專利名稱：一種廣譜高效提取植物rna的試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種廣譜、高效提取植物RNA的方法，屬于生物化學技術(shù)領域，適用于 從各種植物，包括富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的頑拗性植物組織中提取高質(zhì)量的總RNA。
背景技術(shù)：
從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。要進行 Northern雜交分析，純化mRNA以用于體外翻譯或構(gòu)建cDNA文庫，大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組和miRNA測 序分析，基因芯片分析，RT-PCR及差顯分析等功能基因組學和分子生物學研究，都需要高質(zhì) 量的完整RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的基 本前提，同時也是關(guān)鍵步驟。植物組織富含酚類化合物、多糖以及某些尚無法確定的次生代謝產(chǎn)物，而且RNase 的活性較高。在完整的細胞內(nèi)，這些物質(zhì)與核酸因區(qū)隔化分布而在空間上彼此隔離，但當 組織被研磨，細胞結(jié)構(gòu)破壞之后，這些物質(zhì)就會與RNA相互作用酚類化合物被氧化后會與 RNA不可逆地結(jié)合，導致RNA活性喪失及在用苯酚、氯仿抽提時RNA的丟失，或形成不溶性 復合物；而多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來；萜類化合物和RNase會分別造成 RNA的化學降解和酶解。一些頑拗性植物例如棉花、馬尾松、香蕉等由于缺乏成熟的商業(yè)試 劑盒或者提取方法用于提取完整的、高質(zhì)量、高產(chǎn)率的RNA是這些植物分子生物學研究中 的一大挑戰(zhàn)。以重要的農(nóng)作物棉花為例棉花的各種組織特別是花藥、胚珠、纖維細胞內(nèi)常含 有豐富的多糖、脂類以及多酚、色素等次生物質(zhì)，而這些物質(zhì)在RNA提取過程中很難去除干 凈。多糖、脂類的存在不僅會使RNA的溶解度降低，還可以抑制許多工具酶的活性，且多酚、 色素等物質(zhì)在提取過程中很容易被氧化導致RNA變褐，影響對RNA的進一步分子操作?，F(xiàn) 有的商業(yè)試劑盒Trizol (Gibco-BRL生命技術(shù)公司)、RNeasy(Qiagen)等都不能有效提取 棉花組織的RNA，有的產(chǎn)率為零。目前國內(nèi)外廣泛采用CTAB法和熱硼酸法提取棉花組織的 RNA，其中CTAB法被認為可以用于提取棉花根、莖、葉、幼嫩胚珠等組織的RNA，熱硼酸法則 可以用于提取纖維中的RNA。但是在實際應用中這兩種方法都有缺點一是提取成功率只 能達到60 %，二是提取RNA的質(zhì)量不夠高，不能滿足RNA表達譜測序等一些對RNA質(zhì)量要求 高的分析研究的需要。國內(nèi)某研究機構(gòu)因為沒有找到合適的提取方法使有關(guān)研究停滯三年 之久，而采用本方法之后，經(jīng)Agilent 2100Bioanlyzer檢測，即達到了規(guī)定的質(zhì)量要求，使 有關(guān)工作得以進行。本方法以棉花為初始試驗材料，在比較、分析、綜合現(xiàn)有的十三種RNA提取方法的 基礎上，認識到緩沖系統(tǒng)是決定棉花組織RNA提取成功與否以及質(zhì)量高低的最重要因素。 篩選出硼酸緩沖液為RNA提取液的最佳緩沖體系，采用該體系可以高效提取植物組織中的 RNA。用該體系提取粗RNA之后，再用使用CTAB為去污劑的Tris-HCl-EDTA-NaCl緩沖體 系，溶解粗RNA，并添加異硫氰酸胍。其中的硼酸可以與棉花組織中富含的酚類化合物以氫 鍵形成復合物，抑制酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合；CTAB、異硫氰酸胍可以使蛋白質(zhì)迅速變性，有利于防止RNA的降解，保持其完整性，同時，該緩沖系統(tǒng)可以有效地去除多糖，使 RNA與多糖能有效分離，大大提高了 RNA的純度。 由于棉花是最難提取RNA的代表性植物之一，本方法在棉花上取得滿意效果之 后，我們用該方法又分別嘗試從擬南芥、水稻、松樹、香蕉(果皮、果肉)、雪松、冬青等植物 中提取RNA，成功率達到100%，0D260/0D280比值穩(wěn)定在2. 0左右。說明該方法適用范圍

