專利名稱：基于綠色熒光蛋白sfGFP的熒光互補系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于綠色熒光蛋白sfGFP的熒光互補系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
研究蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)間的相互作用(PPI)是研究細(xì)胞中信號通道和傳導(dǎo)的基礎(chǔ)。 細(xì)胞的平衡態(tài)、內(nèi)部變化和細(xì)胞生理功能都很大程度上依賴于蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的 信號網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)。檢測他們之間的相互作用，揭示生物學(xué)功能是當(dāng)代生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱
點ο通過分子生物學(xué)的方法，調(diào)節(jié)特定的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用為一些疑難雜癥也 提供了一種新的治療方法的可能性。因此，無論是學(xué)術(shù)科研機構(gòu)還是制藥公司對這一領(lǐng)域 都表現(xiàn)出濃厚的興趣，希望將調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用作為一種新的治療手段。
在生物體外有很多種研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法。其中大多需要首先將 這些蛋白從其環(huán)境中純化出來才可以使用。但因為只有將所研究的蛋白還原到自然細(xì)胞生 理狀態(tài)下進行研究，我們才能得到準(zhǔn)確空間信息，因此能夠用于活細(xì)胞中PPI的分析技術(shù) 顯得尤為重要。類似的技術(shù)包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)、雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)、 熒光互相關(guān)譜(FCCS)等。在這些方法中，雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)被證明是較為普遍 的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，并且廣泛用于研究各類細(xì)胞和生物。另外，亞細(xì)胞定位、多 蛋白質(zhì)分析同樣也能夠被雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)檢測出來。雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)屬于蛋白質(zhì)互補分析的一種，包括GFP的拆分、內(nèi)酰 胺酶的拆分、熒光素酶的拆分等。BiFC的原理是通過分子工程技術(shù)，在適當(dāng)?shù)奈恢脤晒?蛋白拆分為互補的兩個片段。在細(xì)胞中，這兩個片段本沒有熒光，通常會先和各自的蛋白質(zhì) 結(jié)合(速度較快)，然后隨著這兩個蛋白的相互作用，兩個熒光蛋白片段自組裝，發(fā)出熒光。 目前，青色、綠色、黃色、紅色熒光蛋白都已經(jīng)用于雙分子熒光互補技術(shù)。雙熒光互補系統(tǒng)(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)以其快速 便捷，細(xì)胞生理水平即時檢測蛋白質(zhì)相互作用和無需裂解細(xì)胞等諸多優(yōu)勢而受到分子標(biāo)記 領(lǐng)域的廣泛青睞。但是，BiFC主要的缺點是大部分被拆分的熒光蛋白片段本身仍具有很高 的親和力和同源性，易于自組裝，導(dǎo)致即使蛋白沒有相互作用也能發(fā)出熒光的假陽性。這個 問題大大限制了 BiFC的靈敏度，時空分辨率和準(zhǔn)確度。要使BiFC能夠在更大的范圍內(nèi)應(yīng) 用，一些更加可行的改進方法迫在眉睫。Superfolder GFP蛋白，簡稱sfGFP蛋白。Superfolder GFP是綠色熒光蛋白家族 的重要成員。和其他GFP相比，superfolder GFP具有更好的循環(huán)排列，更強的適應(yīng)化學(xué)變 性和更強的折疊能力。但是，superfolder GFP最大的劣勢是，以其構(gòu)建BiFC容易自激活 從而產(chǎn)生嚴(yán)重的假陽性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用作熒光互補系統(tǒng)的蛋白片段及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白片段，如1)、2)或3)所示1)氨基酸序列如SEQUENCE 一-
