專利名稱：控制乙醇發(fā)酵方法中的微生物污染的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗微生物組合物和一種在乙醇發(fā)酵方法中，特別是在用甘蔗生產(chǎn)乙醇的過程中控制微生物污染的方法。
背景技術：
盡管在過去幾年中人們對發(fā)酵方法進行了改進，但對于污染控制仍然沒有取得令人滿意的效果，因為對進行壓榨和加工成果汁的待發(fā)酵的原材料的污染水平的控制的難度和高成本。如今，甘蔗加工在乙醇生產(chǎn)壓榨機中的特性典型地導致細菌小型生物群的出現(xiàn)， 其通常在發(fā)酵果汁中超過IO4細胞/ml。此外，同樣的果汁，果汁是一個有利于細菌生長的培養(yǎng)基，除了有發(fā)酵酵母釀酒酵母菌，還攜帶著許多種的細菌污染物，如乳桿菌和野生酵母。污染物的存在可能導致發(fā)酵生產(chǎn)率的降低和其他操作問題。例如，野生酵母會與發(fā)酵酵母競爭，其從待發(fā)酵的果汁中吸收糖但不會將它轉(zhuǎn)化成乙醇。此外，發(fā)酵果汁中存在的細菌、乳桿菌和野生酵母容易引起這些生物體在發(fā)酵酵母的周圍團聚，從而產(chǎn)生絮凝并削弱發(fā)酵酵母的生產(chǎn)能力。應當進一步觀察到，隨著在發(fā)酵果汁中細菌和乳桿菌密度的增加，有機酸的濃度往往變得過高。高的有機酸濃度抑制發(fā)酵酵母的增殖，其可以使工業(yè)加工廠的生產(chǎn)率降低約10-20%。在污染更嚴重的情況下，可以觀察到乙醇生產(chǎn)率更大的減少。迄今為止，抗生劑已被廣泛用于控制發(fā)酵果汁的污染。然而，抗生劑的效力通常限于某一類細菌。例如，雖然目前可用的抗生劑能夠理想的特異性作用于革蘭氏陽性菌和乳桿菌，但它們對野生酵母的作用則減弱了。因此，使用抗生劑并不能消除由于發(fā)酵果汁中存在野生酵母而導致的生產(chǎn)率損失，因為野生酵母與發(fā)酵酵母競爭待發(fā)酵的果汁中所含的糖。此外，抗生劑在發(fā)酵果汁中作用緩慢?？股鷦┑倪@種特點使得在抗生作用的初始階段野生酵母、細菌和乳桿菌能夠生長。相應地，通常需要高用量的抗生劑以控制發(fā)酵果汁中細菌和乳桿菌污染物的增長率。此外，隨著時間的推移，越來越多的細菌產(chǎn)生了抗生劑耐藥性，這可能還需要高用量的抗生劑以獲得可接受的生產(chǎn)率水平?？股鷦┩ǔＪ前嘿F的，抗生劑用量的增加可能會帶來不可接受程度的發(fā)酵成本。 而且，抗生劑的更高用量也可引起過敏和其他疾病，影響方法中該階段所涉及的操作者。此外，從消費者對由這些產(chǎn)品的發(fā)酵方法產(chǎn)生的副產(chǎn)物的日益增長的要求是能夠生態(tài)友好并對人類和環(huán)境沒有危害。這轉(zhuǎn)換為一個需求，即產(chǎn)品中的抗生劑的殘留量愈來愈少。作為使用抗生劑控制污染物的局限性和不便性的結果，人們已經(jīng)嘗試開發(fā)一種能夠使以上評述的缺陷最小化的試劑，上述缺陷中的一些是能夠有效地減少發(fā)酵方法中存在的細菌、乳桿菌和野生酵母的負面作用的同時，抗生劑高用量固有的。已知雙胍類化合物作為抗微生物劑用于抑制污染物微生物腫瘤病微生物在植物上的生長。Ecolab公司的巴西專利申請PI 0505795-7(對應于北美專利申請US60/640，595)披露了用于減少一系列對象，如柑橘類植物、水果、種子、鮮切花等上的腫瘤病微生物(例如，柑桔腫瘤病微生物)種群的組合物。