專利名稱：用于核酸特異性分析的探針的制作方法
用于核酸特異性分析的探針本發(fā)明涉及用于檢測或富集復(fù)雜的核酸樣品中的靶標(biāo)核酸的方法。在此類方法中，將樣品片段化，并通過核酸連接(“單側(cè)連接”，即靶標(biāo)片段的一端不涉及連接反應(yīng)并且保持游離)使含有靶標(biāo)核酸的片段在一端或接近一端處與每個(gè)靶標(biāo)片段的單個(gè)靶標(biāo)特異性探針共價(jià)結(jié)合。任選地，可以以非靶標(biāo)特異性的方式對片段的所述游離端添加通用的核酸接頭。探針可含有促進(jìn)靶標(biāo)片段富集的元件，所述富集例如通過純化(例如通過固定至固相)或擴(kuò)增(例如通過在探針和任選的接頭中使用元件)進(jìn)行。通過這種方式，可從復(fù)雜樣品中獲得靶標(biāo)核酸，用于隨后通過例如核酸測序、微陣列、qPCR、可視雜交探針、原位分析等進(jìn)行分析。本發(fā)明提供(和使用)僅對靶標(biāo)核酸(或靶標(biāo)核酸片段)一端特異性的連接探針的特征是有利的，并且推進(jìn)了使用已知方法不可能進(jìn)行的具體應(yīng)用。通常期望分離大量亞基因組序列以允許對它們進(jìn)一步表征，例如分離被認(rèn)為與具體的生理或病理?xiàng)l件相關(guān)的基因組區(qū)。在出現(xiàn)高通量測序的平行方法之后尤其如此，所述高通量測序使得用于快速分離在此類測序方法中使用的感興趣的基因組序列的方法成為必要。用于從核酸樣品中同時(shí)擴(kuò)增(擴(kuò)增構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的“富集”手段)大量靶標(biāo)核酸的一種已知的方法公開于WO 2005/111236中。在所述方法中，部分雙鏈的“選擇器 (Selector)，，核酸分子(其中更長的鏈在兩端均懸突的單個(gè)對稱分子，或是僅在一端具有單鏈懸突的兩個(gè)不對稱分子)通過它們的單鏈懸突以靶標(biāo)特異性的方式與通過核酸樣品片段化得到的單鏈(變性的)靶標(biāo)片段的兩端雜交(在單一對稱選擇器的情況下，雜交的選擇器-靶標(biāo)片段被環(huán)化(circularised))。在使用對稱選擇器的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，僅靶標(biāo)片段的一端與選擇器的一端雜交，選擇器的另一端與靶標(biāo)核酸片段內(nèi)部雜交， 并且需要結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切核酸酶通過切除內(nèi)部雜交區(qū)之外“突出”的靶標(biāo)片段部分來拆解 (resolve)得到的結(jié)構(gòu)。因此，在所有情況下，靶標(biāo)片段的可擴(kuò)增部分由選擇器被設(shè)計(jì)為與之雜交的已知序列的區(qū)域(兩個(gè)末端區(qū)域或一端和一個(gè)內(nèi)部區(qū)域)描繪(delineated)。 雜交(和適當(dāng)時(shí)次級結(jié)構(gòu)的拆解)后，選擇器和靶標(biāo)核酸片段通過連接接合在一起，得到 (i)在對稱選擇器的情況下環(huán)狀核酸分子，和(ii)不對稱選擇器的情況下包含靶標(biāo)片段的線性分子，所述靶標(biāo)片段側(cè)翼為選擇器。選擇器的雙鏈區(qū)含有對多種型測定法(multiplex assay)中使用的大量不同靶標(biāo)特異性選擇器而言通用的引物對基序。因此，多種靶標(biāo)片段的擴(kuò)增可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)，同時(shí)避免由于使用多種不同引物對而導(dǎo)致的擴(kuò)增假象(artefacts)。在WO 2005/111236的方法中，對每種靶標(biāo)片段而言需要兩種靶標(biāo)特異性雜交事件；選擇器與靶標(biāo)片段的兩條鏈雜交，或與一端和一條內(nèi)部序列雜交。這不可避免地要求獲知至少這兩個(gè)雜交區(qū)域處靶標(biāo)核酸的序列，從而設(shè)計(jì)靶標(biāo)特異性雜交探針。然而，通常期望以僅獲知序列的一個(gè)區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)來分離或富集基因組序列或片段，即其中期望分離的片段(或序列區(qū)域)不與已知序列的區(qū)域(所描繪的)兩端結(jié)合。當(dāng)期望對序列/片段進(jìn)行測序(即序列的至少部分未知)而導(dǎo)致需要分離靶標(biāo)序列(例如片段)時(shí)，通常會(huì)是這種情況。一個(gè)具體的例子是染色體易位斷裂點(diǎn)(breakpoints)的分析， 其中期望測定與含有已知序列的另一染色體的區(qū)域融合的染色體區(qū)域的精確序列。其他例子包括分析剪接模式或VDJ重組事件。因此對下述方法存在需要，所述方法迅速并高效地檢測(或富集或捕獲)一種或多種靶標(biāo)核酸，而不需要獲知相應(yīng)的靶標(biāo)核酸片段兩端區(qū)域的序列。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過使用單一(即單一種類的)探針來克服上述選擇器方法的限制，即針對每種靶標(biāo)核酸使用單一(或單一種類的)探針，所述探針對對應(yīng)于靶標(biāo)核酸的核酸片段中已知序列的區(qū)域具有特異性。也就是說，本發(fā)明以下述新穎特征為基礎(chǔ)針對每種靶標(biāo)核酸僅使用一種靶標(biāo)特異性探針，其在靶標(biāo)核酸片段中以靶標(biāo)特異性的方式僅結(jié)合一次(更特別地僅在一個(gè)位點(diǎn)上結(jié)合)。因此，對由核酸樣品片段化得到的每種靶標(biāo)核酸片段而言，僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性雜交和連接(“結(jié)合”)事件；靶標(biāo)特異性連接對靶標(biāo)核酸片段而言是單側(cè)的，因此只需要靶標(biāo)核酸片段中單個(gè)已知序列區(qū)域來設(shè)計(jì)探針。也就是說， 對每個(gè)靶標(biāo)核酸片段中的探針而言僅需要一個(gè)確定的結(jié)合位點(diǎn)，即靶標(biāo)片段的序列僅需要在一個(gè)位點(diǎn)(例如僅在一端)被定義。藉此，本發(fā)明的方法使得能夠并且有利地簡化并非在兩端均為已知序列(即僅在一端具有已知序列)的基因組核酸的檢測或富集。除了能夠檢測或富集在一端(即除靶標(biāo)特異性探針?biāo)s交的一端之外的另一端) 具有未知序列的靶標(biāo)核酸之外，此類單一靶標(biāo)特異性探針的使用還提供了其他優(yōu)點(diǎn)。探針與靶標(biāo)核酸片段的連接導(dǎo)致這些分子之間的共價(jià)連接。因此，實(shí)際的基因組片段而不是其擴(kuò)增產(chǎn)物與探針共價(jià)連接。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，探針含有有助于將探針固定在固相上的元件。在此類實(shí)施方案中，靶標(biāo)核酸片段與探針之間的共價(jià)連接導(dǎo)致前者的穩(wěn)定捕獲，并允許使用高度嚴(yán)格的洗滌條件去除非特異性雜交(非連接)的片段，導(dǎo)致高特異性。 此類高度嚴(yán)格的洗滌不能使用已知的基于雜交(與連接相反)的方法例如微陣列捕獲和熒光原位雜交(FISH)進(jìn)行，因此在本方法中能夠使用此類洗滌是有利的。本發(fā)明方法中單一靶標(biāo)特異性探針的使用不必僅限于使用基因組DNA的方法?？紤]到使用人基因組DNA(見實(shí)施例)獲得的有利結(jié)果，認(rèn)為本發(fā)明的方法對含有一種或多種靶標(biāo)核酸的任何DNA樣品會(huì)同樣適用。因此，例如本發(fā)明的方法可以使用一種或多種cDNA 樣品，例如從整個(gè)生物、特定組織、細(xì)胞類型等或暴露于多種條件的生物樣品中獲得、衍生或合成的cDNA，所述條件可改變所述樣品的基因表達(dá)，得到經(jīng)改變的cDNA種群。因此，本發(fā)明提供了用于檢測或富集存在于核酸樣品中的靶標(biāo)脫氧核酸(DNA)的方法，所述方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo)DNA ；(b)使得包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段至少部分被單鏈化，其中單鏈化的部分包括末端部分，并且其中所述單鏈化部分的長度足以允許所述靶標(biāo)片段單鏈化部分的至少一部分與步驟(C)的探針雜交；(c)將步驟(b)的至少部分單鏈化的片段與單個(gè)靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸 A和B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述靶標(biāo)片段的所述單鏈化部分的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與探針的寡核苷酸B的至少一部分(包括一端)互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和
(ii)寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸可含有或帶有用于檢測和/或富集(特別是檢測、擴(kuò)增和/或捕獲)所述靶標(biāo)片段的至少一種元件，并且其至少一部分(包括一端)與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(d)將所述探針的寡核苷酸B與所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分中與所述探針的寡核苷酸A雜交的部分直接或間接連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；和(e)檢測或富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。如下文更詳細(xì)地描述的，本發(fā)明的方法可在步驟(a)和(b)之間有利地包括額外的步驟，其中通用的核酸接頭與片段的末端非靶標(biāo)特異性地退火。涉及使用通用接頭的此類方法代表了本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。特別地，在這樣的步驟中，退火的接頭僅在片段的3'端或5'端與片段連接。更特別地，接頭與下述靶標(biāo)片段鏈的一端連接，在步驟(d) 中探針的寡核苷酸B與所述片段鏈的另一端連接。也就是說，在靶標(biāo)序列中，接頭連接在與靶標(biāo)特異性探針?biāo)B接的一端相對的另一端。可如上文所述(“單一型”方式(〃 simplex" format))進(jìn)行本發(fā)明的方法，以富集單一(即單一種類的，其通常以許多拷貝存在)靶標(biāo)片段或在序列上足夠相似從而可能使用相同探針進(jìn)行富集的多種靶標(biāo)片段。在本文上下文中可以看出，關(guān)于步驟(c)中靶標(biāo)特異性探針使用的術(shù)語“單一”在具體靶標(biāo)片段的語境中表示單一，即對每種靶標(biāo)片段使用一種探針(或更特別地一種類型或種類的探針)(即每種靶標(biāo)片段單一探針)。因此，僅有一種靶標(biāo)片段時(shí)，可僅使用一種探針(意為一個(gè)探針種類)。因此，上文的部分(c)可替代性地表述為“(c)將(b)的至少部分單鏈的片段與靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和B接觸，其中對每種靶標(biāo)片段而言使用一種探針，其中”。從上文可以看出，“單一”探針表示單一種類的探針，并且不意味著對使用的探針分子實(shí)際數(shù)量的任何限制?；蛘撸梢砸浴岸喾N型”方式("multiplex" format)同時(shí)使用多種(即多個(gè)種類的)探針，來富集多種靶標(biāo)DNA。因此，在此類后一方面中，上文定義的方法是用于富集多種靶標(biāo)DNA，其中在步驟(c)中所述靶標(biāo)片段與多種核酸探針的寡核苷酸A和B接觸，每種寡核苷酸探針具有帶有不同第一靶標(biāo)特異性部分的寡核苷酸A，從而多種不同的靶標(biāo)片段可與所述探針退火。如上文所述，此類多種型方法中，對多種靶標(biāo)片段的每種而言(即每種不同類型或種類的靶標(biāo)片段)可使用單一(即意為單一種類的)探針。因此可以使用多種探針，每種靶標(biāo)片段使用(不同的)單一探針。本文使用術(shù)語“多種”(“Plurality") 表示2種或更多(或至少2種)，更特別地3種或更多(或至少3種)，或4、5、6、8、10、15、 20、30、50、70或100種或更多種，等等。在某些實(shí)施方案中，可以使用進(jìn)一步更高數(shù)量的探針，并可富集或檢測非常多的不同靶標(biāo)，例如500、1000、2000、5000或10，000種。例如，可以同時(shí)使用10、100、1000或10000種不同的探針分別檢測或富集10、100、1000或10000種不同的靶標(biāo)片段。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“富集”被廣義使用，并包括從核酸樣品中選擇、分離和/或捕獲感興趣的DNA序列(“靶標(biāo)DNA”)的任何手段，所述核酸樣品除了靶標(biāo)DNA以外還含有其他核酸，尤其是其他DNA(還包括屬于與靶標(biāo)DNA相同的DNA分子一部分的DNA)。因此，“富集”包括將靶標(biāo)DNA與樣品中存在的其他核酸實(shí)際(如果不必須是通過物理方式的話)“分離”的任何手段，更特別地通過將探針與之共價(jià)結(jié)合的手段，使得可以對靶標(biāo)DNA 進(jìn)行分析技術(shù)和/或制備技術(shù)或合成技術(shù)，或其他富集技術(shù)。對本文使用的靶標(biāo)DNA而言， “富集”可例如是通過核酸擴(kuò)增的許多已知方法之一進(jìn)行擴(kuò)增，或者可以是(例如通過固定至固相進(jìn)行的)物理捕獲，任選地之后進(jìn)行擴(kuò)增。盡管如下文進(jìn)一步討論的，在某些實(shí)施方案中所述方法可涉及固定在固相上，但是這并非方法的必要特征。因此，方法可以在溶液中進(jìn)行，即可以是均相的方法。術(shù)語“檢測”也在本文中廣義使用，并且包括檢測或測定或測試靶標(biāo)DNA存在的任何手段，或分析靶標(biāo)DNA的任何手段。靶標(biāo)DNA序列的直接分析(即靶標(biāo)DNA全部或任何部分的測序)被術(shù)語“檢測”包括在內(nèi)。如下文進(jìn)一步描述的，這可以通過能夠使探針與靶標(biāo)分子連接的任何手段(例如在探針中存在測序引物結(jié)合位點(diǎn))來完成。因此，本發(fā)明的方法允許對所選擇的靶標(biāo)片段測序。更特別地，通過根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)特異性探針?biāo)x擇的靶標(biāo)片段可以被直接測序。當(dāng)然，本發(fā)明還涵蓋了靶標(biāo)DNA的間接分析(例如測序)，例如被擴(kuò)增的靶標(biāo)DNA或被捕獲的靶標(biāo)DNA片段的分析(例如測序)。檢測或富集靶標(biāo)DNA的步驟涉及檢測或富集探針-靶標(biāo)片段雜交體。因此，靶標(biāo) DNA的檢測或富集可以通過對雜交體具有選擇性的任何檢測或富集手段來實(shí)現(xiàn)。如下文更詳細(xì)描述的，這可以通過探針中存在(從而被摻入雜交體中，但是不存在于樣品中存在的未與探針連接的其他非靶標(biāo)片段上)的檢測和/或富集(例如捕獲和/或擴(kuò)增)元件來實(shí)現(xiàn)，或者更普遍地，通過依賴于探針與靶標(biāo)片段連接的任何手段，或通過另一種方式依賴于探針-靶標(biāo)片段雜交體形成的任何手段來實(shí)現(xiàn)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“靶標(biāo)DNA”表示想要檢測或想要富集的感興趣的DNA。這通常會(huì)是樣品中可存在的更長DNA分子的部分(或一部分或區(qū)段)。因此，其可以是核酸樣品(或更特別地，DNA樣品)中存在的更長DNA的區(qū)域或序列段(stretch)。靶標(biāo)DNA可以具有任何長度，但是為了通過本發(fā)明的方法檢測或富集，必須包含通過核酸樣品片段化的步驟生產(chǎn)的片段(“靶標(biāo)片段”)或被包含在所述片段內(nèi)。靶標(biāo)DNA的序列可能是未知的，前提是至少靶標(biāo)片段的一部分是已知序列，從而有助于探針的設(shè)計(jì)，所述探針必須能夠與靶標(biāo)片段的單一區(qū)域雜交。盡管靶標(biāo)DNA可以具有任何長度，但是本文公開的方法有利地可被用于檢測或富集大的靶標(biāo)片段，或者從另一種觀點(diǎn)來看，最小長度的靶標(biāo)片段多核苷酸，這表示包含至少 30個(gè)核苷酸的靶標(biāo)片段。