專利名稱：檢測等位基因、基因組和轉(zhuǎn)錄物組的方法和基因型分析譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測兩種個體混合物中等位基因、基因組和轉(zhuǎn)錄物組的方法和基因型分析譜領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
產(chǎn)前診斷方法的主要目標(biāo)是獲得胎兒或胚胎的遺傳信息。在臨床實(shí)踐中使用的產(chǎn)前遺傳診斷方法主要涉及侵入性技術(shù)，如羊水診斷、絨毛膜絨毛取樣和胎兒血液取樣或活組織檢查。那些技術(shù)涉及直接從胎兒或間接從雌性生殖結(jié)構(gòu)中獲取樣品。由于那些方法的高度侵入性性質(zhì)，它們易于對母體或胎兒引起并發(fā)癥?？梢栽谘蛩\斷情況下引證的這樣的并發(fā)癥的例子是感染的風(fēng)險(xiǎn)、伴隨可能的異源免疫的胎兒-母體出血、羊水損失和腹痛。不同的研究已經(jīng)評估羊水診斷后流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)是0.06% -2. 1%，高于對照組的風(fēng)險(xiǎn) (Eddleman, Obstet Gynecol 2006 108(5) 1067-1072)。結(jié)果，羊水診斷僅被推薦給那些生產(chǎn)具有臨床上顯著的遺傳變異的孩子的風(fēng)險(xiǎn)高于醫(yī)源性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)的女性，并且許多內(nèi)科醫(yī)生更喜歡引證與他們的經(jīng)驗(yàn)相當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)(代表性地1/300-1/500)。為了限制引起上述并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)和通常是令人厭惡和/或成為母親壓力來源的侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)的使用，非侵入性方法的發(fā)展構(gòu)成了現(xiàn)代產(chǎn)科學(xué)的主要目標(biāo)。特別是，在母親血液中循環(huán)的胎兒細(xì)胞構(gòu)成了作為產(chǎn)前遺傳診斷潛在應(yīng)用的遺傳物質(zhì)來源(Bianchi，Br J Haematol 1999 105 :574-583 ；Fisk,Curr Opin Obstet Gynecol 1998 10:81-83)。在懷孕期間，胎兒來源的不同細(xì)胞類型穿過胎盤并在母親血液中循環(huán) (Bianchi，Br J Haematol 1999 105 :574-583)。這樣的細(xì)胞類型包括淋巴樣細(xì)胞和類紅細(xì)胞、髓系前體和滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞(細(xì)胞滋養(yǎng)層和合胞滋養(yǎng)層)。已經(jīng)描述了以產(chǎn)前診斷為目的的用于分析在母親血液中循環(huán)的胎兒細(xì)胞的基因組的方法，但是它們?nèi)匀幌鄬Φ叵拗屏嗽\斷的靈敏度和特異性(Di Naro等，Mol Hum Reprod 2000 6 :571-574 ；Watanabe φ, Hum Genet 1998 102 :611-615 ；Takabayashi φ, Prenat Diagn 1995 15 :74-77 fekizawa 等，Hum Genet 1998 102:393-396)。開發(fā)非侵入性的高度特異的產(chǎn)前診斷方法的優(yōu)勢來自于使用其以減少在最終該結(jié)果是陰性的孕婦中實(shí)施的侵入性診斷方法的比例的可能性。作為例子，在21三體情況下(涉及1/700女性)，在法國，通常僅當(dāng)母親是38歲時才提供產(chǎn)前診斷，而能夠檢測60 %的21三體病例、 價(jià)格是羊水診斷價(jià)格的5%的生化分析實(shí)驗(yàn)被推薦給較年輕的女性。但是，40%的21三體病例不能由目前可利用的實(shí)驗(yàn)檢測出。已經(jīng)描述了使用FISH技術(shù)在分離自母親血漿的胎兒細(xì)胞中進(jìn)行21三體的產(chǎn)前檢測。這個方法是有趣的，但是由于胎兒細(xì)胞在血漿中很少(1/500-1/2000)并經(jīng)常包括凋亡細(xì)胞，可靠的診斷將需要在非常大量的細(xì)胞上實(shí)施所述方法，導(dǎo)致其不能常規(guī)地完成。此外，整倍體胎兒細(xì)胞不能通過該方法鑒別。該方法的一個局限性源自于在血液中循環(huán)的胎兒細(xì)胞以非常低的濃度存在?；跊]有提前挑選的血液樣品中Y染色體的PCR檢測的研究已經(jīng)確定要被檢測的胎兒細(xì)胞的平均數(shù)是大約每毫升血液1個胎兒淋巴細(xì)胞(Bianchi，J Perinat Med 1998 26 =175-85) 最近，由于改進(jìn)的富集技術(shù)產(chǎn)生更多細(xì)胞，該胎兒細(xì)胞的平均數(shù)已經(jīng)向上修訂。一個新近的研究發(fā)現(xiàn)平均值是每毫升血液37個胎兒淋巴細(xì)胞(HuangJrenatal Diagnosis 2008 28 892-899)。因此，需要改進(jìn)檢測胎兒細(xì)胞等位基因和胎兒遺傳變異的方法和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及檢測胎兒等位基因和胎兒遺傳變異的方法和基因型分析譜。本發(fā)明的一個實(shí)施方式是一種檢測胎兒標(biāo)識符的方法，包括獲得包含母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞混合物的樣品；將所述樣品分成子樣品；篩選或基因型分析子樣品中胎兒標(biāo)識符的存在；及從至少一個子樣品的胎兒細(xì)胞中鑒定至少一個胎兒標(biāo)識符的存在。本發(fā)明的實(shí)施方式可以和可能包括以下的一種或多種一種方法，進(jìn)一步包括在至少一個子樣品上實(shí)行子樣品擴(kuò)增以提供擴(kuò)增產(chǎn)物；一種方法，進(jìn)一步包括將擴(kuò)增產(chǎn)物分成等份，其中篩選或基因型分析子樣品中至少一個胎兒標(biāo)識符的存在包括篩選等份中胎兒標(biāo)識符的存在；一種方法，其中子樣品擴(kuò)增包括一種選自以下方法的方法全基因組擴(kuò)增、 全轉(zhuǎn)錄物組擴(kuò)增、目標(biāo)核酸擴(kuò)增、非胎兒標(biāo)識符的核酸序列的擴(kuò)增、核酸序列代理(proxy) 