專利名稱：大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中的水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)鑒定技術(shù)，具體涉及一種養(yǎng)殖魚類大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，適合在大菱鲆養(yǎng)殖和育種中進(jìn)行種質(zhì)鑒定和家系管理。
背景技術(shù)：
在中國(guó)稱“多寶魚”的大菱鲆是原產(chǎn)于歐洲沿海的一種名貴比目魚，它具有生長(zhǎng)速 度快，肉質(zhì)好，養(yǎng)殖和市場(chǎng)潛力大等優(yōu)點(diǎn)，相繼成為各國(guó)開發(fā)的優(yōu)良海水養(yǎng)殖魚類之一。自 1992年引進(jìn)我國(guó)后，大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在我國(guó)得到迅速發(fā)展，現(xiàn)已經(jīng)成為我國(guó)北方沿海重要 的魚類養(yǎng)殖品種。但是，由于我國(guó)不是大菱鲆的原產(chǎn)地，養(yǎng)殖生產(chǎn)中長(zhǎng)期依賴于歐洲大菱鲆 原產(chǎn)國(guó)提供、補(bǔ)充種源。同時(shí)，由于累代養(yǎng)殖和近親交配比較嚴(yán)重，國(guó)內(nèi)大菱鲆產(chǎn)業(yè)普遍出 現(xiàn)了種質(zhì)退化現(xiàn)象。主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度降低、白化率增高、出苗率降低等現(xiàn)象。因此種質(zhì) 資源優(yōu)化、良種選育已經(jīng)成為我國(guó)大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展急待解決的重要課題 之一。家系選育是獲得優(yōu)良品種的重要手段。家系選育過(guò)程中，保持完整、準(zhǔn)確的系譜信 息可以有效指導(dǎo)親本選留，從而避免近交衰退現(xiàn)象。大菱鲆良種培育中，為了實(shí)現(xiàn)家系遺傳 參數(shù)的準(zhǔn)確評(píng)估，需要早期對(duì)不同家系進(jìn)行混養(yǎng)。而采用物理標(biāo)記對(duì)幼體進(jìn)行標(biāo)識(shí)存在較 大的局限性，如標(biāo)記存續(xù)時(shí)間短，成本高、工作量大，幼體達(dá)到標(biāo)記大小才能標(biāo)記，無(wú)法完全 消除環(huán)境誤差等問(wèn)題。因此，選用有效的分子標(biāo)記，進(jìn)行高通量的親子鑒定和家系管理已成 為大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，用于大菱鲆親子鑒 定和家系管理，以克服現(xiàn)有技術(shù)的親子鑒定方法不能高通量檢測(cè)、誤差大的不足。本發(fā)明采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)與多重PCR技術(shù)，根據(jù)已有序列設(shè)計(jì)無(wú)熒光標(biāo)記的 PCR引物，篩選多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，將多對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物放在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，從而建立了在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)擴(kuò)增多個(gè)微衛(wèi)星引物的多重PCR方法，再應(yīng) 用微衛(wèi)星多重PCR方法獲得基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行親子鑒定。本發(fā)明包括以下四個(gè)步驟一 )、大菱鲆個(gè)體DNA提取；二)、大菱鲆多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成；三)、大菱鲆多重PCR體系的構(gòu)建；四)、家系和親子鑒定；其具體操作如下一)、大菱鲆個(gè)體DNA提取將大菱鲆鰭條采用常規(guī)的酚/氯仿方法提取親本和子代DNA，把獲得的DNA測(cè)定濃度后，稀釋至lOOng/μ 1。二 )、大菱鲆多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成根據(jù)現(xiàn)有的微衛(wèi)星標(biāo)記序列，設(shè)計(jì)引物，合成非熒光標(biāo)記微 衛(wèi)星引物，并運(yùn)用大菱 鲆家系親本和家系個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增；篩選出獲得清晰條帶的引物，選擇在已知親本中擴(kuò) 增出2個(gè)及以上DNA條帶的微衛(wèi)星標(biāo)記作為多態(tài)性標(biāo)記，根據(jù)篩選獲得的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo) 記設(shè)計(jì)多重PCR。