專(zhuān)利名稱(chēng)：用于生物質(zhì)發(fā)酵的組合物和方法
用于生物質(zhì)發(fā)酵的組合物和方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年4月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)61/171，077 ;2009年4月22日提交的61/171，831 ;和2009年6月29日提交的61/221，519的優(yōu)先權(quán)，其在此通過(guò)引用整體并入。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及通過(guò)同時(shí)水解和發(fā)酵糖和寡聚物從生物質(zhì)制備有用的發(fā)酵終產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)展用于有效預(yù)處理和以高轉(zhuǎn)化效率(產(chǎn)率)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)成終產(chǎn)物的方法。 各種形式的生物質(zhì)由于其大量可用性和低成本而具有作為乙醇制備的可再生原料的潛力。然而，依然存在對(duì)利用可用于產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物例如乙醇和其他化合物或生物燃料的原料的低成本的強(qiáng)大方法的未滿(mǎn)足的需求。生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生生物燃料例如醇(例如甲醇、乙醇、丁醇或丙醇)可以提供對(duì)世界能源問(wèn)題的急需解決方案。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)具有纖維素和半纖維素兩種主要組分。這些組分的水解產(chǎn)生己糖(C6)和戊糖(C5)。生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率高度依賴(lài)于可被用于生物質(zhì)到燃料轉(zhuǎn)化過(guò)程的生物體利用的碳水化合物范圍。具體說(shuō)，不能利用己糖(例如纖維素二糖、葡萄糖)和戊糖(例如阿拉伯糖、木糖)二者來(lái)轉(zhuǎn)化成乙醇可能極大限制可從給定量生物質(zhì)產(chǎn)生的生物燃料或其他化學(xué)品的總量。因此，為了獲得木質(zhì)纖維素生物質(zhì)到乙醇的高轉(zhuǎn)化效率(產(chǎn)率)，重要的是能夠成功將己糖和戊糖二者發(fā)酵成乙醇。然而，戊糖(木糖和阿拉伯糖)的發(fā)酵依然是從生物質(zhì)制備乙醇的技術(shù)瓶頸。該限制可以導(dǎo)致低效率、發(fā)酵反應(yīng)中低最大可實(shí)現(xiàn)的生物燃料滴度和低生物燃料制備率的乙醇制備。而且，生物質(zhì)中碳水化合物含量的大部分可能通過(guò)預(yù)處理過(guò)程中戊糖的溶解而損失。一般而言，較低的產(chǎn)率和低生產(chǎn)率導(dǎo)致較高的生產(chǎn)成本，這可以轉(zhuǎn)化為不可能被微生物的其他特征所抵消的競(jìng)爭(zhēng)缺點(diǎn)。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)用第一微生物發(fā)酵包含己糖和戊糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來(lái)制備一種或多種發(fā)酵終產(chǎn)物的方法，其中所述第一微生物同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵終產(chǎn)物的至少一種是乙醇，并且其中乙醇以至少約45g/L的滴度被制備。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌(Clostridium phytofermentans)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括使用第二微生物發(fā)酵己糖和戊糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二微生物是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、熱梭狀芽胞桿菌(C. thermocellum)、丙麗丁醇梭狀芽胞桿菌(C. acetobutylicum)、曬纖維梭狀芽胞桿菌(C. cellovorans)或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述己糖包括選自由纖維素、半纖維素、淀粉、甘露聚糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成的組的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述戊糖包括選自由木聚糖、半纖維素、木糖和阿拉伯糖組成的組的碳水化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌是非重組或重組微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述第一微生物生長(zhǎng)過(guò)程中向培養(yǎng)基添加一種或多種包括己糖或戊糖的培養(yǎng)基補(bǔ)充物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述己糖或戊糖相對(duì)于被所述第一微生物轉(zhuǎn)化為其他化合物的糖量來(lái)添加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括預(yù)處理所述生物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)處理包括蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括添加發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充物是脂肪酸、表面活性劑、螯合劑、微生物、礦物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、酵母提取物和鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一微生物同時(shí)發(fā)酵所述己糖和戊糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括添加一種或多種酶，其中所述一種或多種酶不是衍生自第一微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種酶是纖維素酶、半纖維素酶、半乳糖醛酸酶、果膠酸裂合酶、糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、和內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、淀粉酶、肌醇六磷酸酶或漆酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述己糖和戊糖包括麥芽糖漿、玉米浸潰液體、蒸餾干燥顆?；蛴衩捉⒐腆w。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述方法還包括批量添加生物質(zhì)固體的生物質(zhì)補(bǔ)料分批發(fā)酵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物質(zhì)固體使用濾網(wǎng)回收。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述濾網(wǎng)包括多個(gè)直徑約150-250微米的孔。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)在包含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株而制備的生物燃料產(chǎn)物；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了制備乙醇的方法，所述方法包括以下步驟在包含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)；以大于約45g/L的產(chǎn)率制備乙醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括在所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的生長(zhǎng)過(guò)程中向培養(yǎng)基添加一種或多種培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述培養(yǎng)基補(bǔ)充物的一種或多種包含一種或多種己糖和/或戊糖化合物，并且一種或多種糖化合物相對(duì)于被所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉(zhuǎn)化為其他化合物的糖量來(lái)添加。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了用于制備發(fā)酵終產(chǎn)物的系統(tǒng)，包括發(fā)酵容器；木質(zhì)纖維素生物質(zhì)；和同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的第一微生物；其中所述發(fā)酵容器適于提供適合同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，還包括包含己糖和戊糖的培養(yǎng)基補(bǔ)充物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物質(zhì)在與所述第一微生物接觸之前通過(guò)蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件來(lái)預(yù)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)一步用非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述己糖和戊糖包括玉米浸潰固體、玉米浸潰液體、麥芽糖漿、木聚糖、纖維素、半纖維素、果糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖或木糖的一種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括選自由脂肪酸、表面活性劑、螯合齊U、維生素、礦物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、酵母提取物和鹽組成的組的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)還包括第二微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二微生物是釀酒酵母、熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌、噬纖維梭狀芽胞桿菌或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的新特征在所附權(quán)利要求書(shū)中精確提出。通過(guò)參考提出其中利用本發(fā)明原理的示例性實(shí)施方案的下文詳述和附圖將獲得對(duì)本發(fā)明特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解，附圖中圖I描繪了在約15天的時(shí)段內(nèi)加入發(fā)酵反應(yīng)的處理的生物質(zhì)固體的累積總量。圖2是描繪通過(guò)根據(jù)本文描述的尺寸減少和堿處理的玉米秸桿生物質(zhì)的碳水化合物組成的餅形圖。圖3A-3B描繪在指示時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵反應(yīng)的糖和乙醇濃度曲線(xiàn)。圖3A描繪了同時(shí)發(fā)酵纖維素二糖和木糖的糖和乙醇濃度曲線(xiàn)。圖3B描繪同時(shí)發(fā)酵葡萄糖和木糖的糖和乙醇濃度曲線(xiàn)。 圖4描繪了在指示時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵反應(yīng)中指示的己糖(葡萄糖，纖維素二糖)和戊糖(木糖)的標(biāo)準(zhǔn)化攝取和利用。圖5描繪了在指示的時(shí)間點(diǎn)木糖、纖維素二糖和淀粉同時(shí)發(fā)酵為乙醇的糖和乙醇濃度曲線(xiàn)。圖6描繪了在指示的時(shí)間點(diǎn)葡萄糖、木糖和阿拉伯糖同時(shí)發(fā)酵為乙醇的糖和乙醇濃度曲線(xiàn)。圖7描繪了同時(shí)發(fā)酵淀粉、纖維素、木聚糖和纖維素二糖的乙醇濃度曲線(xiàn)。圖8描繪了通過(guò)首先用酸在升高的溫度和壓力下在水解設(shè)備中處理生物質(zhì)而從生物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物的方法。圖9描繪了通過(guò)將生物質(zhì)裝入發(fā)酵容器而從生物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物的方法。

圖10公開(kāi)了產(chǎn)生己糖或戊糖或寡聚體的預(yù)處理，其然后不經(jīng)加工或進(jìn)一步加工并單獨(dú)或一起發(fā)酵。圖11是用于轉(zhuǎn)化植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的質(zhì)粒pIMPT1029的圖譜。通過(guò)引用并入本說(shuō)明書(shū)提及的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用并入，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)被明確且單獨(dú)地指明通過(guò)引用并入。發(fā)明詳述以下描述和實(shí)例詳細(xì)地示例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)有許多涵蓋在其范圍內(nèi)的本發(fā)明的變體和修飾。因此，優(yōu)選實(shí)施方案的描述不應(yīng)被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。定義除非不同地表征，本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。術(shù)語(yǔ)“約”相對(duì)于參考數(shù)值包括該值的加或減15%。例如，量“約10”包括8. 5至11.5的量。本文使用的術(shù)語(yǔ)"燃料”或“生物燃料”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括一種或多種適合作為液體燃料、氣體燃料、反應(yīng)物、化學(xué)原料的一種或多種化合物，包括但不限于烴、氫、甲烷、生物柴油、羥基化合物，例如醇(例如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇、等等)和羰基化合物例如醛和酮(例如，丙酮、甲醛、I-丙醛、等等)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵終產(chǎn)物”或“終產(chǎn)物”具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括一種或多種生物燃料、化學(xué)添加劑、加工輔劑、食物添加劑、有機(jī)酸(例如乙酸、乳酸、甲酸、檸檬酸等)、有機(jī)酸的衍生物例如酯(例如蠟酯、甘油酯、等等)和其他功能化合物，包括但不限于I，2-丙二醇、I，3-丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、酶例如纖維素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木質(zhì)酶和半纖維素酶，并且可以作為純化合物、混合物、或不純或稀釋形式存在。發(fā)酵終產(chǎn)物的其他實(shí)例包括但不限于1，4_ 二酸(琥珀酸、富馬酸和蘋(píng)果酸)、2，5呋喃二羧酸、3羥基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羥基丁內(nèi)酯、甘油、山梨糖醇、木糖醇/阿拉伯糖醇、丁二醇、丁醇、甲烷、甲醇、乙烷、乙烯、乙醇、η-丙烷、I-丙烯、I-丙醇、丙醛、丙酮、丙酸、η- 丁烷、I- 丁烯、I- 丁醇、丁醛、丁酸、異丁醛、異丁醇、2-甲基丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇、2- 丁烯、2-丁醇、2- 丁酮、2，3- 丁二醇、3-羥基-2- 丁酮、2，3- 丁二酮、乙苯、乙烯苯、2-苯基乙醇、苯乙醒、I-苯基丁燒、4-苯基_1- 丁稀、4-苯基-2- 丁稀、I-苯基-2- 丁稀、I-苯基-2- 丁醇、 4-苯基-2- 丁醇、I-苯基-2- 丁酮、4-苯基-2- 丁酮、I-苯基-2，3- 丁二醇、I-苯基_3_羥基-2- 丁酮、4-苯基-3-羥基-2- 丁酮、I-苯基-2，3- 丁二酮、η-戊烷、乙基苯酚、乙烯基苯酹、2-(4-輕基苯基)乙醇、4-輕基苯基乙醒、1-(4-輕基苯基)丁燒、4-(4-輕基苯基)-I- 丁烯、4- (4-羥基苯基)-2- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-I-丁烯、I- (4-羥基苯基)_2_ 丁醇、4-(4-羥基苯基)-2-丁醇、1-(4-羥基苯基)-2-丁酮、4-(4-羥基苯基)-2-丁酮、I-(4-羥基苯基)-2，3- 丁二醇、I- (4-羥基苯基)-3-羥基-2- 丁酮、4- (4-羥基苯基)-3-羥基-2- 丁酮、1-(4-羥基苯基)-2，3- 丁二酮、卩引哚基乙烷、卩引哚基乙烯、2-(吲哚-3-)乙醇、η-戊烷、I-戊烯、I-戊醇、戊醛、戊酸、2-戊烯、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、4-甲基戊醛、4-甲基戊醇、2，3-戊二醇、2-羥基-3-戊酮、3-羥基-2-戊酮、2，3-戊二酮、2-甲基戊烷、4-甲基-I-戊烯、4-甲基-2-戊烯、4-甲基-3-戊烯、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-戊酮、4-甲基-2，3-戊二醇、4-甲基-2-羥基-3-戊酮、4-甲基-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-2，3-戊二酮、I-苯基戊烷、I-苯基_1_戊烯、I-苯基-2-戊烯、I-苯基-3-戊烯、I-苯基-2-戊醇、I-苯基-3-戊醇、I-苯基-2-戊酮、I-苯基-3-戊酮、I-苯基_2，3-戊二醇、I-苯基-2-羥基-3-戊酮、I-苯基-3-羥基-2-戊酮、I-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-I-苯基戊烷、4-甲基-I-苯基-I-戊烯、4-甲基-I-苯基-2-戊烯、4-甲基-I-苯基-3-戊烯、4-甲基-I-苯基-3-戊醇、4-甲基-I-苯基-2-戊醇、4-甲基-I-苯基-3-戊酮、4-甲基-I-苯基-2-戊酮、4-甲基-I-苯基-2，3-戊二醇、4-甲基-I-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-I-苯基-3-羥基-2-戊酮、4-甲基-I-苯基-2-羥基-3-戊酮、I- (4-羥基苯基)戊烷、I-(4-羥基苯基)-I-戊烯、I- (4-羥基苯基)-2-戊烯、I-(4-羥基苯基)-3-戊烯、I- (4-羥基苯基)-2-戊醇、I- (4-羥基苯基)-3-戊醇、I- (4-羥基苯基)-2-戊酮、1-(4-羥基苯基)-3-戊酮、1-(4-羥基苯基)-2，3-戊二醇、1_(4_羥基苯基)-2-羥基-3-戊酮、1-(4-羥基苯基)-3-羥基-2-戊酮、1-(4-羥基苯基)-2，
