專利名稱：用于鑒定短小乳桿菌的引物序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及用于鑒定短小乳桿菌的引物序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
短小乳桿菌(Lactobacillus brevis)是乳桿菌屬的重要菌種之一，其來(lái)源廣泛， 在泡菜、鮮奶、動(dòng)物腸道中均有發(fā)現(xiàn)。短小乳桿菌具有產(chǎn)Y氨基丁酸、共軛亞油酸、蘋果酸、 干擾素等多種功能產(chǎn)物的特性，在食品和醫(yī)藥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)分離 鑒定短小乳桿菌多采用的平皿培養(yǎng)法、生化試驗(yàn)、氣體生長(zhǎng)試驗(yàn)等傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法，上述方法 存在檢出周期長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低、準(zhǔn)確性差等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于鑒定短小乳桿菌的引物序列，該引物能夠特異性擴(kuò)增短小乳桿 菌16S rDNA的部分序列，擴(kuò)增特異性高，能夠準(zhǔn)確、快速鑒定短小乳桿菌。該引物用于鑒定 短小乳桿菌過(guò)程簡(jiǎn)單，鑒定方法穩(wěn)定、高效，不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且檢測(cè)成本低。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供了用于鑒定短小乳桿菌的引物序列，其特征在于正向引物具有序列 表中SEQ ID NO :1所述的堿基序列，反向引物具有序列表中SEQ IDNO :2所述的堿基序列。本發(fā)明的引物序列可用于鑒定短小乳桿菌，其鑒定過(guò)程如下(1)制備待測(cè)菌株 的模板DNA ；(2)使用權(quán)1所述的引物對(duì)步驟(1)制備的模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在200bp處產(chǎn)生特異性擴(kuò)增條帶的菌株， 則鑒定為短小乳桿菌。其中，制備待測(cè)菌株的模板DNA過(guò)程如下挑取短小乳桿菌的單菌落至50-100微 升的超純水中，置于沸水中水浴5-15分鐘，于-80°C凍存15-40分鐘，至沸水中水浴5_15分 鐘，4000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，取上清即得模板DNA。其中，PCR擴(kuò)增程序如下95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸 20s，進(jìn)行30次循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。本發(fā)明電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物采用的為2%的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色，最 后在凝膠成像儀中拍照。其中，本發(fā)明模板DNA提取中涉及的短小乳桿菌僅為實(shí)驗(yàn)材料，本發(fā)明不限定特 定短小乳桿菌菌株，可為現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外公開或可購(gòu)買的任何一株短小乳桿菌，也可為任意的 自行分離材料，本發(fā)明所用短小乳桿菌購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編 號(hào)為CICC6239，無(wú)論任何一株短小乳桿菌均不影響本發(fā)明的實(shí)施；實(shí)施例4電泳中用的干 酪乳桿菌，約氏乳桿菌，德氏乳桿菌，羅氏乳桿菌，植物乳桿菌，唾液乳桿菌，彎曲乳桿菌，瑞 士乳桿菌等菌株均為對(duì)照菌株實(shí)驗(yàn)材料，不須限定為某株菌株，可根據(jù)需要或可得到的實(shí)驗(yàn)材料選定，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施無(wú)影響。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的用于鑒定短小乳桿 菌的引物序列能夠特異性擴(kuò)增短小乳桿菌16S rDNA的部分序列，擴(kuò)增特異性高，能夠準(zhǔn)確、 快速鑒定短小乳桿菌。該引物用于鑒定短小乳桿菌過(guò)程快速簡(jiǎn)單，鑒定方法穩(wěn)定、高效，不 僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且檢測(cè)成本低(見表1)。本發(fā)明為短小乳桿菌種質(zhì)資源鑒定提供了 檢測(cè)方法，進(jìn)而為篩選短小乳桿菌的優(yōu)良菌株奠定了基礎(chǔ)。表1現(xiàn)有技術(shù)與本發(fā)明鑒定過(guò)程比較
鑒定時(shí)間鑒定成本現(xiàn)有技術(shù)方法一周左右約25元本發(fā)明方法約2小時(shí)約3元


圖1為本發(fā)明引物序列在16S rDNA基因上的位置圖譜；圖2為PCR特異性擴(kuò)增中各菌株擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。圖2中，M為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1短小乳桿菌，2干酪乳桿菌，3約氏乳桿菌，4德氏 乳桿菌，5羅氏乳桿菌，6植物乳桿菌，7唾液乳桿菌，8彎曲乳桿菌，9瑞士乳桿菌，CK水對(duì)照通過(guò)下列實(shí)施例將更具體的說(shuō)明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說(shuō)明本 發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1步驟1引物的設(shè)計(jì)與合成在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取短小乳桿菌及與其具有同源性的乳酸桿菌16SrDNA序 列，查找短小乳桿菌種內(nèi)保守而其余乳桿菌不保守的特異性區(qū)域，設(shè)計(jì)引物并對(duì)特異性序 列進(jìn)行篩選和優(yōu)化，最終得到了一對(duì)參數(shù)較優(yōu)的引物L(fēng)ABBF和LABBR，并合成上述二引物。上述引物的具體序列與序列表中對(duì)應(yīng)關(guān)系如下表2所示表權(quán)利要求
1.用于鑒定短小乳桿菌的引物序列，其特征在于正向引物具有序列表中SEQIDNO 1 所述的堿基序列，反向引物具有序列表中SEQ ID NO :2所述的堿基序列。
2.如權(quán)1所述的引物序列在鑒定短小乳桿菌中的應(yīng)用，其特征在于鑒定過(guò)程如下(1) 制備待測(cè)菌株的模板DNA;(2)使用權(quán)1所述的引物對(duì)步驟(1)制備的模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在200bp處產(chǎn)生特異性擴(kuò)增條帶的菌株，則鑒 定為短小乳桿菌。
3.如權(quán)2所述的引物序列在鑒定短小乳桿菌中的應(yīng)用，其特征在于制備待測(cè)菌株的 模板DNA過(guò)程如下挑取短小乳桿菌的單菌落至50-100微升的超純水中，置于沸水中水浴 5-15分鐘，于-80°C凍存15-40分鐘，至沸水中水浴5-15分鐘，4000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心 5-10分鐘，取上清即得模板DNA。
4.如權(quán)2所述的引物序列在鑒定短小乳桿菌中的應(yīng)用，其特征在于PCR擴(kuò)增程序如下 95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸20s，進(jìn)行30次循環(huán)，最后72°C延 伸 IOmin0
5.如權(quán)2所述的引物序列在鑒定短小乳桿菌中的應(yīng)用，其特征在于電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 采用的為2%的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒定短小乳桿菌的引物序列及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明引物的堿基序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本發(fā)明的引物序列可用于鑒定短小乳桿菌，該引物能夠特異性擴(kuò)增短小乳桿菌16SrDNA的部分序列，擴(kuò)增特異性高，能夠準(zhǔn)確、快速鑒定短小乳桿菌。該引物用于鑒定短小乳桿菌過(guò)程簡(jiǎn)單，鑒定方法穩(wěn)定、高效，不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且檢測(cè)成本低。本發(fā)明為短小乳桿菌種質(zhì)資源鑒定提供了檢測(cè)方法，為篩選短小乳桿菌的優(yōu)良菌株奠定了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102094089SQ201010574429
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者張軍, 張廣民, 王安如, 田子罡, 閆秩潔 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司