專利名稱：一種常壓蒸汽滅菌生物指示劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種常壓蒸汽滅菌指示劑和該指示劑的制備方法。
技術背景
在對食用菌栽培料常壓蒸汽滅菌效果監(jiān)測的物理、化學和生物三種方法中，生物 監(jiān)測方法是效果最為可靠的方法。生物監(jiān)測的原理是依靠某種抗常壓蒸汽滅菌且具有滅菌 效果指示能力的菌類，將其芽孢(孢子)經(jīng)滅菌后培養(yǎng)，通過芽孢存活與否來判定栽培料中 雜菌被殺滅的效果。生物監(jiān)測技術的應用，確實收到了提高滅菌效果、減少污染發(fā)生、改善 食用菌菌絲生長的顯著效果。
常壓蒸汽滅菌生物指示劑是由指示菌干芽孢麩皮菌劑、滅菌粉狀培養(yǎng)基(干培養(yǎng) 基)、增色劑混合組成的，分裝在透明耐高溫的瓶內，使用時往指示劑瓶內加入水后，再伴隨 食用菌栽培料進行滅菌。滅菌工作完成后，對指示劑瓶內的指示菌進行培養(yǎng)，觀察其指示瓶 內有無指示菌菌落長出，如有菌落長出，則說明食用菌栽培料滅菌質量不達標，反之即為達 標。由于常壓蒸汽滅菌指示劑所應用的指示菌，是在某一種類的食用菌栽培料營養(yǎng)水平上 和食用菌菌絲正常生長所需溫度范圍內(20 36°C)能夠生長的菌類。其在指示劑中被 干培養(yǎng)基所包圍時，因缺少芽孢萌發(fā)生長所需水分而處于休眠狀態(tài)，在使用時加水后，就具 備了芽孢萌發(fā)生長所需的營養(yǎng)、水分條件。加之，食用菌栽培時的溫度一般高于20°C，從而 又具備了芽孢快速萌發(fā)生長所需的溫度條件，因此孢子將很快打破休眠狀態(tài)進入營養(yǎng)生長 階段。然而芽孢休眠狀態(tài)的打破，會減弱指示菌對常壓蒸汽滅菌的抗力，故可降低或失去指 示滅菌效果的能力。因此，指示劑一旦加水后，應馬上或盡快進入滅菌程序。然而在實際使 用過程中，指示劑加水后并不可能馬上進入滅菌程序。這是因為每個常壓蒸汽滅菌鍋(或 滅菌室、滅菌池)的裝量是很大的，小的可裝1000個菌袋，大的可裝6000多個菌袋，一般是 邊裝料袋邊入鍋，裝滿后才苫嚴滅菌池或將滅菌鍋、室封口，而后通汽、升溫滅菌，整個裝袋 裝鍋過程約需要5 7小時。這樣，在不同時間、不同位置所放置的指示劑的遇水時間就有 1 7個小時的差別。由此可見，提前遇到水的指示菌干芽孢就會吸水膨脹轉向生長狀態(tài)而 降低對常壓蒸汽的抗力，晚遇到水的芽孢仍保持強的抗力，由于指示菌芽孢生理狀態(tài)的不 同，從而造成在同一滅菌鍋的指示劑指示滅菌的能力有很大差異，這一方面增加了滅菌效 果判定的難度，另一方面降低了判定結果的準確度。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是要提供一種不受遇水時間長短影響的常壓蒸汽滅菌生物指示 劑，同時提供一種該指示劑的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
本發(fā)明所提供的常壓蒸汽滅菌生物指示劑，包括有干培養(yǎng)基、指示菌片，其特征在 于所述的指示菌片為指示菌的芽孢附著在染菌載體片上，在該染菌載體片表面涂布有石 蠟、石蠟乳液或脂肪酸。
本發(fā)明中的干培養(yǎng)基是指加水后即可適于指示菌生長的培養(yǎng)基。即用于培養(yǎng)指示 菌的培養(yǎng)基標準配方中除水之外的、由其他固體成分組成的培養(yǎng)基。
注用于培養(yǎng)指示菌的培養(yǎng)基標準配方是指按照此配方制成的培養(yǎng)基可直按用于 培養(yǎng)指示菌的配方。