更優(yōu)選地，靶標(biāo)片段包含至少40、50、60、70、80、90、100、125、150、 200、250或300個(gè)核苷酸。靶標(biāo)片段包含例如由于切割(片段化)造成的懸突時(shí)，靶標(biāo)的最小長度可包括或排除懸突序列。涉及上文的“核酸樣品”可以是含有來自任何來源或具有任何起源的任意量核酸的任何樣品，期望在其中或從其中檢測或富集已知或懷疑包括在其中的靶標(biāo)DNA。更特別地，樣品可以是含有DNA的任何樣品。樣品可以是復(fù)合物，例如整個(gè)基因組DNA，來自整個(gè)生物、組織或細(xì)胞種群的cDNA，或其部分。在這一方面，其可能是例如核酸分離程序或細(xì)胞裂解程序的直接產(chǎn)物，或者其可以通過一些方式被進(jìn)一步分級或純化，例如其可含有已通過一些方式被部分或完全分離、或通過任何方式被處理的核酸，例如被處理以生產(chǎn)cDNA的RNA0樣品可來自任何真核或原核或病毒來源，例如其可以是微生物(例如細(xì)菌或真菌)、植物或動(dòng)物(例如脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物或靈長動(dòng)物)起源的。在一個(gè)具體的方面，樣品可以是人起源的，例如是人基因組DNA或cDNA。樣品可來自單一起源，或者可以由來自不同起源的多種樣品池形成。在后一種情況下，可以在所述合并(pooling)之前對樣品進(jìn)行片段化步驟(a)和所述方法的任選地一個(gè)或多個(gè)其他步驟。例如，所述核酸樣品可代表大量患者樣品的合并，使得本發(fā)明的方法允許并列地富集來自多個(gè)患者的靶標(biāo)DNA。因此，靶標(biāo)DNA優(yōu)選地是基因組DNA。其可代表總基因組DNA，或其可以是總基因組DNA的亞級分。因此，樣品可包含基因組DNA，或可例如通過直接隔離/分離基因組DNA 或拷貝(例如擴(kuò)增)基因組DNA而源自基因組DNA。或者，靶標(biāo)DNA優(yōu)選地是cDNA(互補(bǔ)DNA或拷貝DNA)。樣品可包含cDNA或其亞級分，其中cDNA是與信使RNA互補(bǔ)的DNA，或是通過反轉(zhuǎn)錄酶從信使RNA合成的DNA。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，cDNA已被處理為包含雙鏈DNA。因此，cDNA可以被認(rèn)為是提取或分離時(shí)細(xì)胞中存在的RNA的拷貝或其級分，即其代表在分離時(shí)所述細(xì)胞中表達(dá)的所有或一些基因。因此，cDNA樣品可代表由整個(gè)生物或其部分(例如組織或細(xì)胞類型或其群組或亞群組)表達(dá)的基因，還可代表在特定條件下(例如在具體時(shí)間、在特定環(huán)境中、在發(fā)育階段或響應(yīng)刺激時(shí)等等)表達(dá)的基因。cDNA可代表從任何上述來源分離的RNA的亞級分，例如 RNA或cDNA可以例如通過大小被分級，從而僅包括一定比例的在所述來源中表達(dá)的基因。 cDNA可源自單一來源或本文別處所述的多個(gè)來源。樣品可包含直接源自mRNA的cDNA，或 cDNA可間接源自mRNA，例如cDNA可以通過例如cDNA文庫的生產(chǎn)而被擴(kuò)增。在方法的第一個(gè)步驟(a)中，已知或懷疑含有靶標(biāo)DNA的核酸樣品被片段化，以生產(chǎn)片段，(如果樣品中存在靶標(biāo)DNA并且適當(dāng)?shù)剡x擇了片段化方法的話)其中會(huì)存在至少一種(即至少一個(gè)種類的)含有靶標(biāo)DNA的片段。術(shù)語“片段化”在本文中廣義使用，以包括可以將樣品中的核酸片段化或切割(即分成或“切”成更小片或片段)的任何手段。因此， 片段化可以(例如使用限制性或其他內(nèi)切核酸酶或核酸酶如DNase)酶促進(jìn)行，和/或(例如通過噴霧法或超聲處理或任何基于剪力的方法)物理地進(jìn)行。此類物理方法導(dǎo)致不可預(yù)測的、非序列特異性的片段化，如某些(非限制性)內(nèi)切核酸酶一樣。因此，隨機(jī)片段化和預(yù)定(或位點(diǎn)特異性)片段化均包括在內(nèi)，但是優(yōu)選后者。因此，使用在已知或確定的位點(diǎn)切割的酶的片段化是優(yōu)選的，也就是說，以序列特異性或結(jié)構(gòu)特異性方式切割的酶，或者換句話說，切割產(chǎn)生具有已知(確定)序列末端的酶，例如限制性內(nèi)切核酸酶和FLAP內(nèi)切核酸酶。然而，還包括在步驟(a)中“片段化”之內(nèi)的是可能由于樣品年齡、儲存樣品的條件和對樣品的任何處理(例如固定化，例如在組織樣品中)和這些因素促成的降解而導(dǎo)致發(fā)生的核酸樣品的片段化?？梢允褂萌魏魏线m的限制性內(nèi)切核酸酶種類，包括II型和IIs型酶。IIs型內(nèi)切核酸酶的使用是特別有利的，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致不會(huì)具有相同末端序列的片段， 從而通過使用具有適當(dāng)序列的寡核苷酸A改進(jìn)了將探針靶向至目標(biāo)靶標(biāo)片段的機(jī)會(huì)?；蛘撸梢允褂胒lap內(nèi)切核酸酶來實(shí)現(xiàn)切割(片段化)，其中所添加的核酸或寡核苷酸由于是部分雙鏈的，所以僅部分可與核酸樣品中的序列雜交，導(dǎo)致與雜交區(qū)域相鄰的核酸樣品的突出的非雜交區(qū)域。該二級結(jié)構(gòu)式所謂的結(jié)構(gòu)特異性“flap內(nèi)切核酸酶”的底物，所述酶在雜交和非雜交區(qū)域的接合處切割核酸樣品(Lyamichev V et al, Science. 1993 May 7 ； 260(5109) :778-83)。不存在接近核酸樣品內(nèi)靶標(biāo)DNA的(已知)限制性酶識別序列時(shí)，flap內(nèi)切核酸酶的使用可以是有利的，因?yàn)槠湓试S切割(片段化)被靶向至任何已知序列的區(qū)域。藉此提供了定位切割位點(diǎn)的靈活性。使用flap內(nèi)切核酸酶時(shí)，先行進(jìn)行物理片段化步驟可能是有利的。片段化手段可以組合使用，例如一起使用兩種或更多的內(nèi)切核酸酶，更特別地兩種或更多的限制性內(nèi)切核酸酶，或一起使用酶促手段和物理手段。另外，核酸樣品可以在單獨(dú)的小份試樣中被差異化地片段化，所述小份試樣隨后被合并并一起進(jìn)行本發(fā)明方法的剩余步驟。因此，片段化可以如下實(shí)現(xiàn)將核酸樣品分成多個(gè)小份試樣，并用不同的手段或不同的手段組合將各個(gè)小份試樣片段化，此類手段例如為限制性酶。然后對小份試樣進(jìn)行方法的剩余步驟，并可在方法期間的任何時(shí)間點(diǎn)例如在步驟(b)之前、步驟(C)之前、步驟(d) 之前或步驟(e)之前或之后將其合并，得到上述方法中涉及的(單一)核酸樣品。此類實(shí)施方案應(yīng)與上文討論的單獨(dú)片段化和隨后合并區(qū)分開來，在上文所述情況下樣品具有不同的起源(而不是單一樣品的小份試樣)。然而在這一方面中，不同起源的樣品自身可在多個(gè)分離的小份試樣中分別被片段化并如上文所述分別合并，在合并之前得到上述方法中涉及的(單一)核酸樣品，以供在方法的隨后步驟中使用?？赡艿脑挘梢允褂孟率鰞?nèi)切核酸酶通過片段化來開發(fā)樣品核酸中已知的雜合多態(tài)性(heterozygous polymorphisms)，所述內(nèi)切核酸酶識別在至少一種情況下被此類多態(tài)性失活的序列。通過設(shè)計(jì)被靶向至存在和不存在多態(tài)性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)處的切割時(shí)所生產(chǎn)的片段的探針，所述單體型特異性片段可獨(dú)立地被富集和分析。在片段化步驟后，核酸樣品的片段(包括含有靶標(biāo)DNA的片段)被至少部分單鏈化(步驟(b))。盡管片段未被完全單鏈化，但是它們應(yīng)至少在一個(gè)“末端部分”處被單鏈化，這表示此類片段的單鏈化部分應(yīng)包括片段的一個(gè)末端，并且單鏈化部分應(yīng)具有足夠的長度，以允許在靶標(biāo)片段的情況下使所述部分的至少一部分與探針雜交。因此，在本文中使用時(shí)，“使其至少部分單鏈化”包括導(dǎo)致雙鏈DNA片段整個(gè)變成單鏈或至少使含有末端的部分變成單鏈的所有手段。此類手段包括變性，例如通過熱或PH或通過使用化學(xué)品，如本領(lǐng)域所已知的。熱變性是特別優(yōu)選的。使得片段僅部分單鏈化從而它們保持大部分或至少部分為雙鏈?zhǔn)怯欣?，尤其是對長基因組序列的富集而言，因?yàn)檫@在一定程度上避免了單鏈核酸片段之間不想要的交叉反應(yīng)性，并從而降低了互相必須區(qū)分開的雜交體的發(fā)生率?；蛘?，至少部分單鏈化可以使用適當(dāng)?shù)?'或5'外切核酸酶，通過3'或5'外切核酸降解(exonucleolysis)來實(shí)現(xiàn)。從游離的雙鏈片段末端開始，此類酶進(jìn)行性地降解或消化雙鏈核酸的一條鏈，留下互補(bǔ)鏈并使得核酸沿著酶作用的長度被單鏈化。外切核酸降解的程度(即得到的單鏈區(qū)的長度)可以通過反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間來控制。選擇外切核酸酶反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，從而去除片段鏈的一個(gè)末端的適當(dāng)長度。消化程度必須足以允許與探針寡核苷酸A的第一個(gè)靶標(biāo)特異性部分有效地雜交(即能夠進(jìn)行模板化連接(templating ligation)的雜交)，但是不會(huì)多到使片段失去所有雙鏈性并成為兩條單鏈片段。合適的外切核酸酶是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如外切核酸酶111(3')和λ外切核酸酶(5')。外切核酸酶III的使用是特別優(yōu)選的。對外切核酸酶的使用而言應(yīng)當(dāng)注意，如果要在步驟(a) 中通過限制性內(nèi)切核酸降解進(jìn)行片段化，則選擇內(nèi)切核酸酶時(shí)必須牢記它們是生產(chǎn)5'或 3'懸突還是生產(chǎn)平末端，因?yàn)槟承╊愋偷南拗菩阅┒藢δ承┩馇泻怂崦付允禽^差的底物。外切核酸酶的底物偏好是本領(lǐng)域已知的。例如，外切核酸酶III不偏好3'懸突末端， 因此留下5'懸突末端的內(nèi)切核酸酶的使用在一些方面中是優(yōu)選的。如上文所述，靶標(biāo)片段的單鏈含末端部分必須能夠至少部分與探針雜交。因此，片段的單鏈化部分的長度必須足以支持步驟(c)中靶標(biāo)片段單鏈化部分的至少部分與探針寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分之間的穩(wěn)定堿基配對。因此，在本文中使用時(shí)“足以允許雜交”表示部分單鏈的靶標(biāo)片段必須被單鏈化至允許與探針有效雜交所需要的程度，即能夠在步驟(d)中進(jìn)行片段的雜交部分與探針的寡核苷酸B的模板化連接的雜交。這不要求，但是可以包括，探針寡核苷酸A 的第一靶標(biāo)特異性部分與靶標(biāo)片段單鏈化部分的相應(yīng)區(qū)域之間100%的互補(bǔ)性。在本文中使用時(shí)，“互補(bǔ)的”表示功能互補(bǔ)，即足以介導(dǎo)雜交的互補(bǔ)性水平，其包括少于100%的互補(bǔ)性程度。上文步驟(b)中涉及靶標(biāo)片段單鏈化部分的“至少部分”包括，例如當(dāng)所述單鏈化部分比(至少部分所述單鏈化部分與之互補(bǔ)的)探針寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分更長時(shí)，所述寡核苷酸A部分與(包含靶標(biāo)片段末端的)所述單鏈化部分的一部分的雜交， 以及替代性的與內(nèi)部非末端部分的雜交。因此，寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分具有針對下述單鏈化部分的含末端部分或內(nèi)部非含末端部分任一的功能互補(bǔ)性，并因此與它們中任一雜交，所述單鏈化部分如上文所述包含末端部分。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中， 寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分在靶標(biāo)片段的單鏈化部分的一個(gè)末端處雜交(功能性互補(bǔ))。如下文更詳細(xì)討論的，在本發(fā)明的某些其他實(shí)施方案中，雜交和連接步驟(c)和(d) 使用flap內(nèi)切核酸酶通過產(chǎn)生的二級結(jié)構(gòu)的拆解(如上文在片段化步驟(a)的上下文中所討論的)而發(fā)生，所述flap內(nèi)切核酸酶的底物通過探針的寡核苷酸A與靶標(biāo)片段的此類內(nèi)部非末端部分的雜交而產(chǎn)生。在步驟(b)中使核酸樣品的片段至少部分被單鏈化后，使它們與步驟(C)的單一靶標(biāo)特異性探針的寡核苷酸A和B接觸。如上文所述，涉及“單一”探針時(shí)旨在涉及單一種類的探針；盡管實(shí)際上會(huì)使用許多拷貝的探針(和其他核酸試劑)，但是對給定的具體靶標(biāo)片段而言，僅使一種探針(雖然使用其許多拷貝)而不是兩種或更多不同的探針與步驟(b) 的片段接觸。探針包含雜交在一起的寡核苷酸A和B或由它們組成。因?yàn)楣押塑账酇具有不與寡核苷酸B互補(bǔ)的第一靶標(biāo)特異性部分，所以探針是部分單鏈的。如從步驟(c)中可以看出的，可以提供(具有預(yù)先雜交的寡核苷酸A和B的)“完整”探針，或者可以添加未雜交的寡核苷酸A和B，在這種情況下形成完整探針的雜交會(huì)發(fā)生在探針(寡核苷酸A)與靶標(biāo)片段退火(在本文中使用時(shí)，“退火的”表示非共價(jià)接合或連接的，并因此不包括連接) 的步驟(c)期間。步驟(c)中涉及“單鏈靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和B”時(shí)還包括下述探針，其中寡核苷酸A和B直接或間接地連接在一起或接合，形成單一連續(xù)的寡核苷酸，寡核苷酸A和B代表其自身互補(bǔ)的部分(其中寡核苷酸A和B可退火(雜交)在一起)。因此，在此類探針中，寡核苷酸A和B可代表單一連續(xù)的部分自身互補(bǔ)的寡核苷酸的 “部分”(更特別地“雜交部分”)。在此類情況下，除(寡核苷酸A的)單鏈靶標(biāo)特異性部分之外的探針末端是發(fā)夾或發(fā)夾環(huán)。因此，在本文中使用時(shí)，涉及“寡核苷酸1和B是指此類多核苷酸的各個(gè)部分。換種方式來看，寡核苷酸A和B可以被看做寡核苷酸序列，它們可以作為單獨(dú)的寡核苷酸分子(即單獨(dú)的部件)來提供，或者它們可以是單一寡核苷酸分子的部分。當(dāng)寡核苷酸A和B是此類單一寡核苷酸的部分時(shí)，寡核苷酸在步驟(c)中與至少部分單鏈的片段接觸時(shí)可以是預(yù)雜交的或未雜交的。有利地，片段與探針的未雜交的寡核苷酸A和B接觸，添加大量的寡核苷酸A和進(jìn)一步更大量的寡核苷酸B (寡核苷酸A和B是單一寡核苷酸的部分的情況除外)，從而使盡可能高比例的靶標(biāo)片段與之退火。過量的探針寡核苷酸A和B的使用，或相對于核酸樣品片段量而言大量這些探針寡核苷酸的使用，除了最小化對于樣品材料的需求以外，還試圖確保大比例(100%或接近100%)的可用靶標(biāo)片段與探針結(jié)合，這對于靶標(biāo)片段的等量表現(xiàn)(equal representation)是必需的。等量表現(xiàn)在例如測序應(yīng)用中對于高效的再測序 (resequencing)而言是重要的。作為單一探針的部分提供寡核苷酸A和B時(shí)，這幫助確保寡核苷酸A和B雜交在一起而不必須添加過量的寡核苷酸。靶標(biāo)特異性核酸探針通常由DNA組成，因此寡核苷酸A和B通常由DNA組成。 然而，還包括在內(nèi)的是下述探針，所述探針由核糖核苷酸或合成的或經(jīng)修飾的能夠參與 Watson-Crick型或類似的堿基配對相互作用的核苷酸殘基組成或包含它們。因此，還包括在內(nèi)的是由DNA類似物或經(jīng)修飾的DNA(例如PNA或包含非核苷酸主鏈的其他衍生物)組成的探針。因此，本發(fā)明方法中使用的部分雙鏈的探針由兩條雜交的寡核苷酸A和B組成，或由單一的、部分自身互補(bǔ)的寡核苷酸的兩個(gè)部分A和B組成。寡核苷酸A作為靶標(biāo)片段與寡核苷酸B連接的模板發(fā)揮作用，并因此包含第一靶標(biāo)特異性部分和第二非靶標(biāo)特異性部分?！暗谝话袠?biāo)特異性部分”表示長度至少10個(gè)核苷酸的寡核苷酸A的一部分，其在序列上與靶標(biāo)片段的單鏈化部分的至少一部分互補(bǔ)。