的產(chǎn)生和細(xì)胞分裂；一種方法，其中預(yù)擴(kuò)增包括全基因組擴(kuò)增或全轉(zhuǎn)錄物組擴(kuò)增；一種方法，其中預(yù)擴(kuò)增包括目標(biāo)核酸擴(kuò)增、非胎兒標(biāo)識符的核酸序列的擴(kuò)增、核酸序列代理的產(chǎn)生和細(xì)胞分裂；一種方法，進(jìn)一步包括測定母本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)在一系列目標(biāo)基因座上是純合的或雜合的，以測定母本基因型，其中篩選或基因型分析等份或子樣品中胎兒標(biāo)識符包括篩選或基因型分析等份或子樣品中在至少一個目標(biāo)基因座上不同于母本基因型的基因型，其中不同于母本基因型的基因型的存在顯示了在擴(kuò)增的產(chǎn)物中提供信息的父本等位基因的存在，和其中鑒定至少一個胎兒標(biāo)識符的存在包括在至少一個等份或子樣品中鑒定提供信息的父本等位基因；一種方法，進(jìn)一步包括在測定母本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)是純合的或雜合的之前選擇目標(biāo)基因座；一種方法，進(jìn)一步包括從目標(biāo)基因座中選擇實(shí)驗(yàn)基因座，其中篩選包括篩選等份中實(shí)驗(yàn)基因座上不同于母本基因型的基因型；一種方法，其中實(shí)驗(yàn)基因座的選擇包括篩選混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中在目標(biāo)基因座上不同于母本基因型的基因型，并在混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中選擇具有非母本基因型的目標(biāo)基因座作為實(shí)驗(yàn)基因座；一種方法，進(jìn)一步包括分析被鑒定為含有提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異；一種方法，進(jìn)一步包括采集一部分被鑒定為含有提供信息的父本等位基因的等份或子樣品，其中分析被鑒定為含有提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異包括分析采集的部分等份或子樣品；一種方法，其中采集的部分是等份或子樣品的同質(zhì)部分；一種方法，其中采集的部分是等份的非同質(zhì)部分；一種方法，進(jìn)一步包括在分析擴(kuò)增的產(chǎn)物之前從至少兩個子樣品中采集被鑒定為含有提供信息的父本等位基因的等份并合并等份；一種方法，其中遺傳變異是選自染色體重排、拷貝數(shù)變異和多態(tài)性的胎兒遺傳變異；一種方法，其中分析包括測定包含提供信息的父本等位基因的等份中母系遺傳的等位基因和父系遺傳的等位基因的比例，分析所述比例以測定遺傳變異的存在；一種方法，其中分析包括測定包含提供信息的父本等位基因的等份中等位基因的拷貝數(shù)，分析等位基因的拷貝數(shù)以測定遺傳變異的存在；一種方法，進(jìn)一步包括從至少兩個子樣品中分析被鑒定為含有提供信息的父本等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物以檢測嵌合性或異卵雙胞胎的存在；一種方法，其中分析的等份或子樣品不是篩選或基因型分析胎兒標(biāo)識符的存在的等份或子樣品，而是來自于與作為篩選或基因型分析胎兒標(biāo)識符的存在的等份相同的子樣品；一種方法，其中所述目標(biāo)基因座對于母本基因型全部是純合的，對于母本基因型全部是雜合的，或者包含對于母本基因型的純合基因座和雜合基因座的混合物；一種方法，其中所述目標(biāo)基因座對于母本基因型全部是純合的；一種方法，其中擴(kuò)增的產(chǎn)物包括基因組DNA 或互補(bǔ)DNA ；—種方法，其中測定母本基因型包括使用SNP譜以基因型分析母本遺傳物質(zhì)的樣品，其中母本遺傳物質(zhì)來自作為母本細(xì)胞來源的同一個個體；一種方法，其中母本遺傳物質(zhì)的來源選自血液、血清、血漿、尿液、宮頸拭子、眼淚、唾液、口腔拭子或皮膚；一種方法，其中母本遺傳物質(zhì)的來源選自血液或口腔拭子；一種方法，其中母本核酸和胎兒核酸的混合物是無細(xì)胞核酸混合物；一種方法，其中母本和胎兒無細(xì)胞核酸樣品的來源是孕婦的血液、 血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗或后穹窿穿刺；一種方法，包括在單一等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多于一個實(shí)驗(yàn)基因座，在多于一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多于一個實(shí)驗(yàn)基因座，或在多于一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析一個實(shí)驗(yàn)基因座；一種方法，包括在第一等份或子樣品中鑒定提供信息的父本等位基因之后，在至少第二子樣品中選擇和篩選或基因型分析第二目標(biāo)基因座；一種方法， 其中劃分所述樣品以產(chǎn)生具有細(xì)胞泊松分布或非泊松分布的子樣品；一種方法，其中每一個子樣品包含至多一種細(xì)胞；一種方法，進(jìn)一步包括在篩選或基因型分析之前匯集來自兩個或更多個子樣品的等份；一種方法，其中匯集包括含有等份的排和列的孔的索引系統(tǒng)的應(yīng)用；一種方法，進(jìn)一步包括在分成子樣品之前富集樣品的胎兒細(xì)胞；一種方法，其中富集包括胎兒細(xì)胞超過母本細(xì)胞的差異擴(kuò)增；一種方法，其中同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物被分成等份； 以及一種方法，其中非同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物被分成等份。本發(fā)明的另一種實(shí)施方式是用于檢測胎兒等位基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)譜， 包括至少一個包含大約5個至大約100個特異于單一染色體的獨(dú)特SNP的染色體特異譜， 其中在所有主要群組中測量的每一個SNP的頻率范圍在大約30% -大約50% ；且其中SNP 譜中SNP的總數(shù)是在大約5個至大約100個SNP之間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施方式涉及檢測胎兒等位基因(即，非母本等位基因/提供信息的父本等位基因)和胎兒遺傳變異的方法和基因型分析譜。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及胎兒等位基因和胎兒遺傳變異的檢測，不管胎兒的性別且不需要父本核酸序列作為參考樣品。通過區(qū)別母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞，優(yōu)選地逐一細(xì)胞地，本發(fā)明的實(shí)施方式克服了由母本血液中胎兒細(xì)胞的低豐度施加的資源限制并保護(hù)了胎兒基因組或轉(zhuǎn)錄物組的完整性以用于比目前可利用的方法更廣泛的分析。此外，通過逐一細(xì)胞地區(qū)分胎兒細(xì)胞，本發(fā)明的實(shí)施方式涉及嵌合性和異卵雙胞胎的檢測。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，對母本樣品進(jìn)行基因型分析以鑒定純合的目標(biāo)基因座，隨后對這些純合的目標(biāo)基因座進(jìn)行基因型分析以檢測包含胎兒細(xì)胞的樣品中胎兒雜合的基因座的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本文描述的任何一個實(shí)施方式中，可選擇性地對母本樣品進(jìn)行基因型分析以鑒定雜合的目標(biāo)基因座，隨后對這些雜合的目標(biāo)基因座進(jìn)行基因型分析以檢測包含胎兒細(xì)胞的樣品中胎兒的純合基因座的存在。在一些實(shí)施方式中，獲得并富集母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的混合物以產(chǎn)生相對于母本細(xì)胞的胎兒細(xì)胞濃縮的樣品。