專利名稱：Pina-D1r缺失型小麥的鑒定方法及其特異性引物與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠駷镻ina-Dlr的PINA 蛋白缺失型小麥的方法及其特異性引物與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
籽粒硬度是國(guó)內(nèi)外小麥?zhǔn)袌?chǎng)分級(jí)和定價(jià)的重要依據(jù)，嚴(yán)重影響著小麥的磨粉和食 品加工品質(zhì)，是目前最為重要的品質(zhì)性狀之一。近年來，隨著小麥品質(zhì)性狀研究的日趨深 入，籽粒硬度也越來越受到更多的關(guān)注。籽粒硬度是一個(gè)受基因控制的具有較高遺傳力的 性狀，該性狀的分子生物學(xué)改良已經(jīng)在最近十幾年內(nèi)成為一個(gè)較為熱門的研究課題，目前 研究表明，籽粒硬度主要受位于5D染色體短臂上的一對(duì)主效基因控制，并已經(jīng)相繼發(fā)現(xiàn)了 多個(gè)籽粒硬度主效基因等位變異類型，不同變異類型之間除硬度數(shù)值有較大差異外，磨粉 和食品加工品質(zhì)也具有明顯差異。同時(shí)，多項(xiàng)研究也均表明，硬度值過高如PINA蛋白缺失 類型品種反而對(duì)小麥加工品質(zhì)造成一定的負(fù)面影響，因此選育不同類型的專用小麥品種 時(shí)，籽粒硬度基因型是一個(gè)非常重要的選擇指標(biāo)。而之前多項(xiàng)研究也均表明，PINA蛋白缺失類型在CIMMYT硬質(zhì)麥中一直占據(jù)有主 導(dǎo)地位，同時(shí)在我國(guó)春麥區(qū)尤其是東北春麥區(qū)也占有很高的比例，這對(duì)我國(guó)小麥的品種改 良較為不利。而由于該類型分子機(jī)制較為復(fù)雜，其大多數(shù)為包括編碼區(qū)在內(nèi)的大片段缺失， 很難直接利用PCR技術(shù)直接用于鑒定和分析該類型，盡管Chen等已開發(fā)了其中一種PINA 蛋白缺失類型(Pina-Dlb)的分子標(biāo)記，但由于PINA蛋白缺失類型較多，難以全部檢測(cè)，因 此，目前仍需結(jié)合改進(jìn)的SDS-PAGE或雙向電泳技術(shù)對(duì)PINA蛋白缺失類型進(jìn)行檢測(cè)，這無疑 極大提高了檢測(cè)成本和降低了檢測(cè)效率。因此，進(jìn)一步明確該類型的分子機(jī)制，并開發(fā)相應(yīng) 的分子標(biāo)記，從而使用標(biāo)記篩選方法進(jìn)行品質(zhì)改良將會(huì)大大加快我國(guó)小麥品質(zhì)育種進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可直接在分子水平上進(jìn)行檢測(cè)且能大大加 快籽粒硬度基因型的篩選效率和準(zhǔn)確度的Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定方法及其特異性引 物與應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是本發(fā)明保護(hù)序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對(duì)。所 述特異性引物對(duì)為與小麥籽粒硬度Pina基因有關(guān)的分子標(biāo)記，特別為一種可鑒定小麥籽 粒硬度PINA蛋白缺失類型(Pina-Dlr)的分子標(biāo)記。上游引物5，-TCAACATTCGTGCATCATCA-3，(序列表的序列1)；下游引物5，-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3‘(序列表的序列2、。本發(fā)明提供一種Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定方法，包括如下步驟1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異引物 對(duì)為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對(duì)；
2)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中有436bp條帶的待測(cè)小麥為候選的Pina-Dlr缺 失型小麥；所述Pina-Dlr缺失型小麥的基因組DNA的Ha位點(diǎn)有10415bp片段的缺失，即Ha 位點(diǎn)缺失序列表中序列3所示的核苷酸。所述Pina-Dlr缺失型小麥可為如下小麥品種中的任意一種江東門、和尚頭和紅蜷芒。Pina-Dlr缺失型小麥引起小麥中PINA(Pina)蛋白不能表達(dá)，所以所述方法可應(yīng) 用于輔助篩選PINA蛋白缺失型小麥。本發(fā)明提供一種非Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定方法包括如下步驟1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異引物 對(duì)為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸組成的引物對(duì)；2)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有436bp條帶的待測(cè)小麥為候選的非 Pina-Dlr缺失型小麥；所述非Pina-Dlr缺失型小麥?zhǔn)腔蚪MDNA中具有序列表的序列3所 示核苷酸的小麥。