專利名稱：一種用棉籽油生產(chǎn)γ-亞麻酸的棉籽特異表達載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因的表達載體，屬于植物生物技術領域，本發(fā)明可用于 棉花等油料作物的轉(zhuǎn)基因，在棉花種子中特異表達Y -亞麻酸合成關鍵酶——Δ 6-脂肪酸 脫氫酶基因，在棉籽中合成高價值Y-亞麻酸。
背景技術：
Y-亞麻酸作為具有生理作用的藥物，廣泛受到國內(nèi)外醫(yī)學界的重視，用于防治心 血管疾病、糖尿病、降低膽固醇及抑制潰瘍、胃出血、婦女經(jīng)前綜合癥等，另外，Y -亞麻酸在 營養(yǎng)學及美容、化妝品方面也有應用。Y-亞麻酸等多不飽和脂肪酸因在人類健康中具有重 要作用而成為極具價值的產(chǎn)品，據(jù)估計全球市場需求過萬噸。研究表明，Y-亞麻酸僅存在 于紫草科等的少數(shù)植物中，目前主要商業(yè)來源為月見草、玻璃苣(Borago officinalis)和 黑醋栗(Ribes Nigrum)，也有通過真菌的發(fā)酵提取獲得。然而，現(xiàn)在通過植物和真菌發(fā)酵生 產(chǎn)Y-亞麻酸成本高且在質(zhì)量和產(chǎn)量上都不能滿足日益增長的市場需求。目前國內(nèi)外也有 基因工程菌株生產(chǎn)Y -亞麻酸的研究，但成本較高，工程菌含油量低，油分復雜，使得進一 步應用難以推廣。油料作物種子產(chǎn)油量高，商業(yè)化農(nóng)藝生產(chǎn)方法和油的回收處理技術已經(jīng) 相當成熟，但油料作物通常不含Y-亞麻酸，利用外源Y-亞麻酸合成關鍵酶基因，通過遺 傳轉(zhuǎn)化的方法使油料作物合成Y-亞麻酸，將油料作物種子作為生產(chǎn)含Y-亞麻酸等功能 性物質(zhì)的“生化反應器”具有非常好的應用前景。棉花是新疆廣泛種植的重要經(jīng)濟作物，根據(jù)新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)廳提供的數(shù)據(jù) 顯示，2006年新疆棉花種植面積1908萬畝，總產(chǎn)量218萬噸，皮棉平均畝產(chǎn)達114公斤，比 世界平均畝產(chǎn)高1.3倍。棉花種植面積和總產(chǎn)量分別占全國的30%和40%左右。除生產(chǎn) 了大量的原棉外，棉籽作為其副產(chǎn)品每年也達數(shù)百萬噸，含油率遠高于內(nèi)地，然而目前對棉 籽的利用率較低，天然棉籽油中雖不含Y-亞麻酸，但Y-亞麻酸的合成前體物亞油酸的含 量高達66. 05%。因此利用棉花生物反應器將亞油酸轉(zhuǎn)化為Y-亞麻酸，對提高棉花的附加 值和綜合利用價值有重要意義。1993年，Reddy等人首次從一株產(chǎn)Y -亞麻酸的藍細菌(Synechocystis sp. PCC6803)中克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，并在Δ6-脂肪酸脫氫酶缺陷的藍細菌 (Anabaena sp. PCC7120)中獲得了功能性表達，推動了 Δ6-脂肪酸脫氫酶遺傳學水平的研 究。1997年，Olga V. Sayanova等首次從高等植物琉璃苣中克隆Δ6-脂肪酸脫氫酶基因， 通過轉(zhuǎn)基因煙草驗證該基因活性。2003年，Heather Μ. Whitney根據(jù)保守結構域細胞色素 沾結合結構域設計簡并引物從毛茛科銀蓮花(Anemone leveillei)中克隆獲得兩個脫氫 酶基因AL1、AL2，其中ALl基因經(jīng)酵母與擬南芥表達驗證具有Δ6-脂肪酸脫氫酶活性，毛茛 科銀蓮花△6-脂肪酸脫氫酶基因是非紫草科高等植物中克隆獲得的第一個△6-脂肪酸脫 氫酶基因。2003年，Olga V. Sayanova等在報春花科植物中克隆Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，經(jīng)表 達驗證該基因產(chǎn)物對η-3底物α -亞麻酸具有較強的底物偏好性。近幾年，F(xiàn). Garca-Maroto等從藍薊(Echium)中克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，并通過酵母表達發(fā)現(xiàn)來源于 Macaronesian島比來自歐洲大陸的藍薊中克隆的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因?qū)営退峋哂芯?