根據(jù)其說明書，抗微生物組合物可包含金屬抗微生物劑，例如銀離子，和聚合物，例如聚(六甲雙胍)(PHMB)。該組合物具有抑菌和/或殺生物作用，且可通過施用一定量的該抗微生物組合物來幫助控制腫瘤生長并持續(xù)足夠長時間以減少小型生物群體。然而，在Ecolab公司的組合物中雙胍類化合物或聚六甲雙胍(PHMB)的作用是強制性地與另一種無機抗微生物劑相關，使其能有效地在“對象”中具有抗微生物功能，在形成組合物的組分的混合物中的某些量的所述試劑用于減少植物病原菌種群。雖然銀基無機化合物是現(xiàn)有技術中已知的，但它們在形成在乙醇發(fā)酵方法中控制微生物污染的組合物中的用途在經(jīng)濟上是不可行的，使得現(xiàn)有技術中缺少將其用于從乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基制得乙醇的啟示。聚六甲雙胍(PHMB)的另一種應用記載于ElsZetin，C.和Morais，M.A.，文章標題為“聚六甲雙胍類可以從燃料乙醇發(fā)酵方法中消除污染酵母菌”，發(fā)表于J. hd. Microbiol. Biotechnol.，(2008),35 :967_973。在這篇文章中，作者檢驗了聚(六甲雙胍)(PHMB)的殺真菌活性?；谠趯嶒炇遗囵B(yǎng)物和工業(yè)樣品中評估的PHMB對生長抑制和微生物殺滅的作用，作者提議使用200mg/l的PHMB來控制工業(yè)規(guī)模的主要的燃料乙醇污染物。根據(jù)這篇文章，在從工業(yè)生產(chǎn)過程中直接收集的釀酒酵母菌株(JPl和P2)和布魯塞爾德克氏酵母(D.bruxellensis)的野生酵母的細胞中對PHMB的殺真菌作用進行了檢測。雖然這些結果顯示，在第971頁的表2中，PHMB的存在使得布魯塞爾德克氏酵母降低至低于1 log(44% )，但結果也表明，在濃度高于20ppm時發(fā)酵酵母釀酒酵母PE2對PHMB非常敏感。因此，作者建議將PHMB與高發(fā)酵PHMB耐藥菌株組合使用。作者還建議在預發(fā)酵容器中單獨使用PHMB殺生物劑，其中使酵母的生物量通氣并用稀釋的甘蔗汁供養(yǎng)，當它們接觸到蔗糖和低量的乙醇時可以防止或減少PHMB對釀酒酵母菌細胞的任何負面效應。雖然證明了 PHMB在不同應用中作為殺生物劑的活性，但迄今所遇到的解決方案未考慮其中所建議的比例/濃度，就廣泛使用的抗生劑類物質(zhì)和聚(六甲雙胍)化合物二者而言，對發(fā)酵酵母釀酒酵母菌自身的致命效應。近日，國際專利申請WO 2009/001205A2披露了一種生產(chǎn)發(fā)酵型產(chǎn)品，尤其是乙醇的方法，包括在一種添加劑如胍類化合物如PHMB，單獨地或與其他有機殺生物劑如脂肪族和芳香族單醛和二醛等存在下用酵母發(fā)酵含糖培養(yǎng)基，以減少或控制含糖培養(yǎng)基中的細菌群落。雖然可用的現(xiàn)有技術對發(fā)酵培養(yǎng)基中的微生物的控制和副產(chǎn)物(干酵母)中的抗生劑殘留量的減少可以取得良好效果，然而現(xiàn)有的組合物或方法沒有一個可以取得在增加發(fā)酵培養(yǎng)基中的野生酵母、乳桿菌和其他細菌的清除率的同時增加釀酒酵母的保存率，以便在發(fā)酵過程中提供意想不到的生產(chǎn)率。已知方法中的另一個缺陷是由酸的使用帶來的，使用的酸用于處理壓榨機接收的混合汁液，并用于處理果汁負荷的發(fā)酵中剩余的酵母以清除在發(fā)酵過程后仍然存活的細菌，從而使酵母得以在新負荷的果汁的發(fā)酵中使用。