本發(fā)明指示劑在使用時，需向干培養(yǎng)基中加入標準培養(yǎng)基配方規(guī)定比例的水后方 可使用。故在以下表述中，1個指示劑中干培養(yǎng)基的量等于一定體積標準培養(yǎng)基中除水以外 各種固體成分用量之和。用其實際使用時加水后所形成的培養(yǎng)基在液態(tài)時的體積表示(單 位mL)?；蚝唵伪硎鰹橄喈斢谂囵B(yǎng)基標準配方多少毫升。
本發(fā)明中的指示菌除選用棉籽殼抗熱菌01號外，還可選用從其他種類的食用菌 栽培料中(如甘蔗渣、玉米芯、鋸末等)篩選培養(yǎng)出的，能夠在該栽培料營養(yǎng)水平上和食用 菌菌絲正常生長所需溫度范圍內(20 36°C)生長，且對該栽培料的常壓滅菌具有指示能 力的耐熱菌。選用的棉籽殼抗熱菌01號為一種枯草芽孢桿菌，在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心保藏，保藏名稱為棉籽殼抗熱菌01號，保藏編號為CGMCC No. 4153, 保藏日期2010年9月8日。
本發(fā)明所述的脂肪酸為軟脂酸或硬脂酸中的任意一種；所說的石蠟為熔點在 50 70°C的石蠟；所說的石蠟乳液為熔點在50 70°C的石蠟乳化劑。
本發(fā)明中所說染菌載體片可以是紙片，也可以是濾紙。由于采用濾紙更易于干燥， 故優(yōu)選濾紙。
本發(fā)明所提供的常壓蒸汽滅菌生物指示劑的制備方法包括以下步驟
a、將指示菌接種至適合其生長的生芽孢細菌培養(yǎng)基斜面上，在34 36°C下培養(yǎng)， 芽孢生成后，用無菌水沖洗菌苔制成指示菌懸液，85 90°C下滅活20 25分鐘，使指示菌 懸液中指示菌營養(yǎng)體滅活，震蕩后靜置或低速離心處理，取上清液，上清液即為指示菌芽孢 懸液母液，測定指示菌芽孢懸液母液的活孢子濃度，再用無菌水稀釋指示菌芽孢懸液母液 為所需濃度的指示菌芽孢懸液；
b、吸取a步所制的所需濃度的指示菌芽孢懸液，滴加在染菌載體片上，使每一載 體片上附著有規(guī)定劑量(即1個指示劑應含的全部芽孢量)的指示菌芽孢，隨后在36°C以 下干燥，即制成染菌載體片；
C、將染菌載體片放置在融化的石蠟或脂肪酸液體或石蠟乳液中浸漬，然后在36°C 以下干燥，即制成防水指示菌片；
d、將防水指示菌片與干培養(yǎng)基組合成一體。
本發(fā)明所提供的常壓蒸汽滅菌生物指示劑，在常溫下，指示菌片中的指示菌芽孢 在疏水物質石蠟或脂肪酸的保護下，可與水隔離。因而，在滅菌前，無論何時往指示瓶內加 入水，只要溫度低于石蠟或脂肪酸的熔點時，石蠟或脂肪酸所形成的防水膜即可阻止指示 菌芽孢與水直接接觸，因而即使指示菌片處于水中，指示菌片中的芽孢也無法吸收水分，而 依舊處于休眠狀態(tài)。當溫度高于其熔點時，石蠟或脂肪酸所形成的防水膜即被破壞，此時指 示菌片中的芽孢一邊分散到培養(yǎng)基中，一邊吸水分繼而膨脹轉為生長狀態(tài)。由此可見本發(fā) 明指示菌片，其指示菌芽孢與水直接接觸的時間，可通過溫度來控制。由于在同一鍋滅菌 時，起始溫度基本是一致的，因此在采用本發(fā)明指示劑進行常壓蒸汽滅菌效果測定時，不論 指示劑瓶內加水時間早晚，都能夠保證指示菌芽孢實際接觸水的時間是基本一致，從而有4效避免了同一滅菌鍋的指示劑由于加水時間前后不一，而導致通過指示劑指示滅菌能力不 一的問題。


圖1是本發(fā)明實施例1所采用的棉籽殼抗熱菌01號菌株的脂肪酸組成氣相色譜 圖。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但其并不對本發(fā)明的保護范圍做 不利的限定。