在步驟(c)(i)中涉及“在一端”時(shí)表示一般含義，即第一靶標(biāo)特異性部分和第二非靶標(biāo)特異性部分一般處于寡核苷酸A的相對兩端， 并且不需要第一靶標(biāo)特異性部分處于寡核苷酸A的末端盡頭(the very terminus) 0在本文中使用時(shí)，“互補(bǔ)的”如上文定義，即功能互補(bǔ)(能夠介導(dǎo)雜交)。因此，“互補(bǔ)的”涉及作為整體的所述部分而非個(gè)體核苷酸，并不必須表示寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分和與之雜交的靶標(biāo)片段單鏈化部分的一部分之間100%的互補(bǔ)性。然而，所述部分的距離最遠(yuǎn)的與靶標(biāo)片段互補(bǔ)的核苷酸必須描繪至少10個(gè)核苷酸的序列段。因此，第一靶標(biāo)特異性部分長度可以是10個(gè)核苷酸，或大于10個(gè)核苷酸的任何長度，例如10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、25、30、35、40、50、100或這些之間或大于這些的任何整數(shù)，前提是長度足以介導(dǎo)有效的雜交，即足以為靶標(biāo)片段和寡核苷酸B之間的連接提供模板的雜交。此類有效雜交不必須要求寡核苷酸A相關(guān)末端的末端核苷酸包括在與靶標(biāo)片段互補(bǔ)的核苷酸序列段(第一靶標(biāo)特異性部分)內(nèi)，因此寡核苷酸A可在不與靶標(biāo)片段互補(bǔ)的末端含有一個(gè)或多個(gè)末端寡核苷酸。寡核苷酸A的非靶標(biāo)特異性部分典型地會(huì)具有至少20個(gè)核苷酸的長度，從而有助于與寡核苷酸B的穩(wěn)定、有效的雜交。如果探針是單一的、部分自身互補(bǔ)的寡核苷酸，則分子內(nèi)雜交可允許寡核苷酸A的更短的不與靶標(biāo)互補(bǔ)的區(qū)域，盡管在此類情況下隨后連接步驟中需要的連接酶會(huì)需要約6-10個(gè)核苷酸的雙鏈區(qū)。寡核苷酸A的非靶標(biāo)特異性部分的長度將代表靶標(biāo)特異性部分的長度和約200個(gè)核苷酸的寡核苷酸A最大長度之間的差異。 優(yōu)選地，寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分和第二非靶標(biāo)特異性部分各自由20、25或30或更多個(gè)核苷酸組成。寡核苷酸A可總計(jì)例如16到200個(gè)核苷酸長，更特別地18、20、30、40、 50或60到100、120、150或200個(gè)核苷酸長。因此代表性的長度范圍可特別地是16、18或20 到 40、50、60、70、80 或 100，或在更高端處為 30,40 或 50 到 60、70、80、90、100、120、150 或 200。寡核苷酸B必須至少具有足以維持與寡核苷酸A的非靶標(biāo)特異性部分的至少一部分有效雜交的長度，但是如下文所討論的，可以比該長度更長，并且可以在除單鏈靶標(biāo)特異性部分之外的探針另一端處懸突寡核苷酸A。因此，典型地，寡核苷酸B應(yīng)為至少20個(gè)核苷酸長，但是在單一部分自身互補(bǔ)探針的情況下可以更少，例如至少6、8或10個(gè)核苷酸長。 更特別地，代表性的寡核苷酸B可因此為6、8或10到20、30、40、50、70、80、100、120、150或 180個(gè)核苷酸長。應(yīng)當(dāng)注意，至少10個(gè)核苷酸的序列段(代表寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分) 比通過限制性內(nèi)切核酸酶生產(chǎn)的單鏈“粘性”懸突更長。因此，在本文中使用時(shí)，“靶標(biāo)特異性”表示以片段的至少10個(gè)核苷酸的序列段為基礎(chǔ)對靶標(biāo)片段的特異性。這表示探針(或更特別地探針的寡核苷酸A)對靶標(biāo)片段的退火(雜交)依賴于(或取決于或聽令于)靶標(biāo)片段的序列。限制性片段的粘性末端雜交不包括在內(nèi)。在對靶標(biāo)片段為選擇性的含義上來說探針是靶標(biāo)特異性的，即能夠與靶標(biāo)片段雜交，但是不與不含有對探針寡核苷酸A具有 (單鏈化部分中的)互補(bǔ)性的區(qū)域(或部分)的其他非靶標(biāo)片段雜交。因此探針(或更特別地探針的寡核苷酸A)在靶標(biāo)和非靶標(biāo)片段之間區(qū)別或區(qū)分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地理解，可以通過提高所述第一靶標(biāo)特異性部分來提高探針針對靶標(biāo)片段的特異性程度。通過改變所述第一靶標(biāo)特異性部分的長度，可以改變探針捕獲的片段的核酸樣品中的“獨(dú)特性”("uniqueness")，并可通過這種方式將高度類似的序列例如靶標(biāo)片段的家族成員或同源物包括在使用探針捕獲的片段內(nèi)或從中排除。通常在實(shí)踐中會(huì)期望“靶標(biāo)特異性^示寡核苷酸A的所述第一靶標(biāo)特異性部分靶向核酸樣品內(nèi)獨(dú)特(盡管可能以許多拷貝存在； 獨(dú)特的種類)的DNA。然而如上文所討論的，可能期望在共享序列的基礎(chǔ)上使用單一探針來檢測或富集多于一種DNA，并且在此類情況下，“靶標(biāo)特異性”不表示靶標(biāo)DNA在樣品中是獨(dú)特的。因?yàn)閮H單一靶標(biāo)特異性核酸探針在步驟(c)中與步驟(b)的片段接觸，所以方法對每種靶標(biāo)片段僅涉及一種靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件。更特別地，連接步驟(d)之前對每種靶標(biāo)片段而言僅存在一種靶標(biāo)特異性探針結(jié)合(探針雜交)事件。換句話說，方法不包括對每種靶標(biāo)片段而言使用兩種或更多靶標(biāo)特異性探針，也不包括使用以靶標(biāo)特異性方式與靶標(biāo)片段結(jié)合多于一次(也就是說在多于一個(gè)位點(diǎn)上結(jié)合)的探針，特別是在連接步驟 (d)之前。寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分包含與探針的寡核苷酸B的至少一部分(包括一端)互補(bǔ)的核苷酸序列。因此，除含有第一靶標(biāo)特異性部分的末端之外的寡核苷酸A 的末端與寡核苷酸B的至少一個(gè)末端雜交。如果寡核苷酸B含有與寡核苷酸A不互補(bǔ)的部分，則其相對于寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分而言位于寡核苷酸B的遠(yuǎn)端處?；パa(bǔ)性區(qū)域可具有能夠介導(dǎo)有效雜交的任何長度和互補(bǔ)性程度，所述有效雜交即足以對寡核苷酸 B和靶標(biāo)片段之間的連接提供模板的雜交。由于與寡核苷酸B和靶標(biāo)片段雜交的寡核苷酸A的模板作用，寡核苷酸B可與靶標(biāo)片段連接。因此，寡核苷酸B包含至少一部分在序列上與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分互補(bǔ)，使得寡核苷酸A和B—起形成部分雙鏈的核酸探針，所述探針在一端包含單鏈靶標(biāo)特異性部分以及雙鏈非靶標(biāo)特異性部分。在探針(或更特別地寡核苷酸A)與靶標(biāo)片段末端雜交的情況下，可以設(shè)計(jì)探針，使得通過雜交將寡核苷酸B定位至與靶標(biāo)片段的末端核苷酸緊鄰。然而，如下文進(jìn)一步討論的，這不是絕對的需求。除單鏈靶標(biāo)特異性部分之外的探針末端可以是單鏈或雙鏈的(或是發(fā)夾或發(fā)夾環(huán)，如果寡核苷酸A和B是單一寡核苷酸的部分的話)。因此，在上文步驟(c) (i)和(ii)中涉及寡核苷酸B的“至少一部分” 時(shí)，表示寡核苷酸B可比與寡核苷酸A互補(bǔ)的寡核苷酸B部分更長，在這種情況下不與寡核苷酸A互補(bǔ)的“懸突”(突出)部分處于除與靶標(biāo)片段連接的末端之外的寡核苷酸B的末端。因此，在步驟(c) (i)和(ii)中涉及“包括一個(gè)末端”時(shí)表示與寡核苷酸A的非靶標(biāo)特異性部分互補(bǔ)的寡核苷酸B部分包括寡核苷酸B的一個(gè)末端，或者當(dāng)寡核苷酸B整個(gè)與寡核苷酸A的非靶標(biāo)特異性部分互補(bǔ)(不比后者長)時(shí)，包括寡核苷酸B的兩個(gè)末端。寡核苷酸B與靶標(biāo)片段的連接是本發(fā)明方法中針對給定的靶標(biāo)片段會(huì)發(fā)生(更特別地，會(huì)直至連接步驟(d)才發(fā)生或在連接步驟(d)之前發(fā)生)的僅有的靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件。如果如上文所討論的，寡核苷酸B比與寡核苷酸A互補(bǔ)的寡核苷酸B部分更長并且懸突部分位于寡核苷酸B的3'端時(shí)，所述3'端可發(fā)揮引物作用，用于與所述3'端雜交的已環(huán)化或可環(huán)化的核酸分子的滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification)。核酸可與寡核苷酸B預(yù)雜交，或可以單獨(dú)添加，并可通過下述連接而被預(yù)環(huán)化或環(huán)化，所述連接由與寡核苷酸B的雜交所介導(dǎo)的連接反應(yīng)導(dǎo)致。通過添加DNA聚合試劑，可從已環(huán)化的模板產(chǎn)生 RCA產(chǎn)物，所述產(chǎn)物與探針-靶標(biāo)片段雜交體是連續(xù)的。優(yōu)選地，所述聚合試劑的聚合酶是 11^9聚合酶。因此，在靶標(biāo)核酸片段被固定化的原位實(shí)施方案中，RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生可用于檢測靶標(biāo)核酸。例如可以通過經(jīng)熒光標(biāo)記的寡核苷酸的雜交，使RCA產(chǎn)物原位顯影。寡核苷酸B可含有或帶有可以用于檢測或富集靶標(biāo)片段的元件?！昂谢驇в小北硎敬祟愒砂诠押塑账岬暮塑账嵝蛄袃?nèi)，例如是探針或引物結(jié)合位點(diǎn)或其他基于核酸的親和-結(jié)合位點(diǎn)(例如針對雜合探針或針對DNA結(jié)合蛋白等等的結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)可根據(jù)探針或親和結(jié)合元件的性質(zhì)被看做捕獲或檢測元件，或針對測序引物或針對擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)，所述測序引物結(jié)合位點(diǎn)可相應(yīng)地被看做檢測元件，所述擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)可相應(yīng)地被看做擴(kuò)增元件)，或此類元件可以與寡核苷酸B結(jié)合或綴合或通過任何方式連接或偶聯(lián)或聯(lián)合。例如，其可以是與寡核苷酸結(jié)合等等的功能性部件(例如化學(xué)基團(tuán)或分子)，例如固定化部件或檢測部件(例如報(bào)告子或標(biāo)簽)。固定化部件可例如是親和結(jié)合部件或基團(tuán)，例如親和結(jié)合對的一個(gè)成員(即親和配體)，其與所述寡核苷酸結(jié)合或綴合等等，并且能夠例如在同源結(jié)合配偶體(cognate binding partner)與固相結(jié)合時(shí)為了捕獲或分離的目的而與親和結(jié)合對的另一成員(即其同源結(jié)合配偶體)結(jié)合。寡核苷酸B可含有一個(gè)或多個(gè)此類檢測或富集(例如擴(kuò)增和/或捕獲)元件。檢測元件可如上文所述是包含在寡核苷酸序列中的結(jié)合位點(diǎn)(例如針對檢測探針或部件或針對檢測反應(yīng)中要使用的引物例如測序引物的結(jié)合位點(diǎn))，或其可以是通過任何方式被寡核苷酸載有的檢測部件，例如報(bào)告子基團(tuán)或部件或標(biāo)簽，其可以直接或間接地給出信號。例如，其可以是可顯影的標(biāo)簽，例如有色標(biāo)簽或熒光標(biāo)簽或微粒標(biāo)簽，或者是有助于或參與給出信號的反應(yīng)的部件，例如親和結(jié)合配偶體或配體，或酶的底物或輔因子。富集元件可以是用于擴(kuò)增和/或捕獲靶標(biāo)片段，或?qū)嶋H上用于通過任何方式富集靶標(biāo)片段的任何元件。如從上文的討論中可以看出，“擴(kuò)增元件”可以是寡核苷酸B的任何特征或與寡核苷酸B結(jié)合，其可被用于擴(kuò)增探針-靶標(biāo)片段雜交體的靶標(biāo)片段。典型地，其應(yīng)當(dāng)是擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)。此類擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)可以是針對下述引物的結(jié)合位點(diǎn)，所述引物用于單側(cè)擴(kuò)增或聚合失控(polymerisation runoff)，例如使用T7RNA聚合酶引物來重復(fù)引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄造成擴(kuò)增(Van Gelder RN et al,Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Mar ；87 (5) :1663-7), 或是滾環(huán)擴(kuò)增引物(詳見下文)。其還可以是例如用以允許指數(shù)式擴(kuò)增的針對大量或一組擴(kuò)增引物之一的結(jié)合位點(diǎn)，例如PCR引物或用于基于PCR的程序的引物。如下文進(jìn)一步所述，如果使用多于一種擴(kuò)增引物，則可以在單獨(dú)的步驟中對靶標(biāo)片段提供一種或多種其他引物結(jié)合位點(diǎn)。引物結(jié)合位點(diǎn)也可以被用于測序引物的結(jié)合，或測序引物結(jié)合位點(diǎn)可位于寡核苷酸B中其他地方?！安东@元件”是寡核苷酸B帶有(例如與之結(jié)合或綴合等等)的任何部件，或是寡核苷酸B的序列的任何特征(例如結(jié)合位點(diǎn))，其可能被選擇性地用于將與探針結(jié)合的靶標(biāo)片段(探針-靶標(biāo)片段雜交體)結(jié)合至固相或支持物，包括例如顆粒如珠子。因此，捕獲元件可被看做“固定化元件”。此類元件的大量例子是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如親和結(jié)合配偶體例如生物素或半抗原，其能夠與固相或支持物上提供的其結(jié)合配偶體(即同源結(jié)合配偶體，例如鏈霉親和素或抗生物素蛋白)或抗體結(jié)合。寡核苷酸B和固相之間的所述相互作用可特別地由點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)介導(dǎo)(Kolb HC et al,Angew Chem Int Ed Engl. 2001 Jun 1 ；40(11) :2004-2021)。固相可以是目前被廣泛用于或計(jì)劃用于固定化、分離等等的任何公知的支持物或基質(zhì)。這些可采取顆粒(例如珠子，其可以是磁性或非磁性的)、片層、凝膠、濾器、膜、纖維、毛細(xì)管或微量滴定帶(microtitre strip)、管、平板或孔等等。支持物可由玻璃、二氧化硅、膠乳或聚合物材料。合適的是呈現(xiàn)用于結(jié)合分析物的高表面積的材料。此類支持物可具有不規(guī)則的表面，并且可以是例如多孔的或微粒狀的，例如為顆粒、纖維、網(wǎng)、燒結(jié)物 (sinters)或篩。由于更大的結(jié)合能力，微粒狀的材料例如珠子是有用的，特別是聚合物珠子。便利地，根據(jù)本發(fā)明使用的微粒狀固體支持物會(huì)包含球形的珠子。珠子的大小不是至關(guān)重要的，但是它們可例如具有至少1 μ m和優(yōu)選地至少2 μ m的直徑等級，并具有優(yōu)選地不大于ΙΟμπι，例如不大于6μπι的最大直徑。在尺寸上基本均一(例如具有小于5%的直徑標(biāo)準(zhǔn)差的尺寸)的單分散顆粒具有下述優(yōu)點(diǎn)它們提供非常均一的反應(yīng)再現(xiàn)性。代表性的單分散聚合物顆?？赏ㄟ^US-A-4336173中描述的技術(shù)生產(chǎn)。然而，為了幫助操作和分離， 磁珠是有利的。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“磁性的”表示支持物置于磁場中時(shí)能夠被給予磁矩， 從而能夠在所述場的作用下移動(dòng)。換句話說，包含磁性顆粒的支持物可容易地通過磁性聚集而被去除，這提供了在分析物結(jié)合步驟后迅速、簡單和有效地分離顆粒的一種方式。特別有利的固相包括非常小的顆粒，所述顆粒能夠高效地接觸高比例的不動(dòng)的寡核苷酸B。此類顆粒還可如下使用延緩與顆粒結(jié)合的靶標(biāo)片段通過凝膠的移動(dòng)，允許與游離的、未與顆粒結(jié)合的(非靶標(biāo))片段分離?；蛘?，還優(yōu)選的是使用經(jīng)下述基團(tuán)修飾的色譜基質(zhì)，所述基團(tuán)能夠與探針寡核苷酸B上的基團(tuán)共價(jià)或非共價(jià)反應(yīng)。如上文所述，探針-靶標(biāo)片段雜交體的富集和/或檢測可以通過對所述雜交體具有選擇性的任何手段來進(jìn)行。如下文進(jìn)一步所述的，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，探針-靶標(biāo)片段雜交體可以是被環(huán)化的。在此類實(shí)施方案中，對雜交體的富集可以通過針對環(huán)狀分子的富集而發(fā)生，例如使用外切核酸酶，通過降解任何非環(huán)狀(即線性)核酸分子而發(fā)生。
