專利名稱：一種鑒別豬、牛、羊肉及其制品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬、牛、羊肉及其制品的鑒別方法，具體地說，涉及一種利用DNA 分析鑒別豬、牛、羊肉及其制品的方法。
背景技術(shù)：
目前，對于特殊動物成分的物種鑒定方法主要有三種酶聯(lián)免疫吸附測定法 ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)，顯微鏡結(jié)構(gòu)分析方法和DNA分析方法。其中，DNA分析方法是一種較新的鑒定方法，該方法運用了 PCR擴增技術(shù)(polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，這種技術(shù)可以在幾個小時的時間內(nèi)將微量的目的基因成百萬倍的擴增，非常靈敏，而且操作簡單。由于PCR技術(shù)具有以上這些優(yōu)點，近年來建立了大量基于該技術(shù)的分析方法，用于鑒定食品中的物種組成。PCR技術(shù)(polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴增出足量的 DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2 4分鐘，2 3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍，其到達(dá)平臺期(Plateau)所需的循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動力學(xué)PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴增量可用Y = (1+X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，X表示平均擴增效率，η代表循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內(nèi)，形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)(Agarose gel Electrophoresis)是以瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法。電泳法，是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核苷酸等)在惰性支持介質(zhì) (如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，于電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。瓊脂糖凝膠電泳的基本原理瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3. 6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈在氫鍵及其它力的作用下使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數(shù)成反比；分子構(gòu)型也對遷移率有影響，如共價閉環(huán)DNA >直線DNA >開環(huán)雙鏈 DNA。當(dāng)凝膠濃度太高時，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA(球形)不能進(jìn)入膠中，相對遷移率為0， 而同等大小的直線DNA(剛性棒狀)可以按長軸方向前移，相對遷移率大于0。凝膠電泳產(chǎn)物經(jīng)EB溴化乙錠染色后在紫外光下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。本發(fā)明通過PCR技術(shù)和凝膠電泳技術(shù)，利用一對檢測引物鑒別生鮮豬牛羊的線粒體DNA，從而將豬、牛、山羊、綿羊區(qū)分開來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于鑒別豬、牛、羊及其制品的PCR引物。本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述引物的試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供鑒別豬、牛、羊及其制品的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的用于鑒別豬、牛、羊及其制品的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2所示。本發(fā)明根據(jù) NCBI (National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術(shù)信息中心)的基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到的豬、牛、羊的線粒體DNA全序列，選取 Sus scrofa、Bos taurus 和 Ovis aries 的線粒體基因組序列，經(jīng)過 Bioedit 軟件 ClustalW Multiple alignment程序分析，從比對結(jié)果中找到保守區(qū)域，在保守區(qū)域設(shè)計引物，并且選擇低保守高特異區(qū)為擴增區(qū)域，通過primer premier 5軟件評估引物對，從而選出本發(fā)明的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1和2所示。本發(fā)明還提供含有上述引物的用于鑒別豬、牛、羊肉及其制品的試劑盒。所述試劑盒還包括擴增緩沖液、DNA聚合酶和dNIPs。本發(fā)明的鑒別豬、牛、羊肉及其制品的方法，包括如下步驟1)提取樣品DNA;
