專利名稱：一種固相dna芯片雜交液及雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固相DNA芯片雜交液及簡(jiǎn)易雜交方法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組(測(cè)序)計(jì)劃(Human genome project)的逐步實(shí)施以及分子生 物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得以測(cè)定，基因序列數(shù)據(jù) 正在以前所未有的速度迅速增長?；蛐酒?又稱DNA芯片、生物芯片)技術(shù)就是順應(yīng)這 一科學(xué)發(fā)展要求的產(chǎn)物，它的出現(xiàn)為解決此類問題提供了光輝的前景?；蛐酒夹g(shù)已經(jīng) 越來越多的應(yīng)用于基因診斷、分析、以及基因治療等方面。該技術(shù)系指將大量(通常每平方 厘米點(diǎn)陣密度高于400)探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢 測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。目前已有多種方法 可以將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。這些方法總體上有兩種，即合成點(diǎn)樣與原位 合成(in situ synthesis)兩種。支持物有多種如玻璃片、硅片等但需經(jīng)特殊處理。作點(diǎn) 樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針分子，通常需包被以氨基硅烷 或多聚賴氨酸等。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基(視 所要固定的分子為核酸或寡肽而定)并與保護(hù)基建立共價(jià)連接。也有一些探針被固定到一 些微球上，并且在溶液中實(shí)現(xiàn)芯片雜交，這種芯片一般叫做液相芯片?；蛐酒饕ㄋ膫€(gè)基本要點(diǎn)芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、生物分子反應(yīng)和 信號(hào)的檢測(cè)。其中生物分子反應(yīng)，芯片上的生物分子之間的反應(yīng)是芯片檢測(cè)的關(guān)鍵一步。雜 交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。通過選擇合 適的反應(yīng)條件使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中(如雜交溫度，雜交時(shí)間，雜交液的組成 成分等)，減少生物分子之間的錯(cuò)配比率。寡核苷酸探針與靶分子之間進(jìn)行生物分子反應(yīng)一般需要用到雜交液，.Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ed. 2nd, 1989, vol. 1-3，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道探針的長度， 雜交溫度，以及其他一些因素都會(huì)影響到雜交效果的好壞。如果雜交過程在低于DNA分子 的熔解溫度(Tm值)的5-10°C進(jìn)行時(shí)，能夠有效的減少錯(cuò)配或非Watson/Crick堿基配對(duì)， 加大Watson/Crick堿基配對(duì)的正確率。雜交液通常情況下都包括一種鹽(含單價(jià)陽離子的鹽)，金屬離子螯合劑如EDTA、 以及防止非特異性雜交的封閉劑。含單價(jià)陽離子的鹽，如SSPE、SSC能使雜交緩沖液的PH 維持在6. 8-8. 5之間。SDS為表面活性劑，鮭魚精DNA和脫脂奶粉均可去除背景信號(hào)。一 般情況下雜交緩沖液包含6XSSPE(0. 9M NaCl，60mM磷酸鹽(pH 7.4) ；6mM EDTA)；或者 6X SSC(0. 9M NaCl，90mM 檸檬酸鈉(pH 7. 0)) ,0. 5% w/v sodium dodecyl sulfate (SDS)； 100 μ g/ml鮭魚精DNA，0. 1 %的脫脂奶粉，去除背景信號(hào)。基因芯片雜交溫度和時(shí)間取決于探針的組成(探針的長度及探針中所包含不同 堿基的含量)以及目標(biāo)分子的復(fù)雜度，雜交溫度一般在20°C到70°C之間，雜交時(shí)間一般在2h到2d之間。