專利名稱：：普魯蘭酶變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有普魯蘭酶(pullulanase)活性的普魯蘭酶變體，和編碼所述普魯蘭酶變體的分離的多核苷酸。本發(fā)明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生和使用多肽的方法。本發(fā)明亦涉及將所述普魯蘭酶變體用于淀粉常規(guī)工藝，包括用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如特別是乙醇的工藝的用途。
背景技術(shù)：
：普魯蘭酶是可降解普魯蘭(pullulan)、支鏈淀粉(amylopectin)和其他支化底物的α-(1，6)_連接的酶。在谷物工業(yè)中，已將細菌普魯蘭酶用于去除淀粉中α-1，6_鍵的目的，所述鍵可在糖化工藝中導(dǎo)致不受歡迎的潘糖形成。已知兩種不同類型的普魯蘭酶EC3.2.I.41，其包括兩種類型(類型I和類型II)的普魯蘭酶，和EC3.2.I.135，其稱作“新普魯蘭酶(neopullulanase)WO95/23852公開了來自速生熱球菌(Thermococcusceler)的淀粉普魯蘭酶，以及用于從淀粉產(chǎn)生5種增甜劑和乙醇的用途。來自超嗜熱的(hyperthermophile)Thermococcushydrothermalis的普魯蘭酶類型11(家族GH57)公開為UNIPR0T:Q9Y8I8。來自Thermococcuslitoralis的普魯蘭酶類型11(家族GH57)公開為UNIPR0T:Q8NKS8。WO98/26058涉及來自ThermococcushydrothermalisCNCMI的普魯蘭酶，其在PH5.5具有110°C的最適溫度，以及涉及其與α-淀粉酶和α-葡糖苷酶組合用于產(chǎn)生糖漿的用途。本發(fā)明的目的是為了提供與考慮的親本普魯蘭酶相比，提供分別以增加的產(chǎn)量表達和/或具有更高熱穩(wěn)定性的普魯蘭酶。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了屬于家族GH57普魯蘭酶的親本普魯蘭酶的普魯蘭酶變體。在第一個方面，本發(fā)明涉及屬于家族GH57并包含Χ47域的親本普魯蘭酶的普魯蘭酶變體，其中所述普魯蘭酶變體在Χ47域之后的位置處被截短。在一個優(yōu)選實施方案中，所述親本家族GH57普魯蘭酶可來源于任何細菌。在一個優(yōu)選實施方案中，所述親本普魯蘭酶來源于熱球菌屬(Thermococcus)的菌株,優(yōu)選Thermococcushydrothermalis的菌株,特別是SEQIDNO:2的成熟部分,或Thermococcuslitoralis的菌株，特別是SEQIDNO:4的成熟部分，或所述親本普魯蘭酶是雜合普魯蘭酶，例如，包含來自Thermococcushydrothermalis普魯蘭酶的序列和來自Thermococcuslitoralis普魯蘭酶的序列。親本普魯蘭酶的實例可見于下文“親本普魯蘭酶”部分。更具體而言，本發(fā)明涉及從屬于家族GH57的親本普魯蘭酶(其包含X47域)制備的普魯蘭酶變體，其中所述親本普魯蘭酶是示于SEQIDN0:2或4或34的普魯蘭酶，或另一種親本普魯蘭酶，其與SEQIDNO:2，4或34具有至少60%同一性，其中所述普魯蘭酶變體包含或組成為a)具有普魯蘭酶活性的氨基酸序列，i)其與來自SEQIDNO:2的氨基酸1-1009的序列，優(yōu)選與來自SEQIDNO:2的氨基酸1-782的序列具有至少60%同一性；或ii)其與來自SEQIDNO:4的氨基酸1-988的序列，優(yōu)選與來自SEQIDNO:4的氨基酸1-781的序列具有至少60%同一性；iii)其與來自SEQIDNO:34的氨基酸1-782的序列具有至少60%同一性；b)SEQIDNO:2，4或34的親本普魯蘭酶，其在X47域之后的位置處被截短；c)另一種親本普魯蘭酶，其與SEQIDNO:2，4或34具有至少60%同一性，在對應(yīng)于a)或b)中限定的位置的位置處被截短；d)具有一個或多個(幾個)取代、缺失和/或插入的氨基酸的限定于a)、b)或c)的普魯蘭酶變體。在另一個方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的普魯蘭酶變體或本發(fā)明的X47域的分離的多核苷酸，其選自下組i)多核苷酸，其與SEQIDNO:I或3的普魯蘭酶變體編碼部分或其互補鏈具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，至少96%，優(yōu)選至少97%，優(yōu)選至少98%，優(yōu)選至少99%同一性；ii)多核苷酸，其與序列SEQIDNO:1，3，37的X47域編碼部分或其互補鏈具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，至少96%，優(yōu)選至少97%，優(yōu)選至少98%，優(yōu)選至少99%同一性；和iii)多核苷酸，其在中等嚴格，優(yōu)選高嚴格條件下與SEQIDNO:1，3或37的普魯蘭酶變體或X47域編碼部分或其互補鏈雜交。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達載體和包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的載體的重組宿主細胞。在另一個方面，本發(fā)明涉及從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括下述步驟(a)在α-淀粉酶和家族GH57普魯蘭酶的存在下液化含淀粉材料；(b)使用糖源生成酶糖化步驟(a)中獲得的液化材料；(c)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵。在一個優(yōu)選實施方案中，所述家族GH57普魯蘭酶是本發(fā)明的普魯蘭酶變體。在一個進一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的家族GH57普魯蘭酶或變體在從淀粉產(chǎn)生增甜劑的工藝中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的家族GH57普魯蘭酶或普魯蘭酶變體在從糊化和/或未糊化的淀粉產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的工藝中的用途。圖I顯不了來自Thermococcushydrothermalis(UNIPROT:Q9Y818)和Thermococcuslitoralis(UNIPROT:Q8NKS8)的親本普魯蘭酶的成熟部分的比對。域注釋為CAZy(eFAM)、GH57(催化性普魯蘭酶域)、X47、DUF2223a和DUF2223b域和接頭(推定為結(jié)合細胞壁)。截短X1、X4、X5和X6標(biāo)注向左箭頭。圖2顯不來源于Thermococcushydrothermalis的親本普魯蘭酶(UNIPROT:Q9Y818)中的截短點X1、X4、X5和X6。圖3顯示用于鑒定X47域的HMM過程。圖4顯不純化的普魯蘭酶Thermococcushydrothermalis(XI截短，表達于巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)),Thermococcushydrothermalis的截短X4以及Thermococcushydrothermalis和Thermococcuslitoralis(截短位點X4)的雜合物(嵌合物)的溫度概貌。圖5顯示純化的普魯蘭酶Thermococcushydrothermalis(XI截短,表達于巴斯德畢赤酵母)Thermococcushydrothermalis的截短X4以及Thermococcushydrothermalis和Thermococcuslitoralis(截短位點X4)的雜合物(嵌合物)的pH概貌。圖6顯不54小時的在pH5.4用漸增劑量的Thermococcushydrothermalis普魯蘭酶處理的醪的SSF之后乙醇效價(g/L)的HPLC定量。對照在液化過程中未添加任何普魯蘭酶。柱代表五個重復(fù)試管的平均值，而誤差棒為每次處理的標(biāo)準(zhǔn)偏差。尺度為120克的總醪。發(fā)明詳述發(fā)明人制備了屬于家族GH57(糖苷水解酶家族57)、包含X47域的親本普魯蘭酶的普魯蘭酶變體。GH57普魯蘭酶的收集描述于Zone等，2004，Eur.J.Biochem.271:2863-2872(通過提述并入)。然而，在本發(fā)明的上下文中，GH57普魯蘭酶并不限于那些文獻中描述的那些。一般而言，家族GH57由CAZy團隊定義和更新，并可見于CAZy-服務(wù)器(參見cazy.org)。根據(jù)本發(fā)明的親本普魯蘭酶屬于家族GH57，并且優(yōu)選為歸類于EC3.2.I.41的普魯蘭酶類型II。本發(fā)明人使用的具體親本普魯蘭酶(UNIPROT:Q9Y8I8)和UNIPROT:Q8NKS8分別來源于超嗜熱細菌Thermococcushydrothermalis和Thermococcuslitoralis的菌株，及其雜合物。幾種普魯蘭酶變體以幾種C端截短形式表達于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoria)。舉例而言,緊接著X47域之后截短的普魯蘭酶變體(在SEQIDNO:2的782和783之間截短)顯示顯著增加的表達水平，并且同時保持了類似親本普魯蘭酶的普魯蘭酶活性。普魯蘭酶活性普魯蘭酶活性意指水解糖苷α-(1，6)_連接的能力。