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2)以樣品DNA為擴增模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴增；其中，PCR擴增體系具體為反應(yīng)體系)上述上下游引物各0.5yL(終濃度 IOmM)、0· 125 μ LGo tag DNA 聚合酶(Promga)、5 μ L5XBuffer、2 μ LdNTPs (2. 5mM)、 16. 38 μ L無菌雙蒸水、0. 5 μ L樣品DNA ；3)然后經(jīng)重量體積分?jǐn)?shù)為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓為150 300V ；電泳結(jié)束后，將凝膠置于EB染缸，20min后在紫外光照射下成像。其中，步驟2)中的 PCR 反應(yīng)程序為95°C 5min、94°C 30s、50°C 30s,72°C 30s，進(jìn)行 35 個循環(huán)；72 °C 7min。步驟1)提取樣品DNA的具體步驟如下用剪子將肉樣剪碎后在研缽中研磨，取 0. Ig 樣品放入 2mL 離心管中，加入 ImL CTAB 提取液(CTAB 20g/L、NaCl 1. 4mol/L、Tris 0. lmol/L、Na2EDTA0. 02mol/L、PH = 8. 0)和 20 μ L 20mg/mL 蛋白酶 K 水溶液，充分震蕩， 65°C水浴0. 5 lh，不時震蕩；降至室溫后以12000g離心15min ；取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的酚和氯仿/異戊醇混合溶劑，氯仿與異戊醇的體積比為M 1，充分震蕩后，以12000g離心IOmin ；取上清液并轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇混合溶劑，氯仿與異戊醇的體積比為M 1，充分震蕩后，以12000g離心IOmin ；取上清液并轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入0. 1倍體積的3mol/L NaAc和2/3倍體積的異丙醇，離心管放入-20°C靜置濁以上；然后以12000g離心15min，倒去液體部分留下沉淀，用70% (體積) 乙醇洗滌并在空氣中干燥沉淀，然后用100 μ L無菌水溶解。本發(fā)明所述樣品，豬肉、牛肉樣品均為市售，羊肉樣品采自內(nèi)蒙古寶昌的屠宰場， 所有樣品均置于-20°C冷凍保存。本發(fā)明選擇豬、牛、羊的線粒體DNA作為檢測的靶基因，其原因是(1)線粒體DNA 在動物細(xì)胞內(nèi)有大量的拷貝數(shù)，在取等量的肉樣DNA進(jìn)行PCR檢測時，線粒體基因的模板數(shù)大大高于細(xì)胞核染色體基因模板數(shù)，這就大大提高了 PCR檢測的敏感度；( 許多動物線粒體基因組已被完全測序，不同種類的動物線粒體基因組序列雖然高度同源，存在高度保守區(qū)域，但也存在一定的變異區(qū)域，本實驗根據(jù)豬牛羊線粒體基因中高度保守的區(qū)域設(shè)計引物，而且所選引物產(chǎn)生的特異片段存在于低度保守區(qū)域，從而能夠鑒別三種生鮮肉類，檢測的靈敏度高。本發(fā)明的鑒定方法只限于生鮮肉類及其生鮮制品的鑒定，不能用于肉類加工食品中復(fù)雜動物成分的鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明的鑒別方法只需要一對PCR引物就能對生鮮豬、牛、羊進(jìn)行種類鑒定，相對于分別用不同引物進(jìn)行豬、牛、羊種類鑒定的現(xiàn)有鑒別方法，本發(fā)明方法更簡單、快速；基于本發(fā)明方法，不僅可以快速且靈敏的檢測市場中生鮮肉類是否摻假， 而且對豬個體鑒定和溯源研究也具有重要的意義。


圖1為不同生鮮肉類基因組DNA的PCR擴增結(jié)果，其中1為豬肉、2為牛肉、3為山羊肉、4為綿羊肉；并以IOObp ladder作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，片段大小為1000、900、800、700、 600、500、400、300、200、100bp。圖2為不同濃度的生豬肉基因組DNA的PCR擴增結(jié)果，其編號1 9的濃度分別為 128ng/μ L、12. 9ng/μ L、1. Ong/μ L、0. 5ng/μ L、128pg/μ L、64pg/μ L、42pg/μ L、32pg/ μ L>25pg/μ L。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例11)提取樣品DNA:取0. Ig樣品，用剪子將肉樣剪碎后在研缽中研磨，并轉(zhuǎn)移至 2mL的離心管中，向離心管中加入ImL CTAB提取液(CTAB 20g/L、NaCl 1. 4mol/L、Tris 0. lmol/L、Na2EDTA0. 02mol/L、PH = 8. 