所述非Pina-Dlr缺失型小麥可為中國(guó)春或豫農(nóng)202。所述方法可應(yīng)用于輔助篩選非PINA蛋白缺失型小麥。所述特異性引物對(duì)可應(yīng)用于制備鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠駷镻ina-Dlr缺失型小麥的試 劑盒。所述特異性引物對(duì)還可應(yīng)用于制備鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠駷榉荘ina-Dlr缺失型小麥的 試劑盒。所述特異性引物對(duì)也可應(yīng)用于制備輔助篩選硬麥(硬質(zhì)麥)的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，所述試劑盒包括所述特異性引物對(duì)。所述試劑盒可用 于鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠駷镻ina-Dlr缺失型小麥或鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠駷榉荘ina-Dlr缺失型小 麥或輔助篩選硬麥(硬質(zhì)麥)。本發(fā)明還保護(hù)一種輔助篩選硬麥的方法，包括如下步驟1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異引物 對(duì)為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對(duì)；2)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中有436bp條帶的待測(cè)小麥為候選的硬麥。所述硬麥可為如下品種小麥中的任意一種江東門、和尚頭和紅蜷芒。本發(fā)明具有積極有益的效果所提供的特異引物對(duì)(分子標(biāo)記)能夠取代傳統(tǒng)的SDS-PAGE和雙向電泳技術(shù)，直 接在分子水平上進(jìn)行Pina-Dlr類型的檢測(cè)，準(zhǔn)確度和可信度大大提高，能大大加快籽粒硬 度基因型的篩選效率和準(zhǔn)確度，對(duì)小麥籽粒硬度的基因工程改良起到重要作用，同時(shí)也有 助于小麥籽粒硬度的遺傳和分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究，對(duì)優(yōu)良小麥品種的培育也具有重大
眉、ο


圖1為測(cè)定Pina-Dlr類型缺失片段大小的引物步移法19對(duì)引物設(shè)計(jì)圖；圖2為SDS-PAGE電泳圖；從左向右依次為中國(guó)春、江東門、紅蜷芒和和尚頭，上 下箭頭依次為PINA和PINB蛋白；圖3為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，從左向右，第1泳道為DNAladder DL2000 ；第2、3和4泳道為小麥品種江東門；第5、6和7泳道為小麥品種紅蜷芒；第8和9泳道為小麥品種和尚頭；第10泳道為陰性對(duì)照(即水做模板進(jìn)行擴(kuò)增)；第11和12泳道 分別為中國(guó)春和豫農(nóng)202。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容并不局限于下述具 體實(shí)施例。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的 試驗(yàn)材料，如無特別說明，均購(gòu)自常規(guī)生化試劑商店。； Chen F, Beecher B, Morris CF. Physical mapping and anew variant of Puroindoline b~2 genes in wheat. Theoretical and Applied Genetics, 2010,120 :745_751?！爸袊?guó)春”是中國(guó)四川的一個(gè)地方品種，是目前世界上最常用 的野生型普通小麥對(duì)照品種。豫農(nóng)202 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)；孫繼冰.小麥新品種豫農(nóng)202最佳播期研究.種業(yè)導(dǎo)刊， 2009,6 :20-21?！霸マr(nóng)202”河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥分子育種室2007年育成的小麥品種。和尚頭河南農(nóng)業(yè)大學(xué)；董瓏麗，魏茶花，馬曉娟，張榮.春小麥競(jìng)爭(zhēng)能力與產(chǎn)量的 關(guān)系.生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27 =4023-4028.和尚頭是我國(guó)早期應(yīng)用較為普遍的一個(gè)地方品種。