專(zhuān)利名稱(chēng)：一種玉米心葉特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物啟動(dòng)子的克隆及其應(yīng)用，具體涉及一種玉米心葉特異性啟動(dòng)子的克隆及其功能分析。
背景技術(shù)：
玉米不僅是糧、飼兼用的主要作物，而且還是重要的工業(yè)原料。隨著工業(yè)化的普及和加快，耕地面積的減少、環(huán)境的惡化和食物短缺的矛盾日益尖銳，而常規(guī)育種技術(shù)無(wú)法滿足人類(lèi)對(duì)玉米新品種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病抗逆的需求。十多年來(lái)，已經(jīng)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出一批抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑、抗鹽、抗旱、優(yōu)質(zhì)的玉米新品種。玉米螟(即玉米鉆心蟲(chóng))是玉米的主要害蟲(chóng)之一，對(duì)玉米危害極大，可導(dǎo)致玉米減產(chǎn)10%以上。而由于玉米對(duì)玉米螟的內(nèi)源抗性受多基因控制，常規(guī)育種方法不僅周期長(zhǎng)，且抗性與高產(chǎn)負(fù)相關(guān)，抗瞑育種難度較大，20年間各國(guó)均未取得明顯進(jìn)展。進(jìn)入20世紀(jì)90年代，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法將來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因?qū)胗衩滓垣@得抗蟲(chóng)品種取得突破性進(jìn)展，轉(zhuǎn)Bt基因玉米抗蟲(chóng)效果明顯，平均增產(chǎn) 5-10%。然而轉(zhuǎn)基因植物的安全性一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，其中外源基因的表達(dá)有可能改變植物自身的代謝，從而帶來(lái)目前不為人所知的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為了更安全、高效防治玉米螟，將外源基因表達(dá)對(duì)植物和環(huán)境的影響降到更低，在轉(zhuǎn)基因載體中使用心葉特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子代替組成型CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Bt毒蛋白的表達(dá)，不僅可以控制在幼嫩心葉中為害的第一代玉米螟初孵幼蟲(chóng)，而且可以將外源基因表達(dá)帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)降到最低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種玉米心葉特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)基因在玉米心葉中特異高表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種玉米心葉特異性啟動(dòng)子，來(lái)源于玉米(Zea mays ssp. Mays L.)，具有如下a) 或b)的核苷酸序列a)序列表中SEQ ID No 1所示的核苷酸序列；b)在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列雜交，且具有相同功能的核苷酸序列。所述嚴(yán)格條件為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID No :1 長(zhǎng) 1976bp。含有本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。^^Bjfflil^Bii^Tt^fiPCR(real-time fluoresent quantitative polymerasechain reaction, FQ-PCR)技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ZmPEPl基因在玉米幼嫩的心葉中特異性高表達(dá)，克隆該基因的啟動(dòng)子，命名為WSl-ZmPro，其序列如SEQ ID No:l所示。
本發(fā)明的啟動(dòng)子具有心葉組織特異性，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物育種領(lǐng)域，通過(guò)構(gòu)建含有該啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到植物(例如玉米)中，驅(qū)動(dòng)下游基因在植物心葉中特異性高表達(dá)，達(dá)到育種目的，例如驅(qū)動(dòng)Bt毒蛋白的基因在玉米心葉中特異性高表達(dá)， 從而獲得安全、高效抗玉米螟的轉(zhuǎn)基因玉米。


圖1顯示了 ZmPEPl基因在玉米各組織中的相對(duì)表達(dá)量。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例，結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本實(shí)施例通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)驗(yàn)證了 ZmPEPl基因在玉米幼嫩心葉中的特異高表達(dá)，從而克隆出其啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子長(zhǎng)1976bp，序列見(jiàn)序列表中SEQ ID No :1。一、材料玉米(Zea mays ssp. Mays L.)，在溫室中生長(zhǎng)4周，每天光照16小時(shí)，黑暗 8小時(shí)。 二、總RNA的提取及cDNA合成1、玉米各組織總RNA的提取取4周齡玉米的根、莖以及心葉，分別在液氮中將2g新鮮潔凈的玉米組織研磨為粉末，轉(zhuǎn)移到Iml Trizol溶液(invitrogen公司)中，混勻，加入200 μ 1氯仿，充分混勻， 室溫下靜置2分鐘，4°C、12000g離心15分鐘，吸出上清，轉(zhuǎn)移到新的印pendorf管中，加入 500 μ 1異丙醇，混勻，4°C、12000g離心10分鐘，棄上清，加入1000 μ 1 75%乙醇洗滌一次， 棄上清，所得RNA沉淀溶于50 μ 1 DEPC-ddH20中。2、cDNA 合成將30. 