有更強的底物偏好性，該結果與報春花科植物克隆的△ 6-脂肪酸脫氫酶基因具有對底物 α-亞麻酸的偏好性相反，此現(xiàn)象表明不同來源的△ 6-脂肪酸脫氫酶基因在催化功能方面 具有差異，因而，該基因克隆與功能研究有重要的理論與應用價值。目前△ 6-脂肪酸脫氫酶基因在真菌細胞中的表達最常用的宿主是釀酒酵母，但是 釀酒酵母本身只能合成油酸，只有外源性添加亞油酸，轉(zhuǎn)基因酵母細胞才能合成Y -亞麻 酸，這無疑增加了生產(chǎn)成本。Huang YS等人嘗試將Δ 12-脫氫酶和Δ6-脫氫酶在釀酒酵母 中共表達，不需添加亞油酸，直接將油酸轉(zhuǎn)化成Y -亞麻酸，但是轉(zhuǎn)化率很低，而且釀酒酵 母本身油酸含量也低。我國南開大學微生物學系將高山被孢霉△ 6-脂肪酸脫氫酶轉(zhuǎn)到畢 赤酵母中獲得表達，然而同樣的低油含量以及復雜組分使得進一步應用難以推廣。通過微 生物的基因工程生產(chǎn)Y-亞麻酸仍有待于深入研究。而利用基因工程手段使油料作物合成
Y-亞麻酸是另一種潛在的重要途徑，含油種子作物產(chǎn)油量高，富含Y -亞麻酸的合成前體 亞油酸，而且商業(yè)化農(nóng)藝生產(chǎn)方法和油的回收處理技術已經(jīng)相當成熟。目前，國內(nèi)外不同實 驗室分別將克隆到的脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入油菜、大豆和煙草等作物中，并獲得功能性表 達。因此，通過利用基因工程方法利用油料作物的生產(chǎn)Y-亞麻酸在理論和方法上已經(jīng)初 步建立，為以后大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因的表達載體，屬于植物生物技術領域，本發(fā)明將棉花 基因組中克隆的棉籽儲藏蛋白啟動子和紫草中克隆獲得的Δ 6-脂肪酸脫氫酶基因通過酶 切連接先后構建到ΡΒΙ121植物表達載體，利用棉籽儲藏蛋白啟動子高效啟動Δ6-脂肪酸 脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。本發(fā)明可用于油料作物的轉(zhuǎn)基因，在油料作物種子中特異表達
Y-亞麻酸合成關鍵酶-Δ 6_脂肪酸脫氫酶基因，使其合成高價值Y -亞麻酸。本發(fā)明可以通過以下技術方案實現(xiàn)提取棉花基因組DNA，用特異性引物PCR的方法擴增獲得棉籽特異表達啟動子，將 該啟動子用HindIII與BamH I雙酶切構建到ρΒΙ121植物表達載體，可通過轉(zhuǎn)化擬南芥， 進行GUS染色的方法驗證基因功能該棉籽特異表達系統(tǒng)的功能；提取假狼紫草未成熟種子 mRNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用特異性引物PCR的方法克隆獲得假狼紫草△ 6脂肪酸脫氫酶基因， 用XmaI與ApaL I將△ 6_脂肪酸脫氫酶基因構建到棉籽特異表達載體中，利用該載體系統(tǒng) 可在棉籽中特異表達Δ6脂肪酸脫氫酶基因，利用棉籽油生產(chǎn)高價值Y-亞麻酸。


圖1為用于生產(chǎn)Y-亞麻酸的棉籽特異表達載體的載體圖，圖中指出的位置分別 為棉花種子特異啟動子和Δ6脂肪酸脫氫酶基因的位置，通過棉花特異啟動子啟動Δ6脂肪 酸脫氫酶基因的表達，達到在棉花種子中特異表達Δ6脂肪酸脫氫酶基因的目的。
具體實施例方式供試材料
假狼紫草[Nonea capsica(willd. )G. Don]未成熟種子，新疆陸地棉種子。主要試劑限制性內(nèi)切酶、DNA marker、Taq多聚酶、PCR試劑等為TaKaRa(大連)有限公司 產(chǎn)品；DNA回收試劑盒購于北京百泰克生物工程公司；PCR用引物、亞油酸等購于上海生物 工程公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。配置的溶液主要有溶液I 50mM/L 葡萄糖；25mM/LTri s-HCL (ρΗ8· 0) ;10mM/L EDTA (ρΗ8· 0)溶液11 0. 2M/LNa0H ； 1 % SDS溶液III 5M/L 乙酸鉀 60ml ；冰乙酸 11. 