紅蜷芒河南農(nóng)業(yè)大學(xué)；薛飛，翟雯雯，段霞瑜，周益林，吉萬(wàn)全.小麥地方品種小 白冬麥抗白粉病基因分子標(biāo)記.作物學(xué)報(bào)，2009，35 :1806-1811。紅蜷芒是我國(guó)早期應(yīng)用較 為普遍的一個(gè)地方品種。江東門河南農(nóng)業(yè)大學(xué)；石元春主編.二十世紀(jì)中國(guó)學(xué)術(shù)大典-農(nóng)業(yè)科學(xué)中國(guó)小 麥育種上貢獻(xiàn)卓越的品種.2002 16-19.江東門是我國(guó)早期在長(zhǎng)江中下游地區(qū)應(yīng)用范圍較 大的一個(gè)地方品種。實(shí)施例1不同小麥品種籽粒硬度的測(cè)定檢測(cè)5個(gè)小麥品種的籽粒硬度(中國(guó)春、豫農(nóng)202、紅蜷芒、江東門、和尚頭)。籽 粒硬度測(cè)定方法用單粒谷物硬度儀(SKCS 4100，瑞典Perten公司)測(cè)定300粒小麥樣品 的硬度值，根據(jù)測(cè)定結(jié)果確定籽粒的硬度級(jí)別，同時(shí)記錄千粒重和籽粒直徑。SKCS分析結(jié)果表明，5個(gè)小麥品種中，中國(guó)春屬于軟麥，其余4個(gè)小麥品種均為硬 麥(硬度均在60以上)。SKCS硬度平均值分別為中國(guó)春為12，豫農(nóng)202為60，江東門為 73，和尚頭為61，紅蜷芒為70。實(shí)施例2特異性引物對(duì)的發(fā)現(xiàn)以江東門、和尚頭和紅蜷芒為實(shí)驗(yàn)材料采用引物步移法進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。弓丨物 設(shè)計(jì)如圖1所示，引物擴(kuò)增為采用最佳退火溫度重復(fù)擴(kuò)增三次。其中第1、2、3、4、15、16、 17、18和19對(duì)引物能夠擴(kuò)增出目標(biāo)片段，而第5、6、7、8、9、10、11、12、13和14對(duì)引物則不 能擴(kuò)增出目標(biāo)片段，表明缺失片段發(fā)生在第4對(duì)引物的下游和第15對(duì)引物的上游序列之 間，然后在第5對(duì)引物和第14對(duì)引物之間重新設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，得到了 436bp 的片段。將片段進(jìn)行測(cè)序后，與野生型Ha位點(diǎn)(NCBI編號(hào)CT009735)的同序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn) Pina-Dlr類型Ha位點(diǎn)序列缺少了 10415bp的片段缺失，缺失片段為自Pina基因第-5118bp 位核苷酸(相對(duì)于起始密碼子ATG)至+5301位核苷酸，缺失片段核苷酸序列見序列表3。特異性引物對(duì)如下上游引物5，-TCAACATTCGTGCATCATCA-3，(序列表的序列1)；
下游引物5，-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3‘(序列表的序列2)。實(shí)施例3應(yīng)用特異性引物對(duì)鑒定Pina-Dlr缺失型小麥5個(gè)小麥品種中國(guó)春(軟麥)、豫農(nóng)202 (硬麥)、江東門(硬麥)、紅蜷芒(硬麥) 和和尚頭(硬麥)。分別對(duì)上述5個(gè)小麥品種按如下步驟進(jìn)行鑒定(1) SDS-PAGE鑒定各個(gè)小麥品種是否屬于PINA蛋白缺失類型①提取籽粒蛋白每個(gè)品種的小麥取一粒種子，分別按下述步驟提取籽粒蛋白1)研磨后放入一個(gè) 2mL離心管中，加入ImL預(yù)冷的TBS溶液和0. 15mL 12% Triton-Xl 14(Sigma公司)，混合 后4°C放置12 24h ；2) 12000rpm離心3分鐘，移上清至1. 5mL離心管中，37°C溫育半小時(shí)； 3) 12000rpm離心5min，棄上清，移下層至一新的離心管中，加入ImL預(yù)冷的TBS溶液，37°C 溫育30min ；4) 12000rpm離心3min，棄上清，加入900 μ L預(yù)冷的丙酮，渦旋后在_20°C冰箱 中放置30min ；5) 12000rpm離心2min，棄上清，用丙酮再洗一遍后置于空氣中進(jìn)行干燥，得 到小麥籽粒蛋白。②SDS-PAGE電泳鑒定a)向步驟1提取的籽粒蛋白中加入150 μ L樣品緩沖液(含7. 57mg/mL Tris, 10% 甘油，0. 02mg/mL SDS, 0. 0125mg/mL 溴酚蘭)；b)將加入樣品緩沖液的籽粒蛋白在70°C下溫育15min，取25μ L進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳條件為用濃縮膠(濃度T為4%，膠聯(lián)度C為2. 67%)在40mA下電泳，待 指示劑到達(dá)分離膠(濃度T為13. 5 %，膠聯(lián)度C為2. 6 % )后將電壓功率轉(zhuǎn)換成12W，待 指示劑到達(dá)分離膠底部后再電泳30min。為減少蛋白的擴(kuò)散，用10%甘油代替水配制分 離膠。凝膠配制時(shí)用PDA^iperiazinediacrylamide)代替甲叉以使背景更為清晰，膠更 加結(jié)實(shí)和富有彈性。