5 μ 1總RNA溶液在70°C變性5_10分鐘后置于冰上，迅速加入下列試劑 12 μ 1 5 X 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10 μ 1 dNTPs (2. 5mmol/L)，6 μ 1 DTT (0. lmol/L)，1 μ 1 0. Immo 1/ L Oligo (dT) 15,0. 5 μ 1 RNase 抑制劑(Taara 公司)，1 μ 1 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(invitrogen 公司，200ιι/μ 1)，然后在42°C保溫1小時(shí)。三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各候選基因的組織表達(dá)特異性由于ZmGAPDH在玉米各組織表達(dá)量一致，所以檢測(cè)玉米各基因的相對(duì)表達(dá)量一般使用ZmGAPDH作為內(nèi)參基因，采用如下引物對(duì)其cDNA進(jìn)行擴(kuò)增正向引物序列Pl:5' -CCTGCTTCTCATGGATGGTT-3‘ (SEQ ID No 2)；反向引物序列P2 5 ‘ -TGGTAGCAGGAAGGGAAACA-3 ‘ (SEQ ID No 3)。采用如下引物擴(kuò)增ZmPEPl基因的cDNA 正向引物序列P3:5' -ATGCAGAACACTGGCTAGG-3‘ (SEQ ID No 4)；反向引物序列P4:5' -TTTCCACTTGGACTTGACAAC-3‘ (SEQ ID No 5)。反應(yīng)體系如下10μ1 2XReal-time PCR Master Mix(Toyobo 公司)，0· 1 μ 1cDNA, 2 μ 1 正向引物(lymol/L)禾口 2μ 1 反向弓|物(lymol/L),5. 1 μ 1 ddH20。反應(yīng)條件為94°C30s, 54°C 60s, 72°C 20s, 45 個(gè)循環(huán)。ZmGAPDH和 ZmPEPl 的讀板溫度分別為84°C和85°C。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖可知，相比于ZmGAPDH基因的表達(dá)量，ZmPEPl 基因在玉米心葉中高表達(dá)，在根和莖中幾乎不表達(dá)。四、ZmPEP 1啟動(dòng)子的克隆1.玉米葉片總DNA的提取用CTAB法提取植物葉片的總DNA。在液氮中磨碎2g樣品，加入:3ml 2 X CTAB (2% w/v),并添加 1. 4mol/LNaCl、0. 2 % (ν/ν)巰基乙醇、20mmol/LEDTA 和 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，60°C保溫45min，在加入等體積酚/氯仿，12000rpm室溫離心lOmin。將上清液轉(zhuǎn)入新印pendorf管中，再加入氯仿己戊醇(體積比對(duì)1)抽提，上清液加入兩倍體積乙醇置室溫沉淀20min后，12000rpm、4°C離心15min，去除上清液。沉淀分別用70% 乙醇洗滌一次，DNA沉淀干燥后溶于100 μ 1 ddH20中。2. ZmPEPl啟動(dòng)子的克隆以葉片的總DNA為模板，擴(kuò)增ZmPEPl的啟動(dòng)子，所使用的引物如下正向引物序列P5:5' -GAAAAAACATTGTGAAAGGAG-3‘ (SEQ ID No 6)；反向引物序列P6:5' -ACCTGTGGTTAGGAACTC-3‘ (SEQ IDNo 7)。反應(yīng)體系如下2μ1 總 DNA，5y 1 10X 緩沖液，3 μ 1 MgSO4 (25mmol/L), 5 μ IdNTPs (2mmol/L) ,KOD DNA 聚合酶 1 μ 1,32. 5μ 1 ddH20,1 μ 1 正向引物(20ymol/L)和 1μ 1 反向引物(20ymol/L)。反應(yīng)條件為98°C 10s，50°C 30s，68°C 65s，36個(gè)循環(huán)。經(jīng)電泳檢測(cè)獲得長(zhǎng)1976bp 的DNA片段，測(cè)序得SEQ ID No 1所示序列。上述實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證各候選基因在玉米各組織的相對(duì)表達(dá)量，并克隆在心葉特異高表達(dá)基因-ZmPEPl的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子有望在以后的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因育種中有重要的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種玉米心葉特異性啟動(dòng)子，具有如下a)或b)的核苷酸序列a)序列表中SEQID No 1所示的核苷酸序列；b)在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQID No 1限定的DNA序列雜交，且具有相同功能的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于，所述嚴(yán)格條件為在0.1 X SSPE和0. 1 % SDS的溶液中，或者在0. IXSSC和0. SDS的溶液中，65 °C條件下雜交并洗膜。
3.含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。
4.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米心葉特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子為玉米ZmPEP1基因的啟動(dòng)子，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或者是在嚴(yán)格條件下可與該序列雜交，且具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子具有心葉組織特異性，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物育種領(lǐng)域，通過(guò)構(gòu)建含有該啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到植物(例如玉米)中，驅(qū)動(dòng)下游基因在植物心葉中特異表達(dá)，達(dá)到育種目的。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102373201SQ201010247328
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者徐唯濤, 洪龍, 瞿禮嘉, 顧紅雅, 高遠(yuǎn), 魏桐 申請(qǐng)人:北京大學(xué)