低的雜交溫度在20°C到50°C之間(一般情況下在37°C -45°C范圍內(nèi))，高 的雜交溫度在50°C到70°C之間(一般情況下在60°C-65°C范圍內(nèi))。高的雜交溫度可以 提高Watson/Crick堿基的配對(duì)幾率，低的雜交溫度只能通過延長雜交時(shí)間來提高Watson/ Crick堿基配對(duì)幾率。低的雜交溫度雜交時(shí)一般需要過夜雜交或者更長的時(shí)間(8h-24h)。 雜交溫度低經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)雜交信號(hào)不好，背景信號(hào)高，雜交結(jié)果有斑點(diǎn)等，這就影響了芯片的 品質(zhì)。這個(gè)問題需要通過提高雜交溫度和縮短雜交時(shí)間來解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠以較低成本，簡(jiǎn)單、快速的實(shí)現(xiàn)固相DNA芯片雜交 的雜交液及采用此雜交液進(jìn)行雜交的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人經(jīng)過大量不同類型芯片的雜交試驗(yàn)得到雜交液成分 及采用此雜交液進(jìn)行雜交的優(yōu)選方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種固相DNA芯片雜交液，其特征在于它是由NaCl，Na-MES，EDTA, SDS原料組成； 其 NaCl 717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。本發(fā)明采用所述固相DNA芯片雜交液進(jìn)行雜交的方法，按如下的步驟進(jìn)行2)當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光素進(jìn)行單鏈標(biāo)記時(shí)，PCR標(biāo)記產(chǎn)物于65°C烘干；2)用預(yù)熱的去離子水回溶標(biāo)記產(chǎn)物，再加入預(yù)熱好的雜交液，充分混勻；3)混合液加入孵育室，孵育溫度為探針Tm-10°C，并封閉好雜交倉，放入水浴鍋 內(nèi)，溫度控制在50°C -60°C，雜交時(shí)間2-6小時(shí)；其中雜交時(shí)去離子水和雜交液以體積比為 1 1混合溶解產(chǎn)物。本發(fā)明對(duì)于在PCR擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記的雜交方法1)當(dāng)在PCR擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，PCR產(chǎn)物在95°C充分退火；2)退火后的PCR產(chǎn)物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅；3)取淬滅后的PCR產(chǎn)物與去離子水和已充分預(yù)熱的雜交液混合；其中雜交時(shí)去離 子水和雜交液以體積比為11混合溶解產(chǎn)物；4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，水浴雜交。本發(fā)明所涉及雜交液具體的為雜交液包含717mM NaCl,400mM Na-MES(嗎啉乙磺 酸鈉鹽)，100 μ M EDTA，0. 2% (w/v) SDS (十二烷基磺酸鈉)。雜交液保存溫度為-20°C也可 以存放于4°C。本雜交液為2X雜交液，使用時(shí)要用去離子水1 1稀釋。雜交液和去離子 水回溶PCR產(chǎn)物前應(yīng)放于65°C充分預(yù)熱。具體的雜交方法為1、在第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物基礎(chǔ)上用熒光素進(jìn)行單鏈標(biāo)記時(shí)的雜交方法1)PCR標(biāo)記產(chǎn)物于65°C烘干。2)用10 μ 1預(yù)熱的去離子水回溶標(biāo)記產(chǎn)物，再向其中加入10 μ 1預(yù)熱好的雜交液， 充分混勻。3)混合液加入孵育小室并封閉好雜交倉，放入水浴鍋內(nèi)。步驟3)所述混合液放入水浴鍋中孵育，孵育溫度為探針Tm-10°C，一般在55°C到 70°C之間最為適宜，雜交溫度過高會(huì)引起PCR產(chǎn)物蒸干影響雜交結(jié)果，雜交溫度過低會(huì)降 低Watson/Crick堿基配對(duì)幾率引起錯(cuò)配。雜交時(shí)間一般控制在2_6小時(shí)即可。2、在PCR擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記時(shí)的雜交方法