本發(fā)明從18 對(duì)大菱鲆微衛(wèi)星標(biāo)記 Sma2380、Sma2994、Sma 1880, Sma2010、 Sma2132、Sma2432、Sma_USC25、Sma_USC19、Sma_USC52、Sma_USC20、Sma_USC34、Sma_USC29、 Sma-USC27、Sma-USC 100, Sma-USC 184, Sma_USC103、Sma-USC 174, Sma_USC226 中蹄選出 13 對(duì)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記引物進(jìn)行組合設(shè)計(jì)多重PCR反應(yīng)，最終獲得Sma-USC25、Sma-USClOO, Sma-USC103、Sma_USC29、Sma2380、Sma2994、Sma_USC19、Sma226 共 8 對(duì)引物組合的 2 個(gè)多 重PCR體系。三)、大菱鲆多重PCR體系的構(gòu)建將上述獲得的8對(duì)引物利用軟件Primer Premier 5. 0進(jìn)行多重PCR組合設(shè)計(jì)。 由于使用非熒光標(biāo)記引物，為了適應(yīng)多重PCR中在同一體系中各引物退火溫度基本一致， 不同引物擴(kuò)增等位基因的識(shí)別，對(duì)Sma-USC29引物進(jìn)行重新設(shè)計(jì)命名為Sma-USC29-l，經(jīng)反 應(yīng)條件及反應(yīng)體系優(yōu)化后獲得2個(gè)多重PCR體系，多重PCR體系1引物組合為Sma-USC25、 Sma-USClOO, Sma_USC103、Sma-USC29_l ；多重 PCR 體系 2 引物組合為 Sma2380、Sma2994、 Sma-USC19、Sma226。本發(fā)明的多重PCR體系1為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積15 μ L，包括IOOng基因組DNA， 10XPCR 緩沖液 1. 5μ L, 1. 5mM Mg2+，IUTaq 酶，dNTPO. 2mM,引物 Sma_USC25、Sma-USClOO, Sma-USC103、Sma-USC29_l 引物分別為 0. 25 μ Μ。PCR 反應(yīng)條件為95°C變性 5min ；95°C變 性 45s，58°C退火 50s，72°C延伸 50s，10 個(gè)循環(huán)；95°C變性 30s, 55. 5°C退火 50s，72°C延伸 50s，25個(gè)循環(huán)；95°C變性30s, 50°C退火50s, 72°C延伸50s, 10個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min,最后 10°C保存。本發(fā)明的多重PCR反應(yīng)體系2為每個(gè)PCR反應(yīng)總體積15μ 1，包括IOOng基因 組 DNA，10XPCR 緩沖液 1. 5 μ L, 1. 5mM Mg2+，IU Taq 酶，dNTPO. 2mM, Sma2380、Sma2994、 Sma-USC19、Sma226 引物分別為 0. 25 μ Μ、0· 3 μ Μ、0· 25 μ Μ、0· 25 μ Μ。PCR 反應(yīng)條件為:95 V 變性 5min ；95°C 變性 45s，57 °C 退火 50s，72 °C 延伸 50s，10 個(gè)循環(huán)；95°C 變性 30s，55 °C 退 火 50s，72°C延伸 50s，25 個(gè)循環(huán)；95°C，30s，50°C 50s, 72°C 50s, 10 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min， 10°C保存。四)、家系和親子鑒定將多重PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染后獲得的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖， 利用pBR322分子量標(biāo)準(zhǔn)判定等位基因條帶大小，以已知親本基因型為參照，統(tǒng)計(jì)分析獲得 待測(cè)個(gè)體微衛(wèi)星標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)，將上述基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成(0. 1)矩陣，再采用NTsys軟件 進(jìn)行聚類分析，將那些聚在一支的個(gè)體認(rèn)為來(lái)源于同一家系，聚在不同支的個(gè)體來(lái)源于不 同家系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)個(gè)體的系譜認(rèn)證；將上述基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字基因型格式，采用 Cervus2. 0軟件進(jìn)行分析，根據(jù)待測(cè)個(gè)體基因型和親本基因型之間相關(guān)性的大小確定待測(cè) 個(gè)體是哪個(gè)親本的后裔，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)個(gè)體的親子鑒定。
