專利名稱：整合缺陷型慢病毒在制備鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)的介導(dǎo)劑中的應(yīng)用及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組領(lǐng)域，特別涉及缺陷型慢病毒在介導(dǎo)鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因組靶向修飾是近年來生命科學(xué)研究的熱點之一，特別是在遺傳修飾疾病動物模型制備等方面，基因組靶向修飾具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的動物基因組靶向修飾方法為DNA同源重組法，其不僅效率低，而且不適宜于除小鼠以外的其它哺乳類模式動物種屬，從而限制這些技術(shù)的應(yīng)用。鋅指核酸酶(ZFN)的出現(xiàn)，給基因組靶向修飾技術(shù)帶來了希望。鋅指核酸酶能識別特異的DNA序列，并在此特異位點產(chǎn)生一個DNA雙鏈切口，而后細(xì)胞固有的
DNA修復(fù)機制通過同源重組或非同源末端連接將切口修復(fù)，從而達(dá)到DNA靶向修飾的目的。鋅指核酸酶技術(shù)不僅將基因組靶向修飾的效率提高了3 5個數(shù)量級，而且具有極高的特異性。利用ZFN對動物基因組靶向修飾，能夠縮短動物良新品種的培育時間。但利用 ZFN創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因或基因敲出動物新品種，要求ZFN在動物早期胚胎暫時性表達(dá)的時間較長。 現(xiàn)有技術(shù)中，ZFN于動物早期胚胎表達(dá)的技術(shù)通常為向動物胚胎胞質(zhì)或胞核注射編碼ZFN 的mRNA，或向動物胚胎原核注射編碼ZFN的質(zhì)粒DNA。但由于mRNA極易降解，只能實現(xiàn)ZFN 于動物早期胚胎短暫表達(dá)，不利于ZFN活性充分發(fā)揮進(jìn)而對動物早期胚胎基因組進(jìn)行高效的位點特異性遺傳修飾。雖然向早期胚胎細(xì)胞原核導(dǎo)入質(zhì)粒DNA可實現(xiàn)ZFN較長時間的暫時性表達(dá)，但該方法要求動物胚胎原核清晰，不適合除小鼠以外的其它哺乳類動物種屬。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供整合缺陷型慢病毒的新應(yīng)用，該應(yīng)用可以延長 ZEN動物早期胚胎的表達(dá)時間，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
整合缺陷型慢病毒在制備鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)的介導(dǎo)劑中的應(yīng)用及方法。上述應(yīng)用中，首建構(gòu)建表達(dá)鋅指核酸酶的重組慢病毒載體；之后利用整合酶功能缺失的包裝質(zhì)粒包裝表達(dá)鋅指核酸酶的重組慢病毒載體，獲得表達(dá)鋅指核酸酶的整合缺陷型重組慢病毒；通過卵周隙顯微注射或共孵育等方式利用整合缺陷型慢病毒感染感染動物早期胚胎，實現(xiàn)鋅指核酸酶于動物早期胚胎的表達(dá)。本發(fā)明的另一目的在于提供延長鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)的方法，方法能顯著延長ZEN于動物早期胚胎的表達(dá)時間。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
延長鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)的方法，將缺陷型慢病毒用卵周隙顯微注射感染動物早期胚胎，所述缺陷型慢病毒為表達(dá)鋅指核酸酶的整合缺陷慢病毒表達(dá)載體。本發(fā)明的有益效果在于1、與向胚胎胞質(zhì)或胞核注射mRNA相比，本發(fā)明顯著延長ZFN 于動物早期胚胎的表達(dá)時間。體外檢測表明，mRNA注射法表達(dá)時間為3 4天，本發(fā)明表達(dá)時間在7天以上。2、與向動物早期胚胎原核導(dǎo)入質(zhì)粒DNA的方法相比，本發(fā)明可適用于除小鼠以外的其它種屬哺乳動物，如大鼠、豬、羊、牛等。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例1整合缺陷型慢病毒在介導(dǎo)鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)的應(yīng)用及方法
1、通過DNA重組將編碼ZFN的基因序列亞克隆至慢病毒載體，獲得表達(dá)ZFN的重組慢病毒載體。(1)利用BamHI和EcoRI內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pST1374(左向鋅指核酸酶)或ρ⑶NA3. 1 (右向鋅指核酸酶)，切下包含有鋅指核酸酶開放閱讀框(ORF)的DNA片段；
(2)通過凝膠電泳使鋅指核酸酶編碼區(qū)DNA片段和質(zhì)粒DNA片段分離，通過凝膠純化回收鋅指核酸酶編碼區(qū)片段(操作見所用的商業(yè)化試劑盒說明書)；
(3)利用相同的核酸內(nèi)切酶雙酶切慢病毒載體FUW，并通過凝膠電泳按照步驟(2)回收、純化酶切后線性化的慢病毒載體；
(4)將純化的鋅指核酸酶編碼區(qū)片段和酶切后線性化的慢病毒載體，按照分子數(shù)量之比3 :1的比例混合，利用Τ4 DNA連接酶連接；