然后將所述濃縮的樣品分成子樣品使得每一個子樣品中優(yōu)選地僅包含一個細(xì)胞。然后將這些子樣品的每一個進(jìn)行擴(kuò)增以生產(chǎn)相應(yīng)于每一個子樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物，假設(shè)接近于基因組相對于細(xì)胞。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物分成等份。然后將這些等份單獨(dú)地在至少一個基因座上篩選非母本等位基因，所述至少一個基因座之前在母本樣品中被鑒定為純合的；或者在至少一個基因座上進(jìn)行基因型分析，所述至少一個基因座之前在母本樣品中被鑒定為雜合的； 分別伴隨著雜合基因型或純合基因型的檢測，顯示了在等份中非母本等位基因和因此的胎兒基因組或轉(zhuǎn)錄物組的存在。檢測雜合基因型可以通過僅在選擇的基因座上篩選非母本等位基因來完成。然后對相應(yīng)的未篩選的等份進(jìn)行進(jìn)一步分析以檢測胎兒遺傳變異，其中至少一個等份包含完整的胎兒基因組或轉(zhuǎn)錄物組。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，如上所述的對母本樣品進(jìn)行基因型分析，獲得母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的混合物，濃縮樣品的胎兒細(xì)胞并將樣品分成子樣品。選擇至少一個目標(biāo)基因座的譜用于篩選或基因型分析子樣品，在所述至少一個目標(biāo)基因座處，所述母本樣品是純合的。在至少一個這些基因座上對每一個子樣品單獨(dú)地進(jìn)行篩選或基因型分析，其中雜合基因型的檢測再次顯示子樣品中非母本等位基因的存在。然后分析雜合的子樣品中等位基因的比例以檢測胎兒拷貝數(shù)變異。如本文中所使用的，核酸指脫氧核糖核酸(如DNA、mtDNA、gDNA或cDNA)、核糖核酸(如RNA或mRNA)或本領(lǐng)域已知的任何其它的核酸變異體。如本文中所使用的，目標(biāo)基因座指基因組基因座或轉(zhuǎn)錄物組基因座，其中包含母本遺傳物質(zhì)的樣品在此處具有可檢測的基因型。在具有多于一個目標(biāo)基因座的一些實(shí)施方式中，所述目標(biāo)基因座由完全的純合基因座、完全的雜合基因座或純合基因座和雜合基因座的混合物組成。目標(biāo)基因座譜也可以包含完全純合的基因座、完全雜合的基因座或純合基因座和雜合基因座的混合物。如本文中所使用的，實(shí)驗(yàn)基因座指選擇的用于在包含胎兒遺傳物質(zhì)的樣品中進(jìn)一步進(jìn)行基因型分析的目標(biāo)基因座。如本文中所使用的，胎兒標(biāo)識符指樣品或部分樣品是胎兒來源的任何指示物。胎兒標(biāo)識符可以包括任何遺傳變異或其它信息。胎兒標(biāo)識符的一個例子是胎兒等位基因。如本文中所使用的，胎兒等位基因指提供鑒定如同胎兒的遺傳來源性能的父本等位基因。父本等位基因是在父本樣品中存在的任何等位基因。但是，如本文中所使用的，提供信息的父本等位基因是與非母本等位基因(如本文中所使用的)或胎兒等位基因(如本文中所使用的)等同的任何等位基因。如本文中所使用的，遺傳變異指核酸序列中的任何變異。遺傳變異的范圍從單堿基對變異到染色體變異，或者本領(lǐng)域已知的任何其它變異。遺傳變異可以是簡單序列重復(fù)、 短串聯(lián)重復(fù)、單核苷酸多態(tài)性、易位、倒位、缺失、重復(fù)或任何其它拷貝數(shù)變異。在一些實(shí)施方式中，染色體變異是染色體異常。例如，染色體變異可以是非整倍性、倒位、易位、缺失或重復(fù)。遺傳變異可以是嵌合的。例如，遺傳變異可以與遺傳狀況或遺傳狀況的風(fēng)險(xiǎn)因子(如囊腫性纖維化、泰-薩克斯病、亨廷頓病、阿爾茨海默病和多種癌癥)關(guān)聯(lián)。遺傳變異還可以包括任何突變、染色體異?；蛟谏鲜鲆玫膬?yōu)先權(quán)文件中公開的其它變異(如非整倍性、 微缺失或微重復(fù))。遺傳變異在表型上可以具有正效果、負(fù)效果或中性效果。例如，染色體變異可以包括有利的、有害的或中性變異。在一些實(shí)施方式中，所述遺傳變異是疾病或失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)因子。在一些實(shí)施方式中，所述遺傳變異編碼期望的表型形狀。獲得樣品(如，包含母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的混合物)在本發(fā)明的實(shí)施方式中所述的母本樣品、混合母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的樣品和混合母本和胎兒無細(xì)胞核酸的樣品可以從血液中獲得。在一些實(shí)施方式中，抽取大約20-40mL 的孕婦的血液?？梢栽趹言衅陂g的任何時間點(diǎn)采集血液樣品。例如，在一些實(shí)施方式中，在第一個三個月期間采集母本樣品。在其它實(shí)施方式中，在第二個三個月期間采集母本樣品。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在10-18周孕齡時采集血液。但是，可以在懷孕早期或18周孕齡后采集血液?？梢愿鶕?jù)尋求的信息或產(chǎn)前護(hù)理的標(biāo)準(zhǔn)改變采集的時間。也可以在一天間任何時間采集血液樣品。在一些實(shí)施方式中，在早上采集血液。在其它實(shí)施方式中，在下午采集血液。可以從身體的任何合適區(qū)域采集血液，包括胳膊、腿，或通過中心靜脈導(dǎo)管易取得的血液。在一些實(shí)施方式中，在處理或活動后采集血液。例如，可以在盆骨檢查后采集血液。 也可以協(xié)調(diào)采集的時機(jī)以增加樣品中存在的胎兒細(xì)胞數(shù)。例如，可以在鍛煉或誘導(dǎo)血管擴(kuò)張?zhí)幚砗蟛杉骸Ｔ诓杉?，血液可以與多種成分結(jié)合以保存或制備用于后續(xù)技術(shù)的樣品。例如， 在一些實(shí)施方式中，采集之后，血液用抗凝血劑、細(xì)胞固定劑、或DNA或RNA保護(hù)劑處理。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用包含抗凝血劑如EDTA或肝素的真空采集管通過靜脈穿刺采集血液。同樣可以使用涂覆有肝素的注射器和皮下注射器針頭采集血液。血液還可以與將用于細(xì)胞培養(yǎng)的成分結(jié)合。例如，在一些實(shí)施方式中，血液與細(xì)胞培養(yǎng)基或補(bǔ)充的細(xì)胞培養(yǎng)基 (如細(xì)胞因子)結(jié)合。同樣可以從本領(lǐng)域已知的其它來源獲得母本樣品，所述其它來源包括血清、血漿、 尿液、宮頸拭子、眼淚、唾液、口腔拭子、皮膚或其它組織?；旌系哪副炯?xì)胞和胎兒細(xì)胞的樣品和混合的母本和胎兒無細(xì)胞核酸的樣品同樣可以從本領(lǐng)域已知的其它來源獲得，所述其它來源包括血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗、后穹窿穿刺、淋巴結(jié)或骨髓。 例如，在一些實(shí)施方式中，混合的母本和胎兒無細(xì)胞核酸樣品的來源是宮頸拭子。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，胎兒無細(xì)胞核酸包含DNA。在另一種實(shí)施方式中，胎兒無細(xì)胞核酸包含 RNA 或 cDNA。富集胎兒細(xì)胞為了解決母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的混合樣品中胎兒細(xì)胞的低豐度問題，可以富集這些樣品的胎兒細(xì)胞。由于紅血球在成熟時是無核的，而在未成熟時是有核的，這些性質(zhì)可以被用于區(qū)分樣品中母本紅血球和胎兒紅血球。可以通過正選擇、負(fù)選擇或正選擇和負(fù)選擇的結(jié)合富集樣品中胎兒細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，直接捕獲胎兒細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中， 捕獲母本細(xì)胞并從剩余樣品中采集胎兒細(xì)胞。