酸的使用有一系列的缺點，如需要提供耐酸腐蝕的設備，與處理重復使用的酵母中剩余的大量細菌所需的更大量的酸相關的成本的增加，這種酸輸入的毒性，和需要從發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物(干酵母)中清除酸，特別是當用于生產(chǎn)動物的口糧時。已知的乙醇發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)方法在以經(jīng)濟上可行的方式，滿足所有新的當前的需求上無一獲得成功，這些需求與發(fā)酵方法的效率、用于該方法中抗生劑負荷的減少、副產(chǎn)物 (干酵母)中殘留的細菌和抗生劑的水平相關，并且也與減少用于處理酵母的酸(通常為硫酸)用量相關，由于在其中會發(fā)現(xiàn)殘留的細菌。發(fā)明_既述鑒于現(xiàn)有技術的局限性，本發(fā)明的目的是提供一種抗微生物組合物，其可應用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵桶中所含的果汁，用于控制發(fā)酵下的原料中存在的野生酵母、乳桿菌和細菌的污染，防止發(fā)酵酵母與所述污染微生物競爭培養(yǎng)基上可得到的營養(yǎng)物，并提高發(fā)酵方法的生產(chǎn)率和在發(fā)酵培養(yǎng)基中減少抗生劑的負荷。本發(fā)明的抗微生物組合物包含胍家族的抗微生物劑，例如聚六甲雙胍(PHMB)，抗生劑和表面活性劑，其用量足以充分控制待發(fā)酵果汁中所含的野生酵母、乳桿菌和細菌小型生物群；在所述果汁中產(chǎn)生反絮凝作用；并防止發(fā)酵酵母與污染物小型生物群競爭待發(fā)酵果汁中含有的糖。本發(fā)明進一步涉及一種在乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中控制微生物污染的方法，以便獲得發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇和/或其他產(chǎn)品，向待發(fā)酵果汁中加入足量的上述殺生物劑、抗生劑和表面活性劑，并充分控制待發(fā)酵果汁中所含的野生酵母、乳桿菌和細菌小型生物群；在所述果汁中產(chǎn)生反絮凝作用；并防止發(fā)酵酵母與上述污染物競爭待發(fā)酵果汁中含有的糖。另一方面，目前已知的由發(fā)酵過程結束后收回并加工以重新加入至新的發(fā)酵中的干酵母負荷的事實帶來的處理呈現(xiàn)對抗生作用具有抗性的細菌負荷，需要使其失效，以便在新的發(fā)酵批次中不被重新引入。由于上述試劑的聯(lián)合作用，使用的沒有微生物污染的發(fā)酵酵母的性能得到改善， 且關于污染，該酵母中含有的細菌的數(shù)量將減少或不含細菌，從而減少用于處理干酵母中殘留細菌的酸(通常為硫酸)的必需量，其中酸是壓榨中的難題。發(fā)明詳述上述的總目的之一可通過提供抗微生物組合物來達到，該組合物含有從約1 % 至約5%重量的胍家族的抗微生物劑，例如聚六甲雙胍(PHMB)；從約0. 05%至約0. 5%重量的抗生劑；和從約98. 95%至約94. 5%重量的表面活性劑?？股鷦┩ǔ８鶕?jù)發(fā)酵果汁的特征和在所述果汁中發(fā)現(xiàn)的污染微生物污染物的小生物群，以及原料加入發(fā)酵桶前的環(huán)境來進行選擇?？