以下實施例中所要制備的指示劑，均用100毫升輸液瓶封裝，指示劑芽孢濃度均 為4X IO6個/毫升，1個指示劑中的干培養(yǎng)基的量均為40毫升培養(yǎng)基標準配方中所含的干 物質的量，染菌載體片均為1X1. 5厘米大小的濾紙片。
實施例1以棉籽殼抗熱菌01號為指示菌，制備本發(fā)明指示劑。
該指示劑由棉籽殼抗熱菌01號防水指示菌片及其干培養(yǎng)基(加水后用于棉籽殼 抗熱菌01號指示菌的恢復生長，為無菌狀態(tài))組成。石蠟、硬脂酸、軟脂酸、石蠟乳液中的 任一種均可用作制防水指示菌片的防水材料。
(一 )制備防水指示菌片
(1)制取指示菌芽孢懸液
將棉籽殼抗熱菌01號指示菌劃線接種在生芽孢細菌培養(yǎng)基試管斜面上，34 36°C下培養(yǎng)48小時，20°C下培養(yǎng)72小時；用10毫升無菌水洗脫掉菌苔，洗脫液倒入15毫 升無菌離心管中；振蕩器振蕩菌苔懸液15分鐘；在烘箱內熱處理裝菌苔懸液的離心管，當 菌苔懸液溫度達90°C后持續(xù)20分鐘，以殺死菌苔懸液中的指示菌營養(yǎng)體；離心10分鐘 (500r· rniiT1)，棄去管底沉淀物，將上清液倒入另一個無菌離心管內即為指示菌芽孢懸液 母液，采用平板計數(shù)法測定指示菌芽孢懸液母液中活孢子濃度。
上述的生芽孢細菌培養(yǎng)基，其1000毫升配方為胰蛋白胨10克，葡萄糖5克，氯化 鈉8克，硫酸錳0. 3克，瓊脂20克，水定容至1000毫升。分裝在18 X 180毫米試管內，每管 分裝10毫升，121°C下滅菌30分鐘，出鍋擺放成斜面。
用于平板計數(shù)的培養(yǎng)基，其1000毫升配方為胰蛋白胨10克，葡萄糖5克，氯化鈉 8克，瓊脂20克，水定容至1000毫升。121°C下滅菌30分鐘，出鍋后無菌條件下用9厘米平 皿制成平板。
(2)配制制備染菌載體片所需濃度的指示菌芽孢懸液
染菌載體片所需濃度的指示菌芽孢懸液可根據(jù)制作指示劑時的規(guī)格要求及染菌 載體所承載的適宜菌液量來確定。
1張染菌載體片應含的指示菌芽孢總數(shù)=1個指示劑所含指示菌芽孢總數(shù)=指示 劑芽孢濃度(個/毫升)X1個指示劑實際使用時的培養(yǎng)基量(毫升)
指示劑芽孢濃度為1個指示劑中的干培養(yǎng)基在實際使用時每毫升中含芽孢的個數(shù)。
根據(jù)指示劑芽孢濃度GXlO6個/毫升)，可計算出指示劑中1張染菌載體片應含指示菌芽孢總數(shù)為4X IO6X 40 = 1.6 X IO8個。
染菌載體片所需指示菌芽孢懸液濃度=1張染菌載體片應含的指示劑芽孢總 數(shù)+染菌載體染菌量(毫升)。
預備試驗得知，1X1.5厘米大小濾紙片承載的適宜菌液量為20微升，如此，染菌 載體片所需指示菌芽孢懸液濃度即為1. 6X IO8個+20微升=8X IO9個/毫升。
根據(jù)上述(1)步中指示菌芽孢懸液母液的濃度，可配制出染菌載體片所需濃度 的指示菌芽孢懸液，若(1)步中所配制的指示菌芽孢懸液母液的濃度高于IO9個/毫升， 則用無菌水將其稀釋到8X IO9個/毫升濃度；若其濃度低于IO9數(shù)量級，則離心15分鐘 (8000r · rnirT1)后取沉淀物，再用無菌水稀釋至所需濃度。
(3)制備染菌載體片
將濾紙裁成1X1.5厘米大小的紙片，裝入塑料袋內，121°C下滅菌30分鐘，將紙片 排在無菌土壤篩的篩底上，用微量加液器吸取上一步已配制至所需濃度的指示菌芽孢懸液 20微升，滴加在紙片的中央位置，紙片吸收水分后，放置在30°C鼓風培養(yǎng)箱內快速干燥。
(4)給染菌載體片做防水涂層(可采用以下①-④中的任意一種方式)