5ml ；水 28. 5ml棉花基因組DNA的提取(改進的CTAB法)(1)棉花葉片lOOmg，加入0. IgPVP及少許石英砂。加液氮研磨成粉末狀，置于 1. 5ml離心管內(nèi)；(2)向每個離心管內(nèi)加入600 μ L預熱的CTAB提取緩沖液，并輕輕混勻，65°C水浴 30min，其間不時搖動；(3)加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，IOOOOrpm離心10-20min ；(4)將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1/10體積的10% CTAB，混勻，加入等體積的 氯仿/異戊醇，顛倒離心管混勻，IOOOOrpm離心IOmin ；(5)取上清液，重復步驟4操作一次；(6)將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1倍體積的IXCTAB沉淀緩沖液，混勻，輕輕 搖晃至沉淀生成。如無明顯沉淀生成，可適當延長放置時間；(7) IOOOOrpm離心lOmin，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗滌，室溫晾干；(8)用TE緩沖液50 μ L使沉淀充分溶解，加入2 μ L RNaseA酶液，37°C水浴30min ；(9)加入等體積的酚/氯仿抽提，室溫放置lOmin，IOOOOrpm離心5min ；(10)取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇，顛倒混勻，室溫放置lOmin，IOOOOrpm 離心5min ；(11)取上清液，加入1/10體積的3mol/L NaAc及2倍體積的無水乙醇，混 勻，-20°C放置Ih;(12) 4°C，IOOOOrpm 離心 5min，去上清；(13)沉淀用70%乙醇洗滌，室溫晾干；(14)用25 μ L TE溶解DNA，_20°C下保存?zhèn)溆谩?. 7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和完整性。棉花種子特異啟動子PCR擴增引物正向引物5‘ GAAATCCAAGTTGACACCTA 3 ‘反向引物5‘ GTGTGATGGTAATAGCAAAGA 3 ‘PCR 反應10 X Buffer (Mg2+) 2 μ 1dNTP (2. 5mmol/L)1· 5 μ 1正向引物(10ymol/L)0. 5μ 1
反向引物(10ymol/L)LATaq 酶模板H2O_
14. 2μ 1
0. 5μ 1 0. 3μ 1 1 μ 1Total反應條件94 "C94"C
5min 45s51 °C Imin 35cycles72 °C Imin72 °C 8minPCR擴增產(chǎn)物的回收(1)將擴增的10_50yLPCR產(chǎn)物在瓊脂糖TAE凝膠上進行電泳，然后進行回收操 作；(2)在紫外燈下，將電泳凝膠上的PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物條帶迅速切下(越小越 好)，放在1. 5mL的離心管中，稱重；(3)加入3倍凝膠體積的溶膠/結合柱DB，放入56°C的水浴中5-lOmin，使凝膠溶 解。按每IOOmg膠加入150 μ L異丙醇，震蕩混勻；(4)將上述溶液加入到硅膠樹脂結合柱AC中，12000rpm離心lmin。倒掉收集管中 的廢液，若溶膠液體積大于750 μ L，可分兩次加入同一收集管中；(5)加入 700 μ L 漂洗液 WB, 12000rpm 離心 lmin,棄廢液；(6)加入500 μ L漂洗液WB，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中 殘留的乙醇抑制下游反應；(7)取出結合柱AC，放入干凈的1.5mL的Ep管中，在吸附膜中間部位加30yL洗 脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm，離心2min，所得溶液即為回收片斷的溶液。目的片段的連接10μ 1連接體系，pMD18-TVeCtor和目的片段的摩爾數(shù)之比為1 2-10，加連接液 5μ 1，用水補至10μ 1。16°C連接過夜。熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞的制備(1)劃線活化大腸桿菌DH5 α，挑單菌落于3mlLB液體培養(yǎng)基中，150rpm，37°C振蕩 培養(yǎng)過夜；( 將培養(yǎng)菌液按1 %轉(zhuǎn)接到250mlLB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 4-0. 6，取出置冰上30min ；(3)將菌液分裝在50ml離心管中，4°C，4500g離心5min，回收菌體；(4)用 IOml 預冷的 75mmol/LCaCl2 重懸菌體，冰浴 30min ；(5) 4"C，4500g 離心 5min，回收菌體；(6)用細1預冷的75mm0l/LCaCl2重懸菌體，按400 μ 1/管分裝，并以20%的比例添加滅菌甘油，-80°C保存?zhèn)溆?。如即做即用，則在-80°C處理30min后即可用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化(1)取一支感受態(tài)細胞，置于冰上融化；(2)將10 μ 1連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞，輕輕混合均勻，冰浴30min后，42°C水浴 90s立即取出置于冰上2-;3min，加入Iml液體LB，37°C，150rpm振蕩培養(yǎng)40_60min ；(3)將上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到加有Amp的LB固體平板(表層涂有適量比的X_gal和 IPTG)上，涂布均勻，37 °C倒置培養(yǎng)14-1^1。大腸桿菌質(zhì)粒的制備堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA(1)從轉(zhuǎn)化組平板培養(yǎng)皿上取一轉(zhuǎn)化體單菌落，接種到5ml含AMP的LB液體培養(yǎng) 基中，37°C恒溫振蕩培養(yǎng)過夜；(2)取1. 5ml過夜培養(yǎng)物于EP管中，12000rpm離心lmin，取沉淀；(3)加入溶液I 100μ 1，用移液器吹打沉淀，至到打散為止；(4)加入溶液II 200 μ 1，輕輕混勻，置冰浴5min ；(5)加入溶液II1150 μ 1，振蕩混勻，置冰浴5min ；(6)4°C，12000rpm，離心5min，將上清液移至另一個離心管內(nèi)；(7)加等體積的酚氯仿(體積比1:1)，混勻，4°C，12000rpm,離心5min,將上清 液移至另一個離心管內(nèi)；(8)加2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置2 IOmin ；4°C，12000rpm,離心5min，
棄上清；(9)加入lml70%乙醇洗滌沉淀。4°C，12000rpm，離心2min，棄上清，室溫干燥；(10)用30 μ 1 TE緩沖液(ρΗ8. 0，內(nèi)含10mg/ml濃度的RNase)溶解沉淀。4°C保 存。重組質(zhì)粒的篩選與鑒定藍白斑篩選PMD18-T載體上多克隆位點處含有LacZ基因，可用χ-gal與IPTG選擇培養(yǎng)基初步 篩選，沒有插入外源DNA片段的自身環(huán)化的質(zhì)粒，菌落為藍色；插入外源片段的重組質(zhì)粒的 轉(zhuǎn)化子為白色菌落。PCR鑒定及酶切鑒定以從重組子提取的質(zhì)粒DNA為模板，用4. 1. 2. 1中的引物，按照4. 1. 2. 2的PCR擴 增體系和反應條件，進行PCR鑒定。選用PMD18-T載體上的酶切位點進行酶切鑒定，酶切體 系D.D.W 6μ 1 ；Buffer M 1μ 1 ；EcoR I 0. 5 μ 1 ； Xba I 0. 5 μ 1 ；Plasmid 2μ 1 (約 2μ g)， 37°C水浴，酶切池。進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取陽性質(zhì)粒測序。測序保存質(zhì)粒并送上海Sangon測序。載體及重組質(zhì)粒的提取從保存著攜帶有pBI121的大腸桿菌的平板上挑取單個菌落，放入IOmL含有Kan 的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。載體及重組質(zhì)粒的提取方法同前。酶切獲取載體及目的片斷