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種廣譜、高效提取植物RNA的方法和試劑盒。技術(shù)方案本發(fā)明總結(jié)出緩沖系統(tǒng)是決定植物RNA純度、產(chǎn)率、品質(zhì)的最主要技術(shù)因素，發(fā)明 了串聯(lián)使用兩種緩沖系統(tǒng)高效提取和分離植物組織RNA的技術(shù)方法。在第二種緩沖液中添 加lmol/L異硫氰酸胍，有效抑制了 RNase活性，有效去除多糖物質(zhì)，大大提高了 RNA的完整 性和純度。 一種廣譜、高效從植物中提取RNA的試劑盒，包括(1)提取緩沖溶液I，即硼砂-十二烷基磺酸鈉SDS提取緩沖液質(zhì)量體積百分比 濃度為2 %的SDS，0. 0125mol/L硼砂，用硼酸調(diào)節(jié)pH到8. 5，加入焦炭酸二乙酯DEPC使?jié)?度達到0. 體積百分比，高溫高壓滅菌；(2)提取緩沖溶液II，即十六烷基三甲基溴化銨CTAB提取緩沖液100mol/L pH為 8. 0的三羥甲基氨基甲烷Tris-鹽酸HC1，20mmol/LpH為8. 0的乙二胺四乙酸鈉EDTA-Na2, 質(zhì)量體積百分比濃度為2%的CTAB，1.4mol/L氯化鈉NaCl，質(zhì)量體積百分比濃度為2%的聚 乙烯吡咯烷酮PVP，體積百分比濃度為的β-巰基乙醇，lmol/L異硫氰酸胍；(3)3mol/L pH 為 5. 2 的醋酸鈉 NaAc 溶液4. 801g NaAc ·3Η20 或 3. 566g NaAc .H2O 溶于8mL水，用冰醋酸調(diào)pH至5. 2，加入10 μ L DEPC,定容至10mL，高溫高壓滅菌；(4)8mol/L 氯化鋰 LiCl 33. 91g LiCl 溶于 IOOmL 水，加入 100 μ L DEPC，高溫高壓 滅菌；(5)異丙醇純度100% ；(6) DEPC水或稱無RNase水體積百分比濃度0. 1 % DPEC的雙蒸水溶液，高溫高壓 滅菌。所述試劑盒用于從植物中提取RNA的方法，其特征在于以硼酸緩沖液為緩沖體系首 先有效分離和富集植物組織RNA，再以Tris-HCl-EDTA-NaCl為緩沖液、CTAB為去污劑并加 入lmol/L異硫氰酸胍抑制RNase活性，提取純品RNA。其特征在于(1)向IOmL離心管中加入3. OmL提取緩沖溶液I、0.25mL β-巰基乙醇、2. OmL pH 為8. 0的Tris飽和酚，1. 5mL體積比為24 1的氯仿異戊醇；(2)取0. Ig新鮮植物組織，加入0. Ig交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮PVPP，在液氮中充分研 磨成粉狀，將凍粉迅速轉(zhuǎn)入上述IOmL離心管中，旋渦劇烈震蕩3min，冰上放置5min ；(3) 4"C，10，OOOg 離心 15min ；(4)將上清液轉(zhuǎn)至離心管中，加入等體積預冷異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)30次，混勻，-20°C 靜置1 2h，4°C，10，OOOg離心20min,棄上清；
(5)沉淀中加3mL提取緩沖溶液II，65°C水浴15min ；中途翻轉(zhuǎn)混勻；(6)加等體積氯仿充分混勻，冰浴靜置IOmin ；(7) 4"C，10，OOOg 離心 20min ；(8)上清加 1/3 體積 8mol/lLiCl 混勻，-70°C，30min 或-20°C，l_2h 冰??；(9)4°C，10，OOOg離心20min，棄上清，沉淀即為粗RNA，用70%體積百分比的乙醇 洗滌兩次后溶解于50 μ L DEPC水；(10)力口 入 IOU 無 RNase 活性的 DNase，禾口 25U RNase 抑制齊[J (RNasin Plus, Promega, N2611)，DEPC水補足體積到100 μ L,消化其中的DNA ；(11)直接補加500yL DEPC水和600 μ L體積比為1 1的Tris-酚氯仿， 40C 9，600g離心20min，上清轉(zhuǎn)移至另一新的2mL管中；(12)加入等體積的體積比24 1的氯仿異戊醇，抽提一次；(13)上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入1/10體積的3mol/L pH5. 2的NaAc-HAc，2. 5倍體 積無水乙醇，-70°C冰浴沉淀1. 5h ；(1)4°C 9，600g 離心 20min，沉淀即為純化的 RNA。有益效果本發(fā)明操作步驟比較簡單、成本低、穩(wěn)定性好、成功率高。本方法提取RNA產(chǎn)率高 (表1)，達到174. 3μ g · IOOmgFff"1, 0D260/0D280 = 2. 01，純度高，沒有鹽類的污染，解決了 多糖、多酚等植物富含的干擾物質(zhì)的清除問題，適用性廣，尤其適用于從富含多糖多酚及次 生代謝物質(zhì)的植物組織中提取高質(zhì)量總RNA。該方法可以很方便地開發(fā)出商業(yè)化試劑盒，廣 泛用于植物樣品的RNA提取。