首先解釋PCR擴(kuò)增條帶的命名規(guī)則，用Sma-USC25-a為例Sma-USC25為微衛(wèi)星引物的名稱，a表示擴(kuò)出的片段最小的條帶，按升序依次命名本引物擴(kuò)增得到的其他條帶，如 Sma-USC25-b, Sma-USC25-c…。然后按照下面的步驟進(jìn)行家系和親子鑒定1.確定親本和子代個(gè)體在各微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型通過(guò)2個(gè)多重PCR反應(yīng)對(duì)親本樣品進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝 膠電泳、銀染后獲得的條帶進(jìn)行基因分型，根據(jù)各引物等位基因片段大小確定親本在各微 衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型，以PBR322DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)作為等位基因片段大小的依據(jù)，確定個(gè)體 基因型。由小到大分別命名為 Sma-USC25-a，Sma-USC25_b，Sma-USC25_c，Sma-USC25_d， Sma-USC25-e 等。2.子代個(gè)體的家系鑒定將上述基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成(0. 1)矩陣，再采用NTsys軟件進(jìn)行聚類分析，將那些聚 在一支的個(gè)體認(rèn)為來(lái)源于同一家系，聚在不同支的個(gè)體來(lái)源于不同家系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè) 個(gè)體的家系鑒定。3.個(gè)體親子鑒定將上述基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字基因型格式，采用CerVUS2. 0軟件進(jìn)行分析，根據(jù) 待測(cè)個(gè)體基因型和親本基因型之間相關(guān)性的大小確定待測(cè)個(gè)體是哪個(gè)親本的后裔，從而實(shí) 現(xiàn)對(duì)待測(cè)個(gè)體的親子鑒定。本發(fā)明將微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)和多重PCR技術(shù)相結(jié)合，利用8對(duì)微衛(wèi)星多態(tài)性引物建 立了 2個(gè)微衛(wèi)星多重PCR體系，進(jìn)行大菱鲆家系高通量個(gè)體系譜識(shí)別和親子鑒定。現(xiàn)有的 簡(jiǎn)單PCR方法只能在一個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，而本發(fā)明的方法可以在一個(gè)PCR 反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，因此與原有的簡(jiǎn)單PCR方法相比提高效率4倍左右，大 大提高了親子鑒定的效率和速度；并且檢測(cè)費(fèi)用也僅為原來(lái)的三分之一左右。分析表明有 97. 14%的個(gè)體準(zhǔn)確聚類到各自家系中；親子鑒定分析結(jié)果表明96. 42%的個(gè)體可以準(zhǔn)確 確定其父母。與常見熒光標(biāo)記多重PCR相比，該方法設(shè)備要求低、適應(yīng)性更廣，可以實(shí)現(xiàn)養(yǎng) 殖基地現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本發(fā)明方法的建立為大菱鲆種質(zhì)鑒定和良種選育提供了新的技術(shù)手段。


圖1是本發(fā)明140個(gè)體NTsys聚類分析圖(顯示40個(gè)代表性個(gè)體)圖2是本發(fā)明70個(gè)雙盲個(gè)體聚類分析結(jié)果(Mega4. 0)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (通過(guò)已知家系的親本和子代樣品來(lái)驗(yàn)證本發(fā)明的準(zhǔn)確性)一 )、大菱鲆個(gè)體DNA提取采集大菱鲆7個(gè)家系親本11尾(親本缺失3尾)及相應(yīng)的子代個(gè)體尾鰭材料 140尾，采用酚氯仿方法提取高純度鰭條DNA 取少量鰭條放入離心管中并加入DNA提取液 TENS(IOmMTris-CI，pH8. 0 ；IOOmM EDTA, pH8. 0 ；IOOmM NaCl ；0. 5% SDS)加入蛋白酶 K 和 RNA酶消化2-3小時(shí)，其間震蕩幾次使鰭條充分消化，然后再加入等體積的酚/氯仿/異戊 醇溶液，混勻直至形成乳狀液，室溫下離心，取上清，重復(fù)抽提兩次。向上清液中加入2倍體 積的冰冷無(wú)水乙醇，使DNA沉淀10-30分鐘。