3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)戊烷、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-戊烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3-戊烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-I-戊烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3_戊醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-2-戊醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-戊酮、4-甲基-I- (4-羥基苯基)-2-戊酮、4-甲基-I- (4-羥基苯基)-2，3-戊二醇、4-甲基-I- (4-羥基苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-羥基-2-戊酮、4-甲基_1_(4_羥基苯基)-2-羥基-3-戊酮、I-吲哚-3-戊烷、I-(吲哚-3)-I-戊烯、I-(吲哚-3)-2-戊烯、I-(吲哚-3) -3-戊烯、I-(吲哚-3) -2-戊醇、I-(吲哚-3) -3-戊醇、I-(吲哚_3) -2-戊酮、1-(吲哚-3)-3-戊酮、1_(吲哚-3)-2，3-戊二醇、I-(吲哚-3)-2-羥基_3_戊酮、1_(吲哚-3)-3-羥基-2-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基_1_(吲哚_3_)戊烷、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊烯、4-甲基_1_ (吲哚_3)-I-戊烯、4-甲基-2-(吲哚-3) -3-戊醇、4-甲基-I-(吲哚-3) -2-戊醇、4-甲基-I-(吲哚-3) -3-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、4-甲基_1_(吲哚-3) -2，3-戊二酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -3-羥基-2-戊酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -2-羥基-3-戊酮、η-己烷、I-己烯、I-己醇、己醛、己酸、2-己烯、3-己烯、2-己醇、3-己醇、2- 己酮、3-己酮、2，3-己二醇、2，3-己二酮、3，4-己二醇、3，4_己二酮、2-羥基-3-己酮、3-羥基-2-己酮、3-羥基-4-己酮、4-羥基-3-己酮、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2-甲基-2-己稀、2-甲基-3-己稀、5-甲基-I-己稀、5-甲基_2_己稀、4-甲基-I-己稀、4-甲基_2_己稀、3-甲基-3-己稀、3-甲基_2_己稀、3-甲基-I-己稀、2-甲基-3-己醇、5-甲基_2_己醇、5-甲基-3-己醇、2-甲基-3-己酮、5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮、2-甲基_3，4_己二醇、2-甲基-3，4-己二酮、5-甲基-2，3-己二醇、5-甲基-2，3-己二酮、4-甲基_2，3-己二醇、4-甲基-2，3-己二酮、2-甲基-3-輕基-4-己酮、2-甲基-4-輕基-3-己酮、5-甲基-2-羥基-3-己酮、5-甲基-3-羥基-2-己酮、4-甲基-2-羥基-3-己酮、4-甲基-3-羥基-2-己麗、2，5_ 二甲基己焼、2，5_ 二甲基-2-己稀、2，5_ 二甲基-3-己稀、2，5- 二甲基-3-己醇、2，5- 二甲基-3-己酮、2，5- 二甲基-3，4-己二醇、2，5- 二甲基-3，4-己二酮、2，5-二甲基-3-羥基-4-己酮、5-甲基-I-苯基己烷、4-甲基-I-苯基己烷、5-甲基_1_苯基-I-己烯、5-甲基-I-苯基-2-己烯、5-甲基-I-苯基-3-己烯、4-甲基-I-苯基-I-己烯、4-甲基-I-苯基-2-己烯、4-甲基-I-苯基-3-己烯、5-甲基-I-苯基-2-己醇、5-甲基-I-苯基-3-己醇、4_甲基-I-苯基-2-己醇、4_甲基-I-苯基-3-己醇、5_甲基-I-苯基_2_己麗、5_甲基-I-苯基-3-己麗、4_甲基-I-苯基_2_己麗、4_甲基-I-苯基-3-己麗、5_甲基-I-苯基-2，3-己二醇、4_甲基-I-苯基-2，3-己二醇、5-甲基-I-苯基-3-輕基_2_己麗、5_甲基-I-苯基_2_輕基-3-己麗、4_甲基-I-苯基-3-輕基-2-己麗、4-甲基-I-苯基-2-輕基-3-己酮、5-甲基-I-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-I-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)己烷、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-1-己烯、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-2_己烯、5-甲基-1-(4- 基苯基)-3_己烯、4-甲基-1-(4- 基苯基)-1_己烯、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-2-己烯、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3-己烯、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-己醇、5-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-己醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)_2_己醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-3-己醇、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-己酮、5-甲基-1-(4-羥基苯基)-3_己酮、4-甲基-1-(4-輕基苯基)-2_己酮、4-甲基-1-(4-輕基苯基)-3_己酮、5-甲基-I-(4-羥基苯基)-2，3-己二醇、4-甲基-I-(4-羥基苯基)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(4-輕基苯基)-3_輕基-2-己酮、5-甲基-1-(4-輕基苯基)-2_輕基-3-己酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-3-羥基-2-己酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-2-羥基-3-己酮、5-甲基-I-(4-羥基苯基)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羥基苯基)-2，3_己二酮、4-甲基-I-(吲哚-3-)己烷、5-甲基-I-(吲哚-3)-I-己烯、5-甲基-I-(吲哚-3) -2-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-I-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、
4-甲基-I-(吲哚-3) -3-己烯、5-甲基-I-(吲哚-3) -2-己醇、5-甲基-I-(吲哚-3) -3-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、5-甲基_1_(吲哚-3)-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、4-甲基-I-(吲哚_3)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-羥基-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-羥基-3-己酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -3-羥基-2-己酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -2-羥基-3-己酮、5-甲基-I-(吲哚-3) -2，3-己二酮、4-甲基-I-(吲哚-3) -2，3-己二酮、η-庚烷、I-庚烯、I-庚醇、庚醛、庚酸、2-庚烯、3-庚烯、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2，3- 庚二醇、2，3_庚二酮、3，4_庚二醇、3，4_庚二酮、2-羥基-3-庚酮、3-羥基-2-庚酮、3-羥基-4-庚酮、4-羥基-3-庚酮、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、6-甲基-2-庚烯、6-甲基-3-庚稀、2_甲基-3-庚稀、2_甲基-2-庚稀、5_甲基-2-庚稀、5_甲基-3-庚稀、3-甲基-3-庚烯、2-甲基-3-庚醇、2-甲基-4-庚醇、6-甲基-3-庚醇、5-甲基-3-庚醇、3-甲基-4-庚醇、2-甲基-3-庚酮、2-甲基-4-庚酮、6-甲基-3-庚酮、5-甲基-3-庚酮、3-甲基-4-庚酮、2-甲基-3，4-庚二醇、2-甲基-3，4-庚二酮、6-甲基_3，4-庚二醇、6-甲基_3，4_庚二酮、5-甲基_3，4-庚二醇、5-甲基_3，4-庚二酮、2-甲基-3-羥基_4_庚酮、2-甲基_4_羥基-3-庚酮、6-甲基-3-羥基-4-庚酮、6-甲基-4-羥基-3-庚酮、5-甲基-3-羥基-4-庚酮、5-甲基-4-羥基-3-庚酮、2，6_ 二甲基庚烷、2，5- 二甲基庚烷、2，6_ 二甲基-2-庚烯、2,6_ 二甲基_3_庚稀、2, 5_ 二甲基_2_庚稀、2, 5_ 二甲基-3-庚稀、3,6- 二甲基-3-庚稀、2，6-二甲基-3-庚醇、2，6-二甲基-4-庚醇、2，5-二甲基-3-庚醇、2，5-二甲基-4-庚醇、2，6-二甲基-3，4-庚二醇、2，6-二甲基-3，4-庚二酮、2，5-二甲基-3，4-庚二醇、2，5-二甲基-3，4-庚二酮、2，6- 二甲基-3-羥基-4-庚酮、2，6- 二甲基-4-羥基-3-庚酮、2，5- 二甲基-3-羥基-4-庚酮、2，5- 二甲基-4-羥基-3-庚酮、η-辛烷、I-辛烯、2-辛烯、I-辛醇、辛醛、辛酸、3-辛烯、4-辛烯、4-辛醇、4-辛酮、4，5-辛二醇、4，5-辛二酮、4-羥基-5-辛酮、2-甲基辛烷、2-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛烯、7-甲基-3-辛烯、3-甲基-3-辛烯、
3-甲基-4-辛烯、6-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛醇、7-甲基-4-辛醇、3-甲基-4-辛醇、
6-甲基-4-辛醇、2-甲基-4-辛酮、7-甲基-4-辛酮、3-甲基-4-辛酮、6-甲基-4-辛酮、2-甲基-4，5-辛二醇、2-甲基-4，5-辛二酮、3-甲基-4，5-辛二醇、3-甲基-4，5-辛二酮、2-甲基-4-羥基-5-辛酮、2-甲基-5-羥基-4-辛酮、3-甲基_4_羥基-5-辛酮、3-甲基_5_輕基_4_羊麗、2,7_ 二甲基羊燒、2,7_ 二甲基-3-羊稀、2,7_ 二甲基-4-羊稀、2,
7-二甲基-4-辛醇、2，7-二甲基-4-辛酮、2，7-二甲基-4，5-辛二醇、2，7-二甲基-4，5-辛二酮、2，7- 二甲基-4-羥基-5-辛酮、2，6- 二甲基辛烷、2，6- 二甲基-3-辛烯、2，6- 二甲基-4-辛烯、3，7- 二甲基-3-辛烯、2，6- 二甲基-4-辛醇、3，7- 二甲基-4-辛醇、2，6- 二甲基-4-辛酮、3，7-二甲基-4-辛酮、2，6-二甲基-4，5-辛二醇、2，6-二甲基-4，5-辛二酮、2，6-二甲基-4-羥基-5-辛酮、2，6-二甲基-5-羥基-4-辛酮、3，6-二甲基辛烷、3，6-二甲基-3-辛烯、3，6-二甲基-4-辛烯、3，6-二甲基-4-辛醇、3，6-二甲基-4-辛酮、3，6- 二甲基-4，5-辛二醇、3，6- 二甲基-4，5-辛二酮、3，6- 二甲基-4-羥基-5-辛酮、η-壬烷、I-壬烯、I-壬醇、壬醛、壬酸、2-甲基壬烷、2-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬烯、8-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬醇、8-甲基-4-壬醇、2-甲基-5-壬酮、8-甲基-4-壬酮、8-甲基_4，5-壬二醇、8-甲基-4，5-壬二酮、8-甲基-4-羥基-5-壬酮、8-甲基-5-羥基-4-壬麗、2,8_ _.甲基壬燒、2,8_ _■甲基-3_壬稀、2,8_ _■甲基-4_壬稀、2,8- _■甲基-5_壬稀、2，8-二甲基-4-壬醇、2，8-二甲基-5-壬醇、2，8-二甲基-4-壬酮、2，8-二甲基-5-壬酮、2，8-二甲基-4，5-壬二醇、2，8-二甲基-4，5-壬二酮、2，8-二甲基-4-羥基-5-壬酮、2，
8-二甲基-5-羥基-4-壬酮、2，7-二甲基壬烷、3，8-二甲基-3-壬烯、3，8-二甲基-4-壬烯、3，8-二甲基-5-壬烯、3，8-二甲基-4-壬醇、3，8-二甲基-5-壬醇、3，8-二甲基-4-壬酮、3，8-二甲基-5-壬酮、3，8-二甲基-4，5-壬二醇、3，8-二甲基-4，5-壬二酮、3，8-二甲基-4-羥基-5-壬酮、3，8- 二甲基-5-羥基-4-壬酮、η-癸烷、I-癸烯、I-癸醇、癸酸、2，
9-二甲基癸烷、2，9-二甲基-3-癸烯、2，9-二甲基-4-癸烯、2，9-二甲基-5-癸醇、2，9-二甲基-5-癸酮、2，9- 二甲基-5，6-癸二醇、2，9- 二甲基-6-羥基-5-癸酮、2，9- 二甲基-5，6-癸二酮、η- -| 燒、I- -\ 烯、I- -\ 醇、i 醒、i 酸、η-十二燒、I-十二烯、I-十二 醇、十二醛、十二酸、η-十二烷、I-十二烯、I-十二醇、十二醛、十二酸、η-十三烷、I-十三烯、I-十三醇、十三醛、十三酸、η-十四烷、I-十四烯、I-十四醇、十四醛、十四酸、η-十五烷、I-十五烯、I-十五醇、十五醛、十五酸、η-十六烷、I-十六烯、I-十六醇、十六醛、十六酸、η-十七烷、I-十七烯、I-十七醇、十七醛、十七酸、η-十八烷、I-十八烯、I-十八醇、十八醒、十八酸、η-十九燒、I-十九烯、I-十九醇、十九醒、十九酸、二十燒、I- 二十烯、I- 二十醇、二十醛、二十酸、3-羥基丙醛、1，3-丙二醇、4-羥基丁醛、1，4- 丁二醇、3-羥基-2- 丁酮、2，3_ 丁二醇、1，5_戊二醇、高檸檬酸、高異檸檬酸、b-羥基己二酸、戊二酸、戊二酸半醛、戊二醛、2-羥基-I-環(huán)戊酮、1，2_環(huán)戊二醇、環(huán)戊酮、環(huán)戊醇、(S)-2-乙酰乳酸、(R)-2，3-二羥基-異戊酸、2-氧代異戊酸、異丁酰-CoA、異丁酸、異丁醛、5-氨基戊醛、1，10- 二氨基癸燒、I，10-二氛基_5_癸稀、1,10- 二氛基-5-輕基癸燒、I，10-二氛基_5_癸麗、1，10- 二氨基-5,6-癸二醇、1,10- 二氨基-6-輕基-5-癸酮、苯基苯基乙醒、1,4- 二苯基丁燒、I,
4-_■苯基 _1- 丁稀、I，4- _■苯基-2- 丁稀、1，4- _■苯基 _2_ 丁醇、I，4- _■苯基-2- 丁麗、
1,4- 二苯基-2，3- 丁二醇、1，4_ 二苯基-3-羥基-2- 丁酮、1_(4_羥基苯基)-4_苯基丁烷、I-(4-羥基苯基)-4-苯基-I- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-4-苯基-2- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-4_苯基-2- 丁醇、I-(4-輕基苯基)-4_苯基-2- 丁酮、I-(4-輕基苯基)-4_苯基-2,
3-丁二醇、I- (4-羥基苯基)-4-苯基-3-羥基-2- 丁酮、I-(吲哚-3) -4-苯基丁烷、I-(吲哚-3) -4-苯基-I- 丁烯、I-(吲哚-3) -4-苯基-2- 丁烯、I-(吲哚-3) -4-苯基-2- 丁醇、I-(噴哚-3) -4-苯基-2- 丁酮、I-(吲哚-3) -4-苯基-2，3- 丁二醇、I-(吲哚-3) -4-苯基-3-羥基-2-丁酮、4-羥基苯基乙醛、1，4_ 二(4-羥基苯基)丁烷、1，4_ 二(4-羥基苯基)-1_ 丁烯、1，4-二(4-羥基苯基)-2-丁烯、1，4-二(4-羥基苯基)-2-丁醇、1，4-二(4-羥基苯基)-2-丁酮、I，4-二(4-羥基苯基)-2，3-丁二醇、I，4-二(4-羥基苯基)-3-羥基-2- 丁酮、I- (4-羥基苯基)-4-(吲哚-3-) 丁烷、1-(4-羥基苯基)-4-(吲哚-3)-I- 丁烯、I- 二 (4-羥基苯基)-4-(吲哚-3) -2- 丁烯、I- (4-羥基苯基)-4-(吲哚-3) -2- 丁醇、1-(4-羥基苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁酮、1-(4-羥基苯基)-4-(吲哚-3)-2，3-丁二醇、I-(4-羥基苯基-4-(吲哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、吲哚-3-乙醛、I，4- 二(吲哚_3_) 丁烷、I，