四

圖1采用本方法提取的RNA圖 2 DNase I 消化后的 RNA圖3 RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA圖 4 RNA 進行 RT-PCR 擴增圖 5 3，-RACE圖 6 5，-RACE圖7從香蕉果肉、果皮、馬尾松、雪松提取的RNA
五具體實施例方式有關(guān)溶液的配方如下(I)DEPC水體積百分比濃度為0. 1 %的DEPC雙蒸水溶液，高溫高壓滅菌。以下所 有的水溶液需要用DEPC水配制；(2) lmol/L ρΗ8· 0 的 Tris-HCl 儲備液:lmol/L Tris，溶解于水，用 HCl 調(diào)節(jié) pH 值 到8.0，高溫高壓滅菌，該儲備液用于含有Tris-HCl的緩沖液的配制；(3) 0. 5mol/L ρΗ8· 0 的 EDTA-Na2 儲備液0. 5mol/L EDTA-Na2,溶解于水，用 NaOH 調(diào)節(jié)PH值到8. 0，該儲備液用于含有EDTA-Na2的緩沖液的配制，高溫高壓滅菌；(4)提取緩沖溶液I 即硼砂-SDS提取緩沖液質(zhì)量體積百分比濃度為2%的SDS，
60. 0125mol/L硼砂，用硼酸調(diào)節(jié)pH到8. 5，加入DEPC使體積百分比濃度達到0. 1 %，高溫高 壓滅菌；(5)pH為8. 0的Tris緩沖液飽和酚，購自Sunshine公司，4°C避光保存；(6) 4mol/L NaCl，體積百分比濃度為0. 1 % DEPC,高溫高壓滅菌；(7)提取緩沖液 II 即 CTAB 提取緩沖液IOOmmol/L pH8. OTris-HCl, 20mmol/L pH8. OEDTA-Na2,質(zhì)量體積百分比濃度為2 %的CTAB，1. 4mol/LNaCl，質(zhì)量體積百分比濃度 2% PVP,體積百分比濃度1 % B-巰基乙醇，lmol/L異硫氰酸胍。(8) 3mol/L NaAc, ρΗ5· 2 :4· 801g NaAc · 3H20 或 3. 566gNaAc · H2O 溶于 8mL 水，加 用冰醋酸調(diào)PH至5. 2，定容至10mL，分裝后高壓滅菌，儲存于4°C冰箱。(9)氯仿異戊醇(24 1) 24mL氯仿和ImL異戊醇混合。(10)8mol/L LiCl :33· 91g LiCl 溶于 IOOmL 水，體積百分比 0. 1%DEPC，高溫高壓 滅菌。實施例1 本發(fā)明方法提取棉花胚珠總RNA1.向IOmL離心管中加入3. OmL提取緩沖溶液I、0. 25mL β -巰基乙醇、2. OmLpH 為8. 0的Tris飽和酚，1. 5mL體積比為24 1的氯仿異戊醇；2.取0. Ig棉花胚珠，加入0. Ig交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮PVPP，在液氮中充分研磨成 粉狀，將凍粉迅速轉(zhuǎn)入上述IOmL離心管中，旋渦劇烈震蕩3min，冰上放置5min ；3. 40C，10，OOOg 離心 15min ；4.將上清液轉(zhuǎn)至離心管中，加入等體積預冷異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)30次，混勻，-20°C 靜置1 2h，4°C，10，OOOg離心20min,棄上清；5.沉淀中加3mL提取緩沖溶液II，65°C水浴15min ；中途翻轉(zhuǎn)混勻；6.加3mL氯仿充分混勻，冰浴靜置IOmin ；7. 4"C，10，OOOg 離心 20min ；8.上清加 1/3 體積 8mol/l LiCl 混勻，-70°C，30min 或-20°C，l_2h 冰浴；9. 4°C, 10, OOOg離心20min，棄上清，沉淀即為粗RNA，用70%體積百分比的乙醇洗 滌兩次后溶解于30 μ L DEPC水；10.快速電泳檢測用1 %含溴化乙錠EB的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，電泳時間 15分鐘，電泳后用紫外成像儀觀察。結(jié)果顯示電泳帶有5S、18S、28S三條RNA帶。5S亮度 較淺，28S 18S的亮度比接近2 1(見圖1左)。這說明所提取的RNA達到要求，與常規(guī) CTAB法為對照(圖1右)，對照樣品降解明顯。11.紫外法檢測樣品的濃度取IulRNA稀釋100倍用紫外分光光度計測定分 別測定 0D260、0D280、0D320、0D230 (表 1)。0D260/0D280 越接近 2. 0 說明 RNA 純度較 高，0D260/0D230 > 2. 