按 Morris 等(Morris C F, Massa A N. Puroindoline genotype of the U.S.nationalinstitute of standards & technology reference material 8441, wheathardness. Cereal Chemistry, 2003,80 674-678)的方法進(jìn)行染色(用三氯乙酸和甲 醇固定、銀染顯色，用檸檬酸停止顯色)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，除中國(guó)春和豫農(nóng)202具有PINA蛋白，其余材料均屬于 PINA蛋白缺失類型。部分樣品電泳結(jié)果見圖2。(2) PCR鑒定各個(gè)小麥品種是否屬于Pina-Dlb缺失型小麥每個(gè)品種的小麥取有代表性的一粒種子，提取基因組DNA作為模板，采用 Pina-Dlb基因全長(zhǎng)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(用Pinb基因全長(zhǎng)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增作為對(duì) 照)，以保證DNA質(zhì)量。參照Chen等(2010)開發(fā)的標(biāo)記，鑒定是否屬于Pina-Dlb類型引物對(duì)(詳見申請(qǐng) 號(hào)為201010033760. 4的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng))引物 3 (上游)5，-AATACCACATGGTTCTAGATACTG-3，；引物 4 (下游)5，-GCAATACAAAGGACCTCTAGATT-3，?？刂艱NA質(zhì)量所用的Pinb基因全長(zhǎng)引物對(duì)引物 5 (上游)5，-GAGCCTCAACCCATCTATTCATC-3，；
引物 6 (下游)5，-CAAGGGTGATTTTATTCATAG-3，。
PCR反應(yīng)體系的組成1. 5mmol/L MgCl2,0. 3mmol/L dNTP，上、下游引物各 lOpmol， 模板 DNA 200ng，0.5U Taq 酶，加 IXPCR 緩沖液(含 lOmmol/LTris-HCl，pH9. 0,50mmol/L KCl, 1. 0% Triton X-100)定容至 25 μ L。PCR反應(yīng)程序先94°C預(yù)變性5min ；然后94°C變性50s，58°C退火45sec，72°C延伸 lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后，72°C延伸5min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取上述兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各10 μ L分別進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳(采用IXTAE緩沖液；溴化乙錠(EB)染色，160V, 1. 5小時(shí))，電泳結(jié)束后用凝膠成像系 統(tǒng)(MultiGenius Gel Documentation and Analysis System)掃描成像并用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分 析，部分樣品擴(kuò)增圖見圖3。分析結(jié)果表明5個(gè)小麥品種采用Pinb基因全長(zhǎng)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可以 得到597bp條帶；而用Pina-Dlb特異引物則未擴(kuò)增出任何條帶，表明5個(gè)材料均不屬于 Pina-Dlb 類型。(3)應(yīng)用特異性引物對(duì)鑒定Pina-Dlr缺失型小麥①特異性引物對(duì)的制備人工合成如下特異性引物對(duì)上游引物5，-TCAACATTCGTGCATCATCA-3，(序列表的序列1)；下游引物5，-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3‘(序列表的序列2、。②應(yīng)用特異性引物對(duì)鑒定Pina-Dlr缺失型小麥每個(gè)品種的小麥取一粒有代表性的種子，提取基因組DNA作為模板，采用特異性 引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(用Pinb基因全長(zhǎng)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增作為對(duì)照)，以保證DNA質(zhì)量。結(jié)果表明除中國(guó)春和豫農(nóng)202沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物外，其余3個(gè)小麥品種中，均能 擴(kuò)增出436bp片段。(4)測(cè)序驗(yàn)證每個(gè)品種的小麥取一粒有代表性的種子，提取其基因組DNA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并將 測(cè)序結(jié)果與野生型5D染色體上的Ha序列(NCBI編號(hào)CT009735)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，除 中國(guó)春和豫農(nóng)202外，江東門、和尚頭和紅蜷芒3個(gè)小麥品種的Ha位點(diǎn)均有10415bp片段 的缺失，屬于Pina-Dlr類型。