4-二(吲哚-3)-1-丁烯、I，4-二(吲哚-3)-2-丁烯、I，4-二(吲哚_3)-2-丁醇、I，4-二(吲哚-3) -2- 丁酮、1，4- 二(吲哚-3) -2，3- 丁二醇、1，4- 二(吲哚-3) -3-羥基-2- 丁酮、琥珀酸半醛、己烷-1，8- 二羧酸、3-己烯-1，8- 二羧酸、3-羥基-己烷-1，8- 二羧酸、3-己酮-1，8- 二羧酸、3，4-己二醇-1，8- 二羧酸、4-羥基-3-己酮_1，8_ 二羧酸、巖藻依聚糖、碘、葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、鈣、鎂、鐵、鈉、鉀、磷酸鹽、乳酸、乙酸、甲酸、類(lèi)異戊二烯和聚異戊二烯包括橡膠。本文使用的術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵"具有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括在適合的微生物培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)微生物或微生物組。微生物可以是需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌、異養(yǎng)生物、自養(yǎng)生物、光合自養(yǎng)生物、光合異養(yǎng)生物、化學(xué)異養(yǎng)生物和/或化學(xué)異養(yǎng)生物。細(xì)胞活性，包括細(xì)胞生長(zhǎng)，可以是生長(zhǎng)需氧的 、微需氧的或厭氧的。細(xì)胞可以處于任何生長(zhǎng)期，包括滯后期(或傳導(dǎo)期)、指數(shù)期、過(guò)渡期、穩(wěn)定器、衰亡期、休眠期、營(yíng)養(yǎng)期、孢子形成期、等等。本文使用的術(shù)語(yǔ)"植物多糖"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括糖和糖衍生物的一種或多種碳水化合物聚合物以及糖聚合物的衍生物和/或植物物質(zhì)中存在的其他聚合物材料。示例性的植物多糖包括木質(zhì)素、纖維素、淀粉、果膠和半纖維素。其他多糖是殼多糖、磺化多糖，例如藻酸、瓊脂糖、角叉藻聚糖、金屬卟啉、紅藻膠和海蘿聚糖。一般而言，多糖具有兩個(gè)或多個(gè)糖單元或者糖單元的衍生物。糖單元和/或糖單元的衍生物可以規(guī)則模式或其他方式重復(fù)。糖單元可以是己糖單元或戊糖單元或這些的組合。糖單元的衍生物可以是糖醇、糖酸、氨基糖、等等。多糖可以是直鏈的、支鏈的、交聯(lián)的或其混合物。一種或一類(lèi)多糖可以與另一種或一類(lèi)多糖交聯(lián)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"可發(fā)酵糖"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括可被微生物用作碳源的一種或多種糖和/或糖衍生物，包括這些化合物的單體、二聚體和多聚體，包括這些化合物的兩種或多種。在一些情況下，在引入分解的材料之前，生物體可以分解這些聚合物，例如通過(guò)水解。示例性的可發(fā)酵糖包括但不限于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纖維素二糖、乳糖、鹿糖、麥芽糖和果糖。本文使用的術(shù)語(yǔ)"糖化"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括植物多糖轉(zhuǎn)化為可被生物體就近利用的低分子量物類(lèi)。對(duì)于一些生物體，這將包括將最多約七個(gè)單體單元以及類(lèi)似大小鏈的糖衍生物和糖和糖衍生物組合轉(zhuǎn)化為單糖、二糖、三糖和寡糖。對(duì)于一些生物體，允許的鏈長(zhǎng)可以更長(zhǎng)(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)單體單元或更多)，并且對(duì)于一些生物體，允許的鏈長(zhǎng)可能更短(例如1、2、3、4、5、6個(gè)單體單元)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括可被轉(zhuǎn)化成生物燃料、化學(xué)品或其他產(chǎn)物的一種或多種生物材料。生物質(zhì)的一個(gè)示例性來(lái)源是植物物質(zhì)。植物物質(zhì)可以是例如木本植物物質(zhì)、非木本植物物質(zhì)、纖維材料、木質(zhì)纖維素材料、半纖維材料、碳水化合物、果膠、淀粉、菊粉、果聚糖、葡聚糖、玉米、玉米秸桿、糖甘蔗、草、柳枝稷、竹材、海藻、海甘藍(lán)、椰子、麻風(fēng)樹(shù)、黃麻和這些衍生的材料。植物物質(zhì)可以進(jìn)一步參考現(xiàn)有化學(xué)物類(lèi)例如蛋白、多糖和油來(lái)描述。多糖包括各種單糖和單糖衍生物的聚合物，包括葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、等等。植物物質(zhì)還包括農(nóng)業(yè)廢物副產(chǎn)物或側(cè)線(xiàn)餾分，例如蘋(píng)果渣、玉米浸潰液體、玉米浸潰固體、玉米秸桿、玉米釜餾物、玉米棒、玉米粒、蒸餾顆粒、蒸餾溶質(zhì)、甘蔗渣、蒸餾顆粒、廢胎面膠、凸點(diǎn)塑料、發(fā)酵廢物、木片、鋸末、木粉、木漿、紙漿、紙漿廢液稻草、廢棄雜物、污水、種子餅、外殼、稻殼、葉、草碎片、玉米秸桿、(玉米碎片)和食物殘羹。這些材料可以來(lái)自農(nóng)場(chǎng)、水生環(huán)境、森林、工業(yè)源、家庭、等等。生物質(zhì)的另一種非限制性實(shí)例是動(dòng)物有機(jī)物質(zhì)，包括例如牛奶、肉、脂肪、骨粉、動(dòng)物加工廢物和動(dòng)物廢物。"原料"常用語(yǔ)指用于例如本文描述的那些過(guò)程的生物質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)基"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括可溶和不溶物質(zhì)、懸浮物質(zhì)、細(xì)胞和培養(yǎng)基的組合的全部?jī)?nèi)容，例如發(fā)酵反應(yīng)的全部?jī)?nèi)容可以稱(chēng)為發(fā)酵培養(yǎng)基。本文使用的術(shù)語(yǔ)"生產(chǎn)率"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括在給定時(shí)間、給定體積中產(chǎn)生的感興趣的物質(zhì)的量。單位可以是例如克/升-小時(shí)，或者質(zhì)量、體積和時(shí)間的一些其他組合。在發(fā)酵中，生產(chǎn)率常用于表征產(chǎn)物可以在給定發(fā)酵體積中制成的速度。體積可以參考發(fā)酵容器的總體積、發(fā)酵容器的工作體積或者被發(fā)酵的培養(yǎng)基的實(shí)際體積。該短語(yǔ)的上下文將指示本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期的含義。生產(chǎn)率(例如g/L/d)不同于“滴度”(例如g/L)，因?yàn)樯a(chǎn)率包括時(shí)間術(shù)語(yǔ)，并且滴度類(lèi)似于濃度。本文使用的術(shù)語(yǔ)"生物催化劑"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可 以包括一種或多種酶和/或微生物，包括溶液、懸液、和酶和微生物的混合物。在一些上下文中，該詞語(yǔ)指酶或微生物發(fā)揮特定功能的可能用途，在其他上下文中，該詞語(yǔ)指兩者的組合用途，而在其他上下文中，該詞指兩者中的僅一種。該短語(yǔ)的上下文將指示本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期的含義。本文使用的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化效率"或“產(chǎn)率”具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括從底物量得到的產(chǎn)物量。該術(shù)語(yǔ)可以表示為來(lái)自起始底物量的產(chǎn)物的百分比產(chǎn)量。對(duì)于從葡萄糖生產(chǎn)乙醇，凈反應(yīng)被普遍接受為C6H12O6 — 2C2H50H+2C02且理論最大轉(zhuǎn)化效率或產(chǎn)率為51 % (wt.)。通常，轉(zhuǎn)化效率參考理論最大值，例如"理論最大值的80%"。在將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇的情況下，該表述將指示41% (wt.)的轉(zhuǎn)化效率。該短語(yǔ)的上下文將指示本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期的底物和產(chǎn)物。對(duì)于包含例如生物質(zhì)中存在的不同碳源(木聚糖、木糖、葡萄糖、纖維素二糖、阿拉伯糖纖維素、半纖維素等)的混合物的底物，生物質(zhì)至乙醇的理論最大轉(zhuǎn)化效率是由每種碳源的相對(duì)濃度衡量的個(gè)體碳源組分的最大轉(zhuǎn)化效率的平均值。在一些情況下，理論最大轉(zhuǎn)化效率基于假定的糖化效率來(lái)計(jì)算。僅作為例子，假定包含IOg纖維素的碳源，理論最大轉(zhuǎn)化效率可以通過(guò)假設(shè)纖維素糖化為約75%重量的可同化碳源葡萄糖來(lái)計(jì)算。在該實(shí)例中，IOg纖維素可以提供7. 5g葡萄糖，這可以提供約7. 5g*51%或3. Sg乙醇的最大理論轉(zhuǎn)化效率。在其他情況下，糖化步驟的效率可以被計(jì)算或測(cè)定(即，測(cè)量)。本發(fā)明預(yù)期的糖化效率包括對(duì)于任何碳水化合物碳源比單一單糖亞基大約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或約100%。"預(yù)處理"或"預(yù)處理的"在本文用來(lái)指任何機(jī)械、化學(xué)、熱、生化過(guò)程或這些過(guò)程以組合步驟或順序進(jìn)行的組合，這實(shí)現(xiàn)了生物質(zhì)的破壞或膨脹以使生物質(zhì)更容易受到酶和/或微生物的攻擊。在一些實(shí)施方案中，預(yù)處理可以包括去除或破壞木質(zhì)素以使植物生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素聚合物更容易被纖維素酶和/或微生物利用，例如通過(guò)用酸或堿處理。在一些實(shí)施方案中，預(yù)處理可以包括使用一種類(lèi)型的微生物以使植物多糖更容易被另一種類(lèi)型微生物接近。在一些實(shí)施方案中，預(yù)處理還可以包括纖維素和/或半纖維素材料的破壞或膨脹。蒸汽爆發(fā)和氨纖維膨脹(或爆發(fā))(AFEX)是公知的熱/化學(xué)技術(shù)。可以使用水解，包括利用酸和/或酶的方法。還可以使用其他熱、化學(xué)、生物化學(xué)、酶技術(shù)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)料分批"或"補(bǔ)料分批發(fā)酵"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括其中營(yíng)養(yǎng)物、其他培養(yǎng)基組分或生物催化劑(包括例如酶、新鮮生物體、胞外培養(yǎng)基、等等)在培養(yǎng)期間添加至發(fā)酵罐但在發(fā)酵結(jié)束之前不從發(fā)酵罐收集培養(yǎng)基的培養(yǎng)微生物的方法，但它也可以包括其中收獲一部分發(fā)酵罐體積并然后向發(fā)酵罐中剩余培養(yǎng)基添加新鮮培養(yǎng)基的"自我接種"或"部分收獲"技術(shù)，其中至少一部分的接種物是留在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，補(bǔ)料分批過(guò)程可以用短語(yǔ)例如"細(xì)胞強(qiáng)化補(bǔ)料分批"來(lái)表示。該短語(yǔ)可以包括其中添加營(yíng)養(yǎng)物和微生物細(xì)胞的操作或其中添加不含大量營(yíng)養(yǎng)物的微生物細(xì)胞的操作。更概括的短語(yǔ)“補(bǔ)料分批”也涵蓋這些操作。其中使用這些短語(yǔ)的任何一個(gè)的上下文將指示本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮的技術(shù)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"肌醇六磷酸(鹽)"具有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，可 以包括肌醇六磷酸、其鹽及其組合形式以及這些的組合。本文使用的術(shù)語(yǔ)"糖化合物"具有其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的普通含義，并且可以包括單糖，包括但不限于己糖和戊糖；糖醇；糖酸；糖胺；含有通過(guò)共價(jià)或離子鍵直接或間接連接在一起的這些的兩種或多種的化合物；及其混合物。本說(shuō)明書(shū)包括二糖；三糖；寡糖；多糖；和任何長(zhǎng)度的支鏈和/或直鏈的糖鏈。a.介紹生物質(zhì)是可再生能量源，其可以被生物發(fā)酵以產(chǎn)生終產(chǎn)物，例如移動(dòng)發(fā)動(dòng)機(jī)便攜燃料(例如醇、乙醇、有機(jī)酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)或用于其他商業(yè)目的的化合物。生物質(zhì)包括農(nóng)業(yè)殘?jiān)?玉米秸桿、草、禾桿、谷殼、甘蔗渣、等等)、動(dòng)物廢物(來(lái)自牛、家禽和肥豬的糞肥)、藻類(lèi)、木質(zhì)材料(木料或樹(shù)皮、鋸末、林區(qū)廢料和磨屑)、城市廢物(廢紙、回收的衛(wèi)生紙、碎料等等)、能源作物(楊樹(shù)、柳樹(shù)、柳枝稷、苜蓿、草原須芒草、等等)。木質(zhì)纖維生物質(zhì)具有纖維素和半纖維素作為兩種主要組分。為達(dá)到木質(zhì)纖維生物質(zhì)向終產(chǎn)物(產(chǎn)率)的高發(fā)酵效率，重要的是提供預(yù)處理，以除去和/或脫毒至少一部分木質(zhì)素含量并使纖維素和半纖維素更容易酶促水解。最近，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了纖維素和半纖維素中聚合己糖和戊糖轉(zhuǎn)化為乙醇。參見(jiàn)English等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，349，628 ;還參見(jiàn)等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，400, 470 ；Ingram等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，000, 000 ；Ingram等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，028, 539 ;和Ingram等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，162，516，其全部通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，從生物質(zhì)產(chǎn)生燃料是一個(gè)兩步驟過(guò)程，包括酶促水解，隨后發(fā)酵。生物質(zhì)的酶促水解可以使用可商業(yè)途徑獲得的水解酶混合物、衍生自特定生物體或生物體組的酶、廢棄發(fā)酵培養(yǎng)基、或碳水化合物降解或糖化酶的任何來(lái)源來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于處理生物質(zhì)的酶包括但不限于木聚糖酶、內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶、木糖苷酶、β -D-木糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、糖酶、葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切-1，4-β -葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、β -D-葡糖苷酶、淀粉酶、纖維二糖水解酶、外切纖維二糖水解酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、果膠酸裂合酶、半乳糖醛酸酶、漆酶淀粉酶、蛋白酶、殼多糖酶、果膠酶或角蛋白酶。用于生物質(zhì)的處理、生物質(zhì)的預(yù)處理、生物質(zhì)的酶處理或生物質(zhì)準(zhǔn)備用于發(fā)酵或轉(zhuǎn)化為有用終產(chǎn)物的其他方法和組合物由以下提供美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0090053770、20070031918、20070031953、20090053777、20090042259、20090042266、20090004698、20090004692,20090004706,20090011474,20090011484,20080227161,20080227162,20080044877、20080182323、20070148751、20060246563 和美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5865898、5628830、5693296,5837506和6090595，其每一個(gè)在此通過(guò)引用整體并入。生物質(zhì)的酶處理導(dǎo)致高分子量碳水化合物聚合物降解成較小寡糖，并且在一些情況下最終降解成單聚體己糖和戊糖。在第二步，這些糖使用例如酵母或細(xì)菌菌株被發(fā)酵成終產(chǎn)物(例如，醇、乙醇、有機(jī)酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)。在其他實(shí)施方案中，水解和發(fā)酵過(guò)程被組合成單個(gè)步驟。在一些情況下，這可以通過(guò)減少資金和操作成本，例如通過(guò)最大限度減小對(duì)外部酶處理的需求而提供比兩步過(guò)程更經(jīng)濟(jì)的過(guò)程。在其他實(shí)施方案中，己糖和戊糖兩者轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物與僅己糖或僅戊糖的轉(zhuǎn)化、或者與主要轉(zhuǎn)化戊糖而基本上不轉(zhuǎn)化己糖或主要轉(zhuǎn)化己糖而基本上不轉(zhuǎn)化戊糖的過(guò)程相 t匕，可以提供提高的每克生物質(zhì)的終產(chǎn)物產(chǎn)率。已經(jīng)報(bào)道常用的酵母(釀酒酵母)、真菌和細(xì)菌種能夠容易地將己糖(葡萄糖)轉(zhuǎn)化為乙醇。然而，戊糖(木糖和阿拉伯糖)的發(fā)酵依然是從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的技術(shù)瓶頸。一些研究者已經(jīng)使用遺傳技術(shù)獲得發(fā)酵單胞菌、大腸桿菌、酵母菌和其他酵母的重組體。本發(fā)明提供了使用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種的方法，其在某些實(shí)施方案中能夠同時(shí)水解和發(fā)酵木質(zhì)纖維生物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物同時(shí)發(fā)酵己糖和戊糖成分以產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種可以通過(guò)其產(chǎn)生能夠水解多糖和高級(jí)糖為低分子量糖、寡糖、二糖和單糖的酶的能力而提供用于將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇或其他發(fā)酵終產(chǎn)物(例如醇、有機(jī)酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)的有用優(yōu)點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種)可用于本文描述的方法以進(jìn)行水解高分子量的含糖生物質(zhì)和/或高級(jí)糖或多糖為低級(jí)糖和發(fā)酵來(lái)自纖維素以及半纖維素的寡糖、二糖和單糖成為一種或多種發(fā)酵終產(chǎn)物(包括但不限于乙醇、甲烷、氫和其他化合物，例如有機(jī)酸，包括甲酸、乙酸和乳酸)的組合步驟。