專利名稱：一種高效誘導布朗葡萄藻脂肪積累的培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高效提高布朗葡萄藻-X09的脂肪含量以及開放式高密度養(yǎng)殖布 朗葡萄藻-X09的方法。
背景技術：
全球面臨的能源短缺和環(huán)境污染問題促使開發(fā)和利用可再生、無污染的生物能源 成為一個重要的研究方向。利用微藻生產(chǎn)生物能源具有以下獨特的優(yōu)勢微藻能有效地利 用太陽能，通過光合作用固定co2，將無機物轉(zhuǎn)化為高不飽和烷烴、油脂等能源物質(zhì)；微藻生 物能源可再生。葡萄藻(Botryococcus. sp)又名叢粒藻，屬綠藻門、綠藻綱、葡萄藻科，是一 種世界性分布的淡水或微咸水單細胞綠藻。將該藻作為無污染可再生的替代能源生產(chǎn)者引 起廣泛重視，美、法、日、英、澳、蘇、荷和南朝鮮等國都開展了有關研究。研究發(fā)現(xiàn)葡萄藻呈 串狀集落生長，細胞梨形，一般寬3-6 y m，長6-12 u m,老齡細胞的葉綠體中有淀粉粒，無鞭 毛，細胞含色素體1個，環(huán)狀或葉狀，黃綠色，細胞色素為葉綠素a、b、葉黃素、a-胡蘿卜素 和日-胡蘿卜素。群體多為2個或4個細胞組成，大部分細胞呈輻射狀排列，群體大小可 達50-100i!m。其產(chǎn)烴量通常為25%-40%，大大高于其他微生物的含烴量(幾乎都低于 1 ，并且葡萄藻所產(chǎn)烴的組成和結(jié)構(gòu)與石油極其相似，故又被稱為“油藻”，最可望成為工 業(yè)藻種。但目前，葡萄藻的高密度培養(yǎng)技術并沒有很好的解決，仍處在實驗室探索階段，這 種狀況很大程度上由于葡萄藻生長速度緩慢導致的。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種高效提高布朗葡萄藻-X09 的生長速率和脂肪積累能力以及開放式高密度養(yǎng)殖布朗葡萄藻-X09的方法。本發(fā)明是根 據(jù)超聲波對生物體的代謝作用，在不破壞細胞的前提下，采用適當?shù)念l率、強度和處理時 間，以提高布朗葡萄藻-X09的新陳代謝效率，加速細胞生長，用本發(fā)明方法培養(yǎng)出的布朗 葡萄藻-X09細胞數(shù)目比通用方法提高了 1-1. 5倍，其總脂肪含量提高了 30% -55%。本發(fā)明目的之一是提供一種布朗葡萄藻-X09的培養(yǎng)基。本發(fā)明目的之二是提供一種布朗葡萄藻-X09的培養(yǎng)方法。本發(fā)明目的之三是提供一種超聲波與培養(yǎng)條件相結(jié)合的多條件高效誘導布朗葡 萄藻-X09脂肪積累的方法。本發(fā)明提供的能高效提高布朗葡萄藻-X09生物量的培養(yǎng)基，主要包括氮源、磷 源、鐵鹽、氟化鈉、氯化鈉以及微量元素和水。其中氮源優(yōu)選硝酸鉀，磷源優(yōu)選磷酸二氫鉀， 鐵鹽優(yōu)選硫酸亞鐵，微量元素為氯化鈷、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、氯化錳、鉬酸鈉，本發(fā)明所述 的培養(yǎng)基還可以根據(jù)不同的用途添加其他有益營養(yǎng)成分。本發(fā)明所使用的布朗葡萄藻-X09的培養(yǎng)基為FN16，其配方如下硝酸鉀0. 1-1. Og/L 磷酸氫二鉀 0. 02-0. 12g/L七水硫酸鎂0.1-0. 5g/L 二水氯化鈣 0.05-0. 15g/L
4硫酸亞鐵 0.01-0.04g/L 檸檬酸 0.05-0. 3g/L 氟化鈉 0. 2-0.9mg/L 氯化鈉 0. 5-2. 5g/L 微量元素0. 5-2ml/L 其中微量元素配方為
