專(zhuān)利名稱(chēng)：基于異丁醇的安莎霉素p-3生產(chǎn)優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程與技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種基于異丁醇的安莎 霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法。
背景技術(shù)：
Ansamitocin是珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌(Actinosynnema pretiosum)來(lái)源的美登素 衍生物，其母核為19-C的大環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)，C-3連接不同長(zhǎng)度的碳鏈，主要活性成份安莎霉素 P-3(AP-3)的側(cè)鏈為異丁?；诘蜐舛认驴梢种品前籽园籽〖?xì)胞系及人類(lèi)固體腫瘤。 由于腸胃副效應(yīng)及神經(jīng)毒性，其研究還停留在臨床二階段。然而，由于A(yíng)nsamitocin可在臨 床一期中作為抗體毒素結(jié)合物及免疫結(jié)合物，各方面的研究仍在進(jìn)行中，并且其在2009年 被世界衛(wèi)生組織列為非常重要的抗菌藥物。次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量受不同環(huán)境條件影響，如培養(yǎng)基中組成、氧供應(yīng)及發(fā)酵溫度 等。而優(yōu)化培養(yǎng)基的組成是傳統(tǒng)也是重要的一步用于提高代謝物產(chǎn)量。目前，已報(bào)道的野 生型珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌產(chǎn)Ansamitocin主要為液體發(fā)酵，盡管有報(bào)道利用培養(yǎng)基優(yōu)化的 方法及高表達(dá)調(diào)節(jié)基因的方法提高AP-3產(chǎn)量，但得到的產(chǎn)率仍只在50mg/L[6，7]左右；因 此，利用各種方法提高AP-3產(chǎn)率是其應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵步驟。異丁醇是一種重要的化工原 料，同時(shí)也有報(bào)道其可作為能源燃料，在發(fā)酵生物質(zhì)產(chǎn)乙醇的過(guò)程中作為副產(chǎn)物積累；由于 異丁醇是一種分支醇，可作為分支鏈脂肪酸的前體，這就為其在需要以分支鏈脂肪酸為底 物的生物培養(yǎng)過(guò)程的利用提供可能；然而，對(duì)于醇(特別是異丁醇)作為生物培養(yǎng)過(guò)程中的 添加劑或營(yíng)養(yǎng)因子是鮮有報(bào)道的。本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物AP-3屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，其合成 需要一系列來(lái)源于脂肪酸的CoA，這使利用異丁醇添加提高AP-3產(chǎn)量成為可能。經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，K.Hatano, E. Higashide, S. Akiyama, and Μ.Yoneda(1984)在 Selective accumulation of Ansamitocin P_2, P_3and P_4, and biosynthetic origins of their acylmoieties (P_2，P_3 及 P_4 的選擇性積累及其?；?基團(tuán)來(lái)源)(Agric. Biol. Chem. 48(7) :1721_1729) 一文中記載了纈氨酸也可以作為AP-3的 前體以提高其產(chǎn)量[6，8]，但由于纈氨酸在使用前需要過(guò)濾除菌，但其在水中的溶解度低， 為添加操作帶來(lái)極大的不便，且提高AP-3產(chǎn)量的幅度(僅為20% -60% )遠(yuǎn)不如異丁醇 (200% -400% )，故在A(yíng)P-3發(fā)酵過(guò)程中，我們提出添加異丁醇提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn) 優(yōu)化方法，即通過(guò)在野生型珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌比較添加與不添加異丁醇的AP-3產(chǎn)量，獲 得一個(gè)有效提高AP-3產(chǎn)量的方法，此方法有助于提高AP-3產(chǎn)率，并減少副產(chǎn)物的生成，可 為簡(jiǎn)化后續(xù)的分離純化工作作奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括如下步驟第一步、配制種子培養(yǎng)基，采用甘油保存的珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌接種于種子培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)操作，獲得一級(jí)種子，并經(jīng)二次培養(yǎng)后獲得二級(jí)種子；所述的野生型珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌(Actinosynnema pretiosum subsp. auranticum)保藏于 The Global Bioresource Center ATCC (國(guó)際生物資源中心 ATCC，保 藏號(hào)31565)，可通過(guò)以下方式獲得http //www, atcc. orR/ATCCAdvancedCataloRSearch/ProductDetails/ tabid/452/Default. aspx ？ ATCCNum = 31565&Template = bacteria ；所述的種子培養(yǎng)基的組分及質(zhì)量百分比含量為酵母提取物質(zhì)1%、牛肉浸膏 1%、葡萄糖0. 5%、甘油和氯化鈉0. 3%以及96. 2%的雙蒸水，其PH為7. 4。所述的甘油管種子保存于-70°c冰箱，保存濃度為108CFU/ml，按1.6%接種率接種 于種子培養(yǎng)基中，接種量為1.6%。所述的培養(yǎng)操作是指在28°C環(huán)境下以220rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2天。所述的二次培養(yǎng)是指取一級(jí)種子按1. 6%接種率接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng) 操作。第二步、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，取二級(jí)種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，添加異丁醇并進(jìn)行搖瓶 培養(yǎng)；所述的配制發(fā)酵培養(yǎng)基是指依次配置組分及質(zhì)量百分比含量如下酵母提取物 質(zhì)1 %、玉米煮沸濾液2 %、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸鈣0. 5%、磷酸氫二鉀0. 05%及七 水合硫酸亞鐵0. 0002%，余量為雙蒸水，配置得到的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7. 4。所述的搖瓶培養(yǎng)是指將二級(jí)種子按1. 6%接種率接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C 環(huán)境下以220rpm培養(yǎng)4_6天。所述的添加異丁醇是指直接在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程的0-48小時(shí)時(shí)間段內(nèi)滴加質(zhì)量百 分比濃度大于99%的異丁醇，直至發(fā)酵培養(yǎng)基中的異丁醇濃度達(dá)到72毫摩爾/升。第三步、培養(yǎng)結(jié)束的發(fā)酵液經(jīng)離心后，分離出上清液，用等體積的乙酸乙酯提取3 次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸干后，再用甲醇溶解并過(guò)濾備用，最后采用高相液相色譜分析所得 安莎霉素的純度。經(jīng)上述方法優(yōu)化發(fā)酵得到的AP-3產(chǎn)量提高200%以上，并大大減少副產(chǎn)物AP-2的 積累。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，便于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1為實(shí)施例中野生型珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌在添加不同濃度異丁醇條件下的 AP-3產(chǎn)量。圖2為實(shí)施例中野生型珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌在不同培養(yǎng)時(shí)間添加異丁醇條件下 的AP-3產(chǎn)量。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。所使用的微生物珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)。液體發(fā)酵之前，菌體先接兩級(jí)種子(60ml/250ml，220rpm, 28°C各2天)，再以1. 6%的接種量 接種發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)初始或培養(yǎng)過(guò)程中添加不同濃度的異丁醇，培養(yǎng)結(jié)束后，再用等體 積的乙酸乙酯萃取Ansamitocin，蒸干后溶于甲醇，過(guò)濾后低溫保存或直接HPLC檢測(cè)。實(shí)施例1采用的菌種珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；種子及發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基成份為酵母提取物質(zhì)1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖 0. 5 %，甘油1 %和氯化鈉0.3%。發(fā)酵培養(yǎng)基成份為酵母提取物質(zhì)1 %、玉米煮沸濾液1 %、 葡萄糖0. 5 %，甘油4 %，碳酸鈣0. 5 %，磷酸氫二鉀0. 05 %及七水合硫酸亞鐵0. 0002 %。 250-ml搖瓶裝液量60ml。低溫保存的甘油管種子1ml，于28°C，220rpm培養(yǎng)2天，按1. 6% 的接種量轉(zhuǎn)接二級(jí)種子，28°C，培養(yǎng)2天，再以1. 6%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加不同 濃度的異丁醇(7. 2、18、36和72mM，對(duì)應(yīng)為40、100、200、400微升)，以不添加為對(duì)照，每個(gè) 條件設(shè)三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，培養(yǎng)4-6天。樣品處理及檢測(cè)方法液體培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液離心取上清用等體積的乙酸乙酯 萃取3次，合并3次乙酸乙酯萃取液。上述乙酸乙酯液于50°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，加入Iml的甲醇 溶解，用0. 