本文描述的方法還提供微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種在包括以下的條件下生長(zhǎng)、培養(yǎng)、發(fā)酵等等升高的乙醇濃度、高糖濃度、低糖濃度、利用可溶性碳源和厭氧條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種優(yōu)先發(fā)酵寡聚體而非單糖。該代謝特征可以被用來(lái)減少生物質(zhì)預(yù)處理的時(shí)間和嚴(yán)重度。例如，導(dǎo)致寡聚體而非單糖釋放的較不強(qiáng)烈的酸處理減少預(yù)處理過(guò)程的時(shí)間和化學(xué)品成本。這可以導(dǎo)致生產(chǎn)發(fā)酵終產(chǎn)物的總成本較小。在這種過(guò)程中較少的糖被降解，由此添加生物質(zhì)較高的糖含量和增加的乙醇或其他化學(xué)產(chǎn)物的產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了發(fā)酵方法，例如連續(xù)發(fā)酵方法、分批發(fā)酵方法或補(bǔ)料分批發(fā)酵方法(例如，恒定體積或可變體積)。在一些實(shí)施方案中，所述方法提供了用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種發(fā)酵生物質(zhì)。在一些情況下，提供補(bǔ)料分批發(fā)酵方法用于使用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他梭狀芽胞桿菌種從生物質(zhì)(例如玉米秸桿或本文提供的任何生物質(zhì))生產(chǎn)乙醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法提供了 5至200g/L的乙醇滴度，具有約O. 5至20g/L/d的生產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法提供了約O. 1-1克乙醇/克發(fā)酵罐中加載的生物質(zhì)的乙醇產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，方法提供了發(fā)酵終產(chǎn)物(例如醇、乙醇、甲醇、有機(jī)酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)的理論最大可能產(chǎn)率的約45% -99. 5%或更大的收率。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法提供了至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、4、142、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120 125、130、135、140、145、150，160、170、180、190 或 200g/L 或更多的乙醇滴度，具有約 O. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19或20g/L/d或更高的生產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法提供了約O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9或Ig或更多乙醇/g發(fā)酵罐中加載的生物質(zhì)的乙醇產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，提供了發(fā)酵終產(chǎn)物(例如醇、乙醇、有機(jī)酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)的理論最大可能產(chǎn)率的至少約50%、60%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高的產(chǎn)率。b.方法遞以下描述和實(shí)施例詳細(xì)地示例說(shuō)明了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，存在許多由其范圍涵蓋的變化和調(diào)整。因此，優(yōu)選實(shí)施方案的描述不應(yīng)被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。提供用于發(fā)酵生物質(zhì)和隨后生產(chǎn)有用的終產(chǎn)物的方法，所述終產(chǎn)物包括但不限于醇、乙醇、有機(jī)酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫或其他化學(xué)品。在一些實(shí)施方案中，生物質(zhì)(例如玉米秸桿)在發(fā)酵之前被加工或預(yù)處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)處理方法包括但不限于生物質(zhì)粒度減小，例如粉碎、磨碎、切碎、壓碎、研磨或磨粉。在一些實(shí)施方案中，生物質(zhì)粒度減小可以包括尺寸分離方法，例如篩分，或者本領(lǐng)域已知的根據(jù)尺寸分離材料的其他適合方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，尺寸分離可以提供提高的產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，精細(xì)粉碎的生物質(zhì)(例如，直徑小于約 8mm，例如 8、7· 9,7. 7,7. 5,7. 3、7、6· 9,6. 7,6. 5,6. 3、6、5· 9,5. 7,5. 5、5. 3、5、4. 9、4. 7、4. 5、4. 3、4、3. 9、3. 7、3. 5、3. 3、3、2. 9、2. 7、2. 5、2· 3、2、1· 9、I. 7、I. 5、I. 3、1、0. 9,0. 8,0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3,0. 2或O. Imm的顆粒)與較大顆粒的分離允許較大顆粒被回收回尺寸減小過(guò)程，從而增加被加工的生物質(zhì)的最終產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，預(yù)處理方法可以包括在高或低pH條件下的處理。高或低pH處理包括但不限于使用濃酸或濃堿的處理，或使用稀酸或稀堿的處理。用于在本發(fā)明方法中處理生物質(zhì)的堿性組合物包括但不限于苛性堿，例如苛性石灰、苛性蘇打、苛性鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或氧化鈣。在一些實(shí)施方案中，適用于處理生物質(zhì)的堿量范圍是每克待處理生物質(zhì)O. Olg至3g堿(例如苛性堿)。在一些實(shí)施方案中，適用于處理生物質(zhì)的堿量包括但不限于每克待處理生物質(zhì)約O. Olg堿(例如苛性堿)、0. 02g、0. 03g、0. 04g、O. 05g、0. 075g、0. lg、0. 2g、0. 3g、0. 4g、0. 5g、0. 75g、lg、2g 或約 3g 堿(例如苛性堿)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)可以在升高的溫度和/或壓力下預(yù)處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在20°C至400°C的溫度范圍預(yù)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在約 20 0C >25 0C >30 0C >35 0C >40 0C >45 0C >50 0C >55 0C >60 V、65 0C >80 0C >90 V、100 V、120 V、150°c、200°c、250°c、30(rc，35(rc、40(rc或更高的溫度下預(yù)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，升
高的溫度通過(guò)使用蒸汽、熱水或熱氣體來(lái)提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，蒸汽可以被注射入含生物質(zhì)的容器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蒸汽、熱水或熱氣可以被注射入容器套，使得它加熱但不直接接觸生物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)可以在升高的壓力下處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在約Ipsi至約30psi的壓力范圍預(yù)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在約lpsi、2psi、3psi、4psi、5psi、6psi、7psi、8psi、9psi、IOpsi、12psi、15psi、18psi、20psi、22psi、24psi、26psi、28psi、30psi或更高壓力下預(yù)處理。在一些實(shí)施方案中，生物質(zhì)可以通過(guò)注射蒸汽進(jìn)入含有生物質(zhì)的容器而用升高的壓力處理。在其他實(shí)施方案中，生物質(zhì)可以在堿或酸處理或本文提供的任何其他處理方法之前或之后被處理至真空條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿或酸預(yù)處理的生物質(zhì)被洗滌(例如用水(熱的或冷的)或 其他溶劑例如醇(例如乙醇))、用酸、堿或緩沖劑(例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽)中和pH，或者在發(fā)酵之前干燥。在一個(gè)實(shí)施方案中，干燥步驟可以在真空下進(jìn)行以增加水或其他溶劑的蒸發(fā)速率?？蛇x地或附加地，干燥步驟可以在例如約20°C、25°C、30°C、35 °C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 °C >65 °C >80 °C >90 V、100 V、120 V、150 °C >200 °C >250 V、300°C或更高的升高溫度下進(jìn)行。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，預(yù)處理步驟包括固體回收步驟。固體回收步驟可以在預(yù)處理(例如，酸或堿預(yù)處理)期間或之后，或者在干燥步驟之前。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法提供的固體回收步驟包括使用濾網(wǎng)、濾器、篩或膜來(lái)分離液體和固體成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，適合的濾網(wǎng)孔直徑尺寸范圍約O. 001微米至8mm,例如約O. 005微米至3mm或約O. 01微米至1mm。在一個(gè)實(shí)施方案中，濾網(wǎng)孔尺寸具有約O. 01微米、O. 02微米、O. 05微米、O. I微米、O. 5微米、I微米、2微米、4微米、5微米、10微米、20微米、25微米、50微米、75微米、100微米、125微米、150微米、200微米、250微米、300微米、400微米、500微米、750微米、Imm或更大的孔徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，補(bǔ)料分批發(fā)酵對(duì)處理的生物質(zhì)進(jìn)行以產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物(例如，醇、乙醇、有機(jī)酸、乙酸、乳酸、甲烷或氫)。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵過(guò)程包括使用一種或多種微生物同時(shí)水解和發(fā)酵生物質(zhì)，所述微生物例如梭狀芽胞桿菌屬菌株、木霉菌屬菌株、酵母菌屬菌株、發(fā)酵單胞菌屬菌株、或適合發(fā)酵生物質(zhì)的另一種微生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵過(guò)程包括使用以下微生物同時(shí)水解和發(fā)酵生物質(zhì)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌、解木素梭狀芽胞桿菌(Clostridium algidixylanolyticum)、解木聚糖梭狀芽胞桿菌(Clostridium xylanolyticum)、卩遼纖維梭狀芽胞桿菌(Clostridiumcellulovorans)、解纖維梭狀芽胞桿菌(Clostridium cellulolyticum)、熱梭狀芽胞桿菌(Clostridium thermocellum)、約氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium josui)、溶紙莎草梭狀芽胞桿菌(Clostridium papyrosolvens)、產(chǎn)纖維二糖梭狀芽胞桿菌(Clostridiumcellobioparum)、Clostridium hungatei、纖維素梭狀芽胞桿菌(Clostridiumcellulosi)、幾堆梭狀芽胞桿菌(Clostridium stercorarium)、白蟻梭狀芽胞桿菌(Clostridium termitidis)、熱幾梭狀芽胞桿菌(Clostridium thermocopriae)、速生梭狀芽胞桿菌(Clostridium celerecrescens)、解多糖梭狀芽胞桿菌(Clostridiumpolysaccharolyticum)、波氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium populeti)、緩纖維梭狀芽胞桿菌(Clostridium Ientocellum)、Clostridium chartatabidum、阿氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium aldrichii)、Clostridium herbivorans、角軍纖維素醋弧菌(Acetivibriocellulolyticus)、溶纖維素?cái)M桿菌(Bacteroides cellulosolvens)、解糖熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor saccharoIyticum)、白色瘤胃球菌、生黃瘤胃球菌、產(chǎn)玻拍酸絲狀桿菌、溶纖維真桿菌(Eubacterium cellulosolvens)、溶纖維丁酸弧菌、Anaerocellumthermophilum、解纖維素嗜鹽菌(Halocella celIulolytica)、熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、 Sacharophagus degradans、或角軍糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于發(fā)酵生物質(zhì)的一種或多種微生物是野生型微生物。野生型微生物是基本類(lèi)似于獲自天然環(huán)境的分離株的那些微生物，并且包括在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中 繁殖的分離株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種微生物被繁殖和/或根據(jù)期望特征來(lái)篩選。篩選或繁殖方法可以包括用包含是或類(lèi)似于發(fā)酵終產(chǎn)物生產(chǎn)中利用的碳源的碳源的培養(yǎng)基生長(zhǎng)。期望特征包括但不限于增加的生物質(zhì)糖化、增加的特定發(fā)酵終產(chǎn)物生產(chǎn)、增加的乙醇生產(chǎn)、增加的對(duì)乙醇的耐受性、增加的酶合成或減少的孢子形成。篩選方法可以進(jìn)一步包括使用誘變(例如通過(guò)化學(xué)或輻射方式)以產(chǎn)生期望的微生物群體。然后，可以根據(jù)期望特征篩選誘變的微生物，導(dǎo)致更高頻率的期望分離株。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于發(fā)酵的一種或多種微生物可以是重組微生物。重組微生物包括與各自野生型微生物相比對(duì)其核酸的一個(gè)或多個(gè)改變，這是自發(fā)(即，天然)突變沒(méi)有產(chǎn)生的。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物包括來(lái)自另一物類(lèi)(例如另一種微生物)的外源性多核酸、合成多核酸、或從相同物類(lèi)分離或衍生的多核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵過(guò)程可以包括用一種或多種酶同時(shí)水解和發(fā)酵生物質(zhì)，所述酶例如木聚糖酶、內(nèi)切1，4-β -木聚糖酶、木糖苷酶、β-D-木糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、糖酶、葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、內(nèi)切1，4-β-葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、β -D-葡糖苷酶、淀粉酶、纖維二糖水解酶、外切纖維二糖水解酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、過(guò)氧化物酶、果膠酸裂合酶、半乳糖醛酸酶或漆酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于處理生物質(zhì)的一種或多種酶是熱穩(wěn)定的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在發(fā)酵之前用一種或多種例如本文提供的那些酶處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在發(fā)酵期間用一種或多種例如本文提供的那些酶處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在發(fā)酵之前和發(fā)酵期間用一種或多種例如本文提供的那些酶處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于預(yù)處理生物質(zhì)的酶與發(fā)酵期間添加的那些酶相同。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于預(yù)處理生物質(zhì)的酶不同于在發(fā)酵期間添加的那些酶。