氯化鈷 0. 01-0. 04mg/L 硼酸2. 5-9. 45mg/L
四水氯化錳 1. 3-5. 45mg/L
七水硫酸鋅 0. 22-0. 80mg/ 五水硫酸銅 0. 08-0. 32mg/ 鉬酸鈉 0. 04-0. 15mg/
加蒸餾水至1L 日常添加溶液配方 溶液A 硝酸鉀25-55g/L
本發(fā)明所使用的布朗葡萄藻-X09的培養(yǎng)基較好的配方為
磷酸氫二鉀 0. 04-0. 10g/L 二水氯化鈣 0. 08-0. 12g/L 檸檬酸 0. 08-0. 15g/L 氯化鈉 0. 8-1. 9g/L
七水硫酸鋅0. 32-0. 55mg/L 五水硫酸銅0. 10-0. 22mg/L 鉬酸鈉 0. 06-0. 10mg/L
硝酸鉀 0. 1-0. 6g/L 七水硫酸鎂0. 1-0. 4g/L 硫酸亞鐵 0. 01-0. 03g/L 氟化鈉 0. 4-0. 9mg/L 微量元素 0. 5-2ml/L 其中微量元素配方為 氯化鈷 0. 01-0. 03mg/L 硼酸3. 5-7. 45mg/L
四水氯化錳2. 0-4. 45mg/L 加蒸餾水至1L 日常添加溶液配方 溶液A 硝酸鉀30-50g/L
若非特指，本發(fā)明培養(yǎng)基配方中所述的化學成分，均為分析純的市售商品。 應用本發(fā)明所提供的利用超聲波與培養(yǎng)條件相結(jié)合的高效誘導布朗葡萄藻-X09 脂肪積累的方法，包括如下步驟
步驟1 配置FN16培養(yǎng)基以及日常添加的營養(yǎng)液A ；
步驟2 布朗葡萄藻-X09生物量積累，按照布朗葡萄藻-X09與培養(yǎng)基體積比按 1:8-1: 15的比例將布朗葡萄藻-X09接種到培養(yǎng)基中，溫度20-30°C，pH值6-9，光 照5000-200001UX，光照時間10-16小時/天，每天需一次性向微藻培養(yǎng)液中加入溶液A 0. 5-2ml/L，培養(yǎng)10-18天即可達到對數(shù)生長期末期；布朗葡萄藻-X09生物量較好的積累條 件布朗葡萄藻-X09與培養(yǎng)基體積比按1 9-1 12的比例將布朗葡萄藻-X09接種到培 養(yǎng)基中，溫度22-28°C，pH值7-8，光照12000_200001ux，光照時間11_14小時/天，每天需 一次性向微藻培養(yǎng)液中加入溶液A 0. 8-1. 2ml/L，培養(yǎng)12-15天即可達到對數(shù)生長期末期； 最好的培養(yǎng)條件為布朗葡萄藻-X09與培養(yǎng)基體積比按1 10的比例將布朗葡萄藻-X09 接種到培養(yǎng)基中，溫度26-28°C，光照15000-180001UX，光照時間14小時/天，每天需一次 性向微藻培養(yǎng)液中加入溶液A為lml/L，培養(yǎng)13天時可達到對數(shù)生長期末期；
步驟3 誘導脂肪積累，使用超聲生物促進生長儀將培養(yǎng)至對數(shù)生長期末期的微 藻培養(yǎng)液以15-40kHz的頻率，3-lOw的功率，處理時間15-60s，處理1_3次，每次時間間隔為10s，進行超聲處理，然后向微藻培養(yǎng)液中以0. 5-2. 5L/min的流量通入濃度為2% -6% 的C02，每天補充的溶液A降至0. 01-0. lml/L, 一次性添加氯化鈉4. 68-8. 78g/L，同時加入 100-200mg/L的硫酸亞鐵，在誘導培養(yǎng)2天時，再以10_20kHz的頻率，2_7w的功率，處理時 間5-30s，處理1-2次，每次時間間隔為10s，共誘導培養(yǎng)4天；較好的誘導布朗葡萄藻-X09 脂肪積累條件超聲頻率為15-30kHz的頻率，3-7w的功率，處理時間15-40s，處理2_3次， 每次時間間隔為10s，然后以0. 