70%乙醇漂洗沉淀，TE (IOmM Tris-HCl,pH8. 0 ；IOmM EDTA，pH8. 0)溶解DNA。測(cè)定DNA濃度后，將上述個(gè)體的DNA稀釋至50ng/μ 1。-20°C 保存?zhèn)溆枚?、大菱鲆多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成 根據(jù)現(xiàn)有的微衛(wèi)星標(biāo)記序列，設(shè)計(jì)引物，采用非熒光標(biāo)記方法合成微衛(wèi)星標(biāo)記引 物，并運(yùn)用大菱鲆家系親本和家系個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增；篩選出獲得清晰條帶的引物，選擇在 已知親本中擴(kuò)增出2個(gè)及以上DNA條帶的微衛(wèi)星標(biāo)記作為多態(tài)性標(biāo)記，根據(jù)該多態(tài)性微衛(wèi) 星標(biāo)記的序列設(shè)計(jì)多重PCR的引物，采用非熒光標(biāo)記方法合成多重PCR引物；1、大菱鲆多重PCR候選微衛(wèi)星引物來(lái)源采用已有微衛(wèi)星引物Sma2380、Sma2994、Sma 1880, Sma2010、Sma2132、Sma2432、 Sma-USC 19、Sma_USC20、Sma_USC25、Sma_USC27、Sma_USC29、Sma_USC34、Sma_USC52、 Sma-USClOO, Sma_USC103、Sma-USC 174, Sma-USC 184, Sma_USC226 用表 1 中的 18 對(duì)微衛(wèi)星 引物在已知親本中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，選擇在已知親本中能夠 擴(kuò)增出2個(gè)以上等位基因的微衛(wèi)星標(biāo)記作為多態(tài)性標(biāo)記用于進(jìn)行多重PCR設(shè)計(jì)。本發(fā)明中 從上述18對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物中篩選獲得引物13對(duì)(見表1中星號(hào)標(biāo)注引物)，為滿足多 重PCP設(shè)計(jì)中引物組合擴(kuò)增片段大小的要求，對(duì)Sma-USC20和Sma-USC29依據(jù)其序列對(duì)引 物重新設(shè)計(jì)分別命名為Sma-USC20-l和Sma-USC29-l (見表1)。不同引物組合經(jīng)篩選，最后 獲得8個(gè)位點(diǎn)組合的2個(gè)多重PCR體系(見表2)。表1 用于多態(tài)性篩選的18對(duì)大菱鲆微衛(wèi)星引物序列和重新設(shè)計(jì)的2對(duì)引物及其
反應(yīng)條件
TCore repeatPrimer sequencesτ , orl. GenBank
Locus,「 ‘ ‘ ο， 、Im ( L).
sequences(.5 to J )accession no.
IΤ"~~ ^F: AGAGAGAAGAGGTGGCTGGGTAA~~~~~~~
Sma2380*(CG)6n(GATG)5R: CTTCCCTCCGTCTACGCTCC55DQ659659
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Sma2994*(AT)23H(TCA)3R; CCGCTGCCTTTATGTGAGM50職59675
Smal880*(CT),2n(CT)5F: AAGGCTTTTGGGTDQ659632
R:CACCATAACAACCACAAATGTTCA c 0Λ η*^tt,F: ACCCGCCCACTACAGGATGC
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W132(CAG)'A(CAG)'R:CATGCCATAGTGAAACATCAATAC52職59645 其中F向引物R反向引物2.微衛(wèi)星引物的PCR擴(kuò)增條件的確定以11尾家系親本大菱鲆基因組DNA為模板，優(yōu)化18對(duì)微衛(wèi)星引物的PCR反應(yīng)條 件。PCR反應(yīng)體系如下上游引物(10μ Μ)0. 4μ L下游引物(10μ Μ)0. 4μ L10XPCR buffer (含 Mg2+)1 · 5 μ LTaq DNA polymerase (5u/ μ L) 0. 1 μ LdNTPs (2. 5mM)0. 6 μ L基因組DNAl.OyLddH2011. 0μ L_總體積15. OyLPCR反應(yīng)條件為95°C變性5min ；95°C變性30s，引物對(duì)應(yīng)的退火溫度(表1)下退 火50s，72°C延伸50s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后再72°C延伸5min，最后10°C保存。3.微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳采用北京六一儀器廠DYY-10C電泳儀和DYY-20C序列分析電泳槽，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物通過(guò)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法染色，固定。