可以基于細(xì)胞物理性質(zhì)的差異富集樣品中的胎兒細(xì)胞。例如，可以基于密度、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或形態(tài)富集樣品中的胎兒細(xì)胞。在一些基于密度的實(shí)施方式中，使用如FIC0LL (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) >PERC0LL (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway，NJ)、碘克沙醇(Axis Shield, Oslo,Norway) ,NYCODENZ (Axis Shield, Oslo, Norway)或蔗糖的密度梯度。在一些基于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的實(shí)施方式中，使用裂解試劑(如氯化銨)。在一些基于形態(tài)的實(shí)施方式中，使用流式細(xì)胞術(shù)或過濾器。還可以基于本領(lǐng)域已知的其它物理性質(zhì)富集樣品中的胎兒細(xì)胞。例如，可以基于介電性能或磁性富集樣品中的胎兒細(xì)胞。此外，可以通過采集骨髓富集樣品中的胎兒細(xì)胞。還可以基于細(xì)胞生化性質(zhì)的差異富集樣品中的胎兒細(xì)胞。例如，可以基于抗原、核酸、代謝作用、基因表達(dá)或表觀遺傳差異富集樣品中的胎兒細(xì)胞。在一些基于抗原差異的實(shí)施方式中，使用磁場梯度中的偶聯(lián)抗體的磁珠或順磁珠或連同流式細(xì)胞術(shù)的熒光標(biāo)記的抗體。在一些基于核酸差異的實(shí)施方式中，使用流式細(xì)胞術(shù)。在一些基于代謝作用差異的實(shí)施方式中，使用通過流式細(xì)胞術(shù)或另一種分類技術(shù)測量的染料吸收/排除。在一些基于基因表達(dá)的實(shí)施方式中，使用具有細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)。在一些基于表觀遺傳差異的實(shí)施方式中，使用細(xì)胞培養(yǎng)。還可以基于本領(lǐng)域已知的其它生化性質(zhì)富集樣品中的胎兒細(xì)胞。例如，可以基于PH或運(yùn)動力富集樣品中的胎兒細(xì)胞。此外，在一些實(shí)施方式中，使用多于一種方法富集胎兒細(xì)胞。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過使用如氯化銨的裂解試劑去除紅血球或通過使用如 FIC0LL (Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)、PERC0LL (GE Healthcare Life Sciences Piscataway, NJ)或蔗糖的密度梯度分離而富集樣品中的胎兒細(xì)胞。密度梯度還可以用于減少白細(xì)胞級分。得到的外周血單核細(xì)胞(“PBMC”)可以使用來自如Miltenyi Biotec (Gladbach,德國)、Stemcell Technologies (Vancouver, BC,力口拿大)禾口 Dynal Biotech/Invitrogen (Carlsbad, CA)的生產(chǎn)商的磁珠分離技術(shù)被進(jìn)一步富集胎兒細(xì)胞。正富集或負(fù)消耗或兩者的結(jié)合可以用于富集PBMC中的胎兒級分。盡管目前已知沒有胎兒特異表面標(biāo)記物，已經(jīng)顯示有多種標(biāo)記物正富集胎兒細(xì)胞至1，000-100，000個母本細(xì)胞中1個胎兒細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，⑶71、⑶34、CD45或 CD235a細(xì)胞表面標(biāo)記物被用于富集胎兒細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，在胎兒細(xì)胞群體中沒有發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)記物通過耗盡成人細(xì)胞群體被用于負(fù)富集胎兒細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，CD2、CD3、CDllb, CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123 和 CD61 的結(jié)合被用于耗盡成人細(xì)胞。使用細(xì)胞表面標(biāo)記物或偶聯(lián)熒光標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物，流式細(xì)胞術(shù)分類同樣可以用于進(jìn)一步富集胎兒細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物可以包括核染色或抗優(yōu)先在胎兒細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)蛋白(如胎兒血紅蛋白)的抗體。血紅蛋白的氧化已經(jīng)被鑒定為使用磁場梯度優(yōu)先富集有核的紅血球(NRBC)的一種途徑(Zborowski，Biophys J 2003 84(4) =2638-2645) 此外，便于從白細(xì)胞中分離紅細(xì)胞或從PBMC中富集胎兒細(xì)胞的微流體裝置已經(jīng)開發(fā)(Huang，I^renatal Diagnosis 2008 28 :892-899)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過在培養(yǎng)中差異擴(kuò)增胎兒細(xì)胞超過母本細(xì)胞來富集樣品中的胎兒細(xì)胞。差異擴(kuò)增可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法實(shí)施，包括在如 W02008/048931中描述的在含有干細(xì)胞因子(SCF)的無血清培養(yǎng)基中孵育來自含有母本和胎兒來源的⑶34+細(xì)胞的母本血液樣品的細(xì)胞，W02008/048931通過參考的方式全部結(jié)合
