專利名稱：用于防治植物病原性真菌的生物殺真菌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌毒性細(xì)菌(特別是普城沙雷菌(Serratia plymuthica) CCGG2742野生型菌株)及其分泌的真菌毒性分子，其作為植物病原性真菌(特別是在收獲前后導(dǎo)致果實(shí)灰腐的灰霉菌(Botrytis cinerea)真菌)的生物防治劑。該細(xì)菌可在收獲前后以活菌形式使用，這是因?yàn)槠涫且环N對(duì)動(dòng)植物均不顯示致病性的野生腐生微生物。同時(shí)，也可以使用所分泌分子的濃縮物或者單獨(dú)使用純的真菌毒性分子制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了表征為普城沙雷菌CCGG2742的野生型細(xì)菌菌株及其作為生物殺真菌劑的用途。所述細(xì)菌菌株已保藏于西班牙瓦倫西亞大學(xué)的西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Coleccion Espafiolade Cultivos Tipo，CECT))。國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)指定的登錄號(hào)為CECT7404 (參見所附文件)。這種源自智利的野生型細(xì)菌從葡萄皮中分離出來，并具有殺死 植物病原性真菌灰霉菌之不同分離株和野生型菌株的能力。該細(xì)菌的殺真菌能力是由于其 分泌真菌毒性分子所致，所述真菌毒性分子與真菌相互作用、破壞真菌并因此抑制分生孢子萌發(fā)以及真菌菌絲體增殖。許多目前使用的生物殺真菌劑對(duì)于人和植物具有潛在的致病性。相反，普城沙雷菌CCGG2742對(duì)于植物或果實(shí)不具有致病性也不具有毒性，并且還發(fā)現(xiàn)其對(duì)于動(dòng)物和人也不具有致病性。實(shí)驗(yàn)室研究表明，在僅含有I. 5% (重量/體積)瓊脂(用以維持適當(dāng)水平的濕度)的培養(yǎng)皿中，在20°C接種7天后觀察，發(fā)現(xiàn)將其接種到豆類和葡萄植物葉子中不會(huì)造成這些宿主任何可見的變化。以同樣的方式，當(dāng)將高水平的細(xì)菌菌株接種物(2 X IO10Cfu (菌落形成單位)/葡萄衆(zhòng)果)加至健康或有傷口的葡萄中，在如上述同樣的條件下接種7天后未觀察到任何影響。目前的細(xì)菌生物殺真菌劑存在的另一個(gè)問題是其在需要保護(hù)免受植物病原性真菌侵害的植物和果實(shí)表面的存活時(shí)間短。實(shí)驗(yàn)室研究表明，將CCGG2742菌株以IO6 108cfU/cm2劑量接種于葡萄上，在果皮表面達(dá)到IO3 105cfU/cm2的水平，并且如果葡萄有傷口，則菌群在20°C接種24小時(shí)后生長(zhǎng)至IO5 107cfu/cm2，當(dāng)將果實(shí)保存在4°C，則維持同樣的水平達(dá)5 7天，保護(hù)免受灰霉菌的感染。本發(fā)明的生物學(xué)試劑對(duì)應(yīng)于從田間(一般在葡萄皮上)分離的并且已通過生物化學(xué)、微生物學(xué)，電子顯微鏡和16S rDNA測(cè)序技術(shù)鑒定的野生細(xì)菌。普城沙雷菌CCGG2742是源于智利的菌株，其對(duì)應(yīng)于腐生生物，對(duì)動(dòng)植物無致病性，因此其活細(xì)胞適于用作抗灰霉菌的生物殺真菌劑。此外，本發(fā)明涉及含有所述細(xì)菌菌株或含有所述細(xì)菌菌株之提取物的組合物，或者涉及含有從其衍生之化合物(例如，所述細(xì)菌菌株分泌的真菌毒性分子)的溶液或混合物，所有這些都能夠保護(hù)植物及其果實(shí)在收獲前后期間免受植物病原性微生物的侵害。本發(fā)明還包括從野生型菌株衍生的、具有基本相同之特征的突變體。同樣地，本發(fā)明涉及獲得所述細(xì)菌菌株或其衍生物的方法，并且涉及其在保護(hù)植物(尤其是果實(shí))中的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明提供了使用純的普城沙雷菌CCGG2742細(xì)菌菌株防治植物中真菌病害的制劑。使用該細(xì)菌作為化學(xué)合成之殺真菌劑的天然替代物，從而為實(shí)現(xiàn)植物病原性真菌病害的防治或消除確保了更安全的環(huán)境。最后，本發(fā)明提供了含有生物學(xué)活性之合適形式和量的所述細(xì)菌菌株的組合物。該混合物含有能夠使細(xì)菌粘附到其所接種之植物上的無毒試劑、植物營(yíng)養(yǎng)物和防腐劑。該混合物以液體懸液或凍干粉末的形式存在。
背景技術(shù)：
由植物病原性真菌導(dǎo)致的病害被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)最有害且傳播較廣的病害。目前，這些病害的防治主要基于化學(xué)殺真菌劑的使用。由于缺乏有效的和環(huán)境更安全的替代物，盡管化學(xué)殺真菌劑對(duì)于植物和操作者和/或在噴灑區(qū)域工作的人具有高毒性，并且其幾乎不被生物所降解，但是因?yàn)槠鋵?duì)抗真菌病害相對(duì)有效的活性所以仍在大量使用。