紤]到甘蔗果汁(“garapa”)的發(fā)酵，形成本發(fā)明的抗微生物組合物所用的抗生劑可以是一種離子載體，選自維吉霉素、青霉素、青霉素V、克林霉素、丙氨酸、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素和優(yōu)選地莫能菌素，如已知的來自Elanco公司的商品名為Kamoran的抗生素，以組合物的重量百分比計，如上文所述。本申請組合物中使用的殺生物劑，以上文定義的百分比計，是一種胍家族的抗微生物劑，聚六甲雙胍(PHMB)，其殺生物/殺菌功能是現(xiàn)有技術中已知的。本申請使用的PHMB 是商業(yè)上已知的“Vantocil IB”，由本申請的申請人制造。為了更加提高的發(fā)酵方法的效率，抗微生物組合物包含合適的非離子型表面活性劑，包括烷氧基化醇類，優(yōu)選乙氧基化醇類。
特別地，適當?shù)姆请x子型表面活性劑活性化合物可以大致描述為通過天然(天然存在)的親水性環(huán)氧烷烴與有機疏水性化合物的縮合產(chǎn)生的化合物，其中有機疏水性化合物可以是天然(天然存在)的脂肪族或烷基芳族化合物。與任何特殊的疏水基縮合的親水的或聚氧化亞烷基的長度可以很容易地調(diào)節(jié)，以產(chǎn)生符合預期的親水性和疏水性成分之間的平衡程度的水溶性化合物。優(yōu)選的烷氧基化醇類選自下列通式的乙氧基化醇類 R-(OCH2CH2)-N-OH,其中R是直鏈或支鏈的，C8-C18是烷基或羥烷基且N平均為1_14。在本發(fā)明中使用的合適的醇類包括，例如，椰子油脂肪醇和/或聚乙二醇醚，優(yōu)選Clariant公司生產(chǎn)的商業(yè)名稱為“Genapol”的產(chǎn)品，也可使用陽離子表面活性劑，兩性表面活性劑和其他非離子型表面活性劑。應當理解，不同類型的表面活性劑可用于增加活性殺生物劑的分散度、果汁中發(fā)酵酵母的抗絮凝程度和所述酵母與糖的接觸面積。使用上文定義的濃度的抗生劑和PHMB使得PHMB對發(fā)酵酵母菌無害，但對發(fā)酵果汁中含有的野生酵母和污染細菌(乳桿菌屬和AcrcAacter屬)有效，施用所述組合物后能夠立即控制污染物。作為控制手段的抗微生物組合物中的PHMB，以適當?shù)挠邢逎舛?，以避免其對發(fā)酵酵母的有害作用，使得該殺生物劑對該野生酵母且甚至對大量的對其殺菌作用敏感的污染細菌快速地起作用，防止所述污染物與生產(chǎn)性酵母競爭發(fā)酵果汁中的營養(yǎng)物(糖類)。這種PHMB對野生酵母和對污染細菌的作用的一個重要方面基于以下事實這種作用是在施用該組合物后即刻的，即，不到五分鐘，PHMB就發(fā)揮其殺生物/殺菌作用，引起野生酵母的減少并控制對其作用敏感的細菌，且防止所述污染物的增殖和減少其對發(fā)酵酵母的團聚作用。由于PHMB對污染微生物的即刻作用，野生酵母菌和污染細菌的作用和增殖被中斷，與PHMB的作用相比，要通過抗生劑的特異性作用減少細菌數(shù)量表現(xiàn)出相當慢的作用， 其從約3至5小時。因此，將要攜帶到發(fā)酵方法中抗生劑的負荷可實質(zhì)性地減少至與殘留在發(fā)酵果汁中的細菌小型生物群一致的值。此外，根據(jù)抗微生物劑和抗生劑對待發(fā)酵果汁中含有的污染物小型生物群的作用，應當注意到，該組合物中的表面活性劑的存在使獲得了在待發(fā)酵果汁中的解團聚作用， 提供不僅發(fā)酵酵母的顆粒而且污染物小型生物群的顆粒的分離。