至本文。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的混合物中胎兒細(xì)胞被富集至胎兒細(xì)胞母本細(xì)胞為大約1 2、大約1 5、大約1 10、大約1 100、大約1 1000、 大約1 10000或大約1 100000，或任意兩個前述值所限定的范圍。分成子樣品在子樣品擴(kuò)增(優(yōu)選地使用全基因組擴(kuò)增(WGA)或全轉(zhuǎn)錄物組擴(kuò)增(WTA))、篩選或基因型分析純合或雜合基因座之前，所述樣品可以被分成幾乎沒有足夠細(xì)胞的子樣品使得甚至在子樣品擴(kuò)增(如WGA或WTA)之后所述樣品的染色體拷貝數(shù)保持在子樣品中。樣品可以被分成與泊松分布或非泊松分布一致的子樣品。在一些實(shí)施方式中，繼續(xù)劃分樣品。 例如，可以連續(xù)地劃分樣品。在其它實(shí)施方式中，平行地劃分樣品。在一些實(shí)施方式中，樣品被分成的子樣品體積是小于或小于大約100yL、50yL、 10μ L、1000nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、30nL、10nL、3nL 或 InL,或任意兩個前述值限定的范圍。優(yōu)選地，每一個子樣品包含的體積不多于lOOnL。在一些實(shí)施方式中，每一個子樣品包含不多于大約500、400、300、200或100個細(xì)胞，或任意兩個前述值所限定的范圍。優(yōu)選地，每一個子樣品包含不多于大于50、40、30、20或10個細(xì)胞，或任意兩個前述值所限定的范圍。更優(yōu)選地，每一個子樣品包含不多于大約5、4、3或2個細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，每一個子樣品包含不多于1個細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，每一個子樣品包含平均或大約500、400、300、200或100個細(xì)胞，或任意兩個前述值所限定的范圍。優(yōu)選地，每一個子樣品包含平均大約50、40、30、20或 10個細(xì)胞，或任意兩個前述值所限定的范圍。更優(yōu)選地，每一個子樣品包含平均或大約5、 4、3或2個細(xì)胞，或任意兩個前述值所限定的范圍。在一些實(shí)施方式中，每一個子樣品包含平均小于大約1個細(xì)胞、大約1個細(xì)胞、或大約1至2個細(xì)胞、或任意兩個前述值限定的范圍。樣品的劃分通過本領(lǐng)域已知的任何方法完成，包括使用油塞以造成微流體裝置中單獨(dú)細(xì)胞的油分離，沉淀至孔中，或由表面張力錨定至平的基底的單體滴狀物。此外，子樣品可以懸浮在將適于后續(xù)反應(yīng)的緩沖液中。例如，子樣品可以懸浮在包含裂解緩沖液和PCR 緩沖液的溶液中，所述裂解緩沖液和PCR緩沖液將使得單步細(xì)胞裂解，然后在沒有對子樣品進(jìn)一步處理下擴(kuò)增。擴(kuò)增子樣品為抵補(bǔ)單一細(xì)胞或子樣品中有效量的遺傳物質(zhì)，可以任選地實(shí)施子樣品擴(kuò)增。例如，可以實(shí)施核酸復(fù)制或細(xì)胞分裂。樣品被分成幾乎沒有足夠細(xì)胞的子樣品，使得在子樣品擴(kuò)增之后所述樣品的染色體拷貝數(shù)保持在子樣品中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，對包含單細(xì)胞的子樣品實(shí)施子樣品擴(kuò)增，使得得到的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)了母本細(xì)胞或胎兒細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)錄物組。例如，子樣品擴(kuò)增可以在定位在微孔或通過如本文描述的油塞分離的滴狀物中的單獨(dú)細(xì)胞上實(shí)施?？梢允褂糜糜诋a(chǎn)生額外拷貝的核酸、預(yù)示核酸的額外信號或本領(lǐng)域已知的其它核酸代理(如蛋白表達(dá))的任何方法實(shí)施核酸復(fù)制。在一些實(shí)施方式中，使用WGA、WTA或目標(biāo)核酸擴(kuò)增技術(shù)實(shí)施核酸復(fù)制。在其它實(shí)施方式中，使用產(chǎn)生預(yù)示核酸序列的信號的方法實(shí)施核酸復(fù)制，如INVADER. (Hologic,Inc. ,Bedford,ΜΑ) 在一些實(shí)施方式中，僅一部分?jǐn)U增的序列與核酸模板互補(bǔ)。例如，在一些實(shí)施方式中，連續(xù)擴(kuò)增產(chǎn)物包含一部分核酸模板和一部分信號序列。用于核酸復(fù)制的常規(guī)技術(shù)可以包括等溫復(fù)制或熱循環(huán)(thermocycled) 復(fù)制。在一些實(shí)施方式中，在SNP基因型分析之前實(shí)施核酸復(fù)制。但是，核酸復(fù)制也可以在 SNP基因型分析之后實(shí)施。同樣可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)施細(xì)胞復(fù)制。在一些實(shí)施方式中，在培養(yǎng)基和添加物中培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生在本文描述的方法中使用的額外的核酸拷貝。在其它實(shí)施方式中，培養(yǎng)細(xì)胞且一個或多個細(xì)胞完整保留以用于后續(xù)的分析。在一些實(shí)施方式中，在分成子樣品之前實(shí)施細(xì)胞復(fù)制。優(yōu)選地，在分成子樣品之后實(shí)施細(xì)胞復(fù)制。分成等份子樣品擴(kuò)增之后，擴(kuò)增的產(chǎn)物可以分成等份。這些等份可以用于多種實(shí)驗(yàn)。例如， 在一個實(shí)施方式中，擴(kuò)增產(chǎn)物的一個或多個等份用于檢測胎兒等位基因的存在，而一個或多個其它等份用于檢測包含胎兒基因組或轉(zhuǎn)錄物組的擴(kuò)增產(chǎn)物中胎兒遺傳變異的存在。在一些實(shí)施方式中，通過陣列檢測被鑒定為包含胎兒基因組或轉(zhuǎn)錄物組的等份的遺傳變異。 例如，等份可以用于檢測與遺傳環(huán)境相關(guān)的遺傳變異(如威廉斯綜合征、沃爾夫-赫塞豪恩綜合征、米-迪綜合征、史密斯-馬吉尼斯綜合征、天使綜合征、迪喬治綜合征、普拉德-威利綜合征、雅各布森綜合征、貓叫綜合征、夏科-馬里-圖思病、微小重復(fù)22qll. 2綜合征、 囊腫性纖維化、泰-薩二氏病、亨廷頓病、阿爾茨海默病和多種癌癥)?？梢蕴暨x同質(zhì)或非同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物用于分成等份。在一些實(shí)施方式中，同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物被順序分開(如連續(xù)地)。在其它實(shí)施方式中，同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物被平行地分開。可選地，可以選擇非同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用正選擇、負(fù)選擇或正選擇和負(fù)選擇的組合來分成等份。例如，在一些實(shí)施方式中，珠結(jié)合(bead-bound)捕獲寡聚物被用于靶定期望部分的用于分成等份的擴(kuò)增產(chǎn)物。在其它實(shí)施方式中，表面結(jié)合寡聚物用于排除不期望部分的擴(kuò)增產(chǎn)物?？苫诒绢I(lǐng)域已知的任何物理或生化性質(zhì)(包括本文描述的那些) 選擇非同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物。例如，挑選具有特定電荷、大小或染色體特性的擴(kuò)增產(chǎn)物部分用于分成等份。在子樣品擴(kuò)增的可選步驟沒有完成的一些實(shí)施方式中，可以移除子樣品的一部分或等份用于后續(xù)分析。在一些實(shí)施方式中，等份被匯集成兩個或多個等份的組。這使得基于SNP或本文描述的其它反應(yīng)的數(shù)量減少了多達(dá)因子N，其中N是每一個匯集中的等份的數(shù)量。