專利名稱：鯉魚背肌中組織蛋白酶l的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶分離純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鯉魚背肌中組織蛋白酶L的分離純化 方法。
背景技術(shù)：
組織蛋白酶cathepsin是在各種動物組織的細胞內(nèi)(特別是溶酶體部分)發(fā)現(xiàn)的 一類蛋白酶。此名源自希臘語的“消化”，為威爾斯達特(R.Willst0atter，1929)命名的。 它是廣泛存在于病毒、細菌、真菌、原生動物及原蟲、植物、哺乳動物和人的溶酶體內(nèi)的一種 酶，屬于胞內(nèi)蛋白酶。弱酸性環(huán)境中易被活化，是一類在堿性和中性溶液中不穩(wěn)定的糖蛋白 (除組織蛋白酶D、E、S外)。到目前為止，組織蛋白酶A到Z都有報道，基本是按照發(fā)現(xiàn)的 順序命名的。按組織蛋白酶的催化活性中心可分為三種，絲氨酸蛋白酶(如A、G、R)、天冬 氨酸蛋白酶(如D、E)和半胱氨酸蛋白酶(如B、C、H、L、S等)。組織蛋白酶L(cath印sin L CL)屬于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶， 以酶原的形式貯存于生物體的溶酶體中，相對分子質(zhì)量為30000。在正常情況下，大約10% 的酶原被生理性分泌至胞質(zhì)，然后可被其他的蛋白水解酶水解或自身激活，切除N端和C端 多余的氨基酸殘基形成相對分子質(zhì)量為24000的活性形式，參與許多特殊的生理過程，如 激素原的激活、抗原呈遞、組織器官的發(fā)育等。對于人類而言，在病理狀態(tài)下，各種原因所致的細胞損傷(如病原微生物、炎癥因 子、氧化應(yīng)激等)，導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低，通透性增高甚至破裂，大量CL釋放到胞質(zhì)或 組織間隙，并被激活，可降解細胞成分或細胞間質(zhì)基質(zhì)成分，包括層粘素、IV型膠原纖維及 纖維連接素等，與人類許多疾病如腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、阿爾茨海姆病、多 發(fā)性硬化癥及其他慢性炎癥性疾病有關(guān)。純化CL并研究其各種性質(zhì)，有助于針對各類CL 相關(guān)病癥研發(fā)專用藥物。在魚類的加工過程中，特別是魚糜加工、貯運過程中，與其他組織蛋白酶相比，CL 活性高、穩(wěn)定性強，能夠降解魚肉、魚糜蛋白質(zhì)的主要組成成分肌原纖維，導(dǎo)致魚肉、魚糜品 質(zhì)劣化。為了有效抑制或消除CL的劣質(zhì)影響，分離純化出CL，充分研究其酶學(xué)性質(zhì)，具有重 要的學(xué)術(shù)價值；對于實際生產(chǎn)中有效指導(dǎo)篩選其有效可食性抑制劑具有重要意義。另一方面，分離純化出CL也有助于今后充分利用其高效蛋白水解性能，開發(fā)食品 嫩化劑、飼料酶制劑、洗滌日用酶制劑以及化妝領(lǐng)域?qū)Ｓ妹钢苿?。目前國?nèi)外對于淡、海水魚類內(nèi)臟中的CL純化已見報道，但是魚類加工過程中內(nèi) 臟一般都會去除，對肉質(zhì)有影響作用的應(yīng)該是肌肉中的CL。目前對于鯉魚背肌中CL的分離 純化尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種從鯉魚背肌中分離純化組 織蛋白酶L(CL)的方法。利用本發(fā)明的方法可以獲得凝膠電泳檢測單一組分的CL。
本發(fā)明包括如下步驟步驟(1)取鯉魚背肌白肉a克，加入b毫升的20毫摩爾/升(mM) Tris-鹽酸緩沖 液勻漿，在離心機轉(zhuǎn)子溫度為3 5°C、6000 X g 6500 X g條件下離心15 20min，得到上 清液；所述的Tris-鹽酸緩沖液pH為6. 8 7. 5，a b = 1 5 10 ；步驟(2)將上清液于55 65°C條件下加熱3 5min，置于冰水冷卻，在離心機轉(zhuǎn) 子溫度為3 5°C、8000Xg 8500Xg條件下離心15 20min，獲得粗酶液；步驟(3)將得到的粗酶液經(jīng)過疏水性凝膠層析，收集具有活性的組分并合并；所 述的活性的組分由CL專一性底物(Z-Phe-Arg-MCA)活性測定方法得到；步驟(4)將合并后的活性的組分經(jīng)過離子交換層析，再次收集具有活性的組分并 合并；步驟(5)加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達到70%，離心獲得沉淀；步驟(6)在得到的沉淀中加入的Macllvaine緩沖液復(fù)溶，得到高濃度的部分純化 酶液；所述的Macllvaine緩沖液復(fù)溶pH為2. 5 3. 5 ；步驟(7)進行超濾濃縮，去除比CL分子量低的蛋白質(zhì)；步驟(8)進行體積排阻高效液相(SEC-HPLC)分離，最終獲得CL ；對獲得的純化酶進行了酶學(xué)性質(zhì)檢驗，其催化底物選擇性實驗結(jié)果表明該純化酶 只能催化水解CL的專一性底物Z-Phe-Arg-MCA ；最適pH為5. 