spGFPC (ml4) RDHMAAHAYVNAAGATID--
spGFPC (ml5) RDHMAAHEYVNAAGITGG [++I-相對平均熒光強度由軟件ImageJ分析得到。(-)代表無可見熒光；(+/_)代表熒光幾乎不可見；(+)，(++)，(+++)，(++++)分別 代表可見熒光。(+)代表sfGFP BiFC和BFP的熒光強度比值大于0小于等于0. 3 ；(++)代表sfGFP BiFC和BFP的熒光強度比值大于0. 3小于等于0. 6 ；(+++)代表sfGFP BiFC和BFP的熒光強度比值大于0. 6小于等于0. 9 ；
(++++)代表sfGFP BiFC和BFP的熒光強度比值大于0. 9小于等于1. 2。sfGFP BiFC表示轉(zhuǎn)入本發(fā)明的熒光互補表達載體的處理組；BFP表示轉(zhuǎn)入BFP質(zhì) 粒的對照組。
"AF of Positive Control，，表示Bcl-xL與Bak(+)組；"AF of Negative Control" 表示 Bcl-xL 與 Bak(-)組。結(jié)果表明，通過突變改造的突變體sfGFPC (m6)、sfGFPC (ml2)、sfGFPC (ml5)區(qū)分 陽性和陰性的效果更佳顯著，且假陽性明顯降低，背景熒光也明顯下降，sfGFPC(ml5)的效 果最好。除了 spGFPC-m6、SpGFPC-ml2、SpGFPC-ml5外，其它spGFPC突變片段均有假陽性高 的缺點。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。三、WesternE 口跡為了確定SfGFPN和sfGFPC及其突變體的表達量，在實驗一中所述的各重組表達 載體中sfGFPN的5'端插入Myc標(biāo)簽的編碼基因，使表達的融合蛋白的的N端帶有Myc標(biāo) 簽；在實驗一中所述的各重組表達載體中sfGFPC的5'端插入His標(biāo)簽的編碼基因，使表 達的融合蛋白的N端帶有His標(biāo)簽。按照實驗二中所述的各處理組，將加有His標(biāo)簽和Myc標(biāo)簽后的重組表達載體轉(zhuǎn) 染細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液(購自碧云天公司，產(chǎn)品號P0013B)裂解細(xì)胞，得到的裂解產(chǎn)物做 western blot 檢測?？笻is按1 1000稀釋；抗Myc—抗按1 1000稀釋，內(nèi)參對照b_actin按 1 1000稀釋；二抗(山羊抗小鼠)按1 40000稀釋。(抗體均購自碧云天公司)。同時以用重組表達載體pcDNA3. 1-His-sfGFP-Bcl-xL轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及用重組表達 載體pcDNA3. 1-Myc-sfGFP-Bcl-XL轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。重組表達載體pcDNA3. 1-His-sfGFP-Bcl-xL 的制備將 SEQUENCE ID 12 所 示的sfGFP編碼基因插入載體pcDNA3. 1的NotI和ClaI酶切位點，同時將SEQUENCE ID 14所示的Bcl-xL編碼基因插入載體pcDNA3. 1的BspEI和XbaI酶切位點，再同 時將His編碼基因插入載體pcDNA3. 1的EcoRI+NotI酶切位點，得到重組表達載體 pcDNA3. 1-His-sfGFP-Bcl-xL。重組表達載體pcDNA3. l-Myc-sfGFP-Bcl-XL 的制備將 SEQUENCE ID 12 所 示的sfGFP編碼基因插入載體pcDNA3. 1的NotI和ClaI酶切位點，同時將SEQUENCE ID 14所示的Bcl-xL編碼基因插入載體pcDNA3. 1的BspEI和XbaI酶切位點，再同 時將Myc編碼基因插入載體pcDNA3. 1的EcoRI+NotI酶切位點，得到重組表達載體 pcDNA3. 1-Myc-sfGFP-Bcl-xLo檢測結(jié)果如圖3所示。圖 3A 中，1. Myc-sfGFPN-Bak (+)和 His-sfGFPC-Bcl-xL，2. Myc-sfGFPN-Bak(+)和 His-sfGFPC(mutant 6)-Bcl-xL,3. Myc-sfGFPN-Bak(+)和 His-sfGFPC(mutant 12)-Bcl-xL,4. Myc-sfGFPN-Bak(+)和 His-sfGFPC(mutant 15)-Bcl-xL.