①用熔點在58 60°C的石蠟做防水涂層在無菌室內，將裝有熔點為58 60°C 的石蠟(該石蠟由天津福晨化學試劑廠生產(chǎn))放在燒杯內，置于66 68°C烘箱內融化，用 鑷子夾住濾紙片的一角，在熔化的石蠟內浸漬后，36°C下攤涼在無菌土壤篩底上，凝固后， 即制成以石蠟作防水涂層的防水指示菌片。
②用軟脂酸做防水涂層將染菌載體片放置在融化的軟脂酸液體中浸漬，然后在 36 °C以下干燥，即制成以軟脂酸作防水涂層的防水指示菌片。
③用硬脂酸做防水涂層將染菌載體片放置在融化的硬脂酸液體中浸漬，然后在 36°C以下干燥，即制成以硬脂酸作防水涂層的防水指示菌片。
④用石蠟乳液做石蠟防水涂層將染菌載體片放置在石蠟乳液中浸漬，然后在 36°C以下干燥，紙片水分蒸發(fā)后留下石蠟，同樣成為石蠟作防水涂層的防水指示菌片。本例 所用石蠟乳液以56°C 58°C半精煉石蠟為主要原料生產(chǎn)，含固量40%，pH 6 7，生產(chǎn)單 位藁城市西城工業(yè)區(qū)寬力乳液廠。
制好的防水指示菌片裝入復合塑料袋內，封口后4 6°C下存放。
( 二)將防水指示菌片與干培養(yǎng)基組合成一體。
本實施例中指示劑干培養(yǎng)基所依據(jù)的培養(yǎng)基標準配方為胰蛋白胨1克，葡萄糖 0.5克，氯化鈉0.8克，瓊脂粉2.0克，水100毫升。配制一個(瓶)指示劑用干培養(yǎng)基的 量(等于按培養(yǎng)基標準配方配制40毫升時所需除水以外各種材料的量)是無菌胰蛋白胨 0. 4克、葡萄糖0. 2克、氯化鈉0. 32克、瓊脂粉0. 8克，各種材料總重1. 72克。
往1個100毫升無菌輸液瓶內放1張防水指示菌片、無菌胰蛋白胨0. 4克、葡萄糖 0. 2克、氯化鈉0. 32克、瓊脂粉0. 8克，丁基膠塞、鋁蓋封口，即制成1個用棉籽殼抗熱菌01 號作指示菌的本發(fā)明指示劑。
(三)棉籽殼抗熱菌01號的來源。
綿籽殼抗熱菌01號為從棉籽殼栽培料中篩選出的具有指示棉籽殼栽培料常壓滅 菌效果的指示菌，鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，在北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏名稱為棉籽殼抗熱菌01號，保藏編號CGMCC No. 4153，保藏日期2010年9月8日。
(1)形態(tài)學特征為革蘭氏陽性、菌體桿狀，單個排列，好氧，芽孢橢圓形。
(2)生理生化特征為經(jīng)Biolog Microplate GP檢測(24小時培養(yǎng))， 可利用95種碳源中的如下類型β -Methyl-D-Glucoside ( β -甲基_D_葡萄糖 苷)，α -Methyl-D-Glucoside (α -甲基-D-葡萄糖苷)，α -D-Glucose ( α -D-葡萄 糖)，Tween80 (吐 80)，Tween 40 (吐溫 40)，Turanose (松二糖)，Sucrose (蔗糖)， N-Acetyl-D-Glucosamine (N-乙酰氨基葡萄糖)，Maltotriose (麥芽三糖)，Maltose (麥 芽糖)，L-Fucose (L-巖藻糖)，L-Arabinose (L-阿拉伯糖)，Glycerol (丙三醇)， Gentiobiose (龍膽二糖)，D-Xylose (D-木糖)，D-Trehalose (D-海澡糖)，D-Ribose (D-核 糖)，D-Psicose (D-阿洛酮糖)，D-Mannose (D-甘露糖)，D-Mannitol (D-甘露醇)， D-Fructose (D-果糖)，Dextrin (糊精)，D-Cellobiose (纖維二糖)，2，3-Butanediol (2， 3- 丁二醇)，其他為陰性，詳見表2。