其可用普魯蘭或支鏈淀粉作為底物，例如通過下文中“材料和方法”部分描述的NPUN測定或?qū)嵤├?中描述的AZCL-普魯蘭平板測定來確定。變體術(shù)語“變體”用于本文意指具有普魯蘭酶活性的多肽，其在成熟親本普魯蘭酶，例如SEQIDN0:2、4或34的一個或多個(幾個)特定位置包含改變，如一個或多個(幾個)氨基酸殘基的取代、插入、缺失、截短。改變的多核苷酸通過人為介入藉由修飾例如公開于SEQIDN0:1或3的多核苷酸序列，或其同源序列來獲得。本發(fā)明的普魯蘭酶變體可具有成熟親本普魯蘭酶，如SEQIDN0:2、4或34中所示的親本普魯蘭酶的普魯蘭酶活性的至少20%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%,至少90%，至少95%，或至少100%。野生型酶術(shù)語“野生型”普魯蘭酶表示由天然存在的微生物如見于自然界的細菌、酵母或絲狀真菌表達的普魯蘭酶。親本酶術(shù)語“親本”普魯蘭酶如用于本文，意指一種普魯蘭酶，對該普魯蘭酶進行了修飾例如取代、插入、缺失和/或截短而產(chǎn)生了本發(fā)明的普魯蘭酶變體。該術(shù)語亦指變體用以比較和比對的普魯蘭酶。所述親本可為天然存在(野生型)普魯蘭酶或變體。舉例而言，所述親本普魯蘭酶可為天然存在的普魯蘭酶的變體，其氨基酸序列經(jīng)修飾或改變。親本亦可為等位基因變體，其為由占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或更多可選形式中的任一種所編碼的普魯蘭酶。分離的變體或多肽術(shù)語“分離的變體”或“分離的普魯蘭酶”用于本文指一種自來源分離的變體或普魯蘭酶。在一個方面，該普魯蘭酶變體或普魯蘭酶至少是1%純的，優(yōu)選至少是5%純的，更優(yōu)選至少是10%純的，更優(yōu)選至少是20%純的，更優(yōu)選至少是40%純的，更優(yōu)選至少是60%純的，甚至更優(yōu)選至少是80%純的，且最優(yōu)選至少是90%純的，其純度由SDS-PAGE確定。基本上(substantially)純的變體或多肽術(shù)語“基本上純的變體”或“基本上純的普魯蘭酶”在本文中指一種多肽制備物，其包含至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，且甚至最優(yōu)選至多O.5%以重量計的與其天然或重組結(jié)合的其他多肽物質(zhì)。因此，優(yōu)選地，基本上純的變體或多肽是以存在于該制備物中的總多肽物質(zhì)重量計至少92%純的，優(yōu)選至少94%純的，更優(yōu)選至少95%純的，更優(yōu)選至少96%純的，更優(yōu)選至少96%純的，更優(yōu)選至少97%純的，更優(yōu)選至少98%純的，甚至更優(yōu)選至少99%純的，最優(yōu)選至少99.5%純的，且甚至最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的變體或多肽優(yōu)選為基本上純的形式。其可通過，例如，以公知的重組方法或以經(jīng)典的純化方法制備該變體或多肽而達成。成熟多肽術(shù)語“成熟普魯蘭酶”在本文中定義為具有普魯蘭酶活性的多肽，其為經(jīng)翻譯和任何翻譯后修飾，如N末端加工、C末端截短、糖化、磷酸化等之后的其最終形式。在一個優(yōu)選實施方案中，所述成熟普魯蘭酶是SEQIDNO:2的氨基酸I至1310和SEQIDNO:4的氨基酸1-1065。SEQIDNO:2的氨基酸-I至-27和SEQIDNO:4的氨基酸-I至-24為信號肽。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼成熟普魯蘭酶的核苷酸序列。在一個實施方案中，所述成熟普魯蘭酶編碼序列是SEQIDNO:I的核苷酸82至4011，和SEQIDNO:3的核苷酸73-3267。SEQIDNO:I的核苷酸I至81和SEQIDNO:3的核苷酸1-72編碼信號肽。比對為了鑒定對應(yīng)位置進行的兩個氨基酸序列的比對根據(jù)本發(fā)明是通過使用MUSCLE(MultipleSequenceComparisonbyLog-Expectation)I匕對程序(Edgar,RobertC.(2004),MUSCLE!multiplesequencealignmentwithhighaccuracyandhighthroughput,NucleicAcidsResearch32(5),1792-97)以16次蛋白序列比對的迭代進行的。同一性兩個氨基酸序列間或兩個核苷酸序列間的相關(guān)性由參數(shù)”同一性”所描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一'I"生程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)確定，如EMBOSS軟件包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277emboss.org)的Needle程序,優(yōu)選為3.0.0版或之后的版本中執(zhí)行的。所用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)O.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,見上)確定，如EMBOSS軟件包(EMB0SS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件組(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),Rice等,2000,見上emboss.org)的Needle程序,優(yōu)選為3.0.0版或之后的版本中執(zhí)行的。所用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0.5jpednafull(ncbinuc4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用標(biāo)記為”最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口總數(shù))。等位變體(allelicvariant):術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個方面，如通過瓊脂糖電泳測定的，所述分離的多核苷酸為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純，并且甚至最優(yōu)選至少95%純。基本上純的多核苷酸術(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合在遺傳工程多肽生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其多肽產(chǎn)物的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框確定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence):術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達所必需的所有組分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的編碼序列的表達。表達術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并與供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不完全相同的親本細胞的任何后代。雜交多核苷酸可能能夠與SEQIDNO:I或3的成熟多肽編碼序列或任何其他編碼成熟家族GH57普魯蘭酶的多核苷酸雜交。所述雜交可在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且變性的鮭精DNAjP(對于非常低和低嚴格性)25%的甲酰胺、(對于中和中-高嚴格性)35%的甲酰胺或(對于高和非常高嚴格性)50%的甲酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在45°C(非常低嚴格性)，在50°C(低嚴格性)，在55°C(中嚴格性)，在60°C(中-高嚴格性)，在65°C(高嚴格性)，或在70°C(非常高嚴格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。親本普魯蘭酶本發(fā)明的親本普魯蘭酶是具有X47域的家族GH57普魯蘭酶。該普魯蘭酶歸類于EC3.2.I.41，并稱作普魯蘭酶類型II或有時稱作“淀粉普魯蘭酶”。與特異性攻擊α-1，6連接的類型I普魯蘭酶相比，類型II普魯蘭酶亦能夠水解α-I,4連接。在一個優(yōu)選實施方案中，親本普魯蘭酶屬于家族GH57，并包含Χ47域和任選的DUF2223a和/或DUF2223b域。域和家族可見于Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫=Finn等，2008，NucleicAcidsResearchDatabaseIssue36:D281_D288。Pfam數(shù)據(jù)庫是蛋白家族的集合，每個由多重序列比對和隱蔽馬爾科夫模型(HMM)所代表。所述親本家族GH57普魯蘭酶可從任何來源如微生物，優(yōu)選細菌或真菌生物，如酵母和絲狀真菌獲得。