專利名稱：：藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本實(shí)用新型涉及動(dòng)物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及以藏綿羊耐寒性相關(guān)基因ADRB3基因的等位基因檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：中國(guó)是世界羊產(chǎn)業(yè)大國(guó)，羊品種資源豐富，養(yǎng)羊數(shù)量居世界首位。2005年，全世界存欄綿羊、山羊分別為10.8億只和8.1億只，其中中國(guó)分別占有1.7億只和2.0億只。2007年全世界綿羊、山羊品種分別有995個(gè)和512個(gè)，其中中國(guó)分別占有50個(gè)和50個(gè)(FAO，2007)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007年在中國(guó)六大牧區(qū)，即新疆、西藏、內(nèi)蒙、青海、四川和甘肅羊只存欄數(shù)1.6億只，占全國(guó)的43.9%，其中存欄綿羊1.1億只，占全國(guó)綿羊總存欄數(shù)的65.6%。這些地區(qū)的海拔在2500m-5000m的高原地區(qū)，因此，高原型綿羊在中國(guó)綿羊總存欄數(shù)中占有很大比例，然而，中國(guó)北方大部分地區(qū)冬春季嚴(yán)寒多風(fēng)，也正值母羊產(chǎn)羔高峰期。由于羔羊出生時(shí)體溫調(diào)節(jié)機(jī)能尚不完善，抵御寒冷的能力較弱，很容易出現(xiàn)羔羊被凍死的現(xiàn)象，新疆每年有14-16萬(wàn)只羊在越冬中死亡，其中羔羊占60%左右，據(jù)統(tǒng)計(jì),在高原牧區(qū)由于綿羊越冬凍死帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失每年為500-700萬(wàn)元。國(guó)內(nèi)外利用傳統(tǒng)方法改善綿羊越冬的耐寒性嘗試了多種方案，其中包括建造暖棚，為綿羊穿上冬衣，改善詞喂條件等。但這些方法皆由于經(jīng)濟(jì)耗費(fèi)高，實(shí)用性差或效果不明顯等原因，并不能從根本上解決羔羊越冬的成活率問(wèn)題。事實(shí)上，綿羊的耐寒性是一種受環(huán)境因素與遺傳因素互作的質(zhì)量性狀，也就是說(shuō)在相同的外界溫度，飼喂和管理體制的條件下，決定綿羊越冬成活率的主要因素便是自身的遺傳特征。隨著分子標(biāo)記輔助育種(Marker-assistedSelection,MAS)技術(shù)的成熟，提高群體內(nèi)綿羊的耐寒性和增加高寒地區(qū)綿羊存活率已成為可能。1987年，Slee在綿羊育