來自陽性匯集(即具有至少一個與母本基因型不同的基因型的匯集)的等份然后可以逐一等份地重復(fù)實(shí)驗(yàn)以鑒定包含胎兒等位基因的等份。在一些實(shí)施方式中，在一種實(shí)驗(yàn)基因座處檢測每一個匯集的非母本等位基因。在一些實(shí)施方式中，在兩種或更多種實(shí)驗(yàn)基因座處檢測每一個匯集的非母本等位基因。在一些實(shí)施方式中，使用索引系統(tǒng)匯集等份，所述索引系統(tǒng)使得鑒定陽性匯集中的陽性等份的來源。例如，可以從每一擴(kuò)增產(chǎn)物中取兩個或更多個等份以形成NXM擴(kuò)增等份的索引的匯集。包含至少一個胎兒等位基因的孔可以通過在正交坐標(biāo)系中定位陽性 N和M匯集的交叉點(diǎn)來鑒定。在一些實(shí)施方式中，N(即，在NXM索引中的列數(shù))和M(即， 在NXM索引中的行數(shù))分別是在大約2和大約100之間。優(yōu)選地，N和M分別在大約8和大約100之間。在一些實(shí)施方式中，N是、是大約、是至少、是至少大約、是不多于、是不多于大約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、32、36、40、 48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、576、672、768、864、960、 1000，或任意兩個前述值所限定的范圍。在一些實(shí)施方式中，M是、是大約、是至少、是至少大約、是不多于、是不多于大約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、30、32、36、40、48、50、56、60、64、70、72、80、84、88、90、96、100、192、288、384、480、 576、672、768、864、960、1000，或任意兩個前述值所限定的范圍。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，同質(zhì)或非同質(zhì)部分的擴(kuò)增產(chǎn)物被索引以使得鑒定陽性等份的來源。獲得或推斷親本基因型可以獲得或推斷親本基因型以幫助非母本等位基因的鑒定。關(guān)于非母本等位基因的信息可以依次用于篩選或基因型分析等份或子樣品、或直接分析胎兒基因組的遺傳變異。例如，可以通過直接地基因型分析父本或母本樣品獲得父本或母本基因型，或通過基因型分析來自遺傳相關(guān)的家庭成員的樣品推斷父本或母本基因型。但是，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，沒有必要獲得或推斷父本基因型。例如，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，僅獲得母本基因型。在一些實(shí)施方式中，通過基因型分析遺傳物質(zhì)獲得父本或母本基因型，所述遺傳物質(zhì)來自血液、血漿、血清、尿液、口腔拭子、唾液、眼淚、皮膚或父本核酸的任何其它來源 (包括本文描述的那些)。在一些實(shí)施方式中，使用無細(xì)胞核酸或從源自這些來源之一的細(xì)胞中提取的核酸獲得父本或母本基因型。同樣優(yōu)選地在DNA上實(shí)施父本或母本基因型分析，但是也可以在RNA、cDNA或本領(lǐng)域已知的任何其它核酸上實(shí)施。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增和檢測(如，使用基于PCR的方法)父本或母本樣品的模板。但是，在一些實(shí)施方式中， 不擴(kuò)增(如，使用本文描述的方法)父本或母本樣品的模板。還可以通過獲得在在前的遺傳實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的信息來獲得父本和母本基因型，所述信息如數(shù)據(jù)庫中的信息、實(shí)驗(yàn)報(bào)告中的信息，或來自實(shí)施本文描述的方法的在前的懷孕的信息。通過可以使用血緣關(guān)系的親屬的基因型推斷父本或母本基因型。例如，遺傳相關(guān)的父母、兄弟姐妹、祖父母、姑媽姨媽(aunts)、伯父叔父(uncles)或孩子的基因型可以用于推斷父本或母本基因型。本領(lǐng)域已知的任何多態(tài)性可以用于基因型分析親本樣品。例如，可以基因型分析 SNP、單體型、短串聯(lián)重復(fù)(STR)或其它序列變異。其它遺傳或表觀遺傳標(biāo)記物同樣可以用于基因型分析親本樣品。例如，可以評估拷貝數(shù)變異(CNV)或甲基化模式。在母本核酸和胎兒核酸的混合物中可選地鑒定至少一個非母本等位基因在純合的目標(biāo)基因座已經(jīng)在母本樣品中鑒定的實(shí)施方式中，母本核酸和胎兒核酸的混合物可選地被用于鑒定相同基因座處的雜合基因型，其表示胎兒的存在(即非母本等位基因/提供信息的父本等位基因)。該可選步驟優(yōu)選地在篩選或基因型分析單獨(dú)等份或子樣品之前實(shí)施。通過在母本核酸和胎兒核酸的混合樣品中篩選非母本等位基因并從而鑒定雜合的基因座(和因此胎兒等位基因)，可以更有效地篩選所述等份和子樣品中已知的提供信息的SNP。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，胎兒無細(xì)胞DNA用于篩選非母本等位基因并鑒定雜合基因座。在另一種實(shí)施方式中，胎兒無細(xì)胞RNA或cDNA用于鑒定雜合基因座。無細(xì)胞核酸可以從本領(lǐng)域已知的任何來源獲得，所述來源包括孕婦的血液、血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗或后穹窿穿刺。同樣可以從母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的混合樣品中提取核酸以鑒定雜合基因座。優(yōu)選地，從母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的混合樣品中提取DNA。但是，RNA或cDNA可以從母本細(xì)胞或胎兒細(xì)胞的混合樣品中提取?？梢詮谋绢I(lǐng)域已知的任何來源，包括血液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗、后穹窿穿刺、淋巴結(jié)或骨髓獲得的細(xì)胞中提取核酸。在其它實(shí)施方式中，全血被用于鑒定雜合基因型而不必(或提前) 將全血分成細(xì)胞部分、血漿部分或血清部分。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增和檢測來自母本核酸和胎兒核酸的混合樣品的等份的核酸模板以鑒定雜合基因座(如使用基于PCR的方法)。但是，在一些實(shí)施方式中，不用擴(kuò)增來自混合樣品的等份的核酸模板以鑒定雜合的基因座。例如，可以使用在其中僅擴(kuò)增與模板相關(guān)的信號的方法(如，在美國專利號7，226，798,7,473, 775和7，468，261中描述的 ABSCRIPTI0N 方法(Ribomed Biotechnologies, Inc. ,Carlsbad,CA)或涉及 INVADER .化學(xué)(Hologic，Inc.)的方法)。同樣可以使用在其中檢測核酸模板而不需要擴(kuò)增信號或模板的方法(如，涉及如在WO 2005/01122中描述的DNA結(jié)合的化學(xué)檢測的方法(Adnavance Technologies, Inc.，San Diego, CA))。此外，可以使用在其中測序核酸模板而不需要擴(kuò)增的方法(如在Eid等，科學(xué)2009323 (5910) :133-38中描述的測序方法)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于非母本等位基因鑒定的模板的來源可以包括血清、血漿、尿液、宮頸拭子或本領(lǐng)域已知的任何其它核酸的來源。一偉·雜口口口帕