在一些實(shí)施方案中，發(fā)酵可以在諸如生物反應(yīng)器、發(fā)酵容器、攪拌罐反應(yīng)器或流化床反應(yīng)器的裝置中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，處理的生物質(zhì)可以補(bǔ)充適合的化學(xué)品以促進(jìn)一種或多種發(fā)酵生物體的強(qiáng)力生長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，有用的補(bǔ)充包括但不限于氮和/或氨基酸來(lái)源，例如酵母提取物、半胱氨酸、銨鹽(例如，硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等等)；簡(jiǎn)單碳水化合物的來(lái)源，例如玉米浸潰液體和麥芽糖漿；維生素來(lái)源，例如酵母提取物；緩沖齊 ，例如鹽(包括但不限于檸檬酸鹽、磷酸鹽或碳酸鹽)；或礦脂營(yíng)養(yǎng)素，例如鎂鹽、鈣鹽或鐵鹽。在一些實(shí)施方案中，氧化還原調(diào)節(jié)劑被添加至發(fā)酵混合物，包括但不限于半胱氨酸或巰基乙醇。用于本發(fā)明方法的化學(xué)品容易獲得并且可以購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商，例如Sigma-Aldricho 此外，商業(yè)酶混合物(例如，accellerase 1000、CelluSeb-TL、CelluSeb-TS、Cellic CTec、STARGEN 、Maxaliq 、Spezyme 、Distillase 、G-Zyme 、Fermenzyme 、Fermgen 、GC 212或Optimash )或任何其他商業(yè)酶混合物可以購(gòu)自供應(yīng)商，例如 Specialty Enzymes & Biochemicals Co.、Genencor 或 Novozymes?？蛇x地，酶混合物可以通過(guò)在適合培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種生物體例如真菌(例如，木霉菌、酵母菌、畢赤酵母、白腐菌等等)、細(xì)菌(例如梭狀芽胞桿菌(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)或大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、Sacharophagus degradans等等)并收獲從其產(chǎn)生的酶來(lái)制備。在一些實(shí)施方案中，收獲可以包括一個(gè)或多個(gè)酶純化步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)微生物生產(chǎn)發(fā)酵終產(chǎn)物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的滴度和/或生產(chǎn)率通過(guò)在包含一種或多種含有己糖和/或戍糖的化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 所述微生物來(lái)提高。在一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)程包括將起始材料(例如生物質(zhì))轉(zhuǎn)化為生物燃料，例如一種或多種醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括使包含己糖(例如葡萄糖、纖維素二糖)和戊糖(例如木糖、阿拉伯糖)的底物與植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌接觸以產(chǎn)生乙醇。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明方法用微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)分批發(fā)酵己糖和戊糖的混合物提供了約O. l-8g/L/h或更高的己糖(例如葡萄糖、纖維素、纖維素二糖等等)和約O. l_8g/L/h或更高的戊糖(木糖、木聚糖、半纖維素等等)的攝取速率。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明方法用微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)分批發(fā)酵己糖和戊糖的混合物提供了約O. 1,0. 2,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8、1、2、3、4、5或6g/L/h或更高的己糖(例如葡萄糖、纖維素、纖維素二糖等等)和約O. 1,0. 2,0. 4、O. 5,0. 6,0. 7,0. 8、1、2、3、4、5或6g/L/h或更高的戊糖(木糖、木聚糖、半纖維素等等)的攝取速率。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)乙醇的方法在40小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生約10g/l至120g/l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)乙醇的方法在40小時(shí)內(nèi)通過(guò)生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生約10g/l、Ilg/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、43g/L、44g/L、45g/L、46g/L、47g/L、48g/L、49g/L、50g/L、51g/L、52g/L、53g/L、54g/L、55g/L、56g/L、57g/L、58g/L、59g/L、60g/L、61g/L、62g/L、63g/L、64g/L、65g/L、66g/L、67g/L、68g/L、69g/L、70g/L、71g/L、72g/L、73g/L、74g/L、75g/L、76g/L、77g/L、78g/L、79g/L、80g/L、81g/L、82g/L、83g/L、84g/L、85g/L、86g/L、87g/L、88g/L、89g/L、90g/L、91g/L、92g/L、93g/L、94g/L、95g/L、96g/L、97g/L、98g/L、99g/L、100g/L、110g/l、120g/l或更多乙醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包括同時(shí)發(fā)酵己糖和戊糖的方法生產(chǎn)乙醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，乙醇通過(guò)包括同時(shí)發(fā)酵己糖和戊糖的微生物生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物的微生物在高醇(例如乙醇或丁醇)濃度存在下耐受。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌在高醇(例如乙醇或丁醇)濃度存在下耐受。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物可以在達(dá)15% v/v的醇(例如乙醇或丁醇)濃度下生長(zhǎng)并發(fā) 車(chē)功能。在另Iv實(shí)施方案中，微生物可以在I、2*%、3*%、4*%、5*%、6*%、7*%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%￥八的醇(例如乙醇或丁醇)濃度下生長(zhǎng)并發(fā)揮功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，高醇濃度中的功能包括促進(jìn)生產(chǎn)醇而無(wú)過(guò)度的醇和/或其他存在組分的抑制或壓抑的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，高醇濃度中的功能包括將生物質(zhì)原料中的己糖和戊糖碳源有效轉(zhuǎn)化成發(fā)酵終產(chǎn)物例如醇的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌在高醇(例如乙醇或丁醇)濃度存在下耐受。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在包含植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇濃度在分批發(fā)酵約36-48小時(shí)之后達(dá)到約15g/L的平穩(wěn)狀態(tài)，碳物質(zhì)包括在培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將發(fā)酵PH降低至約6. 5和/或添加不飽和脂肪酸至發(fā)酵培養(yǎng)基，導(dǎo)致生物體產(chǎn)生的乙醇量顯著增加，在48-96小時(shí)或更長(zhǎng)發(fā)酵之后在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)約20g/L至約30、40、50、60或70g/L或更多的乙醇。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇滴度低 時(shí)，生物體的生產(chǎn)率較高(至約IOg/L-d)，并且當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)，生物體的生產(chǎn)率較低(至約2g/L-d)。在減小的pH和/或添加脂質(zhì)(例如脂肪酸)時(shí)的發(fā)酵可以導(dǎo)致乙醇生產(chǎn)率與未調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基相比約2至10倍(例如2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x或IOx增加)或更高的增加。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，己糖和戊糖的同時(shí)發(fā)酵還可實(shí)現(xiàn)乙醇生產(chǎn)率和/或產(chǎn)率的增加。在一些情況下，己糖和戊糖碳水化合物底物的同時(shí)發(fā)酵可與在減小的PH和/或添加脂質(zhì)(例如脂肪酸)時(shí)的發(fā)酵組合使用以進(jìn)一步增加生產(chǎn)率和/或產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)是脂肪或油，包括但不限于脂肪酸的甘油酯以及伴隨的磷脂、留醇、醇、烴、酮和相關(guān)化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)是磷脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酸是脂肪族或芳香族單羧酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酸是不飽和脂肪酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，不飽和脂肪酸是具有I至3個(gè)雙鍵的脂肪酸，并且"高度不飽和脂肪酸"指具有4個(gè)或更多雙鍵的脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不飽和脂肪酸是ω-3高度不飽和脂肪酸，例如二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、α亞麻酸、二十二碳六烯酸及其軛合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酸是飽和脂肪酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酸是植物油，例如部分氫化的植物油，包括棕櫚油、棉籽油、玉米油、花生油、棕櫚仁油、巴巴蘇油、葵花油、紅花油或其混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含脂肪酸的組合物還包括臘，例如蜂臘、石油臘、米糠臘、蓖麻油臘、微晶臘或其混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在用微生物發(fā)酵之前用表面活性劑預(yù)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在微生物發(fā)酵期間與表面活性劑接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表面活性劑是Tween系列表面活性劑(例如Tween 20或Tween 80)或Triton系列表面活性劑(例如Triton X-100)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表面活性劑是聚山梨酯60、聚山梨酯80、丙二醇、二辛基磺基琥珀酸鈉、月桂基硫酸鈉、脂肪酸的乳酸酯、脂肪酸的聚甘油酯或其混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在用微生物發(fā)酵之前用表面活性劑和脂質(zhì)預(yù)處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物質(zhì)在用微生物發(fā)酵期間與表面活性劑和脂質(zhì)接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括螯合劑(例如檸檬酸三鈉的二水合物或EDTA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑是與某些金屬離子形成可溶性絡(luò)合分子的化學(xué)品，使所述離子失活以使它們不與其他元素或離子反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基中螯合劑的濃度大于約O. 2g/L、大于約O. 5g/L或大于約lg/L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基中螯合劑的濃度小于約10g/L、小于約5g/L或小于約2g/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物可接受螯合劑是5-磺基水楊酸二水合物、檸檬酸二胺、草酸銨一水合物、檸檬酸、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物、L-(+)_酒石酸、草酸鉀一水合物、酒石酸鉀鈉四水合物、檸檬酸三鈉二水合物、L-酒石酸二鈉二水合物、草酸鈉、乙二醇-雙(2-氨基乙醚)-N，N，N'，N'-四乙酸、檸檬酸三鎂九水合物、乙二胺四乙酸二銨鹽、乙二胺四乙酸二鉀鹽二水合物、四草酸鉀二水合物、酒石酸二鈉二水合物、乙二胺四乙酸三鉀鹽二水合物、乙二胺四乙酸三鈉鹽二水合物、酒石酸二銨、檸檬酸三鋰四水合物、檸檬酸鉀、酒石酸氫鈉一水合物、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸四鈉鹽水合物、N，N-二甲基癸胺N-氧化物、N，N-二甲基十二胺N-氧化物、次氮基三乙酸、檸檬酸三鉀、D-酒石酸鉀、過(guò)氧化硫酸氫鉀、酒石酸鉀鈉、苯均四酸水合物、酒石酸二鈉溶液、檸檬酸濃縮溶液、乙二胺四乙酸二鈉鹽、依地酸二鈉、檸檬酸鈉、乙二胺四(亞甲基磷酸)、二羧基甲基谷氨酸、二乙胺二琥珀酸(EDDS)、甲胺、綠膿菌素、綠膿菌熒光素、腸菌素、蛋氨酸，例如植物螯合肽、蘋(píng)果酸、次氮基三乙酸、草酸或去鐵草酰胺B。在一個(gè)實(shí)施方案中，螯合劑根據(jù)靶向螯合的金屬的特異性和/或通過(guò)螯合劑在預(yù)處理環(huán)境中發(fā)揮作用的能力來(lái)選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)堿性PH通過(guò)向原料添加堿劑來(lái)維持時(shí)，選擇的螯合劑將能夠在堿性PH下發(fā)揮作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)酸性pH通過(guò)向原料添加酸劑來(lái)維持時(shí)，選擇的螯合劑將能夠在酸性PH下發(fā)揮作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在預(yù)處理過(guò)程中利用高溫時(shí)，選擇的螯合劑能夠在高溫發(fā)揮作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括超過(guò)一種螯合劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種螯合劑在微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌發(fā)酵生物質(zhì)期間被添加至發(fā)酵培養(yǎng)基。