0這表示RNA沒有鹽類的污染，此方法提取RNA產(chǎn)率較高，達到 174. 3μ g · IOOmgFff-1, 0D260/0D280 = 2. 01，純度高。表1采用本方法提取的棉花胚珠RNA的OD值測定和定量分析OD260OD320OD280 OD260/OD280OD260/OD230產(chǎn)率(pg.lOOmgFW·1)0.3010.0020.150 2.012.20174.3需要特殊說明的是棉花花藥的RNA提取極為困難，一般方法中提取的RNA的中胨 狀污染物難以去除，我們的方法可以有效提取的RNA，而且沒有提胨狀污染物。12.加入 IOU無RNase 活性的 DNase，和 25U RNase 抑制劑(RNasin Plus, Promega, N2611)，DEPC水補足體積到100 μ L，消化其中的DNA ；13.直接補加500yL DEPC水和600 μ L體積比為1 1的Tris-酚氯仿， 40C 9，600g離心20min，上清轉(zhuǎn)移至另一新的2mL管中；14.加入等體積的體積比24 1的氯仿異戊醇，抽提一次；15.上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入1/10體積的3mol/L pH5. 2的NaAc_HAc，2. 5倍體 積無水乙醇，-70°C冰浴沉淀1. 5h ；70%16. 40C 9，600g離心20min，沉淀用70%體積百分比的乙醇洗滌兩次，沉淀即為純 化的RNA ；17.反轉(zhuǎn)錄取5μ g RNA，加入反轉(zhuǎn)錄反應緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑，37°C溫育 4min使引物退火；再加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，混勻，37°C溫育60min，70°C溫育15min滅活反轉(zhuǎn) 錄酶，立即將反應管置于冰上，合成的第一鏈cDNA可以直接用于PCR擴增或保存于-20°C備 用(圖3)，第一鏈cDNA長度在IOObp到5000bp，大多數(shù)在500 3000bp，說明RNA完整性好。18. RT-PCR 用組成性表達的EFl α -對特異引物，作為內(nèi)標進行平行PCR擴 增。反應體系為，10XPCR buffer 2. 0 μ L, 25mmol/L MgCl2 1. 2 μ L，10mmol/L dNTP Mix 0.4“1^，1(^11101/1正向引物和反向引物各IyL, cDNA第一鏈模板1 μ L，rTaq酶(5U/yL, TakaRa) 0. 1 μ L，加無菌超純水至20 μ L ；擴增條件為95°C預變性2min ；94°C變性45s， 551 601退火308，721延伸308，40個循環(huán)；72°C延伸lOmin，以熔解曲線結(jié)束。內(nèi)標檢 測 EFl α (Hong-Ping Dong, Jianling Peng, Zhilong Bao, et al, Downstream Divergence of the Ethylene Signaling Pathway for Harpin-Stimulated Arabidopsis Growth and Insect Defense, Plant Physiology, 2004,136(3) :3628_3638.)，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝 膠電泳(圖4)，全部樣品都擴增出分子量約為500bp的預期條，說明RNA容易進行反轉(zhuǎn)錄。19.5’ -RACE和3，-RACE 用本發(fā)明方法提取棉花RNA，分別進行3’ -RACE和 5’ -RACE擴增全長cDNA基因，都取得了成功，說明RNA質(zhì)量高，完整性好(圖5、圖6)。實施例2 香蕉果肉、果皮、馬尾松、雪松RNA的提取。實驗方法步驟與實施例1完 全相同。結(jié)果見圖7。
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權(quán)利要求