的存在其次的步驟是篩選或基因型分析子樣品或等份以鑒定非母本等位基因。一旦已經(jīng)產(chǎn)生SNP譜(如本文中更詳細(xì)描述的)及已經(jīng)鑒定一系列對于母本遺傳樣品是純合的(或可選地，雜合的)基因座，可以選擇一個或多個實(shí)驗(yàn)基因座以篩選或基因型分析子樣品或等份中胎兒等位基因的存在。為檢測胎兒等位基因的存在，篩選或基因型分析實(shí)驗(yàn)基因座中非母本等位基因的存在(即，通過鑒定實(shí)驗(yàn)基因座處的雜合的或可選地純合的基因型)。 在一些實(shí)施方式中，逐個等份地篩選或基因型分析擴(kuò)增產(chǎn)物的等份以檢測雜合的(或可選地，純合的)基因座。在一些實(shí)施方式中，等份包含來自單一細(xì)胞的擴(kuò)增材料?？梢栽谠谀副緲悠分性谇拌b定為純合的基因座處基因型分析子樣品或等份。在一些實(shí)施方式中，在母本樣品中在前鑒定為純合的基因座處的基因型通過篩選非母本等位基因的存在而測定。優(yōu)選地，如本文描述的，在篩選等份或子樣品的非母本等位基因之前，混合母本和胎兒核酸(優(yōu)選地，無細(xì)胞)的樣品用于鑒定混合的核酸中非母本等位基因的存在，表示在胎兒材料中相同基因座處雜合基因型的存在。在其它實(shí)施方式中，在在母本樣品中在前鑒定為雜合的基因座處基因型分析子樣品或等份。在等份或子樣品中同樣基因座處的純合基因型的鑒定表示了非母本(即胎兒) 等位基因的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本文中描述的任何實(shí)施方式中的篩選或基因型分析方法可以使用等份或子樣品實(shí)施。可以使用本領(lǐng)域已知的許多方法，包括本文提到的那些，篩選或基因型分析等份和子樣品中的胎兒等位基因。例如，使用分子信標(biāo)或其它基于核酸的 SNP檢測方法篩選或基因型分析等份。在一些實(shí)施方式中，擴(kuò)增和檢測等份中的核酸模板 (如，使用基于PCR的方法)。但是，在一些實(shí)施方式中，不用擴(kuò)增核酸模板(如，使用本文描述的方法)。此外，本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)記物可以用于篩選或基因型分析等份和子樣品。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用SNP、單體型、短串聯(lián)重復(fù)(STR)、其它序列變異、拷貝數(shù)變異(CNV) 或在母本樣品中基因型分析的表觀遺傳標(biāo)記物。由于在一些實(shí)施方式中，子樣品包括不多于一個細(xì)胞，可以逐一細(xì)胞地篩選或基因型分析子樣品或等份。同樣可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法，包括本文提到的那些，篩選或基因型分析子樣品或等份。優(yōu)選地，使用具有TAQMAN 系統(tǒng)(Foster City, CA)的定量 PCR(qPCR)篩選子樣品的雜合等位基因?？梢院Y選預(yù)定數(shù)量的子樣品或細(xì)胞以檢測雜合等位基因。例如，如表1中所示，為檢測富集至胎兒母本細(xì)胞為1 10，000的樣品中7個基因座，其中期待每個基因座大約5個胎兒細(xì)胞，所述樣品或細(xì)胞的預(yù)定數(shù)量是350，000。在一些實(shí)施方式中，每個基因座的胎兒細(xì)胞數(shù)是、是大約、是至少、是至少大約、是不多于、是不多于大約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、 175、200、225、250、275或300，或任意兩個前述值所限定的范圍。表 權(quán)利要求
1.一種檢測胎兒標(biāo)識符的方法，包括獲得包含母本細(xì)胞和胎兒細(xì)胞混合物的樣品；將樣品分成子樣品；篩選或基因型分析子樣品中胎兒標(biāo)識符的存在；和從至少一個子樣品的胎兒細(xì)胞中鑒定至少一個所述胎兒標(biāo)識符的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括對至少一個所述子樣品實(shí)施子樣品擴(kuò)增以提供擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包括將所述擴(kuò)增產(chǎn)物分成等份，其中所述篩選或基因型分析子樣品中至少一個胎兒標(biāo)識符的存在包括篩選或基因型分析等份中胎兒標(biāo)識符的存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述子樣品擴(kuò)增包括選自以下的一種方法全基因組擴(kuò)增、全轉(zhuǎn)錄物組擴(kuò)增、目標(biāo)核酸擴(kuò)增、非胎兒標(biāo)識符的核酸序列的擴(kuò)增、產(chǎn)生核酸序列的代理和細(xì)胞分裂。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述子樣品擴(kuò)增包括目標(biāo)核酸擴(kuò)增、非胎兒標(biāo)識符的核酸序列的擴(kuò)增、產(chǎn)生核酸序列的代理和細(xì)胞分裂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4的方法，進(jìn)一步包括在一系列目標(biāo)基因座處測定所述母本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)是純合的或雜合的以測定母本基因型，其中所述篩選或基因型分析等份或子樣品的胎兒標(biāo)識符包括在至少一個目標(biāo)基因座處篩選或基因型分析所述等份或子樣品中不同于所述母本基因型的基因型，其中所述不同于所述母本基因型的基因型的存在表示了在所述擴(kuò)增產(chǎn)物中提供信息的父本等位基因的存在，和其中所述鑒定至少一個所述胎兒標(biāo)識符的存在包括在至少一個等份或子樣品中鑒定提供信息的父本等位基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括在測定所述母本細(xì)胞的遺傳物質(zhì)是純合的或雜合的之前選擇所述的目標(biāo)基因座。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，進(jìn)一步包括從所述目標(biāo)基因座中選擇實(shí)驗(yàn)基因座，其中所述篩選或基因型分析包括在所述實(shí)驗(yàn)基因座處篩選或基因型分析等份或子樣品中不同于所述母本基因型的基因型。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于，所述實(shí)驗(yàn)基因座的所述選擇包括在目標(biāo)基因座處篩選混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中不同于所述母本基因型的基因型，和在所述混合的母本核酸和胎兒核酸的樣品中選擇具有非母本基因型的目標(biāo)基因座作為所述實(shí)驗(yàn)基因座。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，進(jìn)一步包括分析被鑒定為含有所述提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括采集被鑒定為含有所述提供信息的父本等位基因的部分所述等份或子樣品，其中所述分析被鑒定為含有所述提供信息的父本等位基因的等份或子樣品以檢測遺傳變異包括分析所述等份或子樣品的采集部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述采集部分是所述等份或子樣品的同質(zhì)部分。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述采集部分是所述等份或子樣品的非同質(zhì)部分。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括從至少兩個子樣品中采集被鑒定為含有所述提供信息的父本等位基因的等份并在分析所述擴(kuò)增產(chǎn)物之前結(jié)合所述等份。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述遺傳變異是選自染色體重排、拷貝數(shù)變異和多態(tài)性的胎兒遺傳變異。