(5)將步驟(4)的連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌DH5α，通過篩選培養(yǎng)獲得抗性克隆，即為含有表達(dá)鋅指核酸酶的重組慢病毒載體的轉(zhuǎn)化細(xì)菌。2、利用質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取ZFN慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒、表達(dá)包膜蛋白VSV-G 的包裝質(zhì)粒和表達(dá)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和缺陷型整合酶的包裝質(zhì)粒，濃度為400μ g/mL。3、在10個10 cm無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿接種3 XlO6細(xì)胞，并培養(yǎng)至 70%匯合。4、將6yg表達(dá)包膜蛋白的包裝質(zhì)粒、15 μ g表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白和整合酶的包裝質(zhì)粒和20 μ g表達(dá)ZFN的重組慢病毒載體質(zhì)粒混勻于無菌去離子水中至終體積1095 μ L，加入 155 μ L 2 mol/L CaC12，然后滴加1250yL 2XHBS,邊滴加邊混勻，滴加完畢后靜置2分鐘，待沉淀形成后滴加到培養(yǎng)四3 1的10 cm培養(yǎng)皿中。5、培養(yǎng)1 后，吸去上清，加入10 mL新鮮的含10%小牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。6、收集上清，將每個平板中的細(xì)胞上清匯集在滅菌的50mL尖底離心管中，1000轉(zhuǎn) /分鐘離心10分鐘，取上清以0.45μπι濾器過濾至新的滅菌的50mL離心管中。7、20000 Xg離心6小時(或70000 Xg離心2小時)。8、棄去上清，確定沉淀所在位置，用200 μ L HBSS重懸沉淀，之后將重懸液置于 ImL 20%蔗糖的HBSS溶液上，50000 X g梯度離心2小時，棄去上清。用適量HBSS (40 μ L) 充分重懸后，分裝成小管置于-80°C冰箱備用。
9、利用針對病毒蛋白PM的ELISA檢測試劑盒測定病毒滴度。采用方陣滴定法，具體步驟如下(1)將病毒蛋白PM用包被液倍比稀釋(1:20、 1 40、1 80、1 160、1 320、1 640)，包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，置4°C濕盒孵育過夜，洗板機洗滌3次，5min/次，拍干；(2)加入100 μ L/孔封閉液，37°C濕盒封閉lh，洗板機洗滌1次， 5min/次，拍干；(3)加入待測樣品，100 μ L/孔，37°C濕盒作用，洗板機洗滌3次，5min/次， 拍干；(4)將病毒蛋白P24 IgG倍比稀釋(1 20、1 40、1 80、1 160、1 320、1 640)，加入酶標(biāo)板中，100 μ L/L，37°C濕盒孵育Ih,洗板機洗滌3次，5min/次，拍干；(5)加入1 2000稀釋的抗體IgG-HRP，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)45min,洗板機洗滌3次，5min/次，拍干；(6)加入TMB 底物100 μ L/孔，25°C避光顯色201^11后，加入5(^17孔2mol/L硫酸終止反應(yīng)；(7)檢測 用酶標(biāo)儀測OD45tlnm值。同時以1%的BSA/PBS溶液作空白對照，測定病毒滴度。10、將病毒懸液滴度調(diào)整至lX109TU/mL以上，即可用于感染動物早期胚胎、實現(xiàn) ZFN于動物早期胚胎較長時間的暫時性表達(dá)。二、技術(shù)有效性檢測
以小鼠早期胚胎為實驗材料、以同時表達(dá)綠色熒光蛋白(eGFP)和ZFN的整合缺陷慢病毒表達(dá)載體(IDL-ZFN-IRES-GFP)為實驗載體，通過卵周隙顯微注射感染動物早期胚胎，測定IDL介導(dǎo)的ZFN表達(dá)于動物早期胚胎中的表達(dá)持續(xù)時間。由于ZFN與eGFP在同一載體中共轉(zhuǎn)錄與共表達(dá)，因此通過觀察胚胎中的熒光強度及持續(xù)時間即可反映ZFN的表達(dá)強度及持續(xù)時間。同時設(shè)立質(zhì)粒DNA原核注射組、mRNA胞質(zhì)注射組。結(jié)果表明本發(fā)明介導(dǎo)的ZFN在動物早期胚胎表達(dá)的持續(xù)時間顯著長于mRNA注射組(7.1 士2. 3d vs 3. 6士 1.7d，P<0. 01);與質(zhì)粒DNA原核注射組無顯著差異(7. 1 士2. 3d vs 7. 3士2. 7d, Ρ>0· 05)。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.整合缺陷型慢病毒在制備鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)的介導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
2.延長鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)的方法，其特征在于將整合缺陷型慢病毒用卵周隙顯微注射感染動物早期胚胎，所述整合缺陷缺陷型慢病毒為表達(dá)鋅指核酸酶的整合缺陷慢病毒表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組領(lǐng)域，特別涉及整合缺陷型慢病毒在制備鋅指核酸酶于動物早期胚胎表達(dá)中的介導(dǎo)劑中的應(yīng)用，本發(fā)明與向胚胎胞質(zhì)或胞核注射mRNA相比，本發(fā)明顯著延長ZFN于動物早期胚胎的表達(dá)時間；體外檢測表明，mRNA注射法表達(dá)時間為3～4天,本發(fā)明表達(dá)時間在7天以上；與向動物早期胚胎原核導(dǎo)入質(zhì)粒DNA的方法相比，本發(fā)明可適用于除小鼠以外的其它種屬哺乳動物，如大鼠、豬、羊、牛等。
文檔編號C12N5/10GK102559652SQ201010618188
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉勤, 劉宇, 劉昌峨, 周曉楊, 江雯, 王勇, 王露露, 郭科男, 魏泓 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)