灰霉菌是一種感染很多重要經(jīng)濟(jì)作物品種(包括果樹、觀賞植物和蔬菜)的植物病原性真菌。該真菌導(dǎo)致稱為“灰霉病”的病害，造成草莓、覆盆子、蘋果、梨、栗子、獼猴桃和葡萄等收獲前后的主要問題。在葡萄中該真菌導(dǎo)致葡萄腐爛病(pudrici0n delracimo)，這被認(rèn)為是目前在智利的水果出口市場(chǎng)上影響生產(chǎn)水平的最嚴(yán)重病害之一，因?yàn)槠洳粌H在田間而且在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中均可造成巨大的損失(van Kan J. A. 2006.Licensed to kill the lifestyle of a necrotrophic plant pathogen，Trends PlantSci. 11，247-253 ;Elad，Y. ,Williamson,B.，Tudzynski，P.和DeIen，N.編· 2007. Botrytis Biology, Pathology and Control. The Netherlands Kluwer Academic Publishers)。目前，這種重要的植物病原菌的防治主要通過化學(xué)殺真菌劑來實(shí)現(xiàn)。但是，在過去幾年中，已描述了一些具有抗灰霉菌之抗真菌活性的微生物。一些最有前景的實(shí)例有Serenade⑩ 其活性原理是稱為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)QST 713的細(xì)菌，其由加州戴維新的AgraQuest Inc,公司在菜園土壤樣本中發(fā)現(xiàn)。這種殺真菌劑在多個(gè)國(guó)家(包括智利)注冊(cè)。其具有低毒性，并且其作為商品在美國(guó)用于病害(例如粉孢子(葡萄白粉菌(Uncinula necator)),灰霉菌導(dǎo)致的灰腐和葡萄中的酸腐)防治。美國(guó)專利No. 5,869，038 描述了突光假單胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、液化沙雷菌(Serratia Iiquefaciens)、普城沙雷菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilis)和多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)的細(xì)菌分離株,其有效地抑制導(dǎo)致白菜收獲后病害的灰霉菌和甘藍(lán)鏈格孢菌(Alternaria brassicicola)真菌的發(fā)生。該專利所述的普城沙雷菌對(duì)應(yīng)于菌株CL43，其不同于本發(fā)明中的細(xì)菌菌株，并且為了具有合適的抑制真菌發(fā)生的效果，其通常與先前提及的細(xì)菌混合使用。相反，細(xì)菌菌株CCGG2742作為純培養(yǎng)物，有效地抑制灰霉菌，并且不必為了用作殺真菌劑而與其它細(xì)菌混合。美國(guó)專利No. 6，004, 774公開了抑制致病性植物真菌和細(xì)菌發(fā)生的枯草芽孢桿菌菌株，并描述了治療或保護(hù)植物免受真菌和細(xì)菌感染的方法。美國(guó)專利No. 6，077，506涉及一種新的顯示廣譜抗真菌和抗細(xì)菌能力的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)菌菌株。此外還描述了使用該蘇云金芽孢桿菌細(xì)菌菌株或其產(chǎn)生的抗生素防治廣譜的植物病原性細(xì)菌和真菌。WO 00/57706公開了成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)細(xì)菌菌株基本上純的生物培養(yǎng)物，其用作生物防治造成果實(shí)腐爛之真菌的拮抗劑。這些拮抗劑具有非常高的效力，并且與那些最常使用的合成抗真菌劑相當(dāng)。該拮抗劑有效地對(duì)抗由灰霉菌、指狀青霉菌(Penicillimn digitatum)、擴(kuò)展青霉菌(Penicillium expansum)、意大利青霉菌(Penicillium i tali cum)和匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)導(dǎo)致的腐爛。WO 02/072795公開了一組細(xì)菌，其為抗御植物病原性真菌和細(xì)菌的拮抗劑。這些分離的細(xì)菌有多粘芽孢桿菌、綠針假單胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、普城沙雷菌、和枯草芽孢桿菌菌種。在該情形中，所述細(xì)菌菌株普城沙雷菌VKPM B-7957也不同于本發(fā)明的細(xì)菌菌株，因?yàn)楫?dāng)作為純培養(yǎng)物使用時(shí)，此細(xì)菌抗植物病原性真菌的效力很低，并且其必須與其它具有殺真菌活性的細(xì)菌混合使用以增強(qiáng)其效果。WO 03/000051 公開了一種地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)細(xì)菌菌株SB3086的生物學(xué)純培養(yǎng)物用作生物殺真菌劑。將活生物體用作生物防治劑具有一些局限性，例如抗植物病原體的有效范圍窄，隨時(shí)間不穩(wěn)定，這造成活生物體在環(huán)境中的存在時(shí)間短，因而導(dǎo)致非常低的生物殺蟲劑活性。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存條件時(shí)，很多所使用的細(xì)菌菌株在幾周內(nèi)死亡，或者在田間使用典型條件(具有較高的溫度和對(duì)于活躍生長(zhǎng)之微生物有害的紫外線)下幾小時(shí)內(nèi)死亡。在應(yīng)使用所述微生物的同樣位置培養(yǎng)所述微生物的嘗試已取得一些效果。但是，培養(yǎng)物污染的嚴(yán)重問題以及生物防治劑需在晚間施用(以防紫外線和溫度影響)的需要使系統(tǒng)復(fù)雜，并且造價(jià)昂貴。這表明目前尚沒有設(shè)計(jì)出能夠抑制真菌病害造成之植物損害的有效的且環(huán)境友好的生物防治方法，因此，減少目前大量使用的合成化學(xué)殺真菌劑的使用向科學(xué)家提出了巨大的挑戰(zhàn)，也是農(nóng)業(yè)的巨大需求。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有生物殺真菌活性的有效的、環(huán)境安全的生物學(xué)試劑，用于防治由植物病原性真菌和微生物(特別是灰霉菌)造成的植物病害。


