖力特征對所述精子樣品中的精子進(jìn)行區(qū)分；和 b.基于所述所需的生殖力特征分選精子。
15.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，基于所需的生殖力特征分選精子的步驟還包括對所述精子樣品中的精子進(jìn)行性別分選以形成攜帶X染色體的精子的性別富集群體和/或攜帶Y染色體的精子的性別富集群體。
16.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括由所述精子樣品建立授精樣品的步驟。
17.一種增容的精子樣品，所述樣品包含 a.精子； b.喹諾酮；和 c.緩沖溶液。
18.如權(quán)利要求17所述的增容的精子樣品，其中，所述喹諾酮包括氟喹諾酮。
19.如權(quán)利要求18所述的增容的精子樣品，其中，所述氟喹諾酮包括環(huán)丙沙星。
20.如權(quán)利要求17所述的增容的精子樣品，其中，以約O.05 μ g/πιΓ約20 μ g/ml、約O.2 μ g/ml 約5 μ g/ml和/或約O. I μ g/ml 約2 μ g/ml的濃度提供所述喹諾酮。
21.如權(quán)利要求17所述的增容的精子樣品，其中，所述緩沖溶液選自由TRIS、檸檬酸鈉、卵黃、奶、TALP, MOPS、HEPES、磷酸鹽、KMT、硼酸鹽、碳酸氫鹽、含有BSA的緩沖液及其組合組成的組。
22.如權(quán)利要求17所述的增容的精子樣品，其中，所述精子包括根據(jù)生殖力特征分選的精子。
23.如權(quán)利要求22所述的增容的精子樣品，其中，所述生殖力特征包括存在X染色體或存在Y染色體。
24.一種對受到污染的細(xì)胞樣品或細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌的方法，所述方法包括以下步驟 a.獲得包含生殖細(xì)胞的細(xì)胞樣品； b.對受到污染的細(xì)胞樣品或細(xì)胞培養(yǎng)基施用一種或多種喹諾酮；和 c.通過消除或最大限度地減少所述細(xì)胞樣品中的細(xì)菌或微生物的水平來恢復(fù)細(xì)胞系。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，對所述受到污染的細(xì)胞樣品或細(xì)胞培養(yǎng)基施用一種或多種喹諾酮的步驟還包括用所述一種或多種喹諾酮孵育所述細(xì)胞樣品或細(xì)胞培養(yǎng)基。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，細(xì)胞培養(yǎng)樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物包含選自由精子、卵母細(xì)胞、卵子、胚胎、經(jīng)培養(yǎng)的胚胎組成的組中的一種。
27.一種用于產(chǎn)生胚胎的方法，所述方法包括以下步驟 a.獲得精子樣品； b.將所述精子樣品的一部分添加至含有未受精的卵子的懸浮液中以形成配子懸浮液； c.在所述配子懸浮液中用一個所述精子使所述卵子受精； d.使一種或多種喹諾酮與所述精子樣品或所述配子懸浮液或者兩者結(jié)合；和 e.抑制所述精子樣品或所述受精卵中的細(xì)菌生長。
28.如權(quán)利要求31所述的產(chǎn)生胚胎的方法，所述方法還包括以下步驟 a.使用DNA選擇性染料對所述精子樣品中的精子進(jìn)行染色；和 b.基于所述DNA選擇性染料的相對吸收對所述精子樣品中的精子進(jìn)行分選。
29.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述DNA選擇性染料的相對吸收代表X染色體或Y染色體的存在。
30.一種用于處理精子樣品的方法，所述方法包括以下步驟 a.獲得精子樣品； b.用具有pH的第一培養(yǎng)基中的DNA選擇性染料對所述精子樣品進(jìn)行染色； c.對包含第二染料的第二培養(yǎng)基的pH調(diào)整使之與所述第一培養(yǎng)基的pH相協(xié)調(diào)；和 d.用所述第二培養(yǎng)基中的所述第二染料對所述精子樣品進(jìn)行染色。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，所述方法還包括以下步驟 a.根據(jù)與各精子相關(guān)聯(lián)的DNA選擇性染料的量將經(jīng)染色的所述精子樣品分選為不同的亞群體；和 b.基于所述分選步驟收集至少一個精子亞群體。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，將所述第二培養(yǎng)基的pH調(diào)整至所述第一培養(yǎng)基的2pH和/或所述第一培養(yǎng)基的IpH之內(nèi)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，將所述第二培養(yǎng)基的pH調(diào)整為大致與所述第一培養(yǎng)基的pH相同。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述第二染料是淬滅染料。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述第二培養(yǎng)基包含紅色TALP。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述紅色TALP包含TALP類的緩沖劑和紅色食品染料。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述淬滅染料是選自由紅色食品染料、黃色食品染料、perco 11、碘化丙唳和臺盼藍(lán)組成的組中的一種。
38.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述對第二培養(yǎng)基的pH調(diào)整的步驟還包括調(diào)整所述第二培養(yǎng)基的PH至約5. 5 約7. 4、約6. Γ約7. 4和/或約5. 5 約6. 4的步驟。
39.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述紅色TALP的pH為大于5.5。
40.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，對所述第二培養(yǎng)基的pH調(diào)整的步驟還包括調(diào)節(jié)所述第二培養(yǎng)基的PH為大致與所述第一培養(yǎng)基的pH相同的值的步驟。
41.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述精子樣品包含牛精子，并且所述第一染料和第二染料的PH均為約7. 4。
42.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述第二培養(yǎng)基的pH大于5.5。
43.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，基于攜帶X染色體或Y染色體來分選所述精子。