5. His-sfGFP-Bcl-xLo圖 3B 中，1. Myc-sfGFPN-Bak (-)和 His-sfGFPC-Bcl—xL，2. Myc-sfGFPN-Bak(-)和 Hi s-sfGFPC(mutant 6)，3. Myc-sfGFPN-Bak(_)和 His-sfGFPC(mutant 12)，4. Myc-sfGFPN-Bak(_)和 His-sfGFPC(mutant 15)，5. Myc-SfGFP-Bcl-XL0本實驗旨在檢測用本發(fā)明的熒光互補系統(tǒng)檢測Bcl-XL和Bak(+)/Bak(_)蛋白對的相互作用時，是否是因為蛋白表達量不同而導(dǎo)致熒光數(shù)量和強度的不同。結(jié)果可以看到 用Mys和His標(biāo)簽的抗體檢測后，條帶粗細(xì)基本一致；表明，用本發(fā)明的熒光互補系統(tǒng)檢測 Bcl-XL和Bak(+)/Bak(-)蛋白對的相互作用時，熒光強弱不同，并不是因為熒光蛋白片段 表達量不同而造成的，完全是因為待測蛋白片段的結(jié)合能力所致；本發(fā)明的突變體熒光互 補系統(tǒng)在正確檢測出待測蛋白片段能否相互結(jié)合的基礎(chǔ)上，還大大降低了背景熒光和假陽 性。
權(quán)利要求
一種蛋白片段，如1)、2)或3)所示1)氨基酸序列如SEQUENCE ID5所示的蛋白片段；2)氨基酸序列如SEQUENCE ID7所示的蛋白片段；3)氨基酸序列如SEQUENCE ID9所示的蛋白片段。
2.一組蛋白片段，由蛋白片段I和蛋白片段II組成，所述蛋白片段I的氨基酸序列如 SEQUENCE ID 1所示，所述蛋白片段II的氨基酸序列為SEQUENCE ID :5、SEQUENCEID 7或 SEQUENCE ID 9所示；所述蛋白片段I和蛋白片段II分別獨立包裝。
3.權(quán)利要求1或2所述蛋白片段的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4) 或5)的基因1)SEQUENCE ID 5所示蛋白片段的編碼基因為SEQUENCE ID 6所示的DNA分子；2)SEQUENCE ID 7所示蛋白片段的編碼基因為SEQUENCE ID 8所示的DNA分子；3)SEQUENCE ID 9所示蛋白片段的編碼基因為SEQUENCE ID 10所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)、2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；5)與1)、2)或3)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
5.含有權(quán)利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達盒。
6.權(quán)利要求1或2中所述蛋白片段在檢測待測蛋白質(zhì)A與待測蛋白質(zhì)B是否相互作用 中的應(yīng)用；或權(quán)利要求3或4中所述編碼基因在檢測待測蛋白質(zhì)A與待測蛋白質(zhì)B是否相 互作用中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2中所述蛋白片段在構(gòu)建熒光互補系統(tǒng)中的應(yīng)用；或權(quán)利要求3或4 中所述編碼基因在構(gòu)建熒光互補系統(tǒng)中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述熒光互補系統(tǒng)是用于檢測待測蛋白 質(zhì)A與待測蛋白質(zhì)B是否相互作用的熒光互補系統(tǒng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述熒光互補為雙分子熒光互補。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于綠色熒光蛋白sfGFP的熒光互補系統(tǒng)。該蛋白片段，如1)、2)或3)所示1)氨基酸序列如SEQUENCE ID5所示的蛋白片段；2)氨基酸序列如SEQUENCE ID7所示的蛋白片段；3)氨基酸序列如SEQUENCE ID9所示的蛋白片段。本發(fā)明基于superfolder GFP(sfGFP)熒光蛋白，從其第214和第215氨基酸殘基分離得到兩個熒光蛋白片段(sfGFPN and sfGFPC)；其中sfGFPC片段通過點突變的方法改進為假陽性更少的蛋白片段。實驗證明，本發(fā)明突變得到的sfGFPC片段與sfGFPN用于構(gòu)建檢測蛋白質(zhì)相互作用的熒光互補系統(tǒng)的效果很好，且假陽性率很低，遠(yuǎn)低于對照組。本發(fā)明構(gòu)建的super fold GFP BiFC克服了super fold GFP本身自激活產(chǎn)生假陽性結(jié)果的缺陷。因此，本發(fā)明在檢測蛋白質(zhì)相互作用領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/63GK101830972SQ201010143618
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者周軍, 夏斌, 林堅 申請人:北京大學(xué)