寡核苷酸B可還含有針對限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，使得由寡核苷酸A和B 的雜交形成的部分雙鏈的、完整的探針可被內(nèi)切核酸酶水解切割。特別地，識別序列可以針對罕見的、很少切割的內(nèi)切核酸酶。此類切割位點(diǎn)可用于從固相上釋放固定化的探針-靶標(biāo)片段雜交體。或者或另外，寡核苷酸B可含有“分子標(biāo)簽”，即下述特征，所述特征允許將對具體樣品進(jìn)行的本發(fā)明方法中使用的寡核苷酸B與對不同樣品進(jìn)行的方法中使用的寡核苷酸B 區(qū)分開來，從而允許鑒定已富集或檢測了給定片段的樣品。分子標(biāo)簽可包含在不與寡核苷酸A互補(bǔ)的寡核苷酸B的部分中。樣品可例如對應(yīng)于患者樣品。在此類實(shí)施方案中，對每種靶標(biāo)核酸而言可能需要不同的寡核苷酸A，同時(shí)可能需要寡核苷酸B僅在對不同樣品進(jìn)行的方法之間有差異。如上文所討論的，本發(fā)明的方法可以以多種型方式(in multiplex)進(jìn)行。在此類實(shí)施方案中，多種核酸探針的各種寡核苷酸B包含在每種探針中相同的共有序列。因此，在探針寡核苷酸B的上下文中，“共有”是指寡核苷酸B的序列，所述序列可包含整個(gè)寡核苷酸B，其在多種型反應(yīng)中使用的多種探針之間是相同的(通用的)。特別地，每種探針中的共有序列可包含使得多種不同的靶標(biāo)片段可以一起被擴(kuò)增和/或捕獲的檢測和/或富集元件(例如擴(kuò)增和/或捕獲元件)，和/或包含限制性內(nèi)切核酸酶識別序列。更特別地，所述方法多重方面中的多種核酸探針包含相同的寡核苷酸B。一旦靶標(biāo)片段在一端與探針的寡核苷酸A雜交并且寡核苷酸B至少在一端與探針的寡核苷酸A雜交，則靶標(biāo)片段的各個(gè)末端和寡核苷酸B可被連接，以生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體。如上文所述和下文進(jìn)一步討論的，用于連接的靶標(biāo)片段“末端”可以如下創(chuàng)建以形成flap內(nèi)切核酸酶底物的方式在靶標(biāo)片段中內(nèi)部雜交探針(或探針的寡核苷酸A)，并用 flap內(nèi)切核酸酶切割此類結(jié)構(gòu)。探針-靶標(biāo)片段雜交體包含與探針連接的靶標(biāo)片段。適用于連接步驟的酶是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如Tth DNA連接酶，Taq DNA連接酶，Thermococcus sp.(菌株 9。N) DNA 連接酶(9。N DNA 連接酶，New England Biolabs)， Ampligase (Epicentre Biotechnologies)和iMDNA連接酶。寡核苷酸B和靶標(biāo)片段的連接可直接發(fā)生，即各個(gè)末端通過雜交與寡核苷酸A恰恰并置，或間接發(fā)生，在這種情況下雜交的末端被缺口隔開。在后一種情況下，可以通過缺口中添加的與寡核苷酸A區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸(即“缺口 ”寡核苷酸)來填充缺口，使兩種連接反應(yīng)成為必需，或者可以通過末端之一的聚合酶延伸來填充缺口，直至被延伸的末端遇到另一端，然后將恰恰并置的末端連接在一起。適用于進(jìn)行此類“缺口填充，，反應(yīng)的聚合酶是本領(lǐng)域已知的。在使得核酸樣品的片段部分(不完全)單鏈化的方法的多個(gè)方面中，在使探針與靶標(biāo)片段連接的步驟后，可以任選地對反應(yīng)添加聚合酶，以修復(fù)(填補(bǔ))探針的寡核苷酸A 的與靶標(biāo)片段雜交的末端和靶標(biāo)片段相應(yīng)鏈的外切核酸酶水解降解末端之間的任何缺口。 聚合酶可延伸寡核苷酸A的所述末端或靶標(biāo)片段的相應(yīng)鏈的所述末端，所述末端的任何一個(gè)是3’末端。聚合酶可以是鏈置換型聚合酶(strand-displacing polymerase)或非鏈置換型聚合酶。在前一種情況下，在填充所述缺口后聚合酶會(huì)根據(jù)情況(即取決于聚合酶是否從寡核苷酸A的末端或靶標(biāo)片段相應(yīng)鏈的末端延伸)，通過置換(和“代替”)寡核苷酸A或靶標(biāo)片段的相應(yīng)鏈繼續(xù)至模板的末端。此類鏈置換聚合酶是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如phi29DNA聚合酶。非鏈置換型聚合酶也可以使用，并且已知其包括例如T7DNA聚合酶。此類聚合酶會(huì)在修復(fù)缺口后和遇到雙鏈核酸時(shí)停止。然后可以根據(jù)情況，將被延伸的末端與探針的寡核苷酸A或靶標(biāo)片段的相應(yīng)鏈的末端連接。通過這種方式，基本上恢復(fù)了探針-靶標(biāo)片段雜交體的雙鏈性。連接步驟和任選的缺口填充步驟后，可以通過尺寸分離步驟將未結(jié)合的探針任選地從反應(yīng)中去除。如上文所述，可以通過對雜交體具有選擇性的任何手段，例如通過除雜交體之外的其他核酸的降解，或通過寡核苷酸B中的檢測和/或富集元件，來檢測或富集探針-靶標(biāo)片段雜交體。還如上文所述，此類富集元件可以是捕獲元件或固定化元件，其可以是能夠與固相或支持物上的元件相互作用的、與寡核苷酸B結(jié)合的任何部件或寡核苷酸B的一串核苷酸。通過捕獲元件，可以通過例如洗滌或凝膠純化，從非靶標(biāo)片段中分離(富集)探針-靶標(biāo)片段雜交體。如上文所述，探針和靶標(biāo)片段之間的連接的共價(jià)性質(zhì)允許使用高度嚴(yán)格的洗滌來有效去除未與探針連接的片段。此類洗滌在探針和靶標(biāo)片段通過雜交被退火的已知方法中是不可能的，因此在本方法中能夠使用此類高度嚴(yán)格條件是有利的?；蛘?，如果使用顆粒，則另一選項(xiàng)是尺寸選擇，例如凝膠純化。本發(fā)明的方法可以使用具有寡核苷酸B的探針進(jìn)行，所述探針是可固定的，即帶有或含有固定化(捕獲)元件，或者是被固定的，即其中所述帶有固定化元件的寡核苷酸B 已經(jīng)與固相結(jié)合。在后一種實(shí)施方案中，富集步驟由洗滌被固定的探針-靶標(biāo)片段雜交體以去除非靶標(biāo)片段組成?？蓪θ缟衔乃霰徊东@或固定化的靶標(biāo)片段直接進(jìn)行分析技術(shù)例如測序，或者首先將其擴(kuò)增?；蛘撸袠?biāo)片段可以未被捕獲/固定化，但是取而代之被單純地?cái)U(kuò)增和/或測序。因此，如上文所述，靶標(biāo)片段的擴(kuò)增可以是從單一擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)(即寡核苷酸B 中)，例如通過使用T7DNA聚合酶引物，來擴(kuò)增核酸的任何合適方法。測序反應(yīng)可從寡核苷酸B中此類擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)(如果存在的話)或單獨(dú)的測序引物結(jié)合位點(diǎn)起被引導(dǎo)。在本文中使用時(shí)，對靶標(biāo)片段測序表示對靶標(biāo)片段中至少兩個(gè)連續(xù)的核苷酸測序(即測定其同一性)。如下文進(jìn)一步描述的，擴(kuò)增也可以通過涉及多于一種擴(kuò)增引物的方法進(jìn)行?？梢栽趩为?dú)的步驟中對靶標(biāo)片段提供針對此類第二或其他引物的結(jié)合位點(diǎn)，如下文所述。此類其他擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)不會(huì)是靶標(biāo)片段特異性的，或者不會(huì)以靶標(biāo)特異性方式被提供給靶標(biāo)片段?？赡芷谕麖墓滔噌尫疟还潭ǖ?、富集的片段，以便于它們的分析。這可以通過用例如在探針寡核苷酸B中具有識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶在探針-靶標(biāo)雜交體的探針中切割來實(shí)現(xiàn)，如上文所述。優(yōu)選地，限制性內(nèi)切核酸酶是切點(diǎn)罕見的內(nèi)切核酸酶。如果被固定的探針-靶標(biāo)片段雜交體變成單鏈，則在切割之前可能必須添加寡核苷酸，為探針雙鏈提供適當(dāng)?shù)牟糠?。然后可以對釋放的靶?biāo)片段進(jìn)行分析技術(shù)，例如上文所討論的那些。此類技術(shù)科直接對被釋放的片段進(jìn)行，或?qū)ζ鋽U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行。在后一種情況下，被釋放的片段可以分子間或分子內(nèi)連接，給出線性多聯(lián)體或雙鏈環(huán)狀分子。這可需要修飾被釋放的片段的末端，例如通過限制性消化和任選的酶促平末端化(blunting)來進(jìn)行，所述平末端化使用例如通過聚合酶活性填充5’懸突并用外切核酸水解活性降解3’懸突的DNA聚合酶I的 Klenow片段，從而將粘性末端轉(zhuǎn)化成平末端。環(huán)狀分子可以通過滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)被擴(kuò)增。 對測序而言，可以使用探針寡核苷酸B中的序列結(jié)合測序引物。
考慮了本發(fā)明一般方法的大量變化，其中一些在下文中描述。在上文步驟(a)之后但是步驟(b)之前可以進(jìn)行任選的另一步驟，其中以非靶標(biāo)特異性的方式使共有的核酸接頭與片段的末端退火。在這一語境中，“共有”表示相同的接頭與給定樣品中的所有片段(或大量片段-見下文-但是在任何情況下與比僅僅靶標(biāo)片段更多的片段)退火，并因此對樣品的所述片段或片段的亞種群而言是共有的或通用的，與僅與靶標(biāo)片段退火的探針相反。在使用多于一種酶(例如限制性內(nèi)切核酸酶)使樣品片段化的情況下，可以使用多于一種“種類”的接頭，其中除了在每種情況下的一個(gè)“退火末端” 之外此類接頭是相同的，所述“退火末端”有所差異，以“匹配”酶生產(chǎn)的有差異的片段末端。本發(fā)明的核酸接頭基本上是雙鏈分子。然而，在本語境中“雙鏈”不表示(但是包括)所述末端是“平末端”，并且通過限制性酶消化產(chǎn)生的由1、2、3、4、5或6等等個(gè)核苷酸單鏈懸突組成的“粘”末端包括在該含義內(nèi)。接頭可以具有任何合適的長度。“非靶標(biāo)特異性地”表示所述接頭以下述方式退火，所述方式在本文別處定義的 “靶標(biāo)特異性”的含義上對靶標(biāo)片段不具有特異性。換句話說，接頭對靶標(biāo)或非靶標(biāo)片段不是選擇性的，即其不能在靶標(biāo)或非靶標(biāo)片段之間辨別或區(qū)分。因此，接頭的結(jié)合(雜交)不依賴于或伴隨著相對于非靶標(biāo)片段而言對靶標(biāo)片段是特別(或特異性)的核苷酸序列。因此，此類接頭與所有片段(包括靶標(biāo)片段)的末端退火。這與步驟(C)的探針的退火不同， 所述探針的退火通過探針寡核苷酸A中存在的具有規(guī)定長度的互補(bǔ)序列而被靶向至靶標(biāo)片段。此類非靶標(biāo)特異性退火可通過促進(jìn)接頭與所有片段退火的任何方法實(shí)現(xiàn)，例如通過與片段的粘性限制性末端(如果存在的話)退火、或平末端或人工產(chǎn)生的粘性末端退火來實(shí)現(xiàn)。因此，接頭必須被設(shè)計(jì)為具有至少一個(gè)適用于此類退火的末端。例如，片段的粘性末端可以通過使用合適的聚合酶而被平末端化，并且再次通過適當(dāng)?shù)木酆厦傅淖饔锰砑訂蝹€(gè)腺苷作為3’懸突。用于任一目的的合適的聚合酶的例子是本領(lǐng)域已知的，并且在前一種情況下包括T4DNA聚合酶，在后一種情況下包括Taq聚合酶。如果接頭被設(shè)計(jì)為具有5’胸苷懸突，則腺苷和胸苷懸突會(huì)作為對連接(已知為“TA連接”)易感的互補(bǔ)粘性末端發(fā)揮作用， 促進(jìn)接頭與片段的連接。接頭可以在一端被修飾，以通過任何下述手段減少或防止接頭彼此連接，所述手段防止連接但是不以其他方式干擾測定。此類修飾包括5’磷酸或3’ OH基團(tuán)的不存在，熒光團(tuán)或親和力基團(tuán)的添加，和“封閉”基團(tuán)例如氨基的引入。重要的是，盡管所述接頭可與片段的兩端退火，但是其僅在片段鏈的3’端或僅在 5’端連接(因此，“退火”如上文所定義，即其不包括連接)。這樣的目的是能夠確保對靶標(biāo)片段而言，接頭與會(huì)在步驟(d)中與寡核苷酸B連接的相同鏈連接，但是在所述鏈的另一端連接。接頭僅與片段鏈的3’端或僅與5’端的選擇性連接可通過任何合適的手段實(shí)現(xiàn)。 例如，退火的接頭與鏈3’或5’端的連接可分別通過片段或接頭的脫磷酸化來控制。合適的脫磷酸化酶(磷酸酶)是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如Antarctic磷酸酶(New England Biolabs)，蝦堿性磷酸酶和小牛腸磷酸酶。片段和接頭的連接可以使用本領(lǐng)域已知的合適連接酶如T4DNA連接酶來實(shí)現(xiàn)。對平末端化的片段添加單個(gè)腺苷作為3’懸突和/或?qū)⑺銎蚊摿姿峄瘜τ跍p少或避免片段間連接也是有益的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在步驟(a)和(b)之間還包括共有(或通用)的核酸接頭與所述片段的末端非靶標(biāo)特異性地退火的步驟，其中退火的接頭僅在片段鏈的3’端或僅在5’端與片段連接。如上文所述，可以使用單一種類的接頭，或可使用一種或多種接頭，取決于片段化的程序。因此接頭退火，使得接頭與靶標(biāo)片段鏈的一端連接，所述靶標(biāo)片段鏈的另一端在步驟(d)中與探針的寡核苷酸B連接。換句話說，在靶標(biāo)片段中， 接頭連接在靶標(biāo)特異性探針?biāo)B接的鏈的相對端。在又一個(gè)實(shí)施方案中，在連接之前，片段末端關(guān)于接頭的至少一端被賦予粘性。還在又一個(gè)實(shí)施方案中，片段或接頭的脫磷酸化被用于促進(jìn)接頭分別與片段鏈的3’端或5’ 端連接。在其中與接頭連接的靶標(biāo)片段在步驟(b)中被完全單鏈化的本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，所述方法必須被設(shè)計(jì)為使得隨后接觸的探針的特異性針對靶標(biāo)片段的一部分，這導(dǎo)致探針的寡核苷酸B與靶標(biāo)片段的相對于接頭所連接的末端的另一端連接。因此在這樣的方面中，寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分包含至少10個(gè)核苷酸在序列上與下述部分互補(bǔ)，所述部分處于所述單鏈靶標(biāo)片段的除共有的核酸接頭所連接的末端之外的末端。接頭(如果在本發(fā)明的方法中使用的話會(huì)包含在探針-靶標(biāo)片段雜交體中)可含有可用于富集和/或檢測靶標(biāo)核酸的元件(有利地為序列)。特別地，此類元件或序列會(huì)與探針中存在的元件結(jié)合使用。因此應(yīng)當(dāng)理解，此類元件可以是針對擴(kuò)增引物對(或大量或一組引物)之一的結(jié)合位點(diǎn)，針對其他所述擴(kuò)增引物對(或大量或一組引物)的結(jié)合位點(diǎn)在探針中提供。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，共有的核酸接頭包含用于擴(kuò)增的元件，優(yōu)選地包含擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)。例如，接頭可包含相對于探針中另一擴(kuò)展呢剛引物結(jié)合位點(diǎn)而言方向合適的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，使得靶標(biāo)片段與探針和接頭二者連接時(shí)刻產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。 此類擴(kuò)增可以通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其他擴(kuò)增方法進(jìn)行，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的許多修飾版本(例如“實(shí)時(shí)”PCR或定量PCR)是本領(lǐng)域公知的。