5，最適溫度為60°C ；能夠被 CL的專一性抑制劑E-64完全抑制活性，被激活劑DTT、EDTA所激活；以上結(jié)果證實了按本 發(fā)明的操作步驟所獲得的純化酶為組織蛋白酶L(CL)。本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益的效果是1.首先將樣品進行熱處理，使得熱不穩(wěn)定性的其他酶類變性，初步達到去除雜質(zhì) 的效果，為下一步純化提供了便利，是分離純化良好的基礎(chǔ)。2.通過酸化處理，將CL從其與天然抑制劑的復(fù)合體中成功分離，達到有效去除天 然抑制劑的目的，與以往的分離提取技術(shù)相比，分離效果好，獲得的CL得率高、純度好。3.充分利用了 CL的性質(zhì)，除了熱處理、酸化處理外，通過離子交換層析去除與CL 性質(zhì)相近的其他組織蛋白酶類(如B、H型)，還采用超濾技術(shù)與體積排阻高效液相分別去 除低于和高于CL分子量的雜質(zhì)蛋白質(zhì)。采用的方法均比較溫和，獲得的CL不但純度高，活 力保持亦較好。
具體實施例方式實施例1 取鮮活鯉魚背部白色肉50g，加入500mL的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)，勻漿 后于3°C條件下6000 X g離心20min，獲得上清液。將上清液置于60°C水浴4min后，冰浴冷 卻，3°C條件下8000 X g離心20min，獲得上清液。上清液作為粗酶液上樣到已經(jīng)洗脫液平衡 好的 Phenyl-S印harose 柱上(內(nèi)徑 1. 5cm,高度 20cm)，以 20mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7· 5) 洗脫，流速為0.5ml/min。收集具有酶活性的洗脫液，合并，進一步以20mM Tris-HCl緩沖 液(PH7. 5)透析純化。所得樣品再上樣到預(yù)平衡好的DEAE-Bio-Gel A柱上(內(nèi)徑1. 5cm, 高度15cm)，以20mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)洗脫一夜，以0 300mM NaCl梯度洗脫 (總體積300ml)。收集具有酶活性的洗脫液，加入70%飽和濃度的硫酸銨，離心分離獲得
4沉淀，以兩倍體積的PH3. 0的MacIlvaine緩沖液(含ImM EDTA-ImM β -巰基乙醇作為 CL的保護劑)復(fù)溶，獲得高濃度的部分純化酶液，經(jīng)Centricon 10超濾裝置超濾去除低 分子量的蛋白組分和解離出的CL天然抑制劑。超濾獲得的組分經(jīng)排阻層析高效液相系統(tǒng) SEC-HPLC (Superose 12HR 10/30 柱，Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden ；連 ^ Bio-Rad HPLC pump, Model 2700, Bio-Radlaboratories, Inc. ， Hercules, CA ；L UV 檢測裝置)，進樣量為ΙΟΟμΙ (蛋白含量5-10mg)，以50mM磷酸緩沖液(pH7. 2)洗脫，流速 為0. 5ml/min,0. 5ml收集樣品檢測其活性，保留時間為23. 9min時檢測到活性峰，與魚肉提 取的上清液酶活相比，純化倍數(shù)為54. 9倍。實施例2 取鮮活鯉魚背部白色肉50g，加入250mL的20mM Tris-HCl緩沖液(pH6. 8)，勻漿 后于4°C條件下6200 X g離心15min，獲得上清液。將上清液置于55°C水浴5min后，冰浴冷 卻，4°C條件下8300Xg離心15min，獲得上清液。上清液作為粗酶液上樣到已經(jīng)洗脫液平衡 好的 Phenyl-S印harose 柱上(內(nèi)徑 1. 5cm,高度 20cm)，以 20mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7· 5) 洗脫，流速為0.5ml/min。收集具有酶活性的洗脫液，合并，進一步以20mM Tris-HCl緩沖 液(PH7. 5)透析純化。所得樣品再上樣到預(yù)平衡好的DEAE-Bio-Gel A柱上(內(nèi)徑1. 5cm, 高度15cm)，以20mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)洗脫一夜，以0_300mM NaCl梯度洗脫(總 體積300ml)。收集具有酶活性的洗脫液，加入70%飽和濃度的硫酸銨，離心分離獲得沉 淀，以兩倍體積的PH2. 5的MacIlvaine緩沖液(含ImM EDTA-ImM β -巰基乙醇作為CL 的保護劑)復(fù)溶，獲得高濃度的部分純化酶液，經(jīng)Centricon 10超濾裝置超濾去除低分 子量的蛋白組分和解離出的CL天然抑制劑。