8-1. 5L/min的流量通入濃度為3% -6%的C02，每天補充的 溶液A降至0. 01-0. 05ml/L，一次性添加氯化鈉為5. 07-7. 02g/L,同時加入120_180mg/L的 硫酸亞鐵，在誘導培養(yǎng)2天時，再以12-20kHz的頻率，2-5w的功率，處理時間5_20s，處理 1-2次，每次時間間隔為10s，共誘導培養(yǎng)4天；最好的誘導布朗葡萄藻-X09脂肪積累條件 超聲頻率為20kHz的頻率，5w的功率，處理時間25s，處理2次，每次時間間隔為10s，然后 以1. 2L/min的流速通入濃度為6%的C02，每天補充溶液A為15 y 1/L，一次性添加氯化鈉 5. 85g/L，同時加入150mg/L的硫酸亞鐵，在誘導培養(yǎng)2天時，再以12kHz的頻率，3w的功率， 處理時間10s，處理2次，每次時間間隔為10s，共誘導培養(yǎng)4天。本發(fā)明所提供的布朗葡萄藻-X09的培養(yǎng)基及誘導脂肪積累的方法，使用超聲波 處理和改變培養(yǎng)基中碳源、氮源、氯化鈉和鐵元素濃度相結(jié)合的方法，非常有利于布朗葡萄 藻-X09脂肪的積累，其油脂的含量比氮元素限制的單一誘導方法提高了 30% -55% ；同時 在培養(yǎng)基中加入氟化鈉和氯化鈉，促進布朗葡萄藻-X09細胞分裂，生長周期比通用培養(yǎng)基 縮短了 2-3天，其生物量比通用培養(yǎng)基提高了 1-1. 5倍，而且本發(fā)明是以通入C02的形式補 充碳源，在大規(guī)模生產(chǎn)布朗葡萄藻-X09誘導脂肪積累的過程中，吸收大量的工業(yè)生產(chǎn)過程 所產(chǎn)生的C02廢氣，對節(jié)能減排、保護環(huán)境具有重要的意義。


圖1為在FN16培養(yǎng)基中添加不同濃度的氟化鈉時布朗葡萄藻-X09的生長曲線。圖2為在FN16培養(yǎng)基中每天添加不同量的溶液A和在通用培養(yǎng)基中培養(yǎng)時布朗 葡萄藻-X09的生長曲線。圖3為超聲波與培養(yǎng)條件相結(jié)合多條件誘導和氮元素單一條件誘導時布朗葡萄 藻-X09的生長曲線圖4為誘導脂肪積累階段加入較高濃度的氮源、低濃度氯化鈉和較強的超聲處理 時布朗葡萄藻-X09的生長曲線圖5為誘導脂肪積累階段加入低濃度氮源、高濃度NaCl和較低強度的超聲處理時 布朗葡萄藻-X09的生長曲線
具體實施例方式實施例1FN16培養(yǎng)基的配方如下硝酸鉀0. 4g/L磷酸氫二鉀0. 08g/L氟化鈉分別為0. 05、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 4mg/L七水硫酸鎂0. 2g/L二水氯化鈣0. 107g/L硫酸亞鐵0. 02g/L 檸檬酸0. lg/L
氯化鈉1. 75g/L微量元素lml/L其中微量元素的配置方法為氯化鈷0. 02mg、七水硫酸鋅0. 44mg、硼5. 72mg、五水 硫酸銅0. 16mg、四水氯化錳3. 62mg、鉬酸鈉0. 084mg加蒸餾水至1L。將上述物質(zhì)溶解，用蒸餾水定容至1L，121°C高壓滅菌20min。在250ml搖瓶中 分別加入100mlFN16培養(yǎng)基，其中氟化鈉的初始濃度分別為0. 05,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0、 1.2、1.4mg/L，接種濃度為3. 