表2 =Biolog碳源利用測定結果
權利要求
1.一種常壓蒸汽滅菌生物指示劑，包括有干培養(yǎng)基、指示菌片，其特征在于所述的指示 菌片為指示菌的芽孢附著在染菌載體片上，在該染菌載體片表面涂布有石蠟、石蠟乳液或 脂肪酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物指示劑，其特征在于所說的指示菌是從食用菌栽培料中 篩選培養(yǎng)出的，對食用菌栽培料常壓滅菌具有指示能力的耐熱菌。
3.根據(jù)權利要求1所述的常壓蒸汽滅菌生物指示劑，其特征在于所說的指示菌為棉籽 殼抗熱菌01號，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏名稱為棉籽 殼抗熱菌01號，保藏編號為CGMCC No. 4153，保藏口期2010年9月8日。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的常壓蒸汽滅菌生物指示劑，其特征在于所說的脂肪 酸為軟脂酸或硬脂酸中的任意一種。
5.根據(jù)權利要求1或2或3所述的常壓蒸汽滅菌生物指示劑，其特征在于所說的石蠟 為熔點在50 70°C的石蠟。
6.根據(jù)權利要求1或2或3所述的常壓蒸汽滅菌生物指示劑，其特征在于所說染菌載 體片為濾紙。
7.—種權利要求1所述的常壓蒸汽滅菌生物指示劑的制備方法，其特征在于它包括以 下步驟a、將指示菌接種至生芽孢細菌培養(yǎng)基斜面上，在34 36°C下培養(yǎng)，芽孢生成后，用無 菌水沖洗菌苔制成指示菌懸液，85 90°C下滅活20 25分鐘，震蕩后靜置或低速離心處 理，取上清液，測定上清液活孢子濃度，再用無菌水稀釋為所需濃度的指示菌芽孢懸液；b、吸取a步所制的指示菌芽孢懸液，滴加在染菌載體片上，使每一載體片上附著有規(guī) 定劑量的指示菌芽孢，隨后在36°C以下干燥，即制成染菌載體片；C、將染菌載體片放置在融化的石蠟、石蠟乳液或脂肪酸液體中浸漬，然后在36°C以下 干燥，即制成防水指示菌片；d、將防水指示菌片與干培養(yǎng)基組合成一體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種常壓蒸汽滅菌生物指示劑及其制備方法，它包括有干培養(yǎng)基、指示菌片。所述的指示菌片為指示菌的芽孢附著在染菌載體片上，在該染菌載體片表面涂布有石蠟、石蠟乳液或脂肪酸。制備方法為將指示菌接種至生芽孢細菌培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)，芽孢生成后制成指示菌懸液；吸取指示菌芽孢懸液，滴加在染菌載體片上，即制成染菌載體片；將染菌載體片放置在融化的石蠟或脂肪酸液體或石蠟乳液中浸漬，然后干燥即制成防水指示菌片；將防水指示菌片與干培養(yǎng)基組合成一體。本發(fā)明指示劑進行常壓蒸汽滅菌效果測定時，不論指示劑瓶內加水時間早晚，都能夠保證指示菌芽孢實際接觸水的時間是基本一致，從而有效避免了同一滅菌鍋的指示劑由于加水時間前后不一，而導致通過指示劑指示滅菌能力不一的問題。
文檔編號C12Q1/04GK102041292SQ20101053092
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權日2010年11月4日
發(fā)明者王世清, 王朝江, 董慶武, 袁永昌, 高春燕 申請人:河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所