1)PCR產(chǎn)物在95°C充分退火。2)退火后的PCR產(chǎn)物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅。3)取適量的淬滅后的PCR產(chǎn)物與合適量的去離子水和10 μ 1已充分預(yù)熱的雜交液
混合ο4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，放入水浴鍋水浴雜交。本發(fā)明的固相DNA芯片雜交的雜交液與現(xiàn)有使用的雜交液相比所具有的積極效 果在于(1)本雜交液配方簡(jiǎn)單，降低了生產(chǎn)成本且易保存。(2)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便易行，可以提高雜交溫度，有效地縮短雜交時(shí)間。通過使用 本雜交液可以很好的控制雜交時(shí)產(chǎn)生的背景值，提高雜交信號(hào)，減小背景值對(duì)信號(hào)值所產(chǎn) 生的干擾，優(yōu)化雜交效果。(3)本雜交液的雜交效果與使用商品化的雜交液的雜交效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)說明利用 本雜交液與商品化雜交液對(duì)侵襲性真菌基因芯片，水產(chǎn)品特異基因芯片，奶粉基因芯片及 水產(chǎn)品間區(qū)基因芯片進(jìn)行雜交得到如圖5的雜交對(duì)比圖。可以看出在縮短雜交時(shí)間的同 時(shí)，芯片雜交信號(hào)有所增強(qiáng)，背景雜點(diǎn)有所減少。


圖1為侵襲性真菌基因芯片在不同溫度梯度下雜交結(jié)果圖，其中圖IA-D分別為 55°C、57°C、59°C、61°C。圖2為侵襲性真菌基因芯片在不同時(shí)間梯度下雜交結(jié)果圖，其中圖2A-D分別為 2h、4h、6h、8h。圖3A-L為雜交液穩(wěn)定性及保存條件試驗(yàn)雜交結(jié)果圖，其中A-F中雜交液保存于 4°C，時(shí)間依次為一個(gè)月到六個(gè)月，G-L中雜交液保存于-20°C，時(shí)間依次為一個(gè)月到六個(gè)月。圖4A為侵襲性真菌基因芯片雜交效果圖。圖4B為利用ITS序列檢測(cè)水產(chǎn)品中主要致病菌基因芯片雜交效果圖。圖4C為利用特異基因檢測(cè)水產(chǎn)品中主要致病菌基因芯片雜交效果圖。圖4D為奶粉基因芯片雜交效果圖。圖4E為致瀉性大腸桿菌基因芯片雜交效果圖。圖5A-D為使用本雜交液的雜交效果與使用商品化的雜交液的雜交效果對(duì)比實(shí) 驗(yàn)，其中圖Al、Bi、Cl、Dl為本雜交液雜交效果圖，圖A2、B2、C2、D2為商品化雜交液雜交效果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過最佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅僅是用于說明 而不是限制本發(fā)明，其中所用原料均有市售。實(shí)施例1雜交液的組成NaCl717mM,Na-MES 400mM,EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。雜交 液的雜交方法
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1)當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光素進(jìn)行單鏈標(biāo)記時(shí)，PCR標(biāo)記產(chǎn)物于65°C烘干；2)用10 μ 1預(yù)熱的去離子水回溶標(biāo)記產(chǎn)物，再加入10 μ 1預(yù)熱好的雜交液，充分混 勻；3)混合液加入孵育室，雜交溫度溫度為探針Tm-10°C，并封閉好雜交倉，放入水浴 鍋內(nèi)；溫度控制在50°C，雜交時(shí)間6小時(shí)。本發(fā)明所述的雜交液為2X雜交液，使用時(shí)要用去離子水1 1稀釋。其中雜交 液和去離子水回溶PCR產(chǎn)物前應(yīng)放于65°C充分預(yù)熱。雜交液保存溫度為4°C或-20°C。實(shí)施例2雜交液的組成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。