牛物質(zhì)在一些實(shí)施方案中，微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)與預(yù)處理或非預(yù)處理的原料接觸，所述原料包含纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)纖維素材料。其他營(yíng)養(yǎng)素可以存在或添加至生物質(zhì)材料以被微生物加工，所述營(yíng)養(yǎng)素包括含氮化合物，例如氨基酸、蛋白、水解蛋白、氨、尿素、硝酸鹽、亞硝酸鹽、大豆、大豆衍生物、酪蛋白、酪蛋白衍生物、乳粉、乳衍生物、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶酵母、玉米浸潰液體、玉米浸潰固體、谷氨酸單鈉和/或其他發(fā)酵氮源。維生素和/或礦物補(bǔ)充物。在一些實(shí)施方案中，一種或多種其他低分子量碳源可以被添加或存在，例如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米糖漿、蒸餾干燥可溶物(DDS)、蒸餾干燥顆粒(DDG)、濃縮蒸餾可溶物(CDS)、蒸餾濕潤(rùn)顆粒(DWG)、蒸餾干燥顆粒及可溶物(DDGS)、乳酸等等。此類(lèi)低分子量碳源可以發(fā)揮多種功能，包括在發(fā)酵期開(kāi)始時(shí)提供初始碳源，幫助構(gòu)建細(xì)胞技術(shù)，控制碳/氮比例，去除過(guò)量氮，或一些其他功能。在一些實(shí)施方案中，添加另一種培養(yǎng)基補(bǔ)充物，例如PH調(diào)節(jié)劑、脂質(zhì)(例如脂肪酸)、表面活性劑或螯合劑)。在一些實(shí)施方案中，需氧/厭氧循環(huán)用于將纖維素或木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品。在一些實(shí)施方案中，厭氧微生物可以直接發(fā)酵生物質(zhì)而無(wú)需預(yù)處理。在一些實(shí)施方案中，原料與能夠?qū)⒅参镅苌木酆衔锊牧戏纸獬傻头肿恿慨a(chǎn)物的生物催化劑接觸，低分子量產(chǎn)物隨后可以被生物催化劑轉(zhuǎn)化為燃料和/或其他期望的化學(xué)品。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)微生物同時(shí)糖化和發(fā)酵來(lái)自生物質(zhì)的纖維素固體成為燃料或另一種發(fā)酵終產(chǎn)物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)微生物對(duì)預(yù)處理的原料的水解和對(duì)寡糖的水解在單個(gè)發(fā)酵反應(yīng)容器中同時(shí)發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)處理的原料的水解、寡糖的水解和單糖轉(zhuǎn)化為乙醇可以在單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，單一微生物同時(shí)進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物的第一和第二個(gè)種進(jìn)行水解和轉(zhuǎn)化步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括用可以糖化C5/C6糖的微生物在封閉容器中處理生物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細(xì)菌或另一梭狀芽胞桿菌種在封閉容器中在其中植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細(xì)菌或其他微生物產(chǎn)生足以充分轉(zhuǎn)化生物質(zhì)成為單糖和二糖的糖解酶的條件下處理生物質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括用可以糖化C5/C6糖的微生物在容器中處理生物質(zhì)并添加一種或多種酶以幫助碳水化合物或木質(zhì)纖維素材料的分解或脫毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或另一種類(lèi)似的C5/C6梭狀芽胞桿菌種在容器中處理微生物并添加一種或多種酶以幫助碳水化合物或木質(zhì)纖維素材料的分解或脫毒。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)物在用第一微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)發(fā)酵之后可以與第二微生物接觸，其中第二微生物能夠充分轉(zhuǎn)化單糖和二糖成為期望的發(fā)酵產(chǎn)物，例如燃料(例如乙醇或丁醇)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二微生物是真菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二微生物是酵母。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二微生物是貝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、 博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)、Saccharomyces cariocanus、Saccharomycescariocus、釀酒酵母、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、 Saccharomycesdairenensis、葡萄酵母(Saccharomyces ellipsoideus) >Saccharomyces martiniae、摩納酵母(Saccharomyces monacensis) >Saccharomyces norbensis、奇異酵母(Saccharomycesparadoxus)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus) > Saccharomyces spencerorum、圖列茨酵母(Saccharomyces turicensis)、單胞酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、Saccharomyces zonatus。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二微生物是酵母菌或念珠菌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二微生物是梭狀芽胞桿菌種，例如熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌和噬纖維梭狀芽胞桿菌或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在一些實(shí)施方案中，提供了從含有木質(zhì)素的生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料或其他化學(xué)品的方法。該方法包括1)使含木質(zhì)素的生物質(zhì)與濃度足以水解至少一部分含木質(zhì)素的生物質(zhì)的堿水溶液接觸；2)將處理的生物質(zhì)中和至pH 5至9 (例如5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5或9) ；3)在封閉容器中用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或另一種類(lèi)似的C5/C6梭狀芽胞桿菌種在其中植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌(任選添加一種或多種酶至容器)充分轉(zhuǎn)化被處理的生物質(zhì)成為單糖和二糖和/或生物燃料或其他發(fā)酵終產(chǎn)物的條件下處理生物質(zhì)；和4)任選地，引入第二微生物培養(yǎng)物，其中所述第二微生物能夠充分轉(zhuǎn)化單糖和二糖成為發(fā)酵終產(chǎn)物，例如生物燃料。微牛物的遺傳修飾另一方面，提供了通過(guò)構(gòu)建和使用遺傳修飾微生物來(lái)生產(chǎn)發(fā)酵終產(chǎn)物例如一種或多種醇例如乙醇的組合物和方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾針對(duì)調(diào)節(jié)或編碼與發(fā)酵生化途徑、糖解酶表達(dá)或增加發(fā)酵期間環(huán)境條件耐受性相關(guān)的蛋白的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾針對(duì)微生物中的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物用編碼感興趣的途徑、酶或蛋白的一個(gè)或多個(gè)基因的多核苷酸轉(zhuǎn)化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生感興趣的途徑、酶或蛋白的一個(gè)或多個(gè)基因的多個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)化入微生物的多核苷酸是異源的。在其他實(shí)施方案中，所述多核苷酸衍生自微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物用編碼一個(gè)或多個(gè)基因的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述一個(gè)或多個(gè)基因編碼用于發(fā)酵己糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述微生物轉(zhuǎn)化子與未轉(zhuǎn)化的微生物相比增加的濃度、生產(chǎn)率水平或產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇的能力的水平表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物用編碼一個(gè)或多個(gè)基因的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述一個(gè)或多個(gè)基因編碼用于發(fā)酵戊糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述微生物轉(zhuǎn)化子與未轉(zhuǎn)化的微生物相比增加的濃度、生產(chǎn)率水平或產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇或其他終產(chǎn)物的能力的水平表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，微生物用發(fā)酵己糖和戊糖的酶的組合轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，可以實(shí)現(xiàn)提高的終產(chǎn)物生產(chǎn)率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物用編碼一個(gè)或多個(gè)基因的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述一個(gè)或多個(gè)基因編碼用于多糖糖化的糖解酶，其中所述基因以足以賦予轉(zhuǎn)化的微生物與未轉(zhuǎn)化的微生物相比增加的濃度、糖化速率或單糖、二糖或寡糖的產(chǎn)率糖化多糖為單糖、二糖或寡糖的能力的水平表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾針對(duì)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌中的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼感興趣的途徑、酶或蛋白的一個(gè)或多個(gè)基因的多核苷酸轉(zhuǎn)化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌被轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生感興趣的途徑、酶或蛋白的一個(gè)或多個(gè)基因的多個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)化入植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的多核苷酸是異源的。在其他實(shí)施方案中，多核苷酸衍生自植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。 在一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼一個(gè)或多個(gè)基因的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述一個(gè)或多個(gè)基因編碼用于發(fā)酵己糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉(zhuǎn)化子與未轉(zhuǎn)化的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌相比增加的濃度、生產(chǎn)率水平或產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇的能力的水平表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼一個(gè)或多個(gè)基因的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述一個(gè)或多個(gè)基因編碼用于發(fā)酵戊糖的酶，其中所述基因以足以賦予所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉(zhuǎn)化子與未轉(zhuǎn)化的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌相比增加的濃度、生產(chǎn)率水平或產(chǎn)率生產(chǎn)乙醇或其他終產(chǎn)物的能力的水平表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌被用于發(fā)酵己糖和戊糖的酶的組合轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，可以實(shí)現(xiàn)提聞的終廣物生廣率。在另一個(gè)實(shí)施方案中，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌用編碼一個(gè)或多個(gè)基因的異源多核苷酸轉(zhuǎn)化，所述一個(gè)或多個(gè)基因編碼用于多糖糖化的糖解酶，其中所述基因以足以賦予所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉(zhuǎn)化子與未轉(zhuǎn)化的予植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌相比增加的濃度、糖化速率或單糖、二糖或寡糖的產(chǎn)率使多糖糖化為單糖、二糖或寡糖的能力的水平表達(dá)。宿主產(chǎn)生糖解酶以及該糖解酶隨后釋放入培養(yǎng)基，減少了降解生物質(zhì)或多糖成為可發(fā)酵單糖和寡糖所必需的商業(yè)酶的量。糖解DNA可以是宿主本身的，但更通常DNA是外來(lái)的，S卩外源的。有利的糖解基因包括纖維素分解、木聚糖分解和淀粉降解酶，例如纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、葡糖苷酶和淀粉酶。糖解酶可以至少部分由宿主分泌，或者它可以大量地在細(xì)胞內(nèi)累積以隨后釋放。有利地，熱穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)累積的酶可以在需要時(shí)通過(guò)熱誘導(dǎo)的溶胞來(lái)釋放。酶的組合可以由異源DNA編碼，一些異源DNA被分泌，而一些異源DNA被累積。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以做出其他修飾以增加重組微生物的終產(chǎn)物(例如乙醇)生成。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組微生物可以進(jìn)一步包含其他異源DNA區(qū)段，其表達(dá)產(chǎn)物是參與單糖和/或寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入重組宿主的蛋白。同樣，來(lái)自糖解途徑的其他基因可以被加入宿主。以這種方式，可以實(shí)現(xiàn)增加的乙醇生成速率。
為了提高發(fā)酵終產(chǎn)物(例如甲醇)的生成，可以在以下中進(jìn)行修飾轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，用于形成有機(jī)酸的基因，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)基因，孢子形成基因，影響酶輔因子形成/再生的基因，影響乙醇耐受性的基因，影響鹽耐受性的基因，影響生長(zhǎng)速率的基因，影響氧耐受性的基因，影響代謝物阻遏的基因，影響氫生成的基因，影響對(duì)重金屬耐受性的基因，影響對(duì)酸耐受性基因，或影響對(duì)醛耐受性的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以對(duì)本文示例的方法進(jìn)行許多修飾。例如，可以利用多種啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)異源基因在重組植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌宿主中表達(dá)。受益于本公開(kāi)內(nèi)容的技術(shù)人員能夠容易選擇和利用可用于此目的的各種啟動(dòng)子的任何一種。類(lèi)似地，作為常規(guī)偏好的問(wèn)題，技術(shù)人員可以利用較高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備用于期望基因染色體整合的構(gòu)建體。外來(lái)基因的染色體整合可以提供超過(guò)基于質(zhì)粒的構(gòu)建的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，基于質(zhì)粒的構(gòu)建對(duì)于商業(yè)化過(guò)程具有某些限制。產(chǎn)甲烷基因被染色體整合入大腸桿菌 B;參見(jiàn) Ohta 等.(1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 :893_900。一般而言，這通過(guò) DNA 片段的純化來(lái)進(jìn)行，所述DNA片段含有(I)來(lái)自抗生素抗性基因上游的期望基因和(2)來(lái)自靶生物體的異源DNA的片段。該DNA可以被連接形成無(wú)復(fù)制子的環(huán)并用于轉(zhuǎn)化。因此，感興趣的基因可以被引入異源宿主，例如大腸桿菌，并且短的隨機(jī)片段可以被分離并連接入植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌以促進(jìn)同源重組。在其他實(shí)施方案中，可以不使用重組DNA技術(shù)而獲得可以表現(xiàn)出期望性質(zhì)例如增加的生產(chǎn)率、增加的產(chǎn)率或增加的滴度的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌分離株。例如，可以通過(guò)化學(xué)方式或通過(guò)微生物輻射來(lái)進(jìn)行誘變或隨機(jī)誘變。然后，可以根據(jù)表現(xiàn)出一種或多種期望性質(zhì)的有益突變來(lái)篩選被誘變的微生物群體。篩選可以通過(guò)在含有將在發(fā)酵生產(chǎn)終產(chǎn)物的過(guò)程中使用的碳源的底物上培養(yǎng)誘變微生物來(lái)進(jìn)行。篩選還可以包括在生物體生長(zhǎng)期間測(cè)量終產(chǎn)物生成，或者測(cè)量碳源的消化或同化。如此獲得的分離株可以進(jìn)一步用重組多核苷酸轉(zhuǎn)化，或者與本文提供的任何方法和組合物組合使用，以進(jìn)一步改善燃料生產(chǎn)。生物燃料廠和產(chǎn)生生物燃料的方法一方面，本文提供了包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物質(zhì)材料的水解設(shè)備和用于容納培養(yǎng)基和其中分散的微生物的發(fā)酵罐的燃料廠。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。另一方面，本文提供了制備燃料或化學(xué)終產(chǎn)物的方法，包括在培養(yǎng)基中混合微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細(xì)胞或類(lèi)似的C5/C6梭狀芽胞桿菌種)和木質(zhì)纖維素材料(和/或其他生物質(zhì)材料)，并在足以產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物例如燃料(例如乙醇、丙醇、甲烷或氫)的條件和時(shí)間下發(fā)酵木質(zhì)纖維素材料。