聚丙烯酰胺凝膠的制備方法如下50mL的6%的丙烯酰胺溶液(6%丙烯酰胺膠的配制方法28. 5g丙烯酰胺粉末+1. 5g甲叉雙丙烯酰胺+210g尿素+25mL 20 X的TBE溶液， 加水定容至500mL，過(guò)濾，4°C保存。)中加入40 μ L的TEMED溶液和120 μ L 10%的過(guò)硫酸 銨溶液(APS，IOg過(guò)硫酸銨融于IOOmL的ddH20中)。混合均勻后，立刻向已準(zhǔn)備好的兩塊 固定好玻璃板中灌膠。為避免出現(xiàn)氣泡，灌膠過(guò)程中可用吸耳球輕輕敲打玻璃表面，使液體 最前端盡可能呈一條直線。待玻璃板中膠灌滿之后，將梳子背部插入膠中，一般經(jīng)1. 5-2h， 丙烯酰胺膠凝固后即獲得聚丙烯酰胺凝膠。電泳液使用IXTBE溶液。電泳參數(shù)為電壓 1500V，功率50W，電流50mA。預(yù)電泳15min后，變性后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣3. 6 μ L，正式電 泳約2. 5h。電泳完成后進(jìn)行聚丙烯酰胺膠的銀染染色和顯色，具體步驟如下(1)將PAGE膠放在IL的70%乙醇中固定約lOmin。(2)回收乙醇后，加IL純水進(jìn)行水洗約5min。(3)倒掉純水后，加IL的染色液(將1. 5g硝酸銀粉末溶于IL純水中)進(jìn)行銀染 色約 10-15min。(4)回收染色液后，加IL的純水進(jìn)行水洗約5s。(5)倒掉純水后，加IL的顯色液(將15g NaOH粉末、4mL甲醛溶液溶于IL純水 中)進(jìn)行顯色直至條帶清晰。(6)倒掉顯色液后，加IL純水進(jìn)行水洗。(7)待膠面晾干后，用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照保存。根據(jù)上述結(jié)果獲得能夠擴(kuò)增出2個(gè)以上等位基因的13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)用作多重PCR 設(shè)計(jì)。將獲得退火溫度作為設(shè)計(jì)多重PCR反應(yīng)條件的依據(jù)。4.微衛(wèi)星引物的合成在商業(yè)生物技術(shù)公司采用非熒光標(biāo)記方法合成多態(tài)性微 衛(wèi)星標(biāo)記引物。三)、大菱鲆多重PCR體系的構(gòu)建1.多重PCR體系構(gòu)建和條件優(yōu)化 將上述獲得的候選13對(duì)引物利用Primer Premier5. O進(jìn)行多重PCR組合設(shè) 計(jì)，為了適應(yīng)多重PCR需要對(duì)個(gè)別引物GENBANK上獲得序列進(jìn)行引物重新設(shè)計(jì)命名為 Sma-USC20-l和Sma-USC29-l，引物組合要求具備各引物有較好的相容性，引物間相互不形 成二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，且各引物擴(kuò)增條帶分散、無(wú)交叉重疊現(xiàn)象便于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生的條帶進(jìn) 行基因型判定，經(jīng)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化后獲得包含8個(gè)位點(diǎn)的2個(gè)多重PCR體系， 分別命名為多重PCR反應(yīng)體系1和多重PCR反應(yīng)體系2。多重PCR反應(yīng)體系1為每個(gè)PCR 反應(yīng)總體積 15 μ L，包括 IOOng 基因組 DNA, IOXPCR 緩沖液 1. 5 μ L，Mg2+(l. 5mM)，IUTaq 酶， dNTPO. 2mM。Sma_USC25、Sma-USClOO, Sma_USC103、Sma-USC29_l 引物分別為 0· 25 μ Μ。反 應(yīng)條件為95°C變性5min ；95°C變性45s，58°C退火50s，72°C延伸50s，10個(gè)循環(huán)；95°C變性 30s, 55. 5°C退火 50s, 72°C延伸 50s，25 個(gè)循環(huán)；95°C變性 30s，50°C退火 50s, 72°C延伸 50s， 10個(gè)循環(huán)，72°c延伸5min，10°C保存。 多重PCR反應(yīng)體系2的引物組合為Sma2380、Sma2994、Sma-USC 19和Sma226。每 個(gè) PCR 反應(yīng)總體積 15 μ L IOOng 基因組 DNA，10XPCR 緩沖液 1. 5μ L, Mg2+(1. 5mM), IUTaq 酶，dNTPO. 2mM。Sma2380、Sma2994、Sma_USC19、Sma226 引物各 0. 25 μ M、0. 3 μ M、0. 25 μ Μ、0. 25 μ Μ。PCR反應(yīng)條件為:95°C變性 5min ；95°C變性 45s，57°C退火 50s，72°C延伸 50s，10 個(gè) 循環(huán)；95°C變性30s，55°C退火50s，72°C延伸50s，25個(gè)循環(huán)；95°C變性30s，50°C退火50s， 72°C延伸508，10個(gè)循環(huán)，721延伸5min，10°C保存。