雜交液的雜交方法1)當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光素進(jìn)行單鏈標(biāo)記時(shí)，PCR標(biāo)記產(chǎn)物于65°C烘干；2)用10 μ 1預(yù)熱的去離子水回溶標(biāo)記產(chǎn)物，再加入10 μ 1預(yù)熱好的雜交液，充分混 勻；3)混合液加入孵育室，雜交溫度為探針Tm-10°C，并封閉好雜交倉，放入水浴鍋 內(nèi)；溫度控制在60°C，雜交時(shí)間4小時(shí)。本發(fā)明所述的雜交液為2X雜交液，使用時(shí)要用去離子水1 1稀釋。其中雜交 液和去離子水回溶PCR產(chǎn)物前應(yīng)放于65°C充分預(yù)熱。實(shí)施例3雜交液的組成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。雜交液的雜交方法1)當(dāng)在PCR擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記時(shí)PCR產(chǎn)物在95°C充分退火；2)退火后的PCR產(chǎn)物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅；3)取淬滅后的PCR產(chǎn)物與10 μ 1去離子水和10 μ 1已充分預(yù)熱的雜交液混合；4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，水浴雜交。本發(fā)明所述的雜交液為2Χ雜交液，使用時(shí)要用去離子水1 1稀釋，雜交液保存 溫度為4°C或_20°C。實(shí)施例4雜交液的實(shí)際應(yīng)用侵襲性真菌基因芯片雜交試驗(yàn)選取侵襲性真菌基因芯片中的克柔氏念珠菌作為試驗(yàn)對(duì)象。1)按照侵襲性真菌基因芯片所要求的PCR程序和PCR體系擴(kuò)增靶基因片段。2)利用熒光素cy3-dUTP對(duì)第一步PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。3)標(biāo)記產(chǎn)物放于65°C烘干，之后用已經(jīng)過預(yù)熱的去離子水和雜交液各10μ 1回溶。4)將回溶后的產(chǎn)物加入孵育小室中，封閉好雜交倉，放入水浴鍋即可。其中的雜交液組成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。使用侵襲性真菌基因芯片中的克柔氏念珠菌作為對(duì)象來研究雜交液的最適雜交 溫度和雜交時(shí)間。侵襲性真菌基因芯片中克柔氏念珠菌有五根探針，探針的Tm值均在65°C 左右。選取55°C、57°C、59°C、61°C四個(gè)溫度梯度來驗(yàn)證不同溫度對(duì)芯片雜交效果的影響。同時(shí)選取2h、4h、6h、8h來驗(yàn)證不同時(shí)間梯度對(duì)雜交效果的影響。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在探針Tm值-10°C范圍內(nèi)雜交效果相差不大，所以選擇較低的雜交 溫度57V。因?yàn)楫?dāng)雜交溫度超過60°C以后很容易將PCR產(chǎn)物蒸干影響雜交結(jié)果。雜交時(shí) 間選取了四個(gè)梯度，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2h時(shí)已經(jīng)可以產(chǎn)生較強(qiáng)的雜交信號(hào)，4-8小時(shí)雜交效果 相差不大。所以為了更好的實(shí)現(xiàn)雜交效果又要盡可能的縮短雜交時(shí)間，雜交時(shí)間一般選取 2-6小時(shí)即可。實(shí)施例5利用ITS序列檢測(cè)水產(chǎn)品中主要致病菌基因芯片雜交試驗(yàn)在利用ITS序列檢測(cè)水產(chǎn)品中主要致病菌基因芯片檢測(cè)范圍中選取金黃色葡萄 球菌作為試驗(yàn)對(duì)象，按照上述實(shí)施例3中所述雜交液的雜交方法來進(jìn)行雜交，得到如圖4B 的雜交效果圖。本芯片雜交溫度為57°C，雜交時(shí)間為6h。實(shí)施例6利用特異基因檢測(cè)水產(chǎn)品中主要病原微生物基因芯片雜交試驗(yàn)在利用特異基因檢測(cè)水產(chǎn)品中主要致病菌基因芯片檢測(cè)范圍中選取志賀氏菌作 為試驗(yàn)對(duì)象，按照上述實(shí)施例3中所述雜交液的雜交方法來進(jìn)行雜交，得到如圖4C的雜交 效果圖。本芯片雜交溫度為56°C，雜交時(shí)間為5h。