2X105個細胞/毫升，在溫度26°C、光暗=14 10，光強 SOOOlux，搖床轉(zhuǎn)速140r/min等條件下進行培養(yǎng)。經(jīng)15天培養(yǎng)，布朗葡萄藻-X09的最大生 物量能達到4. 89X 107個細胞/毫升(見圖1)。根據(jù)上述培養(yǎng)結(jié)果可以得知，使用本發(fā)明提供的FN16培養(yǎng)基，氟化鈉的加入量為 0. 6mg/L時，其達到對數(shù)生長期末期的細胞數(shù)是加入氟化鈉為0. 05mg/L時的1. 5倍，并且提 前2天進入對數(shù)生長期。實施例2
1、FN16培養(yǎng)基的配方如下
硝酸鉀0. 4g/L磷酸氫二鉀0. 08g/L
七水硫酸鎂0. 2g/L二水氯化鈣0. 107g/L
硫酸亞鐵0. 02g/L檸檬酸0. lg/L
氯化鈉1. 75g/L氟化鈉0. 6mg/L
微量元素lml/L
其中微量元素的配置方法為氯化鈷0. 02mg、七水硫酸鋅0. 44mg、硼5. 72mg、五水
硫酸銅0. 16mg、四水氯化錳3. 62mg、鉬酸鈉0. 084mg加蒸餾水至1L。將上述物質(zhì)溶解，用蒸餾水定容至1L，121°C高壓滅菌20min。在250ml搖瓶中 加入100mlFN16培養(yǎng)基，每天添加溶液A的量分別為0. 5,1. 0,1. 5,2. 0ml/L,接種濃度為 3. 25X 105個細胞/毫升，在溫度26°C、光暗=14 10，光強80001ux，搖床轉(zhuǎn)速140r/min 等條件下進行培養(yǎng)。2、通用培養(yǎng)基配方為硝酸鈉1. 5g/L三水磷酸氫二鉀0. 04g/L七水硫酸鎂0. 075g/L二水氯化鈣0. 036g/L檸檬酸0. 006g/L檸檬酸鐵 0. 006g/L乙二胺四乙酸二鈉0. 001g/L 碳酸鈉0. 02g/L微量元素lml/L其中微量元素配方硼酸2. 86g、一水氯化錳1. 81g、七水硫酸鋅0. 222g、五水硫酸 銅0. 079g、二水鉬酸鈉0. 390g、六水硝酸鈷0. 049g加蒸餾水至1L。將上述物質(zhì)溶解，用蒸餾水定容至1L，121°C高壓滅菌20min。在250ml搖瓶中加入 100ml通用培養(yǎng)基，接種濃度為3. 25X 105個細胞/毫升，在溫度26°C、光暗=14 10， 光強SOOOlux，搖床轉(zhuǎn)速140r/min等條件下進行培養(yǎng)。根據(jù)上述培養(yǎng)結(jié)果得知，當每天添加溶液A的量為1. 0ml/L時，布朗葡萄藻-X09 的最大生物量能達到6. 6 X 107個細胞/毫升(見圖2)，培養(yǎng)13天時達到對數(shù)生長期末期， 其細胞數(shù)比通用培養(yǎng)方法提高了 1.2倍。實施例3
1.超聲波與培養(yǎng)條件相結(jié)合多條件誘導在300L小型光反應器系統(tǒng)中，加入FN16培養(yǎng)基，布朗葡萄藻-X09與培養(yǎng)基體 積比為1 10的比例將布朗葡萄藻-X09接種到培養(yǎng)基中，接種濃度為2.24X 105溫度 26-28°C，光照15000-180001UX，光照時間14小時/天，每天需向微藻培養(yǎng)液中加入溶液A 為lml/L，培養(yǎng)13天時開始誘導脂肪積累；脂肪誘導積累階段超聲頻率為20kHz的頻率，5w 的功率，處理時間25s，處理2次，然后以1. 2L/min的流速通入濃度為6%的C02，每天補充 溶液A為15 u 1/L，一次性添加氯化鈉5. 