在一個優(yōu)選實施方案中，所述親本普魯蘭酶是野生型酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述親本普魯蘭酶來源于細菌，優(yōu)選熱球菌屬(Thermococcus)或火球菌屬(Pyrococcus)的細菌,包括下表中的那些Thermococcushydrothermalis.SWISSPROT:Q9Y8I8Thermococcus菌種HJ21.__SWISSPROT:B6SED6TkermococcmonnurinemΝΑΙ).__SWISSPRQT:B6YV54Thermococcuskodakaraensis.__SWISSPROT:Q5J155Thermococcm菌種AM4.__SWISSPROT:B7QZQ4激烈火球菌(乃wcocatf./i#/aw.v)__SWISSPR0T:Q8TZQ1激烈火球菌DSM3638.__SWISSPROT:Q3HUR3激烈火球菌__SW1SSPR0T:03Q772Thermococcusgammatolemm(菌株DSM15229IJCMI丨827/EJ3)._SWISSPRQT:CSA4E3ThermococaisbarophilusMESWISSPROT:B5IRL5Thermococcusliioralis.SWISSPRQT:Q8NKS8rymcocaisahyssi._SW1SSPR0T:Q9V294在一個優(yōu)選實施方案中，所述親本普魯蘭酶來源于來自熱球菌或火球菌屬的菌株，包括Thermococcuslitoralis,優(yōu)選為SEQIDN0:4的成熟部分，或Thermococcushydrothermalis,優(yōu)選為SEQIDN0:2的成熟部分。親本普魯蘭酶亦可為雜合(嵌合)酶，優(yōu)選是細菌普魯蘭酶之間的雜合(嵌合)酶，特別是來自一種普魯蘭酶的催化域和來自另一種普魯蘭酶的X47域的雜合(嵌合)酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述親本普魯蘭酶包含兩種熱球菌屬普魯蘭酶，優(yōu)選為Thermococcushydrothermalis的催化域和Thermococcuslitoralis的X47域,特別是SEQIDNO:34中顯示的嵌合普魯蘭酶。所述親本普魯蘭酶亦可與上述提及的普魯蘭酶的成熟親本普魯蘭酶，優(yōu)選SEQIDNO:2、4或34中所示的親本普魯蘭酶的成熟部分具有至少85%，優(yōu)選至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%同一性。在SEQIDN0:2、4或34中所示的親本普魯蘭酶中，或另一種親本普魯蘭酶中差異的氨基酸的總數(shù)可為十五個，更優(yōu)選十四個，甚至更優(yōu)選十三個，甚至更優(yōu)選十二個，甚至更優(yōu)選十一個，甚至更優(yōu)選十個，甚至更優(yōu)選九個，甚至更優(yōu)選八個，甚至更優(yōu)選七個，甚至更優(yōu)選六個，甚至更優(yōu)選五個，甚至更優(yōu)選四個，甚至更優(yōu)選三個，甚至更優(yōu)選兩個，且最優(yōu)選一個。所述親本普魯蘭酶由核酸序列編碼，所述核酸序列可在中等嚴格條件下，更優(yōu)選高嚴格條件下與SEQIDNO:I或3的核酸序列，或其互補鏈雜交。家族GH57酶和GH57域家族GH57酶，包括家族GH57普魯蘭酶(EC3.2.I.41)，由BernardHenrissat令頁導(dǎo)的CAZy團隊(ArchitectureetFonctiondesMacromoleculesBiologiquesUMR6098,CNRS/UniversitedeProvence/UniversitedelaMediterranee,ParcScientifiqueetTechnologiquedeLuminyCase932163AvenuedeLuminy13288MarseilleCedex09，F(xiàn)rance)所限定。屬于家族GH57的更新的序列表可見于CAZy月艮務(wù)器(cazy.org)。Zone等2004,Eur.J.Biochem.271:2863-2872(通過提述并入本文)使用CAZy服務(wù)器、Pfam數(shù)據(jù)庫和BLAST工具從糖苷水解酶收集了59個屬于家族GH57的氨基酸序列(即GH57域)，其包括Thermococcushydrothermalis普魯蘭酶序列(Q9Y8I8_THEHY)和Thermococcuslitoralis普魯蘭酶序列(Q8NKS8)。這些家族GH57蛋白/域通過提述并入。之前Erra-Pujada等(“ThetypeIIpullulanaseofThermococcushydrothermalis:molecularcharacterizationofthegeneandexpressionofthecatalyticdomain”.JBacteriology181(10):3284-3287(1999))的研究得出了GH57域為酶的催化核的預(yù)測。根據(jù)本發(fā)明，所述親本普魯蘭酶屬于家族GH57(糖基水解酶家族57)。GH57域的實例包括來自SEQIDNO:2的156-436的氨基酸序列，SEQIDN0:4的氨基酸序列156-436JPSEQIDNO:34的氨基酸序列156-436(亦參見圖I)。GH57域在所述親本普魯蘭酶中位于X47域的N端。在本發(fā)明的實施方案中，所述家族GH57普魯蘭酶包含GH57域和X47域。所述GH57域可為與來自SEQIDNO:2的156-436的氨基酸序列，SEQIDNO:4的氨基酸序列156-436,或SEQIDNO:34的氨基酸序列156-436具有至少60%同一性,優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%同一性的域。X47域X47域為在如上所定義的家族GH57普魯蘭酶中在GH57域下游發(fā)現(xiàn)的域。X47域可使用隱蔽馬爾科夫模型(HMM)鑒定。X47域的實例示于SEQIDN0:20_30。在一個實施方案中，所述X47域是與來自SEQIDNO:2的580-768的氨基酸序列或SEQIDNO:4的氨基酸序列579-767，或SEQIDNO:38中的氨基酸86-274，或SEQIDNO:20-30中任一具有至少60%同一性，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%同一性的域。DUF2223a和DUF2223b域如上所提及，親本普魯蘭酶可包含不具有已知功能的DUF2223域。DUF2223a和DUF2223b域位于X47域C端(參見圖I)。DUF2223成員，根據(jù)2009年10月13日的發(fā)布24,見于多種原核生物膜錨定蛋白，并預(yù)測其涉及普魯蘭酶的調(diào)節(jié)。(pfam.sanger.ac.uk/family/DUF2223)。本發(fā)明的普魯蘭酶變體在第一個方面，本發(fā)明涉及屬于家族GH57(包含GH57域)、包含X47域的親本普魯蘭酶的變體，其中所述普魯蘭酶在X47域之后被截短。GH57域和X47域的實例如上所提及。所述變體可在X47域之后被截短，或在X47域的緊接末端處(如1-10個氨基酸)，即在X47域中被截短。然而，優(yōu)選在X47域之后截短。親本普魯蘭酶的實例在上文“親本普魯蘭酶”部分提及。本發(fā)明的普魯蘭酶變體與SEQIDNO:2、4或34中的親本普魯蘭酶或另一種親本普魯蘭酶相比可取代、缺失和/或插入一個或多個(幾個)氨基酸。所述普魯蘭酶變體可與成熟親本普魯蘭酶，優(yōu)選SEQIDNO:2、4或34中所示的親本普魯蘭酶相比是至少60%，優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選90%，更優(yōu)選95%，更優(yōu)選97%，至少98%，至少99%相同的。與成熟親本普魯蘭酶相比，普魯蘭酶變體中不同的氨基酸的總數(shù)可為十五個，更優(yōu)選十四個，甚至更優(yōu)選十三個，甚至更優(yōu)選十二個，甚至更優(yōu)選十一個，甚至更優(yōu)選十個，甚至更優(yōu)選九個，甚至更優(yōu)選八個，甚至更優(yōu)選七個，甚至更優(yōu)選六個，甚至更優(yōu)選五個，甚至更優(yōu)選四個，甚至更優(yōu)選三個，甚至更優(yōu)選兩個，且最優(yōu)選一個。應(yīng)理解的是本發(fā)明的普魯蘭酶變體具有普魯蘭酶活性。在一個優(yōu)選實施方案中，所述截短是在DUF2223a域或DUF223b域中。根據(jù)本發(fā)明，所述截短在X47域末端之后100個氨基酸內(nèi)，優(yōu)選50個氨基酸內(nèi)，優(yōu)選20個氨基酸內(nèi)。在一個具體而優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的普魯蘭酶變體是自屬于家族GH57、包含X47域的親本普魯蘭酶制備的變體，其中所述親本普魯蘭酶是顯示于SEQIDN0:2、4或34中的普魯蘭酶，或者是另一種親本普魯蘭酶，其與SEQIDNO:2、4或34具有至少60%同一性，其中所述普魯蘭酶變體包含或組成為a)具有普魯蘭酶活性的氨基酸序列；i)其與來自SEQIDNO:2的氨基酸1-1009的序列，優(yōu)選與來自SEQIDNO:2的氨基酸1-782的序列具有至少60%同一性；或ii)其與來自SEQIDNO:4的氨基酸1-988的序列，優(yōu)選與來自SEQIDNO:4的氨基酸1-781的序列具有至少60%同一性；iii)其與來自SEQIDNO:34的氨基酸1-782的序列具有至少60%同一性；b)在X47域之后的位置處被截短的SEQIDNO:2，4或34的親本普魯蘭酶；c)另一種親本普魯蘭酶，其與SEQIDNO:2，4或34具有至少60%同一性，并在對應(yīng)于a)或b)中限定的位置的位置處被截短；d)具有一個或多個(幾個)取代、缺失和/或插入的氨基酸的限定于a)、b)或c)的普魯蘭酶變體。