這種解團聚增加發(fā)酵酵母與果汁(糖)之間的接觸表面積，還增加污染物與抗微生物劑和抗生劑之間的接觸表面積， 使試劑對污染物小型生物群作用增加，也使酵母的發(fā)酵效率更好，增加了發(fā)酵方法的生產(chǎn)率。本申請抗微生物組合物可能的配方包括從約到約5%重量的胍家族的抗微生物劑，聚六甲雙胍(PHMB)；從約0.05%到約0.5%重量的抗生劑；和從約98. 95%至約94. 5%重量的表面活性劑，考慮到所述組合物的建議劑量是在約為發(fā)酵果汁的負荷的 0. 052%重量或 520ppm。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種在乙醇發(fā)酵方法中，特別是在源自甘蔗發(fā)酵的乙醇和/或其他產(chǎn)品的生產(chǎn)中控制微生物污染的方法。該方法包括向發(fā)酵果汁加入以占發(fā)酵果汁負載的重量計下列量的試劑的步驟約5ppm至約^ppm的胍家族抗微生物劑，例如聚(六甲雙胍)(PHMB)；約0. 26ppm至約2. 6ppm的抗生劑，如先前對抗微生物組合物的配方所定義，且進一步地，約491ppm至約514ppm的表面活性劑，選自先前定義的與抗微生物組合物有關的組。除了抗生劑負荷的明顯減少帶來的巨大經(jīng)濟和環(huán)境效益，本控制組合物中的PHMB 的提供從發(fā)酵過程的開始就減少發(fā)酵酵母中野生酵母和細菌小型生物群的團聚，削弱了酵母與果汁中的營養(yǎng)物質(zhì)(糖)的接觸和發(fā)酵方法的生產(chǎn)率。此外，由于本申請組合物的表面活性劑與PHMB和抗生劑的聯(lián)合作用，避免了在發(fā)酵果汁中的絮凝，使發(fā)酵酵母與果汁中含有的營養(yǎng)物質(zhì)(糖)高度接觸，提高了發(fā)酵方法的效率。由于上述描述的本發(fā)明組合物，發(fā)酵酵母的性能得到改善。此外，干酵母中的細菌數(shù)量將減少或不含細菌，從而減少了在處理干酵母中的硫酸用量。以上描述的在乙醇發(fā)酵過程中控制微生物污染的三種組分的使用可通過本申請抗微生物組合物進行，或是粉末、凝膠、膏，液體、丸劑或片劑的形式，或者也可以將該組分單獨地添加至發(fā)酵果汁中。下表顯示在本乙醇發(fā)酵方法中的組合物的性能，與發(fā)酵果汁中的發(fā)酵酵母、野生酵母、乳桿菌和細菌的減少的結果有關。表 權利要求
1.一種用于控制乙醇發(fā)酵方法中微生物污染的抗微生物組合物，其特征在于該組合物包含胍系列的抗微生物劑；抗生劑；和表面活性劑，其用量足以充分控制待發(fā)酵果汁中含有的野生酵母、乳桿菌和細菌小型生物群這些污染物；從而在所述果汁中產(chǎn)生抗絮凝效應； 并保護與污染物競爭待發(fā)酵果汁中含有的糖的發(fā)酵酵母。
2.權利要求1所述的組合物，其特征在于所述組合物包含按重量約至約5%的胍家族的抗微生物劑；按重量從約0. 05%至約0. 5%的抗生劑；和按重量從約94. 5%至約 98. 95%的表面活性劑。
3.權利要求1或2任一項所述的組合物，其特征在于所述的胍家族的抗微生物劑是聚 (六甲雙胍)(PHMB)。
4.權利要求1、2或3任一項所述的組合物，其特征在于所述抗生劑是離子載體，選自 維吉霉素、青霉素、青霉素V、克林霉素、丙氨酸、β -內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類且優(yōu)選地莫能菌