85g/L，同時加入150mg/L的硫酸亞鐵，在誘導培養(yǎng) 2天時，再以12kHz的頻率，3w的功率，處理時間10s，處理2次，共誘導培養(yǎng)4天。2.氮源限制的單一誘導方法在300L小型光反應器系統(tǒng)中，加入FN16培養(yǎng)基，布朗葡萄藻-X09與培養(yǎng)基體積 比為1 10的比例接種，接種濃度為2.24X 105個細胞/毫升，培養(yǎng)溫度為26-28°C，光照 為15000-180001UX，光照時間為14小時/天，每天只補充15 iU/L的溶液A，誘導培養(yǎng)4天。結(jié)果表明，用多條件誘導培養(yǎng)布朗葡萄藻-X09，其生長迅速，培養(yǎng)第4天即進入指 數(shù)生長期，培養(yǎng)可達到的最大細胞密度為6. 8X 107個細胞/毫升(見圖3)，誘導脂肪積累 后干重為2. 07g/L，高出氮缺乏單因素誘導所得細胞干重的11.3%，經(jīng)過超聲波等多條件 誘導后，其脂肪占藻體干重的百分含量可達到45 %，總脂肪的產(chǎn)量為932mg/L，其總脂肪占 藻體干重的百分含量高出單條件誘導的45. 2%，如表1。表1超聲波與培養(yǎng)條件相結(jié)合多條件誘導與氮缺乏單條件誘導各指標比較
權利要求
一種布朗葡萄藻 X09的培養(yǎng)基，其配方如下硝酸鉀 0.1 1.0g/L磷酸氫二鉀 0.02 0.12g/L七水硫酸鎂 0.1 0.5g/L二水氯化鈣 0.05 0.15g/L硫酸亞鐵 0.01 0.04g/L 檸檬酸 0.05 0.3g/L氟化鈉 0.2 0.9mg/L 氯化鈉 0.5 2.5g/L微量元素 0.5 2ml/L其中微量元素配方為氯化鈷 0.01 0.04mg/L七水硫酸鋅 0.22 0.80mg/L硼酸 2.5 9.45mg/L 五水硫酸銅 0.08 0.32mg/L四水氯化錳 1.3 5.45mg/L 鉬酸鈉 0.04 0.15mg/L加蒸餾水至 1L日常添加溶液A石硝酸鉀25 55g/L。
2.如權利要求1所述的布朗葡萄藻-X09的培養(yǎng)基，其較好的配方為硝酸鉀 七水硫酸鎂 硫酸亞鐵 氟化鈉微量元素0. 1-0. 6g/L 0. 1-0. 4g/L 0. 01-0. 03g/L 0. 4-0. 9mg/L 0.5-2ml/L其中微量元素配方為 氯化鈷 0. 01-0. 03mg/L 硼酸3. 5-7. 45mg/L四水氯化錳2. 0-4. 45mg/L磷酸氫二鉀 0. 04-0. 10g/L 二水氯化鈣 0. 08-0. 12g/L 檸檬酸 0. 08-0. 15g/L 氯化鈉 0. 8-1. 9g/L七水硫酸鋅0. 32-0. 55mg 五水硫酸銅0. 10-0. 22mg/L 鉬酸鈉 0. 06-0. 10mg/L加蒸餾水至1L日常添加溶液A :石硝酸鉀 30-50g/L。
3.一種高效誘導如權利要求1、2所述布朗葡萄藻-X09脂肪積累的方法，其特征在于包 括如下步驟(1)配置布朗葡萄藻-X09培養(yǎng)基以及日常添加的營養(yǎng)液A；(2)將布朗葡萄藻-X09藻種接種到培養(yǎng)基中，在溫度為20-30°C，pH值為6_9，光照為 5000-200001uX，光照時間10-16小時/天、每天補充溶液A的條件下對布朗葡萄藻-X09進 行10-18天生物量積累的培養(yǎng)。(3)使用超聲儀對生物量積累后的布朗葡萄藻-X09培養(yǎng)液進行超聲處理，然后向微 藻培養(yǎng)液中通入C02、降低溶液A的補充量，并添加氯化鈉、硫酸亞鐵進行誘導布朗葡萄 藻-X09脂肪積累的培養(yǎng)。