在一個優(yōu)選實施方案中，所述普魯蘭酶變體與SEQIDNO:2、4或34中的普魯蘭酶的成熟部分，優(yōu)選來自SEQIDNO:2的氨基酸1-1009的序列或來自SEQIDNO:4中氨基酸1-987(X2截短)的序列，優(yōu)選與來自SEQIDNO:2的氨基酸1-782(X4截短)的序列或來自SEQIDNO:4的氨基酸1-781(X4截短)或SEQIDNO:34的氨基酸1-782(X4截短)的序列具有至少70%，優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%同一性。在一個實施方案中，所述親本普魯蘭酶是野生型普魯蘭酶。在一個實施方案中，所述截短是在位于SEQIDNO:2中的位置769-1009(對應(yīng)于SEQIDNO:4中的位置768-988)的DUF2223a域中，或在另一種親本普魯蘭酶中的相應(yīng)位置中。在一個優(yōu)、選實施方案中，所述截短位于SEQIDNO:2的位置782-783的氨基酸之間(X4截短)，其對應(yīng)于SEQIDNO:4中位置781-782之間的位置，或在另一種親本普魯蘭酶中的相應(yīng)位置中。根據(jù)本發(fā)明，所述截短通常在距X47域末端的100個氨基酸，優(yōu)選50個氨基酸，優(yōu)選20個氨基酸內(nèi)，或另一種親本普魯蘭酶中的相應(yīng)位置中，所述X47域終止于SEQIDNO:2中的位置768和SEQIDNO:4中的位置767和SEQIDNO:34中的768。本發(fā)明的變體與親本普魯蘭酶相比可具有更高的普魯蘭酶活性。在一個實施方案中，所述變體與相應(yīng)的親本普魯蘭酶，特別是SEQIDN0:2、4或34中所示的親本普魯蘭酶相比具有改善的熱穩(wěn)定性。所述普魯蘭酶變體可具有65至100°C，優(yōu)選70至90°C，特別是75至85°C的范圍的最適溫度；和/或具有pH40-6的范圍的最適pH。本發(fā)明的X47域本發(fā)明亦涉及X47域。所述X47可從如上所示例的親本普魯蘭酶獲得，包括從來自熱球菌屬的菌株，包括Thermococcus菌種AM4,Thermococcus菌種HJ21,Thermococcusbarophilus,Thermococcusgammatolerans,Thermococcuskodakarensis，Thermococcuslitoralis；Thermococcushydrothermalis；Thermococcusonnurineus的菌株獲得；或從火球菌屬,如Pyrococcusabyssi和激烈火球菌的菌株獲得。在一個實施方案中,所述X47域包含或組成為SEQIDNO:2中的氨基酸序列580-768，或SEQIDNO:4中的氨基酸序列579-767或SEQIDNO:34中的氨基酸580-768，或SEQIDN0:38中的氨基酸86-274，或另一種親本普魯蘭酶中的對應(yīng)位置。在一個實施方案中，本發(fā)明的X47域包含或組成為SEQIDNO:2中的氨基酸序列580-768或SEQIDNO:4中的氨基酸序列579-767或SEQIDNO:34中的氨基酸580-768，或SEQIDNO:38中的氨基酸序列86-274;或在另一種普魯蘭酶中的相應(yīng)位置，其由隱蔽馬爾科夫模型(hmm)確定具有至少300的得分，優(yōu)選350的得分，優(yōu)選400的得分，優(yōu)選300-500，如380-450的得分。在一個實施方案中，所述X47域是與SEQIDNO:2中的氨基酸序列580-768或與SEQIDNO:4中的氨基酸序列579-767或SEQIDNO:34中的氨基酸序列580-768，或SEQIDNO:38中的氨基酸序列86-274具有至少60%同一性的氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，X47與SEQIDNO:2中的氨基酸序列580-768或SEQIDNO:4中的氨基酸序列579-767或SEQIDNO:34中的氨基酸序列580-768，或SEQIDNO:38中的氨基酸序列86-274具有至少70%，優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少85%，優(yōu)選至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%同一性。編碼普魯蘭酶變體或X47域的分離的多核苷酸在一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的普魯蘭酶變體或本發(fā)明的X47域的分離的多核苷酸，其選自下組i)多核苷酸，其與SEQIDNO:I或3的普魯蘭酶變體編碼部分或其互補鏈具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，至少96%，優(yōu)選至少97%，優(yōu)選至少98%，優(yōu)選至少99%同一性；ii)多核苷酸，其與序列SEQIDNO:1，3或37的X47域編碼部分或其互補鏈具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，至少96%，優(yōu)選至少97%，優(yōu)選至少98%，優(yōu)選至少99%同一性；和iii)多核苷酸，其在中等嚴格，優(yōu)選高嚴格條件下與SEQIDNO:1，3或37的普魯蘭酶變體或X47域編碼部分或其互補鏈雜交。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含可操作地連接的如上所述的多核苷酸和一個或多個(幾個)調(diào)控序列的核酸構(gòu)建體，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)所述編碼序列的表達。所述調(diào)控序列可包括合適的啟動子序列，其是由宿主細胞識別用于表達編碼本發(fā)明的普魯蘭酶變體或X47域的多核苷酸的核苷酸序列。所述啟動子序列包含介導(dǎo)所述普魯蘭酶變體或X47域表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。所述啟動子可為任何在選定宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，且可從編碼對于宿主細胞是同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。所述調(diào)控序列亦可包含合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作地連接于編碼所述普魯蘭酶變體或X47域的核苷酸序列的3’端。任何在選定的宿主細胞中有功能的終止子可用于本發(fā)明。調(diào)控序列亦可包括合適的前導(dǎo)序列，其為mRNA的未翻譯區(qū)，且對于宿主細胞的翻譯是重要的。所述前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼本發(fā)明的普魯蘭酶變體或X47域的核苷酸序列的5’端。任何在選定宿主細胞中有功能的前導(dǎo)序列可用于本發(fā)明。所述調(diào)控序列亦可為聚腺苷酸化序列，其為可操作地連接于核苷酸序列的3’端的序列，并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時，由宿主細胞識別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多腺苷酸殘基的信號。任何在選定的宿主細胞中有功能的聚腺苷酸化序列可用于本發(fā)明。所述調(diào)控序列亦可包括信號肽編碼序列，其編碼連接于普魯蘭酶變體或X47域的氨基端的氨基酸序列，并指導(dǎo)編碼的普魯蘭酶變體或X47域進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5’端可固有地含有信號肽編碼序列，其與編碼所述分泌多肽的編碼序列的區(qū)段天然地在翻譯框內(nèi)連接?；蛘?，編碼序列的5’端可含有對于編碼序列是外源的信號肽編碼序列。當(dāng)編碼序列并不天然包含信號肽編碼序列時，可需要所述外源信號肽編碼序列?；蛘咚鐾庠葱盘栯木幋a序列可簡單地替代天然信號肽編碼序列以增強所述多肽的分泌。然而任何指導(dǎo)表達的多肽進入選定宿主細胞的分泌途徑，即分泌入培養(yǎng)基的信號肽編碼序列，均可用于本發(fā)明。所述調(diào)控序列亦可包含前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列。所得的多肽稱作前酶或前多肽(或在一些情況下稱作酶原)。前肽一般不具活性，并可通過將所述前多肽催化或自催化切割去前肽而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。添加調(diào)節(jié)序列亦可為理想的，所述序列允許相對于宿主細胞的生長調(diào)節(jié)所述多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是導(dǎo)致基因表達響應(yīng)化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些?？捎玫恼{(diào)控序列的實例描述于WO2007/090402。表汰載體本發(fā)明亦涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達載體。