0)和 20 μ L 蛋白酶 K(20mg/mL)，充分震蕩離心管后， 65°C水浴lh，不時震蕩；降至室溫后以12000g離心15min ；取上清后轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的酚和氯仿/異戊醇混合溶劑(氯仿與異戊醇的體積比為M 1)，充分震蕩離心管后，以12000g離心IOmin ；混合液分層后取上層清液并轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇混合溶劑(氯仿與異戊醇的體積比為M 1)，充分震蕩離心管后，以12000g 離心IOmin ；取上層清液并轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入1/10倍體積的NaAc (濃度為3mol/L) 和2/3倍體積異丙醇，離心管放入-20°C靜置濁以上或過夜；以12000g離心15min后，倒去液體部分留下沉淀，用70% (體積)乙醇洗滌并在空氣中干燥DNA沉淀，向沉淀中加入 100 μ L無菌水溶解。2)以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列為上游引物；以SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列為下游引物，以步驟1)的樣品DNA為擴增模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR擴增體系為(25 μ L反應(yīng)體系)上述上下游引物各0. 5 μ L (終濃度IOmM)、 0. 125 μ L Go tag DNA聚合酶(Promga)、5 μ L5 XBuffer、2 μ LdNTPs (2. 5mM)、16. 38 μ L無菌雙蒸水、0. 5yL樣品DNA;3)然后經(jīng)重量體積分?jǐn)?shù)為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓150V ；電泳結(jié)束后，將凝膠置于EB染缸，20min后在凝膠成像體統(tǒng)的紫外光照射下成像。實施例2PCR擴增結(jié)果分別以豬肉、牛肉、山羊肉及綿羊肉為樣品，用實施例1方法分別對上述樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，四種樣品PCR擴增后均能得到單一的DNA條帶，并且豬、牛、羊的DNA擴增條帶大小不一，和期望的片段大小一致(如表1所示)。表1用于物種線粒體特異片段擴增的寡核苷酸序列
權(quán)利要求
1.用于鑒別豬、牛、羊肉及其制品的PCR引物，其核苷酸序列如SEQID No. 1和2所示。
2.含有如權(quán)利要求1所述引物的用于鑒別豬、牛、羊肉及其制品的試劑盒。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其還包括擴增緩沖液、DNA聚合酶和dNIPs。
4.一種鑒別豬、牛、羊肉及其制品的方法，其特征在于，包括如下步驟1)提取樣品DNA；2)以樣品DNA為擴增模板，用權(quán)利要求1所述引物進(jìn)行PCR擴增；3)然后經(jīng)重量體積分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓為150 300V ；電泳結(jié)束后， 將凝膠置于EB染缸，20min后在紫外光照射下成像。
5.如權(quán)利要求4所述的鑒別方法，其特征在于，步驟2)中的PCR反應(yīng)程序為 950C 5min、94°C 30s,50°C 30s,72°C 30s，進(jìn)行 35 個循環(huán)；72°C 7min。
6.如權(quán)利要求4或5的鑒別方法，其特征在于，步驟1)的具體步驟如下用剪子將肉樣剪碎后在研缽中研磨，取0. Ig樣品放入2mL的離心管中，加入ImL CTAB提取液和 20 μ L20mg/mL蛋白酶K水溶液，充分震蕩，65°C水浴0. 5 lh，不時震蕩；降至室溫后以 12000g離心15min ；取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的酚和氯仿/異戊醇混合溶劑，氯仿與異戊醇的體積比為M 1，充分震蕩后，以12000g離心IOmin;取上清液并轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇混合溶劑，氯仿與異戊醇的體積比為M 1，充分震蕩后，以12000g離心IOmin ；取上清液并轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入0. 1倍體積的3mol/L NaAc和2/3倍體積的異丙醇，離心管放入-20°C靜置2h以上；然后以12000g離心15min，倒去液體部分留下沉淀，用70%乙醇洗滌并在空氣中干燥沉淀，然后用IOOyL無菌水溶解。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于鑒別豬、牛、羊肉及其制品的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。本發(fā)明還提供了含有上述引物的試劑盒以及鑒別豬、牛、羊肉及其制品的方法。本發(fā)明方法結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，能快速檢測市場中生鮮肉類是否摻假，對個體鑒定和溯源研究也具有重要的意義。本發(fā)明的鑒別方法只需要一對PCR引物就能對生鮮豬、牛、羊進(jìn)行種類鑒定，更簡單、快速；本發(fā)明方法不僅可以快速且靈敏的檢測市場中生鮮肉類是否摻假，而且對豬個體鑒定和溯源研究也具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102337328SQ201010237540
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者宛煜嵩, 張秀杰, 金蕪軍, 阮泓越 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所