實(shí)施例7奶粉基因芯片雜交試驗(yàn)在奶粉基因芯片檢測(cè)范圍中選取蠟樣芽胞桿菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照上述實(shí)施例 3中所述雜交液的雜交方法來進(jìn)行雜交，得到如圖4D的雜交效果圖。本芯片雜交溫度為 57°C，雜交時(shí)間為6h。實(shí)施例8致瀉性大腸基因芯片雜交試驗(yàn)在致瀉性大腸基因芯片檢測(cè)范圍中選擇侵襲性大腸桿菌EIEC作為檢測(cè)對(duì)象。1)按照致瀉性大腸桿菌基因芯片所要求的PCR程序和PCR體系對(duì)本實(shí)驗(yàn)所選取的 靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。2) PCR 產(chǎn)物在 95 °C 變性。3)變性后的PCR產(chǎn)物迅速放入碎冰中使PCR產(chǎn)物淬火。4)取2μ1 PCR產(chǎn)物與8μ 1去離子水和10μ 1雜交液混勻，將回溶后的產(chǎn)物加 入孵育小室中，封閉好雜交倉，放入水浴鍋即可。圖4Ε為雜交效果圖，本芯片雜交溫度為 60°C，雜交時(shí)間1. 5h。
權(quán)利要求
一種固相DNA芯片雜交液，其特征在于它是由NaCl，Na MES，EDTA，SDS原料組成；其NaCl 717mM，Na MES 400mM，EDTA 100μM，SDS 0.2％(w/v)。
2.一種采用權(quán)利要求1所述固相DNA芯片雜交液進(jìn)行雜交的方法，其特征在于按如下 的步驟進(jìn)行1)當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用熒光素進(jìn)行單鏈標(biāo)記時(shí)，PCR標(biāo)記產(chǎn)物于65°C烘干；2)用預(yù)熱的去離子水回溶標(biāo)記產(chǎn)物，再加入預(yù)熱好的雜交液，充分混勻；3)混合液加入孵育室，孵育溫度為探針Tm-IOV，并封閉好雜交倉，放入水浴鍋內(nèi)，溫 度控制在50°C-60°C，雜交時(shí)間2-6小時(shí)；其中雜交時(shí)去離子水和雜交液以體積比為1 1 混合溶解產(chǎn)物。
3.一種采用權(quán)利要求1所述固相DNA芯片雜交液進(jìn)行雜交的方法，其特征在于按如下 的步驟進(jìn)行1)當(dāng)在PCR擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，PCR產(chǎn)物在95°C充分退火；2)退火后的PCR產(chǎn)物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅；3)取淬滅后的PCR產(chǎn)物與去離子水和已充分預(yù)熱的雜交液混合；其中雜交時(shí)去離子水 和雜交液以體積比為11混合溶解產(chǎn)物；4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，水浴雜交。
4.權(quán)利要求3所述的雜交方法，其中的雜交液為2X雜交液，使用時(shí)要用去離子水 1 1稀釋。
5.權(quán)利要求2所述的雜交方法，其中雜交液和去離子水回溶PCR產(chǎn)物前應(yīng)放于65°C充 分預(yù)熱。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固相DNA芯片雜交液及雜交方法。它是由NaCl，Na-MES，EDTA，SDS原料組成；其NaCl 717mm，Na-MES 400mm，EDTA 100μm，SDS 0.2％(w/v)本雜交液主要成分包括NaCl，Na-MES，EDTA，SDS。雜交時(shí)只需將標(biāo)記的PCR產(chǎn)物烘干，用已預(yù)熱好的雜交液與去離子水1∶1混合溶解，然后將其加入孵育室孵育即可。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便易行，可以提高雜交溫度，有效地縮短雜交時(shí)間。通過使用本雜交液可以很好的控制雜交時(shí)產(chǎn)生的背景值，提高雜交信號(hào)，減小背景值對(duì)信號(hào)值所產(chǎn)生的干擾，優(yōu)化雜交效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101948922SQ20101028798
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者馮露, 張戀心, 曹勃陽, 李榮榮, 楊磊, 王磊 申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司