本文中所述的多種核酸和調(diào)控序列可連接在一起以產(chǎn)生重組表達載體，其可包含一個或多個(幾個)方便的限制性位點以允許編碼多肽的核苷酸序列在此類位點的插入或取代?；蛘?，本發(fā)明的多核苷酸序列可通過將所述核苷酸序列或包含所述序列的核酸構(gòu)建體插入合適的用于表達的載體來表達。在構(gòu)建表達載體時，編碼序列位于載體中使得編碼序列與合適的用于表達的調(diào)控序列可操作地連接。載體系統(tǒng)的實例描述于WO2007/090402。宿主細胞本發(fā)明亦涉及重組宿主細胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，其有利地用于多肽的重組產(chǎn)生。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細胞，使得該載體如前所述作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體得以維持。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何后代，其由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變與親本細胞不完全相同。宿主細胞的選擇在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。宿主細胞的實例描述于WO2007/090402。產(chǎn)牛方法本發(fā)明亦涉及產(chǎn)生本發(fā)明的普魯蘭酶變體或X47域的方法，包括(a)在有助于所述多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)細胞，所述細胞以其野生形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明亦涉及產(chǎn)生本發(fā)明的普魯蘭酶變體或X47域的方法，包括在有助于產(chǎn)生所述多肽的條件下，如本文中所述培養(yǎng)重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明的普魯蘭酶變體的表達水平根據(jù)本發(fā)明可在相同條件下與相應(yīng)的親本普魯蘭酶相比相同或更高。產(chǎn)生可如TO2007/090402中所述進行。用于從未經(jīng)糊化的含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝在該方面，本發(fā)明涉及從未進行含淀粉材料的糊化(即未烹制)的含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝。根據(jù)本發(fā)明，所需發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇,可不經(jīng)液化含有含淀粉材料和水的含水漿料而產(chǎn)生。在一個實施方案中，本發(fā)明的工藝包括在起始糊化溫度以下，優(yōu)選在α-淀粉酶和/或糖源生成酶的存在下糖化(例如磨制的)含淀粉材料，例如粒狀淀粉，以產(chǎn)生糖，其可由合適的發(fā)酵生物發(fā)酵為所需的發(fā)酵產(chǎn)物。在該實施方案中，所述所需的發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇，從未經(jīng)糊化的(即未烹制的)、優(yōu)選磨制的谷物谷粒如玉米產(chǎn)生。相應(yīng)地，在第一個方面，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括使用糖源生成酶和發(fā)酵生物在低于所述含淀粉材料的起始糊化溫度以下在本發(fā)明的普魯蘭酶變體的存在下同時糖化和發(fā)酵含淀粉材料。在一個實施方案中，亦存在蛋白酶。所述蛋白酶可為任何酸性真菌淀粉酶或金屬蛋白酶。實例列于下文“蛋白酶”部分。發(fā)酵產(chǎn)物，如特別是乙醇，可任選地在發(fā)酵之后例如通過蒸餾來回收。合適的含淀粉起始材料列于下文“含淀粉材料”部分。涵蓋的酶列于下文“酶”部分。通常淀粉酶，如葡糖淀粉酶，和/或其他糖源生成酶，和/或α-淀粉酶，在發(fā)酵過程中存在。葡糖淀粉酶和其他糖源生成酶的實例可見于下文，并包括水解生淀粉的葡糖淀粉酶。α-淀粉酶的實例包括酸性α-淀粉酶，優(yōu)選酸性真菌α-淀粉酶。發(fā)酵生物的實例包括酵母，優(yōu)選釀酒酵母的菌株。其他合適的發(fā)酵生物列于上文“發(fā)酵生物”部分。術(shù)語“起始糊化溫度”意指淀粉糊化開始的最低溫度。一般而言，在水中加熱的淀粉在約50°C至75°C之間開始糊化。；糊化的確切溫度取決于具體的淀粉，且可方便地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。因此，所述起始糊化溫度可隨植物物種，隨植物物種的具體品種，以及生長條件而變化。在本發(fā)明的上下文中，給定含淀粉材料的起始糊化溫度可使用Gorinstein等，1992，StarchtStarke44(12):461-466所述的方法確定為在5%的淀粉顆粒中雙折射喪失的溫度。在起始工藝之前，可制備含淀粉材料如粒狀淀粉的漿料，其具有按含淀粉材料計10-55w/w-%干固體，優(yōu)選25-45w/w-%干固體，更優(yōu)選30_40w/w_%干固體。所述衆(zhòng)料可含有水和/或工藝水，如爸懼物(逆流)、洗漆水(scrubberwater)、蒸發(fā)器冷凝液或懼出物、來自蒸懼的側(cè)線汽提器水(side-stripperwater)或其他發(fā)酵產(chǎn)物設(shè)備(Plant)的工藝水。因為本發(fā)明的方法在起始糊化溫度以下進行因而不發(fā)生顯著的粘度增加，所以如果需要，可使用高水平的釜餾物。在一個實施方案中，含水漿料包含約I至約70vol%，優(yōu)選15-60vol%，特別是約30至50vol%的水和/或工藝水，如釜餾物(逆流)、洗漆水(scrubberwater)、蒸發(fā)器冷凝液或懼出物、來自蒸懼的側(cè)線汽提器水(side-stripperwater)或其他發(fā)酵產(chǎn)物設(shè)備(plant)的工藝水,或其組合等?？赏ㄟ^優(yōu)選以干磨或濕磨將其粒度減小到O.05至3.Omm,優(yōu)選O.I至O.5mm來制備含淀粉材料。在進行本發(fā)明的工藝后，含淀粉材料的至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%,至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者優(yōu)選至少99%的干固體轉(zhuǎn)化為可溶的淀粉水解物。本發(fā)明的該方面中的工藝在低于起始糊化溫度的溫度進行，這意指該溫度通常在30至75°C，優(yōu)選45至60°C的范圍。在一個優(yōu)選實施方案中，該工藝在25°C至40°C，如28°C至35°C，如30°C至34°C，優(yōu)選約32°C的溫度進行。在一個實施方案中，進行該工藝從而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如6w/w-%以下，如約3w/w-%以下，如約w/w-%以下，如約Iw/w-%以下，如約O.5w/w-%以下，或O.25w/w-%以下,如約O.lw/w-%以下。所述低水平的糖可通過簡單的使用經(jīng)調(diào)整量的酶和發(fā)酵生物來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地確定使用的酶和發(fā)酵生物的劑量/數(shù)量。酶和發(fā)酵生物的使用量也可經(jīng)選擇以保持麥芽糖在發(fā)酵液中的低濃度。舉例而言，麥芽糖水平可保持為約O.5w/w-%以下,如約O.2w/w-以下。本發(fā)明的方法可在約3至7,優(yōu)選pH3.5至6，或更優(yōu)選pH4至5的pH進行。在一個實施方案中，發(fā)酵持續(xù)6至120小時，特別是24至96小時。用于從經(jīng)糊化的含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝在該方面本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物特別是乙醇的工藝，該工藝包括液化步驟和順序或同時進行的糖化和發(fā)酵步驟。因此，本發(fā)明涉及用于從含淀粉材料產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括下述步驟(a)在α-淀粉酶和家族GH57普魯蘭酶的存在下液化含淀粉材料，或；(b)使用糖源生成酶糖化步驟(a)中獲得的液化材料；(C)使用發(fā)酵生物進行發(fā)酵。家族GH57普魯蘭酶的實例可在上文獲得。在一個優(yōu)選實施方案中，所述普魯蘭酶是本發(fā)明的普魯蘭酶變體。在一個實施方案中，在液化之前、之中和/或之后添加蛋白酶如酸性真菌蛋白酶或金屬蛋白酶。所述蛋白酶可為任何下文“蛋白酶”部分中提及的蛋白酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述金屬蛋白酶來源于嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)的菌株，優(yōu)選為橙橘嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的菌株，特別是橙橘嗜熱子囊菌CGMCCNo.0670。