圖I是普城沙雷菌CCGG2742細(xì)胞的掃描電鏡照片。左下角的短線表示I μ m。圖2是普城沙雷菌CCGG2742的顯微鏡照片。用1%磷鎢酸鉀進(jìn)行負(fù)染。圖3是普城沙雷菌CCGG2742超薄切片的顯微鏡照片。圖4示意普城沙雷菌CCGG2742在不同溫度下的生長(zhǎng)圖示。圖5示意普城沙雷菌CCGG2742在不同pH值緩沖的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)圖示。圖6顯示生物殺真菌劑細(xì)菌對(duì)灰霉菌菌絲體的作用。圖7顯示普城沙雷菌CCGG2742的16S rDNA的部分核苷酸序列。圖8顯示作為生物防治劑的細(xì)菌于20°C在果實(shí)中孵育的效果。圖9顯示作為生物防治劑的細(xì)菌于4°C在果實(shí)中孵育的效果。發(fā)明詳述所述細(xì)菌菌株CCGG2742對(duì)應(yīng)于普城沙雷菌菌種。通過微生物測(cè)定和生化測(cè)定得出的其特征示于表I、2和3中。其在Luria Bertani (LB)瓊脂中以及在補(bǔ)充有麥芽提取物(20g/L)的瓊脂中產(chǎn)生無色/白色菌落，無色素沉著。
表I.普城沙雷菌CCGG2742的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征
權(quán)利要求
1.普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)細(xì)菌菌株，其中所述細(xì)菌菌株是CCGG2742，其由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)西班牙瓦倫西亞大學(xué)西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Colecci0n Espanolade Cultivos Tipo, CECT))指定的登錄號(hào)為 7404。
2.生物殺真菌劑組合物，其包含權(quán)利要求I的細(xì)菌菌株或從其衍生的具有同樣生物學(xué)特性的活性提取物以及農(nóng)業(yè)可接受的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物，當(dāng)將所述細(xì)菌菌株以IO6 IO8Cfu(菌落形成單位)/cm2劑量接種葡萄時(shí)，其存活為IO3 105cfU/cm2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物，其在4°C 40°C溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物，其在pH3 10的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2 5中任一項(xiàng)的生物殺真菌劑組合物用于防治由植物病原性真菌在植物或果實(shí)中造成之真菌感染的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述植物病原性真菌屬于灰霉菌屬(Botrytis)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中IO5 108cfu/mL的有效劑量的細(xì)菌菌株CCGG2742或從其衍生的提取物用于防治灰霉菌Ootrytis cinerea)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6 8的用途，其用于保護(hù)收獲前或收獲后狀態(tài)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和保存期間的果實(shí)。
10.防止果實(shí)腐爛的方法，其中向所述果實(shí)噴灑權(quán)利要求2的生物殺真菌劑組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中通過噴灑液體培養(yǎng)物或用水溶液懸浮的凍干粉末來施加所述生物殺真菌劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物殺真菌劑組合物，其來自從葡萄皮獲得的智利細(xì)菌分離株(對(duì)應(yīng)于普城沙雷菌(Serratia plymuthica)CCGG2742)的生物學(xué)純培養(yǎng)物，其用作防治真菌植物病害(尤其是果實(shí)易被灰霉菌(Botrytis cinerea)感染)的環(huán)境友好型生物防治劑，有效抑制所述植物病原性真菌的分生孢子萌發(fā)和菌絲體增殖。所述生物殺真菌劑組合物還保護(hù)植物葉子和果實(shí)免受所述真菌的感染，并且可以潛在地用于其它植物病原性真菌和微生物的生物防治中。
文檔編號(hào)C12R1/425GK102884173SQ201080025988
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月16日
發(fā)明者安東尼奧·卡斯蒂略納拉 申請(qǐng)人:智利圣地亞哥大學(xué)