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過例如大規(guī)模并行測序平臺(massive parallel sequencing platform)(例如 SOLiD(Applied Biosystems, Inc.)>Illumina Genome Analyzer(IIlumina, Inc.)>Genome Sequencer(454 Life Sciences))微陣列或基于雜交的測序來分析。所述擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)或位于接頭中別處的單獨(dú)序列可被用作針對下述測序引物的結(jié)合位點(diǎn)，所述測序引物用于對經(jīng)富集的靶標(biāo)核酸進(jìn)行測序。除了存在擴(kuò)增元件以外或代替擴(kuò)增元件，共有的核酸接頭可帶有分子標(biāo)簽?！胺肿訕?biāo)簽”表示可被用于在其他方面相同的接頭之間進(jìn)行區(qū)分的特征。換句話說，此類標(biāo)簽是可被用于產(chǎn)生單個(gè)接頭的可區(qū)分變體的元件。標(biāo)簽可以是接頭的核苷酸序列的具體序列段。如上文所述，進(jìn)行本發(fā)明方法的核酸樣品可由不同來源的多種合并的核酸樣品組成。給出單一核酸樣品的此類合并可在片段化步驟(a)之后發(fā)生。在此類方面中，帶有不同分子標(biāo)簽的接頭可在合并之前與各種核酸樣品的片段連接，使得在進(jìn)行方法剩余步驟的經(jīng)合并的核酸樣品中，源自不同樣品的片段會(huì)與可通過不同分子標(biāo)簽區(qū)分的接頭連接。這是高度有利的，因?yàn)槠湓试S以單一型(一種探針，針對一種或多種足夠類似的靶標(biāo)核酸)或多種型(多種探針，針對多種靶標(biāo)核酸)方式同時(shí)(并行)分析多個(gè)樣品。例如，可以在單一測定法中，從多種帶有不同標(biāo)簽的患者樣品中檢測或富集一種或多種靶標(biāo)核酸。使用帶有分子標(biāo)簽的共有核酸接頭鑒定各種樣品的片段而不是在靶標(biāo)特異性探針中并入標(biāo)簽大幅地減少了為了并行處理多種樣品(含有多種靶標(biāo)核酸)而需要合成的不同探針的數(shù)量。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)中所述核酸樣品的片段化包括單獨(dú)地片段化多種核酸樣品，將帶有不同分子標(biāo)簽的共有(或通用)核酸接頭與所述樣品的片段連接，并在步驟(b)之前合并所述與接頭連接的經(jīng)片段化的核酸樣品。接頭可還包含針對內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)。在本發(fā)明方法的另一方面中，雜交和連接步驟(C)和(d)通過使用flap內(nèi)切核酸酶(FEN)使產(chǎn)生的二級結(jié)構(gòu)拆解而發(fā)生。為了產(chǎn)生屬于flap內(nèi)切核酸酶底物的二級結(jié)構(gòu)， 探針寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分必須與靶標(biāo)片段內(nèi)部的部分互補(bǔ)，而不是與末端部分互補(bǔ)。探針(包括與寡核苷酸B雜交的寡核苷酸A)與靶標(biāo)片段的雜交導(dǎo)致靶標(biāo)片段未雜交的5’末端突出。得到的二級結(jié)構(gòu)被flap內(nèi)切核酸酶識別，所述酶切下靶標(biāo)片段突出的未雜交的5’末端，露出新的5’末端，所述新的5’末端與寡核苷酸A雜交并且能夠與寡核苷酸 B連接。因此，與探針的寡核苷酸B連接的靶標(biāo)片段的單鏈化部分的一部分(即如步驟(d) 中所述與探針的寡核苷酸A雜交的一部分)是所述的可連接的5’末端，并且探針-靶標(biāo)片段雜交體會(huì)缺乏與所述突出末端相對應(yīng)的、位于原始的、與探針結(jié)合前(pre-probe-boimd) 的靶標(biāo)片段的5’端的部分。因此在此類實(shí)施方案中，寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分包含至少10個(gè)核苷酸在序列上與所述單鏈靶標(biāo)片段的內(nèi)部非末端部分互補(bǔ)，并且所述探針與所述靶標(biāo)片段的所述退火通過所述內(nèi)部非末端部分與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分的雜交進(jìn)行，導(dǎo)致靶標(biāo)片段的5’末端形成針對flap內(nèi)切核酸水解切割的底物，并且還包括切割所述flap內(nèi)切核酸水解切割底物，產(chǎn)生與所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的可連接的5’末端。因?yàn)閒lap內(nèi)切核酸酶的此類用途導(dǎo)致靶標(biāo)片段的內(nèi)部切割，以產(chǎn)生用于與探針的寡核苷酸B連接的5’末端，所以使用共有核酸接頭時(shí)，所述接頭必須不僅僅與片段鏈的 5’末端連接。因此，接頭可與片段鏈的5’以及3’末端連接(在這種情況下5’末端接頭會(huì)在flap切割步驟期間被切下)，或可僅與片段鏈的3’末端連接(這可如上文所述通過例如片段的脫磷酸化來實(shí)現(xiàn))。因此在又一實(shí)施方案中，如果共有(或通用)的核酸接頭在步驟(a)和(b)之間與片段的末端非靶標(biāo)特異性地退火，則所述退火的接頭僅在片段鏈的3’末端、或在3’末端和5’末端與片段連接，更特別地使得接頭至少與靶標(biāo)片段鏈的3’末端連接，所述靶標(biāo)片段鏈在5’末端與探針的寡核苷酸B在步驟(d)中連接。在本發(fā)明方法的另一方面中，探針-靶標(biāo)片段雜交體被環(huán)化。在此類情況下，富集可涉及相對于線性分子的量提高環(huán)狀分子的量。因此，在連接步驟(d)后，至少靶標(biāo)片段的一個(gè)末端——即未與探針連接的末端(所述末端在某些實(shí)施方案中包含共有的核酸接頭)——在下述情況下變成雙鏈?zhǔn)蛊沃辽俨糠謫捂溁牟襟E(b)后所述末端不是雙鏈的(即在其中片段被完全單鏈化的方法的多個(gè)方面中)。在本語境中，“雙鏈”不表示(但是包括)所述末端是“平末端”，并且通過限制性酶消化產(chǎn)生的由1、2、3、4、5或6等等個(gè)核苷酸的單鏈懸突組成的“粘”末端包括在該含義內(nèi)。此類雙鏈化可通過任何合適的方法實(shí)現(xiàn)，例如通過從雜交的探針3’末端或從添加的與靶標(biāo)片段退火的寡核苷酸(例如六聚物) 或(如果存在的話)接頭通過聚合來實(shí)現(xiàn)。在其中接頭與片段連接的實(shí)施方案中，可以通過添加與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸使得(包含所述接頭的)末端被雙鏈化。在其中片段僅被部分單鏈化的實(shí)施方案中，末端會(huì)典型地已被雙鏈化，并且不需要此類作用。隨后使靶標(biāo)片段的此類雙鏈末端與探針的游離的、未與靶標(biāo)結(jié)合的末端在探針-靶標(biāo)片段雜交體的另一末端處非靶標(biāo)特異性地分子內(nèi)退火。因?yàn)槭Ｓ嗟姆前袠?biāo)的片段會(huì)缺乏連接的探針并因此在另一末端是單鏈的，所以此類分子內(nèi)退火不會(huì)發(fā)生。因此，任選地還含有共有核酸接頭的探針-靶標(biāo)片段雜交體會(huì)在分子內(nèi)采取環(huán)狀構(gòu)象。在所述語境中，“非靶標(biāo)特異性地”表示所述退火是通過不利用或依賴于(即不取決于)靶標(biāo)片段的具體核苷酸序列的手段，其含義是為了實(shí)現(xiàn)此類退火不需要獲知靶標(biāo)片段的序列。因此，退火手段可根據(jù)靶標(biāo)片段的相關(guān)末端是否包含接頭而有所差異。如果存在接頭，則此類退火應(yīng)包括粘性限制性末端之間的退火，因?yàn)殚_發(fā)接頭的已知序列內(nèi)的限制性識別序列不需要靶標(biāo)片段的序列。然而，如果不存在接頭，則此類退火限于平末端或(例如上文所述TA-連接中使用的)兩個(gè)“人工”粘性末端之間的退火。在此類實(shí)施方案中，探針被設(shè)計(jì)為在游離的、 未與靶標(biāo)片段結(jié)合的末端處適當(dāng)?shù)鼐哂衅侥┒嘶蚧パa(bǔ)的粘性末端，或者含有允許通過切割創(chuàng)建此類末端的限制性內(nèi)切核酸酶識別序列。探針-靶標(biāo)片段雜交體的分子內(nèi)退火后，使探針的寡核苷酸B與雙鏈末端的相應(yīng)鏈連接，導(dǎo)致雜交體的環(huán)化。因此，在另一實(shí)施方案中，所述方法在步驟(d)和(e)之間還包括使得至少靶標(biāo)片段的一個(gè)末端——即不與探針連接的末端——成為雙鏈，在共有的核酸接頭在步驟(a) 和(b)之間與片段連接的情況下所述末端應(yīng)包含此類共有的核酸接頭序列；使所述雙鏈末端與探針的游離的、未與靶標(biāo)片段結(jié)合的末端非靶標(biāo)特異性地退火；和使探針-靶標(biāo)片段雜交體的寡核苷酸B與所述雙鏈末端的相應(yīng)鏈連接，以環(huán)化所述雜交體。所述方法這一方面中靶標(biāo)片段的選擇性環(huán)化可在富集和/或檢測步驟中利用。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，所述富集和/或檢測通過提高環(huán)狀核酸與線性核酸比例的手段進(jìn)行。環(huán)狀分子的此類富集或檢測可通過任何合適的手段實(shí)現(xiàn)，包括選擇性擴(kuò)增環(huán)狀核酸的方法，例如滾環(huán)復(fù)制(RCA)、超支化RCA、多鏈置換。另外，環(huán)狀分子的富集可通過選擇性去除非環(huán)狀核酸的方法(例如外切核酸水解)來實(shí)現(xiàn)。合適的外切核酸酶是已知的，并且包括外切核酸酶I、外切核酸酶III、λ外切核酸酶。本發(fā)明的大量代表性優(yōu)選的特定實(shí)施方案在下文中列舉。在第一個(gè)此類實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo)核酸；(b)使共有的核酸接頭與所述片段的末端非靶標(biāo)特異性地退火，其中退火的接頭僅在片段鏈的3’末端或僅在5’末端與片段連接；(c)使得包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段被單鏈化；(d)使步驟(C)的單鏈片段與單一靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含第二非靶標(biāo)特異性部分，所述第一靶標(biāo)特異性部分含有與下述部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸，所述部分位于所述單鏈靶標(biāo)片段的與步驟(b)中與共有核酸接頭連接的末端不同的另一末端處，所述第二靶標(biāo)特異性部分包含于探針的寡核苷酸B的至少一部分(包括一個(gè)末端)互補(bǔ)的核苷酸序列，和(ii)寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸含有或帶有擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)和任選地用于固定化至固相的元件，其中至少一部分(包括一端)與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(e)將所述探針的寡核苷酸B與所述靶標(biāo)片段的與所述探針的寡核苷酸A雜交的末端連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；和(f)借助于探針寡核苷酸B中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)和共有核酸接頭中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，通過擴(kuò)增富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體，并任選地借助于探針寡核苷酸B中的固定化元件將所述片段固定至固相。優(yōu)選地，步驟(a)中的片段化通過限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行，和/或步驟(C)中通過變性使片段單鏈化。如上文所述，本發(fā)明的方法是有利的，因?yàn)榘袠?biāo)片段僅與探針經(jīng)歷單一的靶標(biāo)特異性結(jié)合事件，使得僅需要獲知靶標(biāo)片段的單一短區(qū)域。這相對于已知方法例如WO 2005/111236的Electors (選擇器)和PCT而言是有利的，因?yàn)橐阎椒ㄐ枰@知(劃定靶標(biāo)核酸的)兩個(gè)區(qū)域的靶標(biāo)片段/核酸序列。特別地，本發(fā)明的方法促進(jìn)了未知的核酸結(jié)點(diǎn)(例如DNA易位斷點(diǎn)、重組位點(diǎn)和剪接結(jié)點(diǎn))的分析?？梢钥紤]探針與含有靶標(biāo)核酸的靶標(biāo)核酸片段的單側(cè)連接，因?yàn)槠瓮ㄟ^一端(含有已知序列的末端，探針以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì))從核酸樣品中選擇性地被“拉出(pulled-out)”。在樣品已被適當(dāng)?shù)仄位?即給出具有足夠長度的片段)的前提下，感興趣的交點(diǎn)應(yīng)位于被拉出的片段中，并可通過例如核酸測序被分析和鑒定。所述方法在醫(yī)學(xué)診斷學(xué)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用，特別地通過使用在寡核苷酸B中具有相同富集元件的靶標(biāo)特異性探針和任選地使用共有接頭，給予了可以使所述方法成為多樣型的便利。盡管此類接頭在使用時(shí)在所有“功能性”元件(例如擴(kuò)增元件或限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn))方面會(huì)變成共有的，但是如上文所述，可以通過添加分子標(biāo)簽產(chǎn)生可區(qū)分的變體。此類帶有不同標(biāo)簽的接頭可分別與進(jìn)行了所述方法的單一(合并)核酸樣品的不同的經(jīng)片段化的亞樣品連接。除了允許在單一探針檢測和富集步驟中迅速制備數(shù)百或數(shù)千樣品以外，這還促進(jìn)了并行鑒定從此類樣品中富集的靶標(biāo)核酸的便利， 所述樣品在醫(yī)學(xué)診斷學(xué)語境中可以是患者樣品。此類帶有標(biāo)簽的接頭的使用在下述方面是有利的其可觀地減少為了通過使用“帶標(biāo)簽的”探針指出每種被靶向的核酸的樣品起源所需要設(shè)計(jì)和合成的個(gè)體探針的數(shù)量。另外，探針和(如果使用的話)接頭可被設(shè)計(jì)為包含用于測序的引物，從而形成經(jīng)過非常少的額外制備就能直接測序的擴(kuò)增產(chǎn)物。所述方法的單側(cè)連接的特征還使得能夠進(jìn)行其他有用的應(yīng)用。例如，靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件僅在靶標(biāo)片段的一個(gè)“末端”發(fā)生而另一末端非靶標(biāo)特異性地與共有接頭 (如果使用的話)結(jié)合的事實(shí)表示，所述方法可用于分析可能以稀有量(scarce amount)存在于例如組織學(xué)樣品(例如福爾馬林固定的、石蠟包埋的樣品)中的被降解的DNA。因?yàn)榻宇^與靶標(biāo)片段非靶標(biāo)特異性地連接，所以即使通過降解或例如物理的“隨機(jī)”片段化產(chǎn)生未與探針結(jié)合的末端，每個(gè)與探針結(jié)合的片段也會(huì)與接頭連接。因此，所述方法可促進(jìn)從樣品中富集通過其他方法不易富集的核酸，所述其他方法需要在靶標(biāo)核酸的兩端進(jìn)行靶標(biāo)特異性結(jié)合(例如PCR或依賴于分子內(nèi)環(huán)化的方法)。另外，此類已知方法可要求靶標(biāo)片段具有用于有效擴(kuò)增的最小長度，而片段長度在本發(fā)明的方法中不是至關(guān)重要的。因此，所述方法可對具有非常短平均片段的經(jīng)降解或片段化的核酸進(jìn)行，代表了用于分析稀有量經(jīng)降解的DNA的合適途徑。如上文所述，本發(fā)明方法的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是靶標(biāo)片段和探針之間聯(lián)系(連接)的共價(jià)性質(zhì)。探針與樣品的靶標(biāo)片段直接連接(而不是與其擴(kuò)增或聚合產(chǎn)物連接)，允許使用嚴(yán)格分離條件來有效地去除游離的探針和非靶標(biāo)片段和其他試劑，導(dǎo)致相對于依賴于探針和靶標(biāo)之間雜交的現(xiàn)有技術(shù)方法(例如微陣列捕獲和FISH)的富集。