選擇KpnI和I3StI作為酶切位點。按如下步驟進行酶切鑒定D. D. W IlyL; Buffer 2μ L ；Plasmid 6μ L ；Hindi 110. 5 μ L ；BamH I 0.5yL。37°C 水浴，酶切 2h。回收酶切后的片段回收方法同前。構建棉花種子特異表達載體(1)按順序依次加入以下各種成分酶切回收pBI121my L ；目的片段η μ L ligation Buffer l.lyL ；DNA T4 Ligase 1. 0 μ L(根據(jù)回收片斷的大小，進行摩爾數(shù)的配比計算，才可確定m、η的具體數(shù)值)。(2)輕輕混勻上述連接成分，低速離心后，放置在16°C反應過夜。C3)熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci :同前。(4)質(zhì)粒的制備同前。(5)酶切鑒定陽性質(zhì)粒選擇Xma I和ApaL I進行鑒定。按如下體系進行酶切 D. D. W6 μ L ；Buffer 1 μ L ；Plasmid 2 μ L ；Xma I 0. 5 μ L ；ApaL I 0. 5 μ L. 37°C水浴，酶切 2h。Trizol法提取假狼紫草未成熟種子總RNA預處理(1)雙蒸水和溶液用DEPC進行處理每IOOml溶液或水中加入0. ImlDEPC原液， 充分混勻并在37°C放置過夜，然后將溶液或水121°C高壓滅菌60min，備用。(2)玻璃制品置于烘箱300°C 4h。提取步驟(1)稱取0. Ig樣品放入用液氮預冷的研缽，液氮研磨。(2)將樣品粉末轉(zhuǎn)入1.5ml EP管中，按0. Ig樣品/lml Trizol加Trizol，充分混
口 O(3)4°C, 12000rpm 離心 5min。(4)取上清，按 200ul/lml Trizol 加氯仿，劇烈晃動 15s，30°C靜置 2-3min0(5)4°C，12000rpm 離心 15min。(6)吸上層水相于另一 1. 5mlEP管，棄沉淀。按0. 5ml異丙醇/ImlTrizol加異丙 醇，混勻后室溫靜置5-lOmin。(7)4°C，12000rpm 離心 5min。(8)棄上清，按lml75%乙醇/ImlTrizol加乙醇，懸浮沉淀。(9)4°C，12000rpm 離心 5min，盡量棄上清，室溫晾干 5-10min。(10)用 50ul ddH20 或 TE 溶解沉淀。(11)檢驗純度和完整性后-20°C保存?zhèn)溆?。RT-PCR(1)引物根據(jù)載體pBI121-p及NcD6D基因上的酶切位點，本試驗對目的基因進行了修飾， 分別在正向引物和反向引物中添加了 Xma I和ApaL I兩個酶切位點。正向引物5，CCCGGGCCATGGCTACTGAAATCAAGAAG3，Xma I35 cycles
0129]反向引物5，GTGCACTTAACCATGAGTTTGAAGAGCTT3，
0130]ApaL I
0131](2)反轉(zhuǎn)錄體系
0132]oligo(dT)Iul
0133]RNAlug
0134]10mmol/L dNTPIul
0135]DEPC-ddH20加至 14. 5ul
0136]以上溶液混勻后，65°C保溫5min，在冰上靜置Imin后，加入以下試劑
0137]5X First-Strand Buffer 4ul
0138]DTT (0. lmol/L)Iul
0139]Reverse transcriptase 0. 5ul
0140]混合均勻后，50°C保溫30-60min，然后70°C保溫15min。-20°C貯存?zhèn)溆谩?br> 0141]NcD6D基因的PCR擴增
0142]PCR 反應
0143]IOXBuffer (Mg2+) 2μ 1
0144]dNTP(2. 5mmol/L)1. 5μ 1
0145]正向引物(ΙΟμπιοΙ/L) 0. 5μ 1
0146]反向引物(ΙΟμπιοΙ/L) 0. 5 μ 1
0147]LATaq 酶0. 3 μ 1
0148]模板1μ 1
0149]H2O14. 2μ 1
0150]_
0151]Total20 μ 1
0152]反應條件