在一些實(shí)施方案中，提供了使用酸水解預(yù)處理從生物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物(例如乙醇或氫)的方法。在一些實(shí)施方案中，提供了使用酶水解預(yù)處理從生物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物(例如乙醇或氫)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了使用已經(jīng)酶預(yù)處理的生物質(zhì)從生物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物(例如乙醇或氫)的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了使用已經(jīng)化學(xué)或酶預(yù)處理但任選蒸汽處理的生物質(zhì)從生物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物(例如乙醇或氫)的方法。另一方面，本文提供了通過(guò)本文描述的任何方法制成的終產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以對(duì)本文示例的方法進(jìn)行許多修飾。例如，可以利用多種啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)異源基因在重組微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)中表達(dá)。受益于本公開(kāi)內(nèi)容的技術(shù)人員能夠容易選擇和利用可用于此目的的各種啟動(dòng)子的任何一種。類(lèi)似地，作為常規(guī)偏好的問(wèn)題，技術(shù)人員可以利用較高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以制備用于期望基因染色體整合的構(gòu)建體。外來(lái)基因的染色體整合可以提供超過(guò)基于質(zhì)粒的構(gòu)建的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，基于質(zhì)粒的構(gòu)建對(duì)于商業(yè)化過(guò)程具有某些限制。產(chǎn)甲烷基因被染色體整合入大腸桿菌 B ;參見(jiàn) Ohta 等.(1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 :893_900。一般而言，這通過(guò)DNA片段的純化來(lái)進(jìn)行，所述DNA片段含有(I)來(lái)自抗生素抗性基因上游的期望基因和(2)來(lái)自靶生物體的異源DNA的片段。該DNA可以被連接形成無(wú)復(fù)制子的環(huán)并用于轉(zhuǎn)化。因此，感興趣的基因可以被引入異源宿主，例如大腸桿菌，并且短的隨機(jī)片段可以被分離并連接入植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌以促進(jìn)同源重組。從生物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵終產(chǎn)物
一方面，利用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌從生物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵終產(chǎn)物(例如乙醇)。在一個(gè)實(shí)施方案中，首先將包括高分子量碳水化合物的生物質(zhì)材料水解為低分子量碳水化合物，然后使用微生物細(xì)胞發(fā)酵低分子量碳水化合物以產(chǎn)生乙醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵生物質(zhì)材料本身而無(wú)化學(xué)和/或酶預(yù)處理。在第一方法中，水解可以使用酸例如布朗斯臺(tái)德酸(例如硫酸或鹽酸)、堿例如氫氧化鈉、熱液處理、蒸汽爆發(fā)、氨纖維爆發(fā)處理("AFEX")、石灰處理、酶、或這些的組合來(lái)完成。如果需要，氫和其他發(fā)酵產(chǎn)物可以被捕獲并純化，或者例如通過(guò)燃燒而處理掉。例如，氫氣可以被點(diǎn)燃，或者用作過(guò)程中的能源，例如以驅(qū)動(dòng)蒸汽鍋爐，例如通過(guò)燃燒。生物質(zhì)的水解和/或蒸汽處理可以例如增加生物質(zhì)的孔隙率和/或表面積，通常使纖維素材料更多暴露于微生物細(xì)胞，這可以增加發(fā)酵速率和產(chǎn)率。木質(zhì)素的去除可以例如提供用于驅(qū)動(dòng)鍋爐的燃料，并且還可以例如增加生物質(zhì)的孔隙率和/或表面積，經(jīng)常增加發(fā)酵速率和產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中碳水化合物的初始濃度大于20mM，例如大于30禮、501111、751111、1001111、1501111、2001111或甚至大于500mMo牛物質(zhì)加工廠和從牛物質(zhì)產(chǎn)牛產(chǎn)物的方法一方面，本發(fā)明特征為燃料廠，包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物質(zhì)材料的水解設(shè)備，用于容納具有分散其中的C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，和分離終產(chǎn)物與相關(guān)副產(chǎn)物和共產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)物回收系統(tǒng)。另一方面，本發(fā)明特征為制備終產(chǎn)物的方法，包括混合C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)和培養(yǎng)基中的生物質(zhì)原料，并在足以產(chǎn)生生物燃料、化學(xué)產(chǎn)物或發(fā)酵終產(chǎn)物(例如乙醇、丙醇、氫、木質(zhì)素、萜類(lèi)等)的條件和時(shí)間下發(fā)酵生物質(zhì)材料。另一方面，本發(fā)明特征為通過(guò)本文描述的任何方法制成的發(fā)酵終產(chǎn)物。從生物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵終產(chǎn)物一般而言，有兩種基本方法利用C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)從生物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)一種或多種發(fā)酵終產(chǎn)物。在所有方法中，根據(jù)生物質(zhì)類(lèi)型及其物理表現(xiàn)，方法之一可以包括經(jīng)由濕研磨或干研磨來(lái)磨碎含碳材料，以減少材料尺寸并增加表面體積比(物理改性)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含高分子量碳水化合物的生物質(zhì)材料被水解以使其脫木質(zhì)素或者以分離碳水化合物和非碳水化合物。使用熱、化學(xué)和/或酶處理的組合，水解的材料可以被分離以形成液體和脫水蒸汽，其可以被單獨(dú)處理并保持分離或重新組合，然后使用C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)發(fā)酵低分子量碳水化合物以產(chǎn)生一種或多種化學(xué)產(chǎn)物。在第二方法中，發(fā)酵生物質(zhì)材料本身而無(wú)熱、化學(xué)和/或酶預(yù)處理。在第一方法中，水解可以使用酸(例如硫酸或鹽酸)、堿(例如氫氧化鈉)、熱液處理、氨纖維爆發(fā)處理("AFEX")、石灰處理、酶、或這些的組合來(lái)完成。生物質(zhì)的水解和/或蒸汽處理可以例如增加生物質(zhì)的孔隙率和/或表面積，常使纖維素材料更多暴露于C5/C6水解微生物(例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)，這可以增加發(fā)酵速率和產(chǎn)率。生物質(zhì)的水解和/或蒸汽處理可以例如產(chǎn)生副產(chǎn)物或共產(chǎn)物，其可以被分離或處理以提高發(fā)酵速率和產(chǎn)率，或者用于產(chǎn)能以驅(qū)動(dòng)過(guò)程，或者經(jīng)進(jìn)一步加工或無(wú)需進(jìn)一步加工而用作產(chǎn)品。木質(zhì)素的去除可以例如提供用于驅(qū)動(dòng)鍋爐的燃料。如果需要，發(fā)酵產(chǎn)物氣體(例如甲烷、氫或CO2)、液體(例如乙醇和有機(jī)酸)或固體(例如木質(zhì)素)可以被捕獲并純化，或者例如通過(guò)燃燒處理掉。例如，氫氣可以被點(diǎn)燃，或例如通過(guò)燃燒用作過(guò)程中的能源以例如驅(qū)動(dòng)蒸汽鍋爐。從發(fā)酵罐排 出的產(chǎn)物可以被進(jìn)一步加工，例如乙醇可以被轉(zhuǎn)移至蒸餾和精餾，產(chǎn)生濃縮的乙醇混合物，或者固體可被分離用于提供能源或作為化學(xué)產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，預(yù)處理包括用酸預(yù)處理的步驟。在一些實(shí)施方案中，酸是稀酸。在一些實(shí)施方案中，酸處理在約85至140°C之間的升高溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，方法還包括例如使用濾網(wǎng)回收酸處理的生物質(zhì)固體。在一些實(shí)施方案中，濾網(wǎng)包括直徑大約150-250微米的開(kāi)口。在一些實(shí)施方案中，方法還包括用水或其他溶劑洗滌酸處理的生物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，方法還包括用堿中和酸。在一些實(shí)施方案中，方法還包括干燥酸處理的生物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，干燥步驟在約15-45°C之間的升高溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，分離的材料的液體部分被進(jìn)一步處理以除去毒性材料。在一些實(shí)施方案中，液體部分與固體分離，然后單獨(dú)發(fā)酵。在一些實(shí)施方案中，從酸處理形成固體和液體的漿體，然后一起發(fā)酵。圖11描繪通過(guò)用酸在升高的溫度和壓力下在水解設(shè)備中處理生物質(zhì)而從生物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)產(chǎn)物的方法的實(shí)例。生物質(zhì)可以首先通過(guò)添加熱水或蒸汽來(lái)加熱。生物質(zhì)可以通過(guò)將氣體二氧化硫鼓泡經(jīng)過(guò)懸浮于水中的生物質(zhì)或者通過(guò)添加強(qiáng)酸例如硫酸、鹽酸或硝酸來(lái)酸化，添加或不添加預(yù)熱/預(yù)蒸汽/水。酸化過(guò)程中，pH保持在低水平，例如低于約5。溫度和壓力可以在酸添加之后被升高。除了已經(jīng)在酸化設(shè)備中的酸外，任選地，可以添加金屬鹽例如硫酸亞鐵、硫酸鐵、氯化鐵、硫酸鋁、氯化鋁、硫酸鎂或這些的混合物以輔助生物質(zhì)的水解。含酸的生物質(zhì)被添加入預(yù)處理設(shè)備的水解部分。蒸汽被注入預(yù)處理設(shè)備的水解部分以直接接觸并加熱生物質(zhì)至期望的溫度。添加蒸汽之后的生物質(zhì)溫度在例如約130°C和220°C。然后將水解產(chǎn)物排入預(yù)處理設(shè)備的閃蒸罐部分，并在罐內(nèi)保持一段時(shí)間以進(jìn)一步水解生物質(zhì)成寡糖和單糖。也可以使用蒸汽爆發(fā)來(lái)進(jìn)一步分解生物質(zhì)?？蛇x地，對(duì)于任何高壓預(yù)處理過(guò)程，生物質(zhì)可以通過(guò)空氣閥排放。然后水解產(chǎn)物從預(yù)處理反應(yīng)器排放，添加或不添加水，例如固體濃度為約15%至60%。預(yù)處理之后，生物質(zhì)可以被脫水和/或用一定量的水洗滌，例如通過(guò)擠壓或通過(guò)離心，或者通過(guò)過(guò)濾，使用例如逆流提取器、壓洗器、壓濾器、壓力過(guò)濾器、螺旋運(yùn)輸提取器或真空皮帶提取器以除去酸化流體。經(jīng)或不經(jīng)進(jìn)一步處理例如添加堿(例如石灰)和或氨(例如磷酸銨)，酸化流體可以例如在預(yù)處理設(shè)備的酸化部分中被重復(fù)使用，或者被添加至發(fā)酵，或者被收集用于其它用途/處理。產(chǎn)物可以衍生自酸化流體的處理，例如石膏或磷酸銨。酶或酶混合物可以在預(yù)處理期間添加以幫助高分子量組分的水解，例如對(duì)纖維素、半纖維素、果膠和淀粉組分活性的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶(CBH)、β-葡糖苷酶、糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、裂合酶和酯酶。發(fā)酵罐被添加水解的生物質(zhì)、來(lái)自生物質(zhì)預(yù)處理的任何液體級(jí)分、植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌細(xì)胞的活性種子培養(yǎng)物、可能需要的輔助發(fā)酵微生物，例如酵母或大腸桿菌，和可能需要的促進(jìn)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌或其他微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)素。可選地，預(yù)處理的生物質(zhì)或液體級(jí)分可以被分入多個(gè)發(fā)酵罐，每個(gè)發(fā)酵罐含有不同菌株的植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌和/或其他微生物，并且每個(gè)發(fā)酵罐在特定物理?xiàng)l件下操作。允許發(fā)酵進(jìn)行一段時(shí)間，例如約15至150小時(shí)，同時(shí)保持溫度在例如約25°C至50°C。發(fā)酵期間產(chǎn)生的氣體從發(fā)酵罐吹掃并排放、收集或點(diǎn)燃，有或沒(méi)有其他處理，例如氫氣可以被收集并用作能源或純化為共產(chǎn)物。發(fā)酵后，發(fā)酵罐內(nèi)容物被轉(zhuǎn)移至產(chǎn)物回收。產(chǎn)物被提取，例如乙醇通過(guò)蒸餾和精餾回收。 無(wú)預(yù)處理從牛物質(zhì)化學(xué)牛產(chǎn)圖12描繪了通過(guò)將生物質(zhì)裝入發(fā)酵容器而從生物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)品的方法。生物質(zhì)可以被允許浸泡一段時(shí)間，添加或不添加熱、水、酶或酸/堿。加工容器中的壓力可以保持在大氣壓或之上。可以在預(yù)處理期末添加酸或堿以中和。在預(yù)處理期末，或者在預(yù)處理開(kāi)始的同時(shí)，添加C5/C6水解微生物(例如,植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的活性種子培養(yǎng)物、可能需要的輔助發(fā)酵微生物，例如酵母或大腸桿菌，和可能需要的促進(jìn)C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)素。如上所述進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵后，發(fā)酵罐內(nèi)容物被轉(zhuǎn)移至如上所述的產(chǎn)物回收。可以使用化學(xué)生產(chǎn)方法和/或特征的任何組合以產(chǎn)生組合生產(chǎn)方法。在本文所述方法的任何一種中，產(chǎn)物可以在任何步驟被去除、添加或組合。C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)可以單獨(dú)使用或者與一種或多種其他微生物(例如酵母、真菌或其他細(xì)菌)組合協(xié)同使用。在一些實(shí)施方案中，不同方法可以用于單一工廠以產(chǎn)生不同終產(chǎn)物。另一方面，本發(fā)明特征為包括用于水解包括高分子量碳水化合物的生物質(zhì)材料的水解設(shè)備和用于容納培養(yǎng)基和其中分散的C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)的發(fā)酵罐的燃料廠。另一方面，本發(fā)明特征為制備燃料的方法，包括在培養(yǎng)基中混合C5/C6水解微生物(例如，植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌)和木質(zhì)纖維素材料(和/或其他生物質(zhì)材料)，并在足以產(chǎn)生燃料例如乙醇、丙醇和/或氫或另一種化合物的條件和時(shí)間下發(fā)酵木質(zhì)纖維素材料。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用酸水解預(yù)處理從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇和氫的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用酶水解預(yù)處理從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇和氫的方法。其他實(shí)施方案提供了使用未經(jīng)酶預(yù)處理的生物質(zhì)從生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇和氫的方法。其他實(shí)施方案公開(kāi)了使用已經(jīng)化學(xué)或酶預(yù)處理但任選蒸汽處理的生物質(zhì)從生物質(zhì)產(chǎn)生乙醇和氫的方法。 圖10公開(kāi)了產(chǎn)生己糖或戊糖或寡聚體的預(yù)處理，其然后不經(jīng)處理或進(jìn)一步處理并單獨(dú)或一起發(fā)酵。圖IOA描繪了產(chǎn)生固相和液相的方法(例如酸預(yù)處理)，其然后被單獨(dú)發(fā)酵。圖IOB描繪了產(chǎn)生固相和液相的類(lèi)似預(yù)處理。液相與固相分離，并且對(duì)于發(fā)酵微生物毒性的成分在發(fā)酵之前被去除。在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，兩相被重新組合并在一起共發(fā)酵。這是比單獨(dú)發(fā)酵每個(gè)相更有經(jīng)濟(jì)效益的方法。第三方法(圖IOC是成本最低的)。預(yù)處理產(chǎn)生液體或固體的漿體，其然后被共發(fā)酵。存在很少的糖分損失和最小的設(shè)備需求。