在大部分實(shí)施方案中不依賴于靶標(biāo)片段環(huán)化的方法因?yàn)檫@一原因特別適用于富集長的基因組靶標(biāo)片段，例如長度超過21Λ、由于相對于較短片段更低的片段末端接近度 (proximity)而更難以環(huán)化的片段。這使得所述方法非常適用于(通過例如測序和/或高分辨率多態(tài)性分析)分析通過全基因組關(guān)聯(lián)研究被鑒定為與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)域。 長片段的富集在本發(fā)明方法使得能夠進(jìn)行的另一應(yīng)用(即單體型分析)中也是有用的。如果已知樣品含有雜合的多態(tài)性，則可能使用一種或多種酶(包括識別被多態(tài)性失活的位點(diǎn)的酶)使樣品片段化。通過設(shè)計(jì)分別針對由多態(tài)性位點(diǎn)處切割的存在和不存在產(chǎn)生的靶標(biāo)片段的探針，可以單獨(dú)地富集對應(yīng)于每種單體型的片段，從而允許分析/鑒定各種單體型。 在這樣的方面中，期望產(chǎn)生和富集長的片段，以最大化可用于分析的單體型特異性核酸的量。因?yàn)樗龇椒ㄒ话阈缘卮砹藦膹?fù)雜樣品中檢測和擴(kuò)增具體核酸的高度特異性的方式，所以其可優(yōu)選地在用于分析復(fù)雜DNA樣品中微生物和其他外生病原體的已知方法中使用。與本領(lǐng)域已知的禁止進(jìn)入的探針(padlock probe)相比，本發(fā)明的探針更短并且制造起來更便宜。外來核酸可以通過例如測序被擴(kuò)增和分析，從而為了例如診斷或藥物靈敏度篩選的目的來表征傳染物。與例如PCR不同，本發(fā)明的方法與例如微陣列上的組合的寡核苷酸合成是相容的，使得能夠以低成本生產(chǎn)大的探針集，并允許分析單一的分子。在本發(fā)明方法的第二個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括(a)使核酸片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo)核酸；(b)通過3’或5’外切核酸酶消化，使得包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段被部分單鏈化，其中得到的單鏈化末端部分的長度足以允許所述靶標(biāo)片段單鏈化末端部分的至少一部分與步驟(c)的探針雜交；(C)使步驟(b)的部分單鏈化的片段與單個(gè)靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和 B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述靶標(biāo)片段的所述單鏈化部分(或更特別地與處于所述單鏈化部分末端的部分)的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與探針的寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和(ii)寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸可含有或帶有用于固定化至固相的元件和任選的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，并且其至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A 的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；
(d)將所述探針的寡核苷酸B與所述靶標(biāo)片段中與所述探針的寡核苷酸A雜交的末端連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；和(e)借助于所述探針的寡核苷酸B中的固定化元件，通過固定化至固相，并任選地借助于所述探針的寡核苷酸B中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，通過擴(kuò)增所述靶標(biāo)片段，來富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。這樣的實(shí)施方案在下述方面是尤其有利的片段保持大部分或至少部分為雙鏈， 即未被完全單鏈化。這在一定程度上避免了單鏈核酸片段之間不想要的交叉反應(yīng)性，從而降低了必須被區(qū)分開的雜交體的發(fā)生率。對長基因組序列的富集而言尤其如此，所述長基因組序列為單鏈時(shí)更易于具有此類交叉反應(yīng)性。上文討論了涉及長片段的富集的本發(fā)明方法的應(yīng)用。優(yōu)選地，步驟(a)中的片段化通過限制性內(nèi)切核酸酶來實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，在步驟(d)和(e)之間存在下述步驟使探針-靶標(biāo)片段雜交體與鏈置換聚合酶或非鏈置換聚合酶接觸，使得探針寡核苷酸A與靶標(biāo)片段-雜交的末端和靶標(biāo)片段相應(yīng)鏈被外切核酸水解降解的末端之間的任何缺口被填充，實(shí)質(zhì)上恢復(fù)了探針-靶標(biāo)片段雜交體的雙鏈性。在又一個(gè)優(yōu)選的方面中，連接步驟之后進(jìn)行尺寸分離步驟，以去除游離的未與靶標(biāo)片段結(jié)合的探針。在本發(fā)明方法的第三個(gè)代表性特定實(shí)施方案中，所述方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo)核酸；(b)任選地，使共有的核酸接頭以非靶標(biāo)特異性的方式與所述片段的末端退火，其中退火的接頭在所述片段鏈的3’端或3’端和5’端與所述片段連接，使得接頭至少與下述靶標(biāo)片段的3’末端連接，所述靶標(biāo)片段在5’端在步驟(f)中與探針的寡核苷酸B連接；(c)使包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段單鏈化；(d)使步驟(C)的單鏈化的片段與單一靶標(biāo)-特異性核酸探針的寡核苷酸A和B 接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述單鏈靶標(biāo)片段內(nèi)部非末端部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分， 并且在另一端包含含有與所述探針的寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和(ii)寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸含有或帶有用于檢測和/ 或富集(或更特別地檢測、擴(kuò)增和/或捕獲)所述靶標(biāo)片段的至少一種元件，并且其至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件，其中所述雜交導(dǎo)致所述靶標(biāo)片段的5’端形成flap內(nèi)切核酸水解切割的底物；(e)切割所述內(nèi)切核酸水解切割底物，生產(chǎn)與所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的可連接的5’端；(f)使所述探針的寡核苷酸B與和所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分的一部分連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；
(g)借助于所述檢測和/或富集(或更特別地檢測、捕獲和/或擴(kuò)增)元件富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。在該實(shí)施方案中，flap內(nèi)切核酸酶的使用在下述方面是有利的其避免了需要鑒定與核酸樣品中靶標(biāo)核酸接近的酶(例如限制性內(nèi)切核酸酶)識別序列。可以通過任何一種或多種酶使樣品片段化，即使未知此類酶在靶標(biāo)核酸附近切割。或者可以使用非序列特異性片段化方法，所述方法產(chǎn)生具有不可預(yù)測的序列的片段末端，例如是物理方法，例如是超聲處理或噴霧處理。在此類實(shí)施方案中，探針被設(shè)計(jì)為靶向至靶標(biāo)核酸中具有已知序列的區(qū)域，所述區(qū)域?qū)ζ味允莾?nèi)部的，即不像其他實(shí)施方案中那樣位于片段末端。因此， 位于片段末端的序列是不重要的，并且不需要已知。識別次級結(jié)構(gòu)(與探針雜交的靶標(biāo)片段的突出的(未雜交的)5’區(qū))的flap內(nèi)切核酸酶切割片段，產(chǎn)生與探針的寡核苷酸A雜交并且可與寡核苷酸B連接的“新的”5’端。因此，本發(fā)明的方法不限制樣品的序列特異性片段化的使用，或限于其中靶標(biāo)核酸的已知序列區(qū)域含有內(nèi)切核酸酶識別序列的情況。優(yōu)選地，步驟(a)中的所述片段化是通過限制性內(nèi)切核酸水解實(shí)現(xiàn)的，和/或步驟 (c)中所述片段通過變性被單鏈化。還優(yōu)選的是寡核苷酸B含有或帶有擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)和任選的用于固定化至固相的元件，使得在步驟(g)中所述富集借助于探針寡核苷酸B中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，通過擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)，或如果共有的核酸接頭以非靶標(biāo)特異性的方式與步驟(b)中片段的末端退火，則所述擴(kuò)增借助于探針寡核苷酸B中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)和共有的核酸接頭中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。在又一個(gè)優(yōu)選的方面中，在步驟(f)和(g) 之間存在通過例如凝膠純化對探針-靶標(biāo)片段雜交體進(jìn)行尺寸選擇的步驟。在第四個(gè)代表性的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo)核酸；(b)任選地，使共有的核酸接頭以非靶標(biāo)特異性的方式與所述片段的末端退火，其中退火的接頭僅在所述片段鏈的3’端或僅在5’端與所述片段連接；(c)使包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段至少部分單鏈化，其中所述單鏈化部分包含末端部分，并且其中所述單鏈化部分的長度足以允許所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分的至少一部分與步驟(d)的所述探針雜交；(d)使步驟(C)的至少部分單鏈化的片段與單一靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸 A和B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述靶標(biāo)片段的所述單鏈化部分的至少一部分(或更特別地與末端處的一部分)在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，其中如果共有的核酸接頭根據(jù)任選的步驟(b) 與所述片段連接，則所述第一靶標(biāo)特異性部分包含在序列上與下述部分互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸，所述部分處于所述至少部分單鏈化的靶標(biāo)片段中除了連接共有核酸接頭的末端之外的另一末端處；并且在另一端包含含有與所述探針的寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和(ii)寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸含有或帶有用于檢測和 /或富集(或更特別地檢測/擴(kuò)增和/或捕獲)所述靶標(biāo)片段的至少一種元件，并且其至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(e)使所述探針的寡核苷酸B與和所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分的一部分連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；(f)需要時(shí)至少使所述靶標(biāo)片段的一個(gè)末端雙鏈化，所述末端是未與所述探針連接的末端，在接頭根據(jù)任選的步驟(b)與所述片段連接的情況下，所述末端應(yīng)包含共有的核酸接頭序列；(g)使步驟(f)的雙鏈末端以非靶標(biāo)特異性的方式與所述探針的游離的、未與靶標(biāo)片段結(jié)合的末端分子內(nèi)退火；(h)使所述探針-靶標(biāo)片段雜交體的寡核苷酸B與步驟(f)的雙鏈化末端的相應(yīng)鏈連接，以環(huán)化所述雜交體；和(i)借助于提高環(huán)狀分子與線性分子比例的手段，富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。通過環(huán)化探針-靶標(biāo)片段雜交體，在該實(shí)施方案中，與非靶標(biāo)片段的線性形式相反，富集或檢測可有利地基于所述雜交體被環(huán)化的性質(zhì)。使至少靶標(biāo)片段的一個(gè)末端雙鏈化的步驟(f)在下述實(shí)施方案中不會(huì)是必需的， 其中在部分(C)中僅使片段部分單鏈化，因?yàn)樵诖祟惽闆r下除與探針連接的末端之外的片段末端會(huì)保持為雙鏈。在此類雙鏈化為必需的情況下，(在所述末端是3’末端的情況下) 這優(yōu)選地通過探針寡核苷酸A與靶標(biāo)片段雜交的末端的聚合作用來實(shí)現(xiàn)，或當(dāng)共有的核酸接頭與片段連接時(shí)通過與之互補(bǔ)的寡核苷酸的退火來實(shí)現(xiàn)。步驟(g)的非靶標(biāo)特異性退火可以通過平末端或人工創(chuàng)建的粘末端退火(即通過不依賴于已知靶標(biāo)片段序列的退火手段)來實(shí)現(xiàn)。如果共有的核酸接頭與靶標(biāo)片段連接，則退火可發(fā)生在通過序列特異性消化接頭產(chǎn)生的粘末端和探針游離端相應(yīng)的粘末端之間。富集步驟可涉及通過例如外切核酸酶處理來選擇性去除非環(huán)狀核酸。優(yōu)選地使用能夠降解線性雙鏈DNA的外切核酸酶的混合物(例如包括外切核酸酶III、λ外切核酸酶和外切核酸酶I)，盡管可以單獨(dú)使用任何這些或其他合適的外切核酸酶?；蛘?，通過選擇性擴(kuò)增環(huán)化的探針-靶標(biāo)片段雜交體，例如通過RCA、超支化RCA或多鏈置換來提高環(huán)狀線性核酸分子的比例。本發(fā)明提供了在上述方法中使用的試劑盒。此類試劑盒應(yīng)至少包含寡核苷酸B和一種或多種寡核苷酸Α，和一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶和/或共有的核酸接頭或此類接頭的組合，所述接頭彼此差異僅在于分子標(biāo)簽和/或退火末端。試劑盒的寡核苷酸B可包含至少一種上文定義的檢測和/或富集元件(更特別地至少檢測、捕獲和/或擴(kuò)增元件之一)，并任選地還包含切割位點(diǎn)，如內(nèi)切核酸酶的識別序列。當(dāng)試劑盒中包含一種或多種內(nèi)切核酸酶時(shí)，此類內(nèi)切核酸酶應(yīng)為下述內(nèi)切核酸酶，所述內(nèi)切核酸酶以使得試劑盒的一種或多種寡核苷酸A有用的方式使具體的靶標(biāo)片段化。如果試劑盒包含一種或多種共有的核酸接頭，則此類接頭應(yīng)當(dāng)具有與通過一種或多種下述限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的粘末端相容的退火末端，所述限制性內(nèi)切核酸酶以使得試劑盒的一種或多種寡核苷酸A有用的方式使具體的靶標(biāo)片段化，與此類一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶是否包含在所述試劑盒中無關(guān)。一種或多種接頭可含有擴(kuò)增和/或測序引物結(jié)合位點(diǎn)，和/或切割位點(diǎn)。試劑盒可還包含一種以下組件或兩種或更多以下組件的組合。因此，試劑盒可含有用于使探針寡核苷酸B的末端與靶標(biāo)核酸片段連接的連接酶，特別是上文關(guān)于使靶標(biāo)片段與探針連接的步驟明確提到的連接酶。如上文定義的固相可包括在內(nèi)，試劑盒的寡核苷酸B可固定化在所述固相上或已固定化在所述固相上。或者或另外，對寡核苷酸B中的引物結(jié)合位點(diǎn)特異性(即對應(yīng)于寡核苷酸B的序列)的擴(kuò)增或測序引物可包括在內(nèi)，任選地還包括擴(kuò)增和/或測序所需的聚合酶和/或其他試劑，例如核苷酸、緩沖液、離子等等。在寡核苷酸B中切割位點(diǎn)處切割探針的手段(例如限制性內(nèi)切核酸酶)可包括在內(nèi)。對使用外切核酸酶使樣品片段單鏈化的本發(fā)明方法的實(shí)施方案而言，試劑盒可包括此類酶，尤其是上文關(guān)于單鏈化步驟明確提到的此類酶。聚合酶可包括在內(nèi)，用于填充寡核苷酸A和與探針雜交的靶標(biāo)片段被部分降解的鏈之間的任何缺口，和/或用于延伸寡核苷酸A的3’端， 從而在某些實(shí)施方案中使探針-靶標(biāo)片段雜交體的非探針末端雙鏈化。任選的其他試劑盒組件包括如上文所述的脫磷酸化酶(磷酸酶)，用于添加進(jìn)行選擇性連接的5’磷酸的激酶， 用于填平懸突的(粘性)限制性片段末端的聚合酶(例如T4DNA聚合酶)，腺苷，用于對平片段末端添加相同末端的聚合酶，用于引導(dǎo)聚合作用從而在某些實(shí)施方案中使探針-靶標(biāo)片段雜交體的非探針末端雙鏈化、或用于多鏈置換擴(kuò)增的隨機(jī)六聚體，QPCR試劑例如帶熒光標(biāo)記的核苷酸或Taqman 探針，用于RCA或超支化RCA的一種或多種引物，和用于使核酸樣品片段化的flap內(nèi)切核酸酶。試劑盒可任選地還含有如上文所述與本發(fā)明方法中可使用的共有核酸接頭中的擴(kuò)增和/或測序引物結(jié)合位點(diǎn)和/或切割位點(diǎn)結(jié)合使用的適當(dāng)?shù)囊?、擴(kuò)增/測序試劑和/或切割手段。還任選地包括在此類試劑盒內(nèi)的是對應(yīng)于雙鏈接頭的任一鏈的單鏈寡核苷酸，從而在某些實(shí)施方案中使探針-靶標(biāo)片段雜交體的非探針末端雙鏈化。在某些實(shí)施方案中，靶標(biāo)片段與探針的雜交/連接由flap內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)，因此試劑盒可還包括此類酶和任選的適當(dāng)?shù)妮o因子。試劑盒組件可存在于單獨(dú)的容器中，或一種或多種組件可存在于相同的容器中， 其中所述容器可以是儲存容器和/或在被設(shè)計(jì)為使用所述試劑盒的測定法期間使用的容