表2 大菱鲆2個(gè)多重PCR體系的引物序列 其中F正向引物R反向引物四)、家系和親子鑒定1.確定親本和家系個(gè)體各微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因型通過(guò)2個(gè)多重PCR反應(yīng)對(duì)11個(gè)親本樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙 烯酰胺凝膠電泳、銀染后獲得的電泳圖。依據(jù)電泳圖對(duì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因進(jìn)行分型， 根據(jù)各引物目的產(chǎn)物大小，以PBR322分子量標(biāo)準(zhǔn)為參照，確定樣品在各微衛(wèi)星位點(diǎn)的基 因型，依據(jù)等位基因片段由小到大分別命名Sma-USC25-a (315bp)，Sma-USC25_b (343bp)， Sma-USC25-c (420bp)，Sma-USC25_d (432bp)，Sma-USC25_e (452bp)…等，表 3 為多重 PCR 體 系中各微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增獲得的等位基因大小信息。表3 多重PCR微衛(wèi)星引物等位基因信息 將親本樣品在每個(gè)微衛(wèi)星引物的擴(kuò)增條帶記錄下，建立每個(gè)親本的基因型數(shù)據(jù) 表。表4列出了部分親本，部分引物的基因型數(shù)據(jù)表。表4部分個(gè)體基因型數(shù)據(jù) 注sma25所在的列表示引物名稱，1-1所在的行是個(gè)體的樣品編號(hào)，1-1表示家系 1的第一個(gè)個(gè)體，2-1表示家系2的第一個(gè)個(gè)體；引物和樣品的交叉格為樣品在此微衛(wèi)星引 物擴(kuò)增得等位基因信息。2.確定子代個(gè)體微衛(wèi)星標(biāo)記基因型通過(guò)2個(gè)多重PCR反應(yīng)對(duì)子代樣品140進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯 酰胺凝膠電泳、銀染后獲得的條帶進(jìn)行等位基因分型，根據(jù)pBR322Marker作為DNA片段大 小的標(biāo)準(zhǔn)，并參照親本的等位基因的條帶來(lái)確定子代樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記基因型，3.聚類分析和家系鑒定將140個(gè)個(gè)體基因型數(shù)據(jù)(基因型數(shù)據(jù)表參照表5)轉(zhuǎn)換為NTsys軟件所需的(0， 1)矩陣，矩陣如表5所示表5部分個(gè)體(0，1)矩陣表 再用NTsys軟件計(jì)算遺傳距離，得到遺傳距離矩陣(表6)表6部分個(gè)體遺傳距離矩陣 再用NTsys軟件根據(jù)遺傳距離矩陣進(jìn)行聚類分析，將那些聚在一支的個(gè)體認(rèn)為 來(lái)源于同一家系，聚在不同支的個(gè)體來(lái)源于不同家系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同個(gè)體的系譜認(rèn)證。 NTsys聚類結(jié)果表明，同一家系聚為一支，97. 14%個(gè)體聚類結(jié)果與實(shí)際情況一致(圖1)。4.親子鑒定
將上述不同家系個(gè)體的基因型數(shù)據(jù)(表5所示的)轉(zhuǎn)換為CerVUS2. 0軟件所需數(shù) 字基因型格式(表7)進(jìn)行個(gè)體排除率分析和親子鑒定。表7將表5的部分基因型數(shù)據(jù)表轉(zhuǎn)換為數(shù)字基因型格式 注數(shù)字代表微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因片段大小按照CerVUS2. O要求對(duì)基因型進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行等位基因頻率分析 (Allelefrequency)(表 10)、模擬分析(Simulation analysis)禾口親子分析(Parentage analysis)，根據(jù)待測(cè)個(gè)體基因型和親本基因型之間相關(guān)性的大小確定某一個(gè)體是哪個(gè)親 本的后裔，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)個(gè)體的親子鑒定，在雙親未知條件下的累積排除率為96. 58% ； 已知一個(gè)親本的累積排除率為99. 71%，親子分析結(jié)果表明96. 42%個(gè)體找到了他們的父 母親本。表8微衛(wèi)星各位點(diǎn)家系遺傳信息及排除率 注樣本量為140 ；NS表示差異不顯著；*表示差異顯著，P < 0. 05 ；Excl (1)表示 親本未知排除率；Excl (2)已知1個(gè)親本的排除率以上結(jié)果表明本發(fā)明的微衛(wèi)星多重PCR方法可以高效的實(shí)現(xiàn)對(duì)7個(gè)大菱鲆家系個(gè) 體的系譜認(rèn)證和親子鑒定，其鑒定準(zhǔn)確率達(dá)95%以上，能夠滿足遺傳育種中系譜分析和家 系管理的要求。實(shí)施例2多重PCR體系在家系親子鑒定中的實(shí)際應(yīng)用(對(duì)未知來(lái)源個(gè)體進(jìn)行系譜 分析和親子鑒定)