實(shí)施例實(shí)施例I :牛物質(zhì)加工和預(yù)處理稈序 玉米秸桿在切碎機(jī)中切碎至O. 25英寸大小，然后通過(guò)2mm濾網(wǎng)篩選。篩選的玉米秸桿與水混合以制備10% (w/v)漿體。玉米秸桿漿體的堿消化在高壓釜中121°C和15PSI下使用O. 2g NaOH每克玉米秸桿進(jìn)行2小時(shí)。消化的玉米秸桿用自來(lái)水(5-7體積)洗滌以中和pH。中和后，固體通過(guò)250微米濾網(wǎng)過(guò)濾回收并在35攝氏度干燥至濕量約5%。干燥的團(tuán)簇在添加至發(fā)酵罐之前被研磨。培養(yǎng)基的脫氣和滅菌程序:所有用于接種物繁殖的血清瓶在室溫下真空(約400mbar絕對(duì)壓力)脫氣約5分鐘，在氮?dú)獯祾呦抡婵掌扑椤＿M(jìn)行最少三個(gè)脫氣循環(huán)。血清瓶、培養(yǎng)基和發(fā)酵容器通過(guò)在121°C溫度和15PSI壓力下高壓滅菌來(lái)滅菌。發(fā)酵罐在接種之前用氮?dú)獯祾逫小時(shí)以降低氧化還原電勢(shì)至大約_300mV。接種物繁殖植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的冷凍培養(yǎng)物將在含有O. 3%纖維素二糖和在去離子水中的 I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HP04、4. 6g/L 硫酸銨、2g/L 半胱氨酸-HC1、lg/L MgCl2 6H20、
0.15g/L CaCl2 2Η20、0· 00125g/L FeSO4 7H20 的 IOmL 管中 35°C下繁殖 48 小時(shí)。用 2N NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7. 5。在測(cè)試管中繁殖后，接種物將在IOOmL血清瓶中35°C生長(zhǎng)24小時(shí)，使用2% (v/v)種子量。血清瓶具有在去離子水中的20g/L麥芽糖漿、I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HP04、4. 6g/L 硫酸銨、2g/L 半胱氨酸-HCl、3g/L 檸檬酸鈉、lg/L MgCl2 6Η20、0· 15g/LCaCl2 2Η20、0· 00125g/L FeSO4 7Η20。生物質(zhì)的同時(shí)水解和發(fā)酵:5L攪拌的罐反應(yīng)器以補(bǔ)料分批模式以2L起始體積運(yùn)行。培養(yǎng)基含有50g/L預(yù)處理的玉米秸桿以及溶解于去離子水的3g/L K2HPO4U. 6g/L KH2PO4、2g/L檸檬酸鈉· 2H20、
1.2g/L 檸檬酸 Η20、0· 5g/L (NH4)2SO4'lg/L NaCl、0· 8g/L MgCl2 · 6Η20、0· lg/L CaCl2 · 2H20、0. 00125g/L FeSO4 WH2OUg/!半胱氨酸 HCl、10g/L 酵母提取物(Bacto)以及 5g/L 玉米漿粉。在一些情況下，50mL CelluSeb-TL在接種之前通過(guò)O. 2微米濾器添加至發(fā)酵罐以增強(qiáng)水解并增加產(chǎn)率。然后發(fā)酵罐用氮?dú)獯祾逫小時(shí)以降低氧化還原電勢(shì)至大約_300mV，隨后接種20ml濃縮接種物。運(yùn)行pH和溫度分別是6. 5和35 °C，并且發(fā)酵罐以300rpm連續(xù)攪拌。25-50g預(yù)處理的玉米秸桿的團(tuán)塊以規(guī)律的時(shí)間間隔提供。7. 5和25mL酶的額外劑在接種后72小時(shí)和240小時(shí)提供。樣品收集和分析:
樣品以時(shí)間間隔收集并使用裝配有Aminex HPX-87H Exclusion柱(300mmx7. 8mm)和RI檢測(cè)器的HPLC分析糖、有機(jī)酸和乙醇。O. OlN H2SO4用作流動(dòng)相，O. 6mL/分鐘，并且柱保持在55 °C。益果發(fā)酵開(kāi)始于添加50g/L固體。額外批量補(bǔ)料25g/L預(yù)處理的玉米秸桿固體在第3天和第4天進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)初始乙醇生產(chǎn)率是約10g/L-d，這在不進(jìn)一步添加玉米秸桿的情況下在第4天至第8天下降至約2g/L-d。從第9天開(kāi)始，固體批量補(bǔ)料量減至12. 5g/L,并每24小時(shí)提供，如圖I所示。這幫助提高乙醇生產(chǎn)率至高于3g/L-d。乙醇是主要的發(fā)酵產(chǎn)物。預(yù)處理玉米秸桿的組成分析使用酸分析進(jìn)行。組成分析結(jié)果顯不甸聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖和不溶物的百分比分別是64*%、26 *%、3和6(圖2)?；谠摻M成，在預(yù)處理玉米秸桿中可發(fā)酵的量是約93%。假設(shè)糖化效率是90%，觀察的乙醇產(chǎn)率被計(jì)算為每克加載的生物質(zhì)O. 39g。
實(shí)施例2從己糖和戊糖生產(chǎn)乙醇通過(guò)使用植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌在攪拌的罐反應(yīng)器中同時(shí)發(fā)酵己糖(葡萄糖、纖維素二糖)和戊糖(木糖和阿拉伯糖)來(lái)進(jìn)行分批發(fā)酵以生產(chǎn)乙醇。使用的化學(xué)品:該實(shí)驗(yàn)中使用的所有化學(xué)品是試劑級(jí)，來(lái)自Sigma-Aldrich。脫氣和滅菌程序所有用于接種物繁殖的反應(yīng)器和血清瓶在室溫下真空(約400mbar絕對(duì)壓力)脫氣約5分鐘，在氮?dú)獯祾呦抡婵掌扑?。進(jìn)行最少三個(gè)脫氣循環(huán)。容器通過(guò)在121°C溫度和15PSI壓力下高壓滅菌來(lái)滅菌。接種物繁殖植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的冷凍培養(yǎng)物將在含有O. 3%纖維素二糖和在去離子水中的 I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HP04、4. 6g/L 硫酸銨、2g/L 半胱氨酸-HC1、lg/L MgCl2 6H20、0. 15g/L CaCl2 2Η20、0· 00125g/L FeSO4 7H20 的 IOmL 管中 35°C下繁殖 48 小時(shí)。用 2N NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7. 5。在高壓滅菌后，接種物在IOOmL血清中35°C生長(zhǎng)24小時(shí)，使用2%(v/v)種子量。血清瓶含有在去離子水中的20g/L麥芽糖漿、I. 5g/L KH2PO4,2. 9g/L K2HPO4,
4.6g/L硫酸銨、2g/L半胱氨酸-HCl、3g/L檸檬酸鈉、lg/L MgCl2 6H20、0. 15g/L CaCl2 2H20、0. 00125g/L FeSO4 7H20。擴(kuò)增的接種物被檢查純度并在3000rpm離心15分鐘以產(chǎn)生IOmL濃縮的生物質(zhì)(2-4g/L總懸浮固體)以用作每個(gè)發(fā)酵罐的接種物。B糖和戊糖的同時(shí)發(fā)酵:400mL工作體積的兩個(gè)攪拌罐反應(yīng)器以分批模式運(yùn)行。在生物反應(yīng)器BRl中，30g/L纖維素二糖和30g/L木糖用作碳源，以及溶于去離子水的3g/L K2HPO4U. 6g/L KH2PO4,2g/L 檸檬酸鈉· 2Η20、1· 2g/L 檸檬酸 Η20、0· 5g/L(NH4)2SO4、lg/L NaCl,0. 8g/L MgCl2 · 6H20、0. lg/L CaCl2 · 2H20、0. 00125g/L FeSO4 · 7H20、lg/L 半胱氨酸 HClUOg/L 酵母提取物(Bacto)以及5g/L玉米漿粉。第二反應(yīng)器BR2含有作為碳源的30g/L的葡萄糖和30g/L的木糖，以及與BRl相同的營(yíng)養(yǎng)素。每個(gè)發(fā)酵罐接種IOml接種物。發(fā)酵罐在35°C和pH 6.5下運(yùn)行，并300rpm連續(xù)攪拌。樣品以不同的時(shí)間間隔收集并使用裝配有Aminex HPX-87H Exclusion柱(300mmx7. 8mm)和RI檢測(cè)器的HPLC分析糖、有機(jī)酸和乙醇。O. 005N H2SO4用作流動(dòng)相，O. 6mL/分鐘，并且柱保持在55 °C。顯示于表I和圖3A和3B的結(jié)果描繪了在發(fā)酵過(guò)程中己糖和戊糖底物的充分利用和這些底物轉(zhuǎn)化為乙醇。結(jié)果還表明，戊糖(例如木糖)至少與己糖(例如纖維素二糖或葡萄糖)一樣快速且完全地轉(zhuǎn)化為乙醇。表I.糖和乙醇的濃度

權(quán)利要求
1.一種通過(guò)用第一微生物發(fā)酵包含己糖和戍糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來(lái)制備一種或多種發(fā)酵終產(chǎn)物的方法，其中所述第一微生物同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述發(fā)酵終產(chǎn)物的至少一種是乙醇，并且其中乙醇以至少約45g/L的滴度被制備。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法還包括使用第二微生物發(fā)酵己糖和戊糖。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第二微生物是釀酒酵母、熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌、噬纖維梭狀芽胞桿菌或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
7.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述己糖包括選自由纖維素、半纖維素、淀粉、甘露聚糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成的組的碳水化合物。
8.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述戊糖包括選自由木聚糖、半纖維素、木糖和阿拉伯糖組成的組的碳水化合物。
9.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌是非重組或重組微生物。
10.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。
11.權(quán)利要求I所述的方法，還包括在所述第一微生物生長(zhǎng)過(guò)程中向培養(yǎng)基添加一種或多種包括己糖或戊糖的培養(yǎng)基補(bǔ)充物。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述己糖或戊糖相對(duì)于被所述第一微生物轉(zhuǎn)化為其他化合物的糖量來(lái)添加。
13.權(quán)利要求I所述的方法，還包括預(yù)處理所述生物質(zhì)。
14.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述預(yù)處理包括蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件。
15.權(quán)利要求I所述的方法，還包括添加發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充物是脂肪酸、表面活性劑、螯合劑、微生物、礦物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、酵母提取物和鹽。
16.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述第一微生物同時(shí)發(fā)酵所述己糖和戊糖。
17.權(quán)利要求I所述的方法，還包括添加一種或多種酶，其中所述一種或多種酶不是衍生自第一微生物。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述一種或多種酶是纖維素酶、半纖維素酶、半乳糖醛酸酶、果膠酸裂合酶、糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、和內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶、淀粉酶、肌醇六磷酸酶或漆酶。
19.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述己糖和戊糖包括麥芽糖漿、玉米浸潰液體、蒸餾干燥顆?；蛴衩捉⒐腆w。
20.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述方法還包括批量添加生物質(zhì)固體的生物質(zhì)補(bǔ)料分批發(fā)酵。
21.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述生物質(zhì)固體使用濾網(wǎng)回收。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述濾網(wǎng)包括多個(gè)直徑約150-250微米的孔。
23.一種通過(guò)在包含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株而制備的生物燃料產(chǎn)物；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。
24.一種制備乙醇的方法，所述方法包括以下步驟 a)在包含木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌菌株；其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)；和 b)以大于約45g/L的產(chǎn)率制備乙醇。
25.權(quán)利要求24所述的方法，還包括在所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌的生長(zhǎng)過(guò)程中向培養(yǎng)基添加一種或多種培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述培養(yǎng)基補(bǔ)充物的一種或多種包含一種或多種己糖和/或戊糖化合物，并且一種或多種糖化合物相對(duì)于被所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌轉(zhuǎn)化為其他化合物的糖量來(lái)添加。
26.—種用于制備發(fā)酵終產(chǎn)物的系統(tǒng),包括 a)發(fā)酵容器； b)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)；和 c)同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的第一微生物；其中所述發(fā)酵容器適于提供適合同時(shí)水解和發(fā)酵所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的條件。
27.權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，還包括包含己糖和戊糖的培養(yǎng)基補(bǔ)充物。
28.權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述第一微生物是梭狀芽胞桿菌屬菌株。
29.權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述梭狀芽胞桿菌屬菌株是植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌。
30.權(quán)利要求29所述的系統(tǒng)，其中所述植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌包括一種或多種異源多核苷酸。
31.權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述生物質(zhì)在與所述第一微生物接觸之前通過(guò)蒸汽爆發(fā)或熱水浸提、暴露于酸或堿條件來(lái)預(yù)處理。
32.權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其中經(jīng)預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)一步用非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶處理。
33.權(quán)利要求27所述的系統(tǒng)，其中所述己糖和戊糖包括玉米浸潰固體、玉米浸潰液體、麥芽糖漿、木聚糖、纖維素、半纖維素、果糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖或木糖的一種或多種。
34.權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括非衍生自所述第一微生物的一種或多種酶。
35.權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包括選自由脂肪酸、表面活性劑、螯合劑、維生素、礦物質(zhì)、PH調(diào)節(jié)劑、酵母提取物和鹽組成的組的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)充物。
36.權(quán)利要求26所述的系統(tǒng)，還包括第二微生物。
37.權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述第二微生物是釀酒酵母、熱梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭狀芽胞桿菌、噬纖維梭狀芽胞桿菌或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
全文摘要
一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌同時(shí)水解和發(fā)酵而從生物質(zhì)制備有用的發(fā)酵終產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)展有效預(yù)處理和高轉(zhuǎn)化效率(產(chǎn)率)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)為終產(chǎn)物的方法。另一方面，本文公開(kāi)了通過(guò)用微生物例如植物發(fā)酵梭狀芽胞桿菌發(fā)酵己糖(C6)和戊糖(C5)而產(chǎn)生發(fā)酵終產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C12P7/10GK102985550SQ201080017643
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者S·帕瑞克, W·G·拉圖夫 申請(qǐng)人:奎特羅斯公司