ο除了上述組件以外，所述試劑盒可還包括用于實(shí)踐所述方法的說明。這些說明可以多種形式存在于所述試劑盒中，其中一種或多種可存在于試劑盒中。這些說明可存在的一種形式是試劑盒包裝中、包裝插入物中等等的合適介質(zhì)或基質(zhì)上的印刷信息(例如印刷有信息的一片紙或數(shù)片紙)。另一種手段可以是記錄了所述信息的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，例如磁盤(diskette)、⑶等等?？梢源嬖诘牧硪环N方式是可通過因特網(wǎng)使用以訪問遠(yuǎn)程站點(diǎn)上信息的網(wǎng)站地址。任何便利的手段可存在于試劑盒中。因此，在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)DNA的試劑盒，所述試劑盒包含(a)屬于單鏈寡核苷酸的寡核苷酸B，其可含有或帶有至少一種用于檢測和/或富集(或更特別地檢測、擴(kuò)增和/或捕獲)靶標(biāo)片段的元件，其中至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，其中所述靶標(biāo)片段和所述第二非靶標(biāo)特異性部分如上文定義，和；
(b)屬于單鏈寡核苷酸的一種或多種寡核苷酸A，其在一端包含含有與靶標(biāo)片段的單鏈化部分的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，其中所述單鏈化部分和所述靶標(biāo)片段如上文定義，和；(c)(i) 一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶，和/或(ii)共有的核酸接頭或此類接頭的多種變體，其中所述變體彼此差異在于所帶有的分子標(biāo)簽和/或在于所述接頭與所述片段退火的末端。本發(fā)明會(huì)參考以下非限制性實(shí)施例，參考以下附圖來進(jìn)一步描述，其中

圖1展示了所述方法的具體實(shí)施方案。核酸樣品經(jīng)限制性酶消化；共有的雙鏈被設(shè)計(jì)為選擇性地連接至片段的3’或5’任一端。這通過接頭或片段的選擇性磷酸化/去磷酸化實(shí)現(xiàn)(磷酸化的末端顯示為“P”)；片段被變性；探針與靶標(biāo)片段退火；探針被連接至靶標(biāo)片段；任選地，探針裝配有固定化至固相的功能；靶標(biāo)片段使用探針寡核苷酸B和接頭中的共有序列來擴(kuò)增。Sl展示了所述方法的又一個(gè)具體的實(shí)施方案。核酸樣品經(jīng)限制性酶消化；通過外切核酸水解使所有片段的5’或3’末端任一的部分單鏈化，同時(shí)中部保持為雙鏈；探針被設(shè)計(jì)為與靶標(biāo)片段兩個(gè)單鏈末端之一雜交，使得產(chǎn)生對連接易感的接點(diǎn)；探針與靶標(biāo)片段連接；探針裝配有用于固相富集的功能，例如生物素分子(顯示為“B”)；任選地，使用探針寡核苷酸B中的共有序列來擴(kuò)增靶標(biāo)片段。Sl展示了所述方法的又一個(gè)具體的實(shí)施方案。使用物理或酶促手段使樣品核酸片段化；任選地，通過例如使樣品去磷酸化并使用經(jīng)磷酸化的接頭(磷酸化的末端顯示為 “P”)，使共有的雙鏈接頭與片段的3’末端特異性連接；片段被變性；使探針與靶標(biāo)片段退火，形成用于靶標(biāo)片段5’末端的flap內(nèi)切核酸水解切割的底物；使探針與靶標(biāo)片段連接；探針裝配有用于固相固定化和富集的功能；使用探針寡核苷酸B中的共有序列和/或任選地使用接頭，來擴(kuò)增和/或檢測探針。Si展示了所述方法的又一個(gè)具體的實(shí)施方案。靶標(biāo)片段裝配有根據(jù)本發(fā)明方法任何實(shí)施方案的探針；
在未雙鏈化的情況下，使靶標(biāo)片段相對于探針的遠(yuǎn)端部分雙鏈化。這可例如通過由雜交的探針3’端開始的聚合作用介導(dǎo)，或通過六聚體退火及之后的聚合作用介導(dǎo)；探針被設(shè)計(jì)為允許與通過連接形成的探針-靶標(biāo)片段雜交體分子的遠(yuǎn)端進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化；分子內(nèi)連接可例如通過粘末端連接或平末端連接來實(shí)現(xiàn)；然后可使用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、超支化RCA、多鏈置換、外切核酸水解或提高環(huán)狀分子與線性分子間比例的其他方法，富集環(huán)化的探針-靶標(biāo)片段雜交體。Sl展示了來自擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。Am3 =與片段連接的胺接頭。NoDNA =雜交反應(yīng)中不包括基因組DNA的陰性對照。所選擇的17種片段長度在200和450個(gè)核苷酸之間。圖6展示了胺阻斷詵擇(amine blocked selection)的qPCR讀數(shù)。每種引物對的Ct數(shù)值沿χ軸從左到右展示，對應(yīng)于檢索表中列出的引物對的降序。
實(shí)施例實(shí)施例1用T4DNA聚合酶孵育經(jīng)限制性酶消化的人基因組DNA，從而產(chǎn)生平末端。隨后通過添加Taq聚合酶產(chǎn)生3’腺苷懸突，并在單獨(dú)的反應(yīng)中使用T4DNA連接酶將產(chǎn)物與具有3’ 突出胸苷的接頭連接。然后與通用的探針-寡核苷酸B —起，向反應(yīng)混合物中添加十七種在計(jì)算機(jī)芯片上設(shè)計(jì)的探針-寡核苷酸A。然后對反應(yīng)熱變性，并允許探針與經(jīng)限制性酶消化的基因組DNA樣品中17種特定的基因組片段的單鏈末端雜交。雜交后使用探針上的生物素，由固相(珠子)捕獲探針。在嚴(yán)格的洗滌后，探針被連接在珠子上，并使用分別位于探針和接頭上的一對通用引物對(Common primer pair)，通過PCR擴(kuò)增所有片段。通過凝膠電泳和qPCR分析結(jié)果。17種探針-寡核苷酸A、接頭、探針-寡核苷酸B和引物對的序列展示于表1中。 與接頭相關(guān)使用的術(shù)語“胺”表示接頭的一端(不旨在與核酸片段連接的一端)被氨基 (NH2) “保護(hù)”免于此類連接。表權(quán)利要求
1.用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)脫氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo) DNA ；(b)使一個(gè)共有的核酸接頭或其多個(gè)變體以非靶標(biāo)特異性的方式與所述片段的末端退火，其中退火的接頭在所述片段鏈的3’端和/或5’端與所述片段連接，使得接頭僅與下述靶標(biāo)片段的末端連接，所述靶標(biāo)片段在另一端在步驟(e)中與探針的寡核苷酸B連接，并且其中所述變體接頭彼此差異在于所帶有的分子標(biāo)簽和/或在于所述接頭與所述片段退火的末端；(c)使包含所述靶標(biāo)片段的所述片段至少部分單鏈化，其中所述單鏈化部分包括末端部分，并且其中所述單鏈化部分的長度足以允許所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分的至少一部分與步驟(d)的所述探針雜交；(d)使步驟(c)的至少部分單鏈化的片段與單個(gè)靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和 B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述靶標(biāo)片段的所述單鏈化部分的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與所述探針的寡核苷酸B的至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和( )寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸可含有或帶有用于檢測和 /或富集所述靶標(biāo)片段的至少一種元件，并且其至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(e)將所述探針的寡核苷酸B與所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分中與所述探針寡核苷酸A 雜交的部分連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；和(f)檢測或富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。
2.用于檢測或富集多種靶標(biāo)DNA的根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(d)中所述靶標(biāo)片段與多種核酸探針的寡核苷酸A和B接觸，所述多種核酸探針各自具有帶有不同的第一靶標(biāo)特異性部分的寡核苷酸A，從而使多種不同的靶標(biāo)片段可分別與所述探針退火。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中在所述多種核酸探針中，寡核苷酸B包含在每種探針中相同的共有序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中每種探針中的所述共有序列包含檢測和/或富集元件。
5.根據(jù)權(quán)利要求2到4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多種核酸探針包含相同的寡核苷酸B。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸樣品包含基因組DNA或其亞級分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸樣品包含cDNA或其亞級分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶標(biāo)片段包含至少30個(gè)核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)中所述片段化是⑴酶促的；和/或(ii)物理的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酶促片段化借助于限制性內(nèi)切酶進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的方法，其中所述酶促片段化借助于下述酶，對所述酶而言，接近核酸樣品中靶標(biāo)DNA的識別序列是多態(tài)的，從而對所述靶標(biāo)DNA的所述檢測或富集是單體型特異性的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段化如下完成對所述核酸樣品的小份試樣分別進(jìn)行一種或多種酶促方法和/或物理方法的組合，并在步驟(c)之前合并經(jīng)片段化的核酸樣品的所述小份試樣。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(c)中通過(i)變性或 ( )核酸外切來實(shí)現(xiàn)所述至少部分的單鏈化。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)中，寡核苷酸A的所述第一靶標(biāo)特異性部分包含與所述至少部分單鏈化的靶標(biāo)片段一端的單鏈化部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(d)中寡核苷酸A的所述第一靶標(biāo)特異性片段的長度是至少20個(gè)核苷酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)中，由寡核苷酸B含有或帶有的所述富集元件是擴(kuò)增元件和/或捕獲元件。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述擴(kuò)增元件和捕獲元件分別是擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)和用于固定化至固相的元件。
18.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)中寡核苷酸B被固定化至固相。
19.根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)中寡核苷酸B還帶有或含有分子標(biāo)簽。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(e)中寡核苷酸B的所述連接是與所述靶標(biāo)片段的末端連接。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在步驟(f)中，所述探針-靶標(biāo)雜交體中的所述靶標(biāo)片段從與所述擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)雜交的引物擴(kuò)增。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在步驟(f)中所述探針-靶標(biāo)片段雜交體中的所述靶標(biāo)片段借助于所述固定化元件被固定化至固相。
23.根據(jù)權(quán)利要求1到22中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(f)中所述探針-靶標(biāo)片段雜交體中的所述片段或其擴(kuò)增產(chǎn)物被測序。
24.根據(jù)權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述共有核酸接頭包含用于擴(kuò)增的元件。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中在步驟(f)中所述探針-靶標(biāo)片段雜交體借助于所述探針寡核苷酸B中和所述接頭中的擴(kuò)增元件而被擴(kuò)增。
26.根據(jù)權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述共有核酸接頭帶有分子標(biāo)簽。
27.根據(jù)權(quán)利要求M到沈中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非特異性退火通過使所述片段的末端關(guān)于所述接頭的至少一個(gè)末端為粘性來實(shí)現(xiàn)，并且其中所述接頭與所述片段在片段鏈3’端或5’端的連接分別通過連接前片段或接頭的選擇性脫磷酸化來實(shí)現(xiàn)。