一種廣譜、高效從植物中提取RNA的試劑盒，包括(1)提取緩沖溶液I，即硼砂 十二烷基磺酸鈉SDS提取緩沖液質(zhì)量體積百分比濃度為2％的SDS，0.0125mol/L硼砂，用硼酸調(diào)節(jié)pH到8.5，加入焦炭酸二乙酯DEPC使?jié)舛冗_到0.1％體積百分比，高溫高壓滅菌；(2)提取緩沖溶液II，即十六烷基三甲基溴化銨CTAB提取緩沖液100mol/L pH為8.0的三羥甲基氨基甲烷Tris 鹽酸HCl，20mmol/L pH為8.0的乙二胺四乙酸鈉EDTA Na2，質(zhì)量體積百分比濃度為2％的CTAB，1.4mol/L氯化鈉NaCl，質(zhì)量體積百分比濃度為2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP，體積百分比濃度為1％的β 巰基乙醇，1mol/L異硫氰酸胍；(3)3mol/L pH為5.2的醋酸鈉NaAc溶液4.801g NaAc·3H2O或3.566g NaAc·H2O溶于8mL水，用冰醋酸調(diào)pH至5.2，加入10μL DEPC，定容至10mL，高溫高壓滅菌；(4)8mol/L氯化鋰LiCl33.91g LiCl溶于100mL水，加入100μL DEPC，高溫高壓滅菌；(5)異丙醇純度100％；(6)DEPC水或稱無RNase水體積百分比濃度0.1％DPEC的雙蒸水溶液，高溫高壓滅菌。
2.權(quán)利要求1所述試劑盒用于從植物中提取RNA的方法，其特征在于以硼酸緩沖液 為緩沖體系首先有效分離和富集植物組織RNA，再以Tris-HCl-EDTA-NaCl為緩沖液、CTAB 為去污劑并加入lmol/L異硫氰酸胍抑制RNase活性，提取純品RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種從植物中提取RNA的方法，其特征在于(1)向IOmL離心管中加入3.OmL提取緩沖溶液I、0. 25mL β -巰基乙醇、2. OmL pH為 8. 0的Tris飽和酚，1. 5mL體積比為24 1的氯仿異戊醇；(2)取0.Ig新鮮植物組織，加入0. Ig交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮PVPP，在液氮中充分研磨成 粉狀，將凍粉迅速轉(zhuǎn)入上述IOmL離心管中，旋渦劇烈震蕩3min，冰上放置5min ；(3)4°C，10，OOOg離心 15min ；(4)將上清液轉(zhuǎn)至離心管中，加入等體積預冷異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)30次，混勻，-20°C靜置 1 2h, 4°C，10，OOOg 離心 20min,棄上清；(5)沉淀中加3mL提取緩沖溶液II，65°C水浴15min；中途翻轉(zhuǎn)混勻；(6)加等體積氯仿充分混勻，冰浴靜置IOmin；(7)4°C，10，OOOg離心 20min ；(8)上清加1/3 體積 8mol/l LiCl 混勻，-70°C，30min 或-20°C，l_2h 冰??；(9)410,OOOg離心20min，棄上清，沉淀即為粗RNA，用70%體積百分比的乙醇洗滌 兩次后溶解于50 μ L DEPC水；(10)加入IOU 無 RNase 活性的 DNasejP 25U RNase 抑制劑(RNasin Plus, Promega, N2611)，DEPC水補足體積到100 μ L，消化其中的DNA ；(11)直接補加500μ L DEPC水和600 μ L體積比為1 1的Tris-酚氯仿， 40C 9，600g離心20min，上清轉(zhuǎn)移至另一新的2mL管中；(12)加入等體積的體積比24 1的氯仿異戊醇，抽提一次；(13)上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入1/10體積的3mol/LpH5. 2的NaAc-HAc，2. 5倍體積無 水乙醇，-70°C冰浴沉淀1. 5h ；(14)4°C 9，600g離心20min，沉淀即為純化 的RNA0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種廣譜、高效從各種植物組織中提取RNA的方法，屬生物化學技術(shù)領域。以硼酸緩沖液為緩沖體系首先有效分離和富集植物組織RNA，再以三羥甲基氨基甲烷Tris-鹽酸HCl-乙二胺四乙酸鈉EDTA-Na2-氯化鈉NaCl為提取緩沖液、十六烷基三甲基溴化銨CTAB為去污劑，并加入1mol/L異硫氰酸胍作為強變性劑迅速抑制RNase活性，提取高品質(zhì)RNA。該方法不僅可以提取棉花胚珠、花藥、葉片、纖維等組織中的RNA，而且可以從擬南芥、水稻、馬塘以及香蕉(果皮、果肉)、馬尾松、雪松等頑拗性植物中提取高品質(zhì)的RNA。該方法提取RNA產(chǎn)率高，純度高，沒有鹽類的污染。成本低，適合商品化開發(fā)，成為一種廣譜、高效提取植物RNA的專用試劑盒。
文檔編號C12N15/10GK101962639SQ20101029034
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者劉康, 惠穎, 李茂峰, 王晉 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學