4.如權利要求3所述的高效誘導布朗葡萄藻-X09脂肪積累的方法，其特征在于所述 的布朗葡萄藻-X09與培養(yǎng)基的接種比例為1 8-1 15，生物量積累階段每天向布朗葡萄 藻-X09培養(yǎng)基中加入的溶液A為0.5-2ml/L;較好的接種比例為1 9_1 12，每天補充 的溶液 A 為 0. 8-1.2ml/L。
5.如權利要求3所述的高效誘導布朗葡萄藻-X09脂肪積累的方法，其特征在于 布朗葡萄藻-X09生物量積累較好的條件是在溫度為22-28 °C，pH值為7_8，光照為 12000-200001ux，光照時間為11-14小時/天的條件下培養(yǎng)12-15天。
6.如權利要求3所述的高效誘導布朗葡萄藻-X09脂肪積累的方法，其特征在于進行 超聲處理時的頻率為15-40kHz，功率為3-lOw，處理1-3次，每次間隔為10s，處理時間為 15-60s/次，再向微藻培養(yǎng)液通入C02、并調(diào)整加入溶液A、氯化鈉和硫酸亞鐵濃度的條件下， 誘導培養(yǎng)2天，再以10-20kHz的頻率，2-7w的功率，進行1_2次的超聲處理，每次間隔10s， 處理5-30s/次，共誘導培養(yǎng)4天。
7.如權利要求3所述的高效誘導布朗葡萄藻-X09脂肪積累的方法，其特征在于較好 的誘導條件是在超聲頻率15-30kHz、功率3-7w、處理時間15-40s/次的條件下處理2_3次， 每次時間間隔為10s，然后向微藻培養(yǎng)液中通入C02、并調(diào)整加入溶液A、氯化鈉和硫酸亞鐵 的濃度，誘導培養(yǎng)2天，再以12-20kHz的頻率，2-5w的功率，處理1-2次，每次時間間隔為 10s，處理時間5-20s/次，共誘導培養(yǎng)4天。
8.如權利要求3所述的高效誘導布朗葡萄藻-X09脂肪積累的方法，其特征在于在誘導 脂肪積累培養(yǎng)時，向微藻培養(yǎng)液中通入C02的濃度為2% -6%、流量為0. 5-2. 5L/min，每天 補充的溶液A為0. 01-0. lml/L、氯化鈉為4. 68-8. 78g/L、硫酸亞鐵為100_200mg/L。
9.如權利要求3所述的高效誘導布朗葡萄藻-X09脂肪積累的方法，其特征在于向微 藻培養(yǎng)液中通入的C02優(yōu)選濃度為3% -6%、流量為0. 8-1. 5L/min，優(yōu)選每天補充的溶液A 0. 01-0. 05ml/L、氯化鈉 5. 07-7. 02g/L、硫酸亞鐵 120_180mg/L。
全文摘要
一種高效誘導布朗葡萄藻脂肪積累的培養(yǎng)方法，包括配制培養(yǎng)基及日常添加的營養(yǎng)液，對布朗葡萄藻進行10-18天的生物量積累的培養(yǎng)，然后向布朗葡萄藻培養(yǎng)液中通入CO2、調(diào)整添加營養(yǎng)液的濃度，并使用超聲儀在一定的頻率下，對微藻培養(yǎng)液進行超聲處理，處理1-3次，每次間隔為10s，處理時間為5-60s/次，誘導布朗葡萄藻脂肪積累，用本發(fā)明方法培養(yǎng)的布朗葡萄藻，其生物量提高了1-1.5倍，總脂肪含量提高了30％-55％，生長周期縮短了2-3天，且本發(fā)明是以通入CO2的形式補充碳源，在大規(guī)模生產(chǎn)布朗葡萄藻誘導脂肪積累的過程中，吸收大量的工業(yè)生產(chǎn)過程所產(chǎn)生的CO2廢氣，對節(jié)能減排、保護環(huán)境具有重要的意義。
文檔編號C12N13/00GK101979497SQ20101026353
公開日2011年2月23日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權日2010年8月26日
發(fā)明者單東杰, 蘇嬌嬌 申請人:北京芳能科技有限公司