利用上面建立的兩個(gè)多重PCR體系對(duì)70尾來(lái)自7個(gè)不同家系的待測(cè)個(gè)體進(jìn)行雙 盲檢測(cè)，鑒定70個(gè)個(gè)體的家系來(lái)源，進(jìn)一步證實(shí)兩個(gè)多重PCR體系在系譜認(rèn)證和親子鑒定 中應(yīng)用的可行性，具體步驟如下一)、大菱鲆個(gè)體DNA提取；提取方法如實(shí)施例1，將70尾樣品的DNA稀釋至lOOng/μ 1，_20°C保存。二)、家系和親子鑒定；1、獲得樣品基因型通過(guò)2個(gè)多重PCR反應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6 %聚丙烯酰 胺凝膠電泳，銀染、獲得聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，統(tǒng)計(jì)獲得樣品的基因型數(shù)據(jù)(見表9)表9部分雙盲個(gè)體聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的數(shù)字基因型數(shù)據(jù)(7個(gè)個(gè)體) 2.聚類分析和家系鑒定將基因型數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為NTsys軟件所需的(0，1)矩陣，運(yùn)用NTsys軟件和 Cervus2. 0軟件分別計(jì)算個(gè)體間遺傳距離和進(jìn)行親子分析。NTsys2. 1軟件計(jì)算獲得遺傳距 離矩陣轉(zhuǎn)化為Mega4. 0格式進(jìn)行70個(gè)個(gè)體的聚類分析，經(jīng)過(guò)與實(shí)際信息比對(duì)，聚類結(jié)果為 95. 71%能夠找到他們的家系歸屬(圖2)。3.親子鑒定將基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為CerVUS2. 0軟件所需數(shù)字基因型格式，用于進(jìn)行親子鑒定分 析，Cervus2. 0分析結(jié)果顯示在雙親未知條件下的累積排除率為94. 82%，已知一個(gè)父母的 累積排除率為99. 50%，親子分析表明70個(gè)體中的66個(gè)體找到了他們的父母雙親，鑒定準(zhǔn) 確率為94.29% (表10)。表10部分雙盲個(gè)體親子鑒定結(jié)果 注※表示親子鑒定結(jié)果預(yù)期家系不符個(gè)體；m表示母本；f表示父本綜上所述，本發(fā)明建立的兩個(gè)微衛(wèi)星多重PCR體系，能夠有效的實(shí)現(xiàn)大菱鲆系譜 分析和大菱鲆家系個(gè)體的親子鑒定，該方法在信息未知的條件下進(jìn)行雙盲分析其親子鑒定 準(zhǔn)確率達(dá)94. 29%,MEGA聚類分析95. 71 %個(gè)體能夠與預(yù)期結(jié)果一致，因此兩個(gè)多重PCR體 系的建立可以實(shí)現(xiàn)在家系選育早期對(duì)混合家系群體的管理。
權(quán)利要求
大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于包括一)、大菱鲆個(gè)體DNA提??；二)、大菱鲆多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成；三)、大菱鲆多重PCR體系的構(gòu)建；四)家系和親子鑒定四個(gè)步驟，其中多重PCR反應(yīng)體系1的微衛(wèi)星引物為Sma-USC25、Sma-USC100、Sma-USC103、Sma-USC29-1的組合；多重PCR反應(yīng)體系2的微衛(wèi)星引物為Sma2380、Sma2994、Sma-USC19、Sma226的組合，各引物信息如下
2.如權(quán)利要求1所述的大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于上述的多 重PCR反應(yīng)體系1和多重PCR反應(yīng)體系2的微衛(wèi)星引物為非熒光標(biāo)記引物。
3.如權(quán)利要求1所述的大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于上述多重 PCR 反應(yīng)體系 1 包括 IOOng 基因組 DNA, 10XPCR 緩沖液 1. 5 μ L，1. 5mMMg2+，IU Taq 酶，dNTP 0. 2mM，引物 Sma-USC25、Sma-USClOO, Sma_USC103、Sma-USC29_l 分別為 0. 25 μ Μ,每個(gè) PCR 反應(yīng)總體積15 μ L ；PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min ；95°C變性45s，58°C退火50s，72°C延 伸50s, 10個(gè)循環(huán)；95°C變性30s, 55. 5°C退火50s, 72°C延伸50s, 25個(gè)循環(huán)；95°C變性30s， 50°C退火50s，72°C延伸508，10個(gè)循環(huán)，721延伸5min，最后10°C保存。