權(quán)利要求
一種用于鑒定小麥籽粒硬度PINA蛋白缺失類型的特異性引物，包括下述引物對(duì)上游引物5’ TCAACATTCGTGCATCATCA 3’；下游引物5’ CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT 3’。
2.—種Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定方法，包括如下步驟1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中有436bp條帶的待測(cè)小麥為候選的Pina-Dlr缺失型 小麥，所述Pina-Dlr缺失型小麥的基因組DNA的Ha位點(diǎn)有10415bp片段的缺失，即Ha位 點(diǎn)缺失序列表中序列3所示的核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定方法，其特征在于，所述 Pina-Dlr缺失型小麥為農(nóng)家品種江東門、和尚頭、紅蜷芒中的任意一種。
4.一種非Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定方法，包括如下步驟1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述特異引物對(duì)為權(quán) 利要求1所述的引物對(duì)；2)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有436bp條帶的待測(cè)小麥為候選的非Pina-Dlr缺 失型小麥；所述非Pina-Dlr缺失型小麥的基因組DNA中的Ha位點(diǎn)具有序列表的序列3所 示核苷酸的小麥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定方法，其特征在于，所述非 Pina-Dlr缺失型小麥為中國(guó)春或豫農(nóng)202。
6.一種輔助篩選硬麥的方法，包括如下步驟1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用特異引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述特異引物對(duì)為 序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對(duì)；2)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物中有436bp條帶的待測(cè)小麥為候選的硬麥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的輔助篩選硬麥的方法，其特征在于，所述硬麥為普通小麥中 PINA蛋白缺失類型中的Pina-Dlr類型。
8.權(quán)利要求1所述特異性引物對(duì)在制備Pina-Dlr缺失型小麥鑒定試劑盒、非 Pina-Dlr缺失型小麥鑒定試劑盒或硬麥輔助篩選試劑盒上的應(yīng)用。
9.一種Pina-Dlr缺失型小麥或非Pina-Dlr缺失型小麥的鑒定試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒含有權(quán)利要求1所述特異性引物對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及Pina-D1r缺失型小麥的鑒定方法及其特異性引物與應(yīng)用。鑒定Pina-D1r缺失型小麥的特異性引物對(duì)5’-TCAACATTCGTGCATCATCA-3’和5’-CTTCATTCGTCAGAGTTCCAT-3’；以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用該引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物中有436bp條帶的為候選Pina-D1r缺失型小麥，反之則不是。上述引物對(duì)可應(yīng)用于輔助篩選硬麥、制備Pina-D1r缺失型小麥鑒定試劑盒等方面。該引物對(duì)可直接在分子水平上進(jìn)行Pina-D1r類型的檢測(cè)，能大大加快籽粒硬度基因型的篩選效率和準(zhǔn)確度，對(duì)小麥籽粒硬度的基因工程改良及優(yōu)良品種的培育起到重要作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921839SQ20101020862
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者崔黨群, 張福彥, 董中東, 陳鋒 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)