16.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述分析包括測定包含所述提供信息的父本等位基因的等份中母系遺傳等位基因和父系遺傳等位基因的比例，其中分析所述比例以測定遺傳變異的存在。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述分析包括測定包含所述提供信息的父本等位基因的等份中等位基因的拷貝數(shù)，其中分析所述等位基因的拷貝數(shù)以測定遺傳變異的存在。
18.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，進(jìn)一步包括分析來自至少兩個所述子樣品的被鑒定為包含所述提供信息的父本等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物以檢測嵌合性或異卵雙胞胎的存在。
19.根據(jù)權(quán)利要求10-18任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述被分析的等份不是被篩選或基因型分析所述胎兒標(biāo)識符的存在的等份，而是來自與被篩選或基因型分析所述胎兒標(biāo)識符的存在的等份相同的子樣品。
20.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因座對于所述母本基因型全部是純合的，對于所述母本基因型全部是雜合的，或包括對于所述母本基因型是純合基因座和雜合基因座的混合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因座對于所述母本基因型全部是純合的。
22.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物包括基因座DNA或互補(bǔ)DNA。
23.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，其特征在于，所述測定母本基因型包括使用SNP譜以基因型分析母本遺傳物質(zhì)的樣品，所述母本遺傳物質(zhì)來自與所述母本細(xì)胞的來源相同的個體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于，所述母本遺傳物質(zhì)的來源選自血液、血清、 血漿、尿液、宮頸拭子、眼淚、唾液、口腔拭子或皮膚。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于，所述母本遺傳物質(zhì)的來源選自血液或口腔拭子。
26.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于，所述母本核酸和胎兒核酸的混合物是無細(xì)胞核酸的混合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈的方法，其特征在于，所述母本和胎兒無細(xì)胞核酸樣品的來源是孕婦的血液、血清、血漿、尿液、宮頸拭子、宮頸灌洗、子宮灌洗或后穹窿穿刺。
28.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，包括在單一等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多于一個實(shí)驗(yàn)基因座，在多于一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析多于一個實(shí)驗(yàn)基因座，或在多于一個等份或子樣品中選擇和篩選或基因型分析一個實(shí)驗(yàn)基因座。
29.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，包括在第一等份或子樣品中鑒定提供信息的父本等位基因之后，在至少第二子樣品中選擇和篩選或基因型分析第二目標(biāo)基因座。
30.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，其特征在于，劃分所述樣品以產(chǎn)生具有細(xì)胞泊松分布或非泊松分布的子樣品。
31.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，其特征在于，每一個所述子樣品包括不多于1個細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，進(jìn)一步包括在所述篩選或基因型分析之前匯集來自兩個或更多個子樣品的等份。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其特征在于，所述匯集包括包含所述等份的行和列的孔的索引系統(tǒng)的應(yīng)用。
34.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，進(jìn)一步包括在所述分成子樣品之前富集所述樣品中的所述胎兒細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于，所述富集包括所述胎兒細(xì)胞超過母本細(xì)胞的差異擴(kuò)增。
36.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的均質(zhì)部分被分成所述等份。
37.根據(jù)權(quán)利要求6或9的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的非均質(zhì)部分被分成所述等份。
38.一種用于檢測胎兒等位基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)譜，包括至少一個包含大約 20個至大約100個特異于單一染色體的獨(dú)特SNP的染色體特異譜，其中在所有主要群組中測量的每一個所述SNP的頻率范圍是大約30%至大約50%;其中每一個所述SNP是處于哈迪-溫伯格平衡；及其中SNP譜中SNP的總數(shù)是在大約5個SNP和大約100個SNP之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測兩種個體混合物中等位基因、基因組和轉(zhuǎn)錄物組的方法和基因型分析譜。
文檔編號C12Q1/68GK102325901SQ200980157313
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者安德魯·S·卡茨, 庫爾特·A·克魯梅爾, 張海川, 阿諾德·R·奧利芬特 申請人:賽盧拉有限公司