所述α-淀粉酶可為任何下文“α-淀粉酶”部分提及的α-淀粉酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，優(yōu)選來源于曲霉屬(Aspergillus)，特別是黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)或川地曲霉(A.kawachii)的菌株，或根毛霉屬(Rhizomucor),優(yōu)選微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)的菌株,或多孔菌屬(Meripilus),優(yōu)選巨多孔菌的菌株(Meripilusgiganteus),或是公開于Richardson等，2002，TheJournalofBiologicalChemistry277(29):267501-26507(Issue19July)，稱作BD5088的α-淀粉酶。所述糖源生成酶可為任何在下文“糖源生成酶”部分中提及的糖源生成酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述糖源生成酶是來源于曲霉屬優(yōu)選黑曲霉(Aspergillusniger)或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)的菌株，踝節(jié)菌屬(Talaromyces)特別是埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)的菌株，或阿太菌屬(Athelia)特別是羅耳阿太菌(Atheliarolfsii)的菌株；栓菌屬(Trametes)優(yōu)選瓣環(huán)栓菌(Trametescingulata)的菌株；大紋飾孢菌屬(Pachykytospora)優(yōu)選紙質(zhì)大紋飾孢菌(Pachykytosporapapyracea)的菌株；或白樁燕屬(Leucopaxillus)優(yōu)選大白樁燕(Leucopaxillusgignteus)的菌株；或隔孢伏革菌屬(Peniophora)優(yōu)選菌種紅邊隔孢伏革菌(Peniophorarufomarginata)的菌株,或其混合物的糖源生成酶。糖化步驟(b)和發(fā)酵步驟(C)可順序或同時進行。當(dāng)工藝作為順序糖化和發(fā)酵工藝進行時，普魯蘭酶變體和/或金屬蛋白酶可在糖化和/或發(fā)酵過程中添加，當(dāng)步驟(b)和(C)同時進行(SSF工藝)時，它們可在發(fā)酵之前或之中添加。普魯蘭酶變體和/或金屬蛋白酶亦可有利地在液化之前(液化前處理)，即在步驟(a)之前或之中添加，和/或在液化之后(液化后處理)，即在步驟(a)之后添加。普魯蘭酶變體最有利地在液化之前或之中，即在步驟(a)之前或之中添力口。發(fā)酵產(chǎn)物，如特別是乙醇，可任選地在發(fā)酵之后例如通過蒸餾回收。合適的含淀粉起始材料列于下文“含淀粉材料”部分。涵蓋的酶列于下文“酶”部分。液化優(yōu)選在至少α-淀粉酶，優(yōu)選細菌α-淀粉酶或酸性真菌α-淀粉酶的存在下進行。發(fā)酵生物優(yōu)選為酵母，優(yōu)選釀酒酵母的菌株。合適的發(fā)酵生物列于下文“發(fā)酵生物”部分。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的工藝進一步在步驟(a)之前包括下述步驟X)減小含淀粉材料的粒度，優(yōu)選通過磨制(milling)(例如，使用錘式粉碎機(hammermill))；y)形成包含含淀粉材料和水的漿料。在一個優(yōu)選實施方案中，粒度小于#7篩網(wǎng)，優(yōu)選#6篩網(wǎng)。#7篩通常用于常規(guī)的現(xiàn)有技術(shù)工藝。含水漿料可含有10-55w/w-%含淀粉材料的干固體(DS)，優(yōu)選25-45w/w-%的干固體(DS)，更優(yōu)選30-40w/w-%干固體。將漿料加熱到糊化溫度以上，并可添加α-淀粉酶，優(yōu)選細菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(稀化(thinning))。在一個實施方案中，在進行步驟(a)中的α-淀粉酶處理前，楽;料可經(jīng)噴射蒸煮(jet-cooked)以進一步使其糊化。在一個實施方案中，液化可作為三步熱漿方法來進行。在pH4-6，優(yōu)選4.5-5.5，將漿料加熱至60-95°C，優(yōu)選70-90°C，如優(yōu)選80-85°C，并添加α-淀粉酶，以及普魯蘭酶變體和/或蛋白酶，優(yōu)選金屬蛋白酶以起始液化(稀化)。在一個實施方案中，然后可將漿料在95-140°C，優(yōu)選100-135。。，如105_125°C的溫度噴射蒸煮約1-15分鐘，優(yōu)選約3-10分鐘，特別是約5分鐘左右。使?jié){料冷卻至60_95°C并添加更多的α-淀粉酶和任選地普魯蘭酶變體和/或蛋白酶，優(yōu)選金屬蛋白酶以完成水解(二次液化)。液化工藝通常在PH4.0-6，特別是在pH4.5-5.5進行。糖化步驟(b)可使用本領(lǐng)域公知的條件進行。舉例而言，完全的糖化工藝可持續(xù)長至約24至約72小時，然而，通常僅在30-65°C，通常約60°C的溫度進行通常40-90分鐘的預(yù)糖化，接著在同時糖化和發(fā)酵工藝(SSF工藝)中在發(fā)酵過程中進行完全糖化。糖化通常在20-75°C，優(yōu)選40-70°C，通常約60°C的溫度，并在pH4-5的pH，通常在約pH4.5進行。最廣泛用于發(fā)酵產(chǎn)物特別是乙醇產(chǎn)生中的工藝是同時糖化和發(fā)酵(SSF)工藝，其中對于糖化沒有保持階段，意思是發(fā)酵生物(如酵母)和酶可一起添加。SSF可通常在25°C至40°C，如28°C至35°C，如30V至34°C，優(yōu)選約32°C左右的溫度進行。在一個實施方案中，發(fā)酵持續(xù)6至120小時，特別是24至96小時。發(fā)酵培養(yǎng)基“發(fā)酵培養(yǎng)基”指進行發(fā)酵的環(huán)境，其包括發(fā)酵底物，S卩，由發(fā)酵生物代謝的糖源。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可包含營養(yǎng)物(nutrient)和針對所述發(fā)酵生物的生長刺激劑(growthstimulator)。營養(yǎng)物和生長刺激劑在發(fā)酵領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，并包括氮源(如氨)；尿素，維生素和礦物質(zhì)，或其組合。發(fā)酵牛物術(shù)語“發(fā)酵生物”指任何適用于發(fā)酵工藝并能夠產(chǎn)生所需的發(fā)酵產(chǎn)物的生物，包括細菌和真菌生物。特別合適的發(fā)酵生物能夠?qū)⑻?如葡萄糖或麥芽糖)直接或間接發(fā)酵(即轉(zhuǎn)化)為所需的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵生物的實例包括真菌生物，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種(Saccharomycesspp.),特別是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株。在一個實施方案中，將所述發(fā)酵生物添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，從而使得活的(viable)發(fā)酵生物(如酵母)在每mL發(fā)酵培養(yǎng)基中的計數(shù)，在IO5至1012，優(yōu)選IO7至101(1，特別是約5xl07的范圍內(nèi)。商業(yè)上可得到的酵母包括，例如，REDSTARRM和ETHANOLRED酵母(可由Fermentis/Lesaffre,USA得到)，F(xiàn)ALI(可由Fleischmann，sYeast,USA得到)，SUPERSTART和THERMOSACC新鮮酵母(可由EthanolTechnology,WI,USA得到)，BIOFERMAFT和XR(可由NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA得到),GERTSTRAND(可由GertStrandAB,Sweden得到)，以及FERMI0L(可由DSMSpecialties得到)。含淀粉材料根據(jù)本發(fā)明，可使用任何合適的含淀粉的材料。所述起始材料通常基于所需的發(fā)酵產(chǎn)物而選擇。適用于本發(fā)明工藝的含淀粉的材料的實例包括全谷粒、玉米、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱、西米、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、高粱、稻、豌豆、大豆或甘薯，或其混合物，或由其獲得的淀粉，或谷類。也涵蓋蠟質(zhì)和非蠟質(zhì)類型的玉米和大麥。術(shù)語“粒狀淀粉”意指未烹制的生淀粉，即，以其天然形式存在于谷類、塊莖或谷粒中的淀粉。淀粉在植物細胞中作為不溶于水的微小顆粒形成。當(dāng)置于冷水中時，淀粉顆?？晌丈倭恳后w并膨脹(swell)。在高至50°C_75°C的溫度，膨脹可為可逆的。然而，在更高溫度開始稱為“糊化”的不可逆膨脹。待加工的粒狀淀粉可為高度精制的淀粉品質(zhì)，優(yōu)選至少90%，至少95%，至少97%或至少99.5%純，或其可為更加粗制的含淀粉材料，其含有包括非淀粉部分(如胚殘余物和纖維)的(例如，經(jīng)磨制的)全谷粒。