0153]94 °C 5min72 C 8min制備中間載體方法同前。載體及重組質(zhì)粒的提取從保存著攜帶有pBI121-p的大腸桿菌的平板上挑取單個菌落，放入IOmL含有Kan 的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。載體及重組質(zhì)粒的提取方法同前。酶切獲取載體及目的片斷按如下步驟進行酶切鑒定D.D.W IlyL5Buffer 2μ L ；Plasmid 6 μ L ；Xma I 0. 5 μ L ；ApaL I 0. 5yL。37°C水浴，酶切濁?；厥漳康臈l帶。連接棉花種子特異表達載體(1)按順序依次加入以下各種成分
Sin 5sm]m 4 12
PPP 4 12 9 5 7
0154]
酶切回收pBI121-p m μ L ；目的片段 η μ L ;Ligation Buffer l.lyL ；DNA T4 Ligase 1.0 μ L(根據(jù)回收片斷的大小，進行摩爾數(shù)的配比計算，才可確定m、η的具體數(shù)值)。(2)輕輕混勻上述連接成分，低速離心后，放置在16°C反應過夜。(3)熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。(4)質(zhì)粒的制備同錢。(5)酶切鑒定陽性質(zhì)粒選擇Xma I和ApaL I進行鑒定。按如下體系進行酶切 D. D. W6 μ L ；Buffer 1 μ L ；Plasmid 2 μ L ；Xma I 0. 5 μ L ；ApaL I 0. 5 μ L. 37°C水浴，酶切 2h。高價值Y -亞麻酸的生產(chǎn)該重組質(zhì)粒即為用棉籽油生產(chǎn)Y-亞麻酸的棉籽特異表達載體，通過農(nóng)桿菌介導 或花粉管轉(zhuǎn)化的方法將目的片段導入棉花或油菜等油料作物中可在種子油中將亞油酸轉(zhuǎn) 變?yōu)楦邇r值Y-亞麻酸。
權利要求
1.一種一種植物轉(zhuǎn)基因的表達載體，通過將棉花基因組中克隆的棉籽儲藏蛋白啟動子 和紫草中克隆獲得的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因通過酶切連接先后構建到PBI 121植物表達 載體得到。
2.如權利要求1所述的表達載體，其特征在于將棉籽儲藏蛋白啟動子和紫草中克隆 獲得的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因通過基因工程方法連接，用棉籽儲藏蛋白啟動子高效啟動 Δ 6-脂肪酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。
3.如權利要求1所述的表達載體的使用，其特征在于用權利要求1所述的表達載體 轉(zhuǎn)化棉花等油料作物，將亞油酸催化生成Y-亞麻酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因的表達載體，屬于植物生物技術領域，本發(fā)明將棉花基因組中克隆的棉籽儲藏蛋白啟動子和紫草中克隆獲得的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因通過酶切連接先后構建到pBI121植物表達載體，利用棉籽儲藏蛋白啟動子高效啟動Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。本發(fā)明中種子特異啟動子的功能在模式植物擬南芥中得到驗證，Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的功能也通過酵母表達得以驗證，本發(fā)明可用于油料作物的轉(zhuǎn)基因，在油料作物種子中特異表達γ-亞麻酸合成關鍵酶-Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，使其合成高價值γ-亞麻酸。本發(fā)明的優(yōu)點在于通過基因工程方法將棉籽油中含量最高的脂肪酸-亞油酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?亞麻酸，大大提高棉籽油的附加值。
文檔編號C12N15/82GK102134576SQ20101004552
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權日2010年1月22日
發(fā)明者李冠, 王賢磊, 謝亞均 申請人:新疆大學