28.根據(jù)權(quán)利要求M到27中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)中，所述核酸樣品的片段化包括單獨(dú)地使多種核酸樣品片段化，且步驟(b)包括分別對樣品的片段連接帶有不同分子標(biāo)簽的變體接頭，并合并所述與接頭連接的經(jīng)片段化的核酸樣品。
29.根據(jù)權(quán)利要求1到觀中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(c)中所述片段被部分而不是完全地單鏈化。
30.根據(jù)權(quán)利要求M到27中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(a)中所述片段化如權(quán)利要求10中定義，并且步驟(b)包括對所述合并的小份試樣的片段連接下述多種變體接頭， 所述多種變體接頭在所述接頭與片段退火處的末端處不同。
31.根據(jù)權(quán)利要求1到13和15到30中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)中寡核苷酸A的所述第一靶標(biāo)特異性部分包含與所述至少部分單鏈化的靶標(biāo)片段的單鏈化內(nèi)部非末端部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸，并且其中所述探針與所述靶標(biāo)片段的所述退火通過所述內(nèi)部非末端部分與寡核苷酸A的所述第一靶標(biāo)特異性部分的雜交來實(shí)現(xiàn)，導(dǎo)致靶標(biāo)片段的5’端形成flap內(nèi)切核酸水解切割的底物，并且還包括切割所述flap內(nèi)切核酸水解切割底物，以生產(chǎn)與所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的可連接的5’端。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中在步驟(e)中，寡核苷酸B的所述連接是與所述靶標(biāo)片段的所述可連接的5’末端的連接。
33.根據(jù)權(quán)利要求1到10、對和沈到32中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(f)中， 所述檢測或富集通過提高環(huán)狀分子與線性分子比例的手段來實(shí)現(xiàn)，還在步驟(e)和(f)之間包括使至少靶標(biāo)片段的一個(gè)末端雙鏈化，所述末端是未與所述探針連接的末端，所述末端應(yīng)包含在步驟(b)中與所述片段連接的共有核酸接頭序列；使所述雙鏈化的末端分子內(nèi)與所述探針的游離的、未與靶標(biāo)片段結(jié)合的末端以非靶標(biāo)特異性的方式退火；和使所述探針-靶標(biāo)片段雜交體的寡核苷酸B與所述雙鏈化末端的相應(yīng)鏈連接，以環(huán)化所述雜交體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中在步驟(f)中提高環(huán)狀分子與線性分子比例的所述手段通過外切核酸酶處理和/或滾環(huán)擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)。
35.用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)脫氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo) DNA ；(b)使共有的核酸接頭以非靶標(biāo)特異性的方式與所述片段的末端退火，其中退火的接頭僅在所述片段鏈的3’端或僅在5’端與所述片段連接；(c)使包含所述靶標(biāo)片段的所述片段單鏈化；(d)使步驟(c)的單鏈化的片段與單個(gè)靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含與下述部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，所述部分處于所述單鏈化靶標(biāo)片段的與步驟(b)中與共有核酸接頭連接的末端不同的另一末端，并且所述單鏈寡核苷酸在另一端包含含有與所述探針的寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和( )寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸含有或帶有擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)和任選的用于固定化至固相的元件，其中至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(e)將所述探針的寡核苷酸B與所述靶標(biāo)片段中與所述探針寡核苷酸A雜交的末端連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；和(f)借助于所述探針寡核苷酸B中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)和所述共有核酸接頭中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，通過擴(kuò)增富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體，并任選地借助于所述探針寡核苷酸B中的固定化元件將所述片段固定化至固相。
36.用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)脫氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法包括(a)使核酸片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo)DNA ；(b)通過3’或5’外切核酸酶消化，使得包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段被部分單鏈化，其中得到的單鏈化末端部分的長度足以允許所述靶標(biāo)片段單鏈化末端部分的至少一部分與步驟(c)的探針雜交；(c)使步驟(b)的部分單鏈化的片段與單個(gè)靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述靶標(biāo)片段的所述單鏈化部分的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與探針的寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和( )寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸可含有或帶有用于固定化至固相的元件和任選的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，并且其至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(d)將所述探針的寡核苷酸B與所述靶標(biāo)片段中與所述探針的寡核苷酸A雜交的末端連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；和(e)借助于所述探針的寡核苷酸B中的固定化元件，通過固定化至固相，并任選地借助于所述探針的寡核苷酸B中的擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)，通過擴(kuò)增所述靶標(biāo)片段，來富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。
37.用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)脫氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo) DNA ；(b)任選地，使共有的核酸接頭以非靶標(biāo)特異性的方式與所述片段的末端退火，其中退火的接頭在所述片段鏈的3’端或3’端和5’端與所述片段連接，使得接頭至少與下述靶標(biāo)片段的3’末端連接，所述靶標(biāo)片段在5’端在步驟(f)中與探針的寡核苷酸B連接；(c)使包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段單鏈化；(d)使步驟(c)的單鏈化的片段與單一靶標(biāo)-特異性核酸探針的寡核苷酸A和B接觸， 其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述單鏈靶標(biāo)片段內(nèi)部非末端部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與所述探針的寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和( )寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸含有或帶有用于檢測和/或富集所述靶標(biāo)片段的至少一種元件，并且其至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件， 其中所述雜交導(dǎo)致所述靶標(biāo)片段的5’端形成flap內(nèi)切核酸水解切割的底物；(e)切割所述內(nèi)切核酸水解切割底物，生產(chǎn)與所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的可連接的5’端；(f)使所述探針的寡核苷酸B與和所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分的一部分連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；(g)借助于所述檢測和/或富集元件富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。
38.用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)脫氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo) DNA ；(b)任選地，使共有的核酸接頭以非靶標(biāo)特異性的方式與所述片段的末端退火，其中退火的接頭在所述片段鏈的3’端和/或5’端與所述片段連接，使得接頭僅與下述靶標(biāo)片段鏈的末端連接，所述靶標(biāo)片段在另一端在步驟(e)中與探針的寡核苷酸B連接；(c)使包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段至少部分單鏈化，其中所述單鏈化部分包含末端部分，并且其中所述單鏈化部分的長度足以允許所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分的至少一部分與步驟(d)的所述探針雜交；(d)使步驟(c)的至少部分單鏈化的片段與單一靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和 B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述靶標(biāo)片段的所述單鏈化部分的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，其中如果共有的核酸接頭根據(jù)任選的步驟(b)與所述片段連接，則所述第一靶標(biāo)特異性部分包含在序列上與下述部分互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸，所述部分處于所述至少部分單鏈化的靶標(biāo)片段的除了連接共有核酸接頭的末端之外的另一末端處，并且所述單鏈寡核苷酸在另一端包含含有與所述探針的寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和( )寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸含有或帶有用于檢測和/或富集所述靶標(biāo)片段的至少一種元件，并且其至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(e)使所述探針的寡核苷酸B與和所述探針的寡核苷酸A雜交的所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分的一部分連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；(f)需要時(shí)至少使所述靶標(biāo)片段的一個(gè)末端雙鏈化，所述末端是未與所述探針連接的末端，在接頭根據(jù)任選的步驟(b)與所述片段連接的情況下，所述末端應(yīng)包含共有的核酸接頭序列；(g)使步驟(f)的雙鏈末端以非靶標(biāo)特異性的方式與所述探針的游離的、未與靶標(biāo)片段結(jié)合的末端分子內(nèi)退火；(h)使所述探針-靶標(biāo)片段雜交體的寡核苷酸B與步驟(f)的雙鏈化末端的相應(yīng)鏈連接，以環(huán)化所述雜交體；和(i)借助于提高環(huán)狀與線性分子比例的手段，富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。
39.用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)DNA的試劑盒，所述試劑盒包含(a)屬于單鏈寡核苷酸的寡核苷酸B，其可含有或帶有至少一種用于檢測和/或富集靶標(biāo)片段的元件，其中至少一部分，包括一端，與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，其中所述靶標(biāo)片段和所述第二非靶標(biāo)特異性部分如權(quán)利要求1中定義，和；(b)屬于單鏈寡核苷酸的一種或多種寡核苷酸A，其在一端包含含有與靶標(biāo)片段的單鏈化部分的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與寡核苷酸B的至少一部分，包括一端，互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，其中所述單鏈化部分和所述靶標(biāo)片段如權(quán)利要求1中定義，和；(C)(i) 一種或多種限制性內(nèi)切核酸酶，和/或( )共有的核酸接頭或此類接頭的多種變體，其中所述變體彼此差異在于所帶有的分子標(biāo)簽和/或在于所述接頭與所述片段退火的末端。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于檢測或富集核酸樣品中存在的靶標(biāo)脫氧核糖核酸(DNA)的方法，所述方法包括(a)使核酸樣品片段化，產(chǎn)生包括靶標(biāo)片段在內(nèi)的核酸片段，所述靶標(biāo)片段含有所述靶標(biāo)DNA；(b)使得包括所述靶標(biāo)片段在內(nèi)的所述片段至少部分被單鏈化，其中單鏈化的部分包括末端部分，并且其中所述單鏈化部分的長度足以允許所述靶標(biāo)片段單鏈化部分的至少一部分與步驟(c)的探針雜交；(c)將步驟(b)的至少部分單鏈化的片段與單個(gè)靶標(biāo)特異性核酸探針的寡核苷酸A和B接觸，其中(i)寡核苷酸A是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸在一端包含含有與所述靶標(biāo)片段的所述單鏈化部分的至少一部分在序列上互補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的第一靶標(biāo)特異性部分，并且在另一端包含含有與探針的寡核苷酸B的至少一部分(包括一端)互補(bǔ)的核苷酸序列的第二非靶標(biāo)特異性部分，和(ii)寡核苷酸B是下述單鏈寡核苷酸，所述單鏈寡核苷酸可含有或帶有用于檢測和/或富集所述靶標(biāo)片段的至少一種元件，并且其至少一部分(包括一端)與寡核苷酸A的第二非靶標(biāo)特異性部分在序列上互補(bǔ)，使得所述靶標(biāo)片段通過與寡核苷酸A的第一靶標(biāo)特異性部分雜交而變得與所述探針退火，導(dǎo)致每個(gè)靶標(biāo)片段僅發(fā)生一次靶標(biāo)特異性探針結(jié)合事件；(d)將所述探針的寡核苷酸B與所述靶標(biāo)片段的單鏈化部分中與所述探針寡核苷酸A雜交的部分連接，生產(chǎn)探針-靶標(biāo)片段雜交體；和(e)檢測或富集所述探針-靶標(biāo)片段雜交體。本發(fā)明還提供了在本發(fā)明方法中使用的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102575293SQ201080042740
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者亨瑞克·約翰森, 奧洛夫·艾瑞克森, 阿勒弗·蘭德恩, 馬格納斯·伊薩克森 申請人:哈羅基因公司