原材料(如全谷粒)可通過例如磨制減小粒度以打開其結(jié)構(gòu)并允許進一步的加工。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選兩種工藝，濕磨和干磨。在干磨中，將整粒磨碎并使用。濕磨導(dǎo)致胚和粗粉(淀粉顆粒和蛋白質(zhì))的良好分離，并常常用于使用淀粉水解物產(chǎn)生例如糖衆(zhòng)的場合(location)。干磨和濕磨在淀粉加工領(lǐng)域都是眾所周知的，并等同地涵蓋于本發(fā)明的工藝中。在一個實施方案中，粒度減少至約O.05到3.Omm,優(yōu)選O.1-0.5mm,或使得至少30%，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選至少90%的含淀粉材料可穿過具有O.05到3.Omm篩網(wǎng)，優(yōu)選O.I到O.5mm篩網(wǎng)的篩。發(fā)酵產(chǎn)物術(shù)語“發(fā)酵產(chǎn)物”意指使用發(fā)酵生物通過包括發(fā)酵步驟的工藝生成的產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明所涵蓋的發(fā)酵產(chǎn)物包括醇類(例如，乙醇、甲醇和丁醇)；有機酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸和葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和CO2);抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶類；維生素(例如，核黃素、B12和β-胡蘿卜素)；以及激素。在一個優(yōu)選實施方案中，所述發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇，例如，燃料乙醇；飲用乙醇，即可飲用的中性酒；或工業(yè)乙醇或在可消費醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工業(yè)(例如，發(fā)酵乳制品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)中使用的產(chǎn)品。優(yōu)選的啤酒類型包括愛兒啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、缽爾透啤酒(porter)、陳忙啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麥芽酒(maltliquor)、發(fā)泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcoholbeer)、低醇啤酒(low-alcoholbeer)、低熱量啤酒(low-caloriebeer)或清淡啤酒(lightbeer)。所用的優(yōu)選發(fā)酵工藝包括醇發(fā)酵工藝。根據(jù)本發(fā)明所得的發(fā)酵產(chǎn)物，如乙醇，可優(yōu)選用作燃料。然而，如果其為乙醇，其亦可用作飲用乙醇。MM在發(fā)酵之后，可從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離發(fā)酵產(chǎn)物。可蒸餾漿料以提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物，或可從發(fā)酵培養(yǎng)基中通過微濾或膜過濾技術(shù)提取所需的發(fā)酵產(chǎn)物?；蛘撸赏ㄟ^提餾(stripping)回收發(fā)酵產(chǎn)物。用于回收的方法在本領(lǐng)域是公知的。普魯蘭酶變體的用途本發(fā)明的普魯蘭酶變體可用于轉(zhuǎn)化淀粉以供產(chǎn)生右旋糖，糖漿(如高果糖糖漿)，可食用產(chǎn)品(如零食(snackpellet))，乙醇或啤酒，例如描述于W02000/001796、WO2001/051620、WO2006/213132或WO2003/024242。因此，其可用于淀粉液化(W02006/028897)，啤酒釀造(W02007/144393)，或與葡糖淀粉酶組合用于糖化(EP63909)。塵蛋白酶·根據(jù)本發(fā)明使用的蛋白酶可為任何來源的。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白酶可為酸性真菌蛋白酶或金屬蛋白酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白酶是來源于熱子囊菌屬的菌株，優(yōu)選橙橘嗜熱子囊菌的菌株，特別是W02003/048353(NOVOZymeS)中公開的橙橘嗜熱子囊菌CGMCCNo.0670的金屬蛋白酶。根據(jù)本發(fā)明，肽酶和其他蛋白降解酶稱作蛋白酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白酶是內(nèi)蛋白酶和/或外蛋白酶。合適的蛋白酶可為真菌，細菌，包括絲狀真菌和酵母，和植物來源。在一個實施方案中，所述蛋白酶是酸性蛋白酶，即特征為在低于pH7例如在2-7的pH的酸性條件下水解蛋白的能力。在一個實施方案中，所述酸性蛋白酶具有2.5至3.5范圍的最適pH(在37°C針對O.7%w/v的高氮酪蛋白底物而確定)和在10mg/mL的酶濃度在30°C在O.IM哌嗪/乙酸甘氨酸緩沖液中進行一小時具有5至50°C的最適溫度。在另一個方面，所述蛋白酶是堿性蛋白酶，即特征為在高于7例如7至11的pH的堿性條件下具有水解蛋白能力的蛋白酶。在一個實施方案中，所述堿性蛋白酶來源于芽孢桿菌屬(Bacillus),特別是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的菌株。在一個實施方案中，所述堿性蛋白酶具有7至11的最適溫度和在PH9確定時約70°C的最適溫度。在另一個實施方案中，所述蛋白酶是中性蛋白酶，即特征為在pH5至8的條件下水解蛋白能力的蛋白酶。在一個實施方案中，所述堿性蛋白酶來源于芽孢桿菌屬，優(yōu)選解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株。在一個實施方案中，所述堿性蛋白酶具有7至11的范圍的最適pH(在25°C，10分鐘反應(yīng)用O.01-0.2AU/L的酶濃度確定)，和50°C至70°C的最適溫度(在pH8.5，10分鐘反應(yīng)時間和O.03-0.3AU/L酶濃度確定)。在一個實施方案中，所述蛋白酶是金屬蛋白酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白酶來源于嗜熱子囊菌屬的菌株，優(yōu)選橙橘嗜熱子囊菌的菌株，特別是具有WO2003/048353(通過提述并入本文)中SEQIDNO:2的成熟部分中所示的序列的橙橘嗜熱子囊菌CGMCCNo.0670。所述橙橘嗜熱子囊菌蛋白酶在20至90°C具活性，具有約70°C的最適溫度。此外，該酶在pH5至10具活性，并在pH6左右最佳。合適的植物蛋白酶可來源于大麥。合適的細菌蛋白酶包括來源于解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的芽孢桿菌屬蛋白酶。合適的絲狀細菌蛋白酶可來源于諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)的菌株,優(yōu)選蔥綠擬諾卡氏菌(Nocardiopsisprasina)NRRL18262蛋白酶(或諾卡氏菌屬菌種10R)和達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei)NRRL18133(達松維爾擬諾卡氏菌M58-1)，兩者均描述于WO88/03947(Novozymes)0合適的酸性真菌蛋白酶包括來源于曲霉屬、毛霉屬(Mucor)、根毛霉屬(Rhizomucor)、根霉屬(Rhizopus)、假絲酵母屬(Candida)、革蓋菌屬(Coriolus)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、蟲霉屬(Enthomophtra)、f巴齒菌屬(Irpex)、青霉屬(Penicillium)、小核菌屬(Sclerotium)、嗜熱子囊菌屬(Thermoaccus)和球擬酵母屬(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特別涵蓋的是來源于黑曲霉(參見，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，齋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(參見，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛曲霉(Hayashida等,1977Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，棘孢曲霉(WO95/02044)或米曲霉的蛋白酶；公開于美國專利號4，357，357和美國專利號3，988，207的來自微小毛霉(Mucorpusillus)或米黑毛霉(Mucormiehei)的蛋白酶；和公開于例如WO94/24880(通過提述并入本文)的曼赫根毛霉(Rhizomucormehei)或微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶描述于，例如Hand-bookofProteolyticEnzymes,EditedbyA.J.Barrett,N.D.RawlingsandJ.F.ffoessner,Aca-demicPress,SanDiego,1998，Chapter270)。