44.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述第一染色劑包括熒光DNA選擇性染料。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述第一染色劑包括Hoechst33342。
46.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，對第二培養(yǎng)基的pH調(diào)整的步驟還包括基于所述第一培養(yǎng)基的PH和所述精子樣品的pH調(diào)節(jié)所述第二培養(yǎng)基的pH的步驟。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，對第二培養(yǎng)基的pH調(diào)整的步驟還包括調(diào)節(jié)所述第二培養(yǎng)基的PH以實現(xiàn)精子樣品的pH為6. 6^7. 2的步驟。
48.如權(quán)利要求34所述的方法，所述方法還包括在緩沖液中增容所分選的精子的步驟，所述緩沖液選自由TRIS、檸檬酸鈉、卵黃、奶、TALP、MOPS、HEPES、磷酸鹽、KMT、硼酸鹽、碳酸氫鹽、包含BSA的緩沖液及其組合組成的組。
49.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述用所述第一培養(yǎng)基和第二培養(yǎng)基進(jìn)行染色的步驟與單一的PH調(diào)整事件同時進(jìn)行。
50.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述獲得精子的步驟還包括將此前冷凍的精子存儲管解凍。
51.如權(quán)利要求35所述的方法，所述方法還包括將所分選的精子凍存的步驟。
52.一種處理精子的方法，所述方法包括以下步驟 a.收集包含精子的精液； b.在進(jìn)行任何其他處理步驟之前，對選自所述精液的pH和所述精液的濃度中的一個進(jìn)行調(diào)節(jié)； c對經(jīng)調(diào)節(jié)的精子進(jìn)行染色；和 d.將經(jīng)染色的緩沖的精子分選為性別富集的亞群體。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)步驟包括在任何其他的處理步驟之前在緩沖溶液中調(diào)節(jié)所述精液的pH。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)步驟包括調(diào)節(jié)所述精液中的精子的濃度。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)所述精液中的精子的濃度的步驟還包括將所述精液離心的步驟。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中，對具有低濃度的精子的精液進(jìn)行離心，然后與TALP緩沖液再結(jié)合，由此調(diào)節(jié)所述樣品的pH和/或濃度。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述TALP緩沖液包含包括pH為約7的緩沖液。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，對于給定的精液，通過調(diào)節(jié)所述精液的濃度或PH使得處理過程中導(dǎo)致的DNA斷裂的量相對于未被調(diào)節(jié)的精液部分減少。
59.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，通過將所述精液直接收集到緩沖溶液中來完成所述PH或濃度的調(diào)節(jié)步驟。
60.一種對精子進(jìn)行染色的方法，所述方法包括以下步驟 a.獲得精子； b.在受控的染色條件下用熒色物染料孵育所述精子； c.向所述精子中添加淬滅染料，其中，所述淬滅染料選自由黃色食品染料、橙色食品染料、綠色食品染料及其組合組成的組。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述淬滅染料包括黃色食品染料。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述黃色食品染料包括6號黃色食品染料。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，黃色食品染料提供了比傳統(tǒng)的紅色食品染料淬滅劑更高的分選分辨率。
64.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述受控的染色條件包括 a.在30°C 39°C的溫度進(jìn)行孵育； b.在7.0 7· 4的pH進(jìn)行孵育；和 c.孵育20分鐘 I小時的時間。
65.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述獲得精子的步驟還包括將已冷凍的精子解凍。
66.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，將所染色的精子在微流體裝置中進(jìn)行分選。
67.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述熒色物染料包括Hoechst33342。
68.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述添加所述淬滅染料的步驟在于受控的染色條件下進(jìn)行孵育的步驟之后發(fā)生。
69.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述添加所述淬滅染料的步驟在用所述熒色物染料進(jìn)行孵育的過程中發(fā)生。
70.一種對通過權(quán)利要求60的方法染色的精子進(jìn)行分選的方法，還包括以下步驟 a.使所述經(jīng)染色的精子流經(jīng)微流體裝置； b.使所染色的精子曝露于輻射能量以激發(fā)所述熒色物染料； c.基于所染色的精子響應(yīng)所述輻射能量而發(fā)出的熒光能量來區(qū)分?jǐn)y帶X染色體的精子和攜帶Y染色體的精子。
全文摘要
本發(fā)明涉及與常規(guī)的分選和處理方法相比以降低的DNA斷裂的水平和發(fā)生率來處理生殖細(xì)胞樣品并分選精子的方法和系統(tǒng)，所述方法和系統(tǒng)使用具有低水平的DNA斷裂的生殖細(xì)胞和精子細(xì)胞樣品來改善授精樣品生殖力的活力和輔助生殖過程的成功率，所述輔助生殖過程包括人工授精、體外受精、胞質(zhì)內(nèi)注射、以及其它相關(guān)的技術(shù)。
文檔編號C12N5/076GK102812123SQ201080065616
公開日2012年12月5日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者J·莫雷諾, M·埃文斯, M·杰蘭德, J·格薩維茲, C·岡薩雷斯·馬丁, C·洛佩茲·費爾南德斯 申請人:英格朗公司