22 μ m有機(jī)膜過(guò)濾后于高相液相色譜(HPLC)檢測(cè)AP-3和AP-2含量；所使用的 HPLC柱為C18反向柱，柱溫28°C，流動(dòng)相為85%甲醇和15%水，流速0. 6ml/min。結(jié)果表明，添加異丁醇濃度為36mM能有效地提高AP-3產(chǎn)量。實(shí)施例2采用的菌種如實(shí)施例1;種子及發(fā)酵培養(yǎng)如實(shí)施例1，不同的是在培養(yǎng)的初始(即第0小時(shí))、第12小時(shí)、 第24小時(shí)、第36小時(shí)及第48小時(shí)添加36mM的異丁醇，以不添加為對(duì)照，每個(gè)條件設(shè)三個(gè) 生物學(xué)重復(fù)，培養(yǎng)4-6天。樣品處理及檢測(cè)方法如實(shí)施例1。結(jié)果表明，在培養(yǎng)初始，即第0小時(shí)，添加終濃度為36mM的異丁醇能使AP_3產(chǎn)量 達(dá) 93. 8mg/L。
權(quán)利要求
一種基于異丁醇的安莎霉素P 3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征在于，包括如下步驟第一步、配制種子培養(yǎng)基，采用甘油保存的珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌接種于種子培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)操作，獲得一級(jí)種子，并經(jīng)二次培養(yǎng)后獲得二級(jí)種子；第二步、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，取二級(jí)種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，添加異丁醇并進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)；第三步、培養(yǎng)結(jié)束的發(fā)酵液經(jīng)離心后，分離出上清液，用等體積的乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸干后，再用甲醇溶解并過(guò)濾備用，最后采用高相液相色譜分析所得安莎霉素的純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征是，所述的 種子培養(yǎng)基的組分及質(zhì)量百分比含量為酵母提取物質(zhì)1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、 甘油和氯化鈉0. 3%以及96. 2%的雙蒸水，其pH為7. 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征是，所述 的甘油管種子保存于-70°C冰箱，保存濃度為108CFU/ml，按1.6%接種率接種于種子培養(yǎng)基 中，接種量為1.6%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征是，第一步 中所述的培養(yǎng)操作是指在28°C環(huán)境下以220rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征是，第一步 中所述的二次培養(yǎng)是指取一級(jí)種子按1. 6%接種率接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)操作。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征是，所述 的配制發(fā)酵培養(yǎng)基是指依次配置組分及質(zhì)量百分比含量如下酵母提取物質(zhì)1%、玉米煮 沸濾液2%、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸鈣0. 5 %、磷酸氫二鉀0. 05%及七水合硫酸亞鐵 0. 0002%，余量為雙蒸水，配置得到的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7. 4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征是，第二步 中所述的搖瓶培養(yǎng)是指將二級(jí)種子按1. 6%接種率接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C環(huán)境下 以220rpm培養(yǎng)4-6天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，其特征是，所述 的添加異丁醇是指直接在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程的0-48小時(shí)時(shí)間段內(nèi)滴加質(zhì)量百分比濃度大于 99%的異丁醇，直至發(fā)酵培養(yǎng)基中的異丁醇濃度達(dá)到72毫摩爾/升。
全文摘要
一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的基于異丁醇的安莎霉素P-3生產(chǎn)優(yōu)化方法，通過(guò)在野生型珍貴橙色束絲放線(xiàn)菌比較添加與不添加異丁醇的AP-3產(chǎn)量，獲得一個(gè)有效提高AP-3產(chǎn)量的方法，此方法有助于提高AP-3產(chǎn)率，并減少副產(chǎn)物的生成，可為簡(jiǎn)化后續(xù)的分離純化工作作奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101914587SQ20101026691
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月30日
發(fā)明者林錦霞, 鐘建江 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)