4.如權(quán)利要求1所述的大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于上述的多 重PCR反應(yīng)體系2包括IOOng基因組DNA，10XPCR緩沖液1. 5 μ L，1. 5mM Mg2+，IU Taq酶， dNTPO. 2mM，引物 Sma2380、Sma2994、Sma_USC19、Sma226 分別為 0. 25 μ M、0. 3 μ M、0. 25 μ Μ、 0. 25 μ Μ,每個(gè)PCR反應(yīng)總體積15 μ 1 ；PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min ；95°C變性45s，57°C 退火50s，72°C延伸50s，10個(gè)循環(huán)；95°C變性30s，55°C退火50s，72°C延伸50s，25個(gè)循環(huán)； 95°C變性 30s，50°C退火 50s，72°C延伸 50s，10 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min，10°C保存。
5.如權(quán)利要求1所述的大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于上述的 家系和親子鑒定步驟是將多重PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染后獲得的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，利用PBR322分子量標(biāo)準(zhǔn)判定等位基因條帶大小，統(tǒng)計(jì)分析獲得待測(cè)個(gè)體微衛(wèi)星標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)，將上述基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成(0. 1)矩陣，再采用NTsys軟件進(jìn)行聚類 分析，將那些聚在一支的個(gè)體認(rèn)為來(lái)源于同一家系，聚在不同支的個(gè)體來(lái)源于不同家系， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)不同個(gè)體的家系鑒定；將上述基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字基因型格式，采用 Cervus2. 0軟件進(jìn)行分析，根據(jù)待測(cè)個(gè)體基因型和親本基因型之間相關(guān)性的大小確定待測(cè) 個(gè)體是哪個(gè)親本的后裔，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)個(gè)體的親子鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大菱鲆親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，包括大菱鲆個(gè)體DNA提取、大菱鲆多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和引物合成、大菱鲆多重PCR體系的構(gòu)建及家系和親子鑒定。本發(fā)明建立了進(jìn)行大菱鲆家系和親子鑒定的2個(gè)多重PCR反應(yīng)體系，將待測(cè)個(gè)體進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增、電泳、銀染后分析獲得微衛(wèi)星標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)，再采用NTsys軟件進(jìn)行家系鑒定的聚類分析，采用Cervus2.0軟件進(jìn)行親子鑒定分析。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，因此與原有的PCR方法相比效率提高了4倍左右，并可以在養(yǎng)殖基地現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本發(fā)明具有高效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，可以在大菱鲆種質(zhì)鑒定、家系管理和良種選育進(jìn)行推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101880719SQ20101022786
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者徐營(yíng), 杜民, 楊景峰, 苗貴東, 陳松林 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所