超濾獲得的組分經(jīng)排阻層析高效液相系統(tǒng) SEC-HPLC (Superose 12HR 10/30 柱，Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden ；連 ^ Bio-Rad HPLC pump, Model 2700, Bio-Rad laboratories, Inc. ，Hercules, CA ；L UV 檢測裝置)，進樣量為ΙΟΟμΙ (蛋白含量5-10mg)，以50mM磷酸緩沖液(pH7. 2)洗脫，流速 為0. 5ml/min,0. 5ml收集樣品檢測其活性，保留時間為23. Smin時檢測到活性峰，與魚肉提 取的上清液酶活相比，純化倍數(shù)為50. 2倍。實施例3 取鮮活鯉魚背部白色肉45g，加入360mL的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)，勻漿 后于5°C條件下6500 X g離心18min，獲得上清液。將上清液置于65°C水浴3min后，冰浴冷 卻，5°C條件下8500Xg離心17min，獲得上清液。上清液作為粗酶液上樣到已經(jīng)洗脫液平衡 好的 Phenyl-S印harose 柱上(內(nèi)徑 1. 5cm,高度 20cm)，以 20mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7· 5) 洗脫，流速為0.5ml/min。收集具有酶活性的洗脫液，合并，進一步以20mM Tris-HCl緩沖 液(PH7. 5)透析純化。所得樣品再上樣到預(yù)平衡好的DEAE-Bio-Gel A柱上(內(nèi)徑1. 5cm, 高度15cm)，以20mM Tris-HCl緩沖液(pH7. 5)洗脫一夜，以0_300mM NaCl梯度洗脫(總 體積300ml)。收集具有酶活性的洗脫液，加入70%飽和濃度的硫酸銨，離心分離獲得沉 淀，以兩倍體積的PH3. 5的MacIlvaine緩沖液(含ImM EDTA-ImM β -巰基乙醇作為CL 的保護劑)復(fù)溶，獲得高濃度的部分純化酶液，經(jīng)Centricon 10超濾裝置超濾去除低分 子量的蛋白組分和解離出的CL天然抑制劑。超濾獲得的組分經(jīng)排阻層析高效液相系統(tǒng) SEC-HPLC (Superose 12HR 10/30 柱，Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden ；連 ^ Bio-Rad HPLC pump, Model 2700, Bio-Radlaboratories, Inc. ， Hercules, CA ；L UV檢測裝置)，進樣量為100 μ 1 (蛋白含量5-10mg)，以50mM磷酸緩沖液(ρΗ7· 2)洗脫，流速 為0. 5ml/min,0. 5ml收集樣品檢測其活性，保留時間為23. 9min時檢測到活性峰，與魚肉提 取的上清液酶活相比，純化倍數(shù)為48. 5倍。
權(quán)利要求
鯉魚背肌中組織蛋白酶L的分離純化方法，其特征在于該方法包括如下步驟步驟(1)取鯉魚背肌白肉a克，加入b毫升的20毫摩爾/升Tris-鹽酸緩沖液勻漿，在離心機轉(zhuǎn)子溫度為3～5℃、6000×g～6500×g條件下離心15～20min，得到上清液；所述的Tris-鹽酸緩沖液pH為6.8～7.5，a∶b＝1∶5～10；步驟(2)將上清液在55～65℃條件下加熱3～5min，置于冰水冷卻，在離心機轉(zhuǎn)子溫度為3～5℃、8000×g～8500×g條件下離心15～20min，獲得粗酶液；步驟(3)將得到的粗酶液經(jīng)過疏水性凝膠層析，收集具有活性的組分并合并；所述的活性的組分由組織蛋白酶L專一性底物活性測定方法得到；步驟(4)將合并后的活性的組分經(jīng)過離子交換層析，再次收集具有活性的組分并合并；步驟(5)加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達到70％，離心獲得沉淀；步驟(6)在得到的沉淀中加入的MacIlvaine緩沖液復(fù)溶，得到高濃度的部分純化酶液；所述的MacIlvaine緩沖液pH為2.5～3.5；步驟(7)將高濃度的部分純化酶液進行超濾濃縮，去除比組織蛋白酶L分子量低的蛋白質(zhì)；步驟(8)進行體積排阻高效液相分離，最終獲得純化后的組織蛋白酶L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組織蛋白酶L的分離純化方法。本發(fā)明的組織蛋白酶L粗酶液先通過熱處理游離出該酶，同時消除其他熱不穩(wěn)定性酶的影響，通過離心獲得粗酶。隨后經(jīng)過疏水性凝膠層析，再經(jīng)離子交換柱層析去除與組織蛋白酶L性質(zhì)相近的其他組織蛋白酶如B、H、S型等，收集有酶活性的組分后通過70％硫酸銨沉淀。沉淀經(jīng)緩沖液復(fù)溶，此過程同時可將組織蛋白酶L從其與其天然抑制劑形成的復(fù)合體中解離，經(jīng)超濾凈化去除低分子量的酶抑制劑并濃縮目標酶。濃縮液經(jīng)體積排阻高效液相分離后獲得組織蛋白酶L。本發(fā)明獲得的CL不但純度高而且活力保持亦較好。
文檔編號C12N9/64GK101886065SQ20101021006
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者劉東紅, 葉興乾, 吳丹, 胡亞芹, 陳健初 申請人:浙江大學(xué)