天冬氨酸蛋白酶的合適的實例包括，例如，Berka等，1990，Gene,96，313);Berka等，1993，Gene,125，195-198；以及Gomi等，1993Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100公開的那些，其通過提述并入本文。商業(yè)上可獲得的產(chǎn)品包括ALCALASEf)、ESPERASE、NEUTRASE、>N0V0ZYMFM2.OL和N0V0ZYM50006(可從NovozymesA/S,Denmark獲得)以及來自GenencorInt.,Inc.，USA的GC106和SPEZYMEFAN。蛋白酶可以以O(shè).0001至I.Owt.-%的TS，優(yōu)選O.001MO.Iwt.-%的TS的范圍的濃度存在。α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明可使用任何α-淀粉酶，如真菌、細菌或植物來源的。在一個優(yōu)選實施方案中，所述α-淀粉酶為酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶或酸性細菌α-淀粉酶。術(shù)語“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E.C.3.2.I.I)，當(dāng)其以有效量添加時，在3到7，優(yōu)選3.5到6，或更優(yōu)選4-5的范圍內(nèi)的pH具有最佳活性。細菌α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，所述細菌α-淀粉酶優(yōu)選源自芽孢桿菌屬。在一個優(yōu)選實施方案中，所述芽孢桿菌屬ct-淀粉酶源自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),解淀粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),枯草桿菌(Bacillussubtilis)或嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)的菌株,但也可源自其他芽孢桿菌屬菌種。涵蓋的α-淀粉酶的特定實例包括示于WO99/19467的SEQIDNO:4的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，示于WO99/19467的SEQIDNO:5的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶，和示于WO99/19467的SEQIDNO:3的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(所有序列通過提述并入本文)。在一個實施方案中，所述α-淀粉酶可為分別與示于WO99/19467的SEQIDN0S:1，2或3中的任何序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。所述芽孢桿菌屬α-淀粉酶也可為變體和/或雜合體，特別是描述于WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO02/10355(所有文件通過提述并入本文)中任一的變體和/或雜合體。特別涵蓋的α-淀粉酶變體公開于美國專利號6，093，562,6,297，038或美國專利號6，187，576(通過提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一個或兩個氨基酸缺失的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)變體，優(yōu)選WO96/023873公開的雙缺失-參見，例如，第20頁第1-10行(通過提述并入本文)，優(yōu)選與WO99/19467公開的SEQIDN0:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比對應(yīng)于Λ(181-182)，或使用WO99/19467中的SEQIDNO:3的編號方式缺失氨基酸R179和G180(所述文獻通過提述并入本文)。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌屬α-淀粉酶，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶，其較之WO99/19467公開的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有對應(yīng)于Λ(181-182)的雙缺失，且進一步包括N193F取代(也表示為I181*+G182*+N193F)。細菌雜合體α-淀粉酶特別涵蓋的雜合體α-淀粉酶包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(示于W099/19467的SEQIDNO:4)的445個C-末端氨基酸殘基，以及源自解淀粉芽孢桿菌的α淀粉酶(示于TO99/19467的SEQIDNO:5)的37個N-末端氨基酸殘基，并具有下列取代中的一個或多個，特別是全部G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQIDNO:4的地衣芽孢桿菌編號)。也優(yōu)選具有一個或更多下述突變的變體(或在其他芽孢桿菌屬α-淀粉酶骨架中的對應(yīng)突變):Η154Υ，Α181Τ，N190F,A209V和Q264S和/或位置176和179之間兩個殘基的缺失，優(yōu)選Ε178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQIDΝ0:5編號)。在一個實施方案中，所述細菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每gDSjt選O.001-1KNU每gDS,如約O.050KNU每gDS的量給料。真菌α-淀粉酶真菌α-淀粉酶包括源自曲霉屬菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae),黑曲霉(Aspergillusniger)和川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。優(yōu)選的酸性真菌α-淀粉酶為Fungamyl樣α-淀粉酶,其源自米曲霉的菌株。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“Fungamyl樣α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即與W096/23874的SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的成熟部分顯示高同一性，即，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%,至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或甚至100%的同一性。另一個優(yōu)選的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶來自黑曲霉，作為“AMYA_ASPNG”以原始登錄號P56271公開于Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫中，并描述于WO89/01969(實施例3，通過提述并入本文)。源自黑曲霉的商業(yè)上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。其他涵蓋的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉屬(Rhizomucor)和多孔菌屬(Meripilus)的菌株,優(yōu)選微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178通過提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilusgignteus)菌株的那些α-淀粉酶。在一個優(yōu)選實施方案中,所述α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298“Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablea-amylasefromAspergilluskawachii”公開，并進一步作為EMBL:#AB008370公開。所述真菌α-淀粉酶也可為包括淀粉結(jié)合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非雜合體)，或其變體。在一個實施方案中，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。真菌雜合體α-淀粉酶在一個優(yōu)選實施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶為雜合體α-淀粉酶。真菌雜合體α-淀粉酶的優(yōu)選實例包括公開于WO2005/003311或美國專利發(fā)明者B.亨利薩特,M.B.希洛,M.博徹特,M.格杰曼森,P.F.哈林,S.克拉克申請人:諾維信公司,諾維信北美公司