5.權利要求1-4任一項所述的組合物，其特征在于所述表面活性劑為非離子表面活性劑，包括烷氧基化醇類，優(yōu)選下列通式的乙氧基化醇類=R-(OCH2CH2)-N-OH,其中R是直鏈或支鏈的，C8-C18是烷基或羥烷基且N平均為1-14。
6.權利要求1-5任一項所述的組合物，其特征在于所述表面活性劑選自椰子油脂肪醇、聚乙二醇醚、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑和其他類型的非離子表面活性劑。
7.權利要求1所述的組合物，其特征在于其以用于添加至待發(fā)酵的果汁中的粉末、丸劑、片劑或液體的形式存在。
8.—種控制乙醇發(fā)酵方法中微生物污染的方法，其特征在于，該方法包括向待發(fā)酵的果汁中加入胍家族的抗微生物劑、抗生劑和表面活性劑的步驟，其用量足以充分控制待發(fā)酵果汁中含有的野生酵母、乳桿菌和細菌小型生物群這些污染物，從而在所述果汁中產(chǎn)生抗絮凝效應，并防止該發(fā)酵酵母與污染物競爭待發(fā)酵的果汁中含有的糖。
9.權利要求8所述的方法，其特征在于，向發(fā)酵果汁中添加抗微生物劑、抗生劑和表面活性劑的步驟包括向所述果汁添加下列物質(zhì)約5ppm至約^ppm的胍家族的抗微生物劑； 約0. 26ppm至約2. 6ppm的抗生劑；和約491ppm至約514ppm的表面活性劑，以發(fā)酵下的果汁負荷的重量計。
10.權利要求8或9任一項所述的方法，其特征在于胍家族的抗微生物劑是聚(六甲雙胍)(Pm )。
11.權利要求8、9或10任一項所述的方法，其特征在于抗生劑是離子載體，選自維吉霉素、青霉素、青霉素V、克林霉素、丙氨酸、β -內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類且優(yōu)選地莫能菌素。
12.權利要求8-11任一項所述的方法，其特征在于所述表面活性劑為非離子表面活性劑，包括烷氧基化醇類，優(yōu)選下列通式的乙氧基化醇類=R-(OCH2CH2)-N-OH,其中R是直鏈或支鏈的，C8-C18是烷基或羥烷基且N平均為1-14。
13.權利要求8-12任一項所述的方法，其特征在于所述表面活性劑選自椰子油脂肪醇、聚乙二醇醚、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑和其他類型的非離子表面活性劑。
14.權利要求8所述的方法，其特征在于所述殺生物劑、抗生劑和表面活性劑以用于添加至待發(fā)酵的果汁中的粉末、丸劑、片劑或液體的形式存在。
全文摘要
在用于獲得乙醇方法中的糖發(fā)酵過程中，微生物污染的控制是一個非常重要的行為，其可以增加乙醇發(fā)酵方法的生產(chǎn)率。釀酒酵母的酵母細胞與細菌(乳桿菌和醋桿菌)和野生酵母對甘蔗汁進行著非常激烈的營養(yǎng)競爭。本發(fā)明建議的組合物使用胍家族的抗微生物劑，例如，聚(六甲雙胍)，抗生劑，以及表面活性劑，以預防不希望的微生物生長。本發(fā)明還涉及通過使用所述藥劑控制微生物污染的方法。
文檔編號C12P7/06GK102317462SQ201080007745
公開日2012年1月11日 申請日期2010年2月11日 優(yōu)先權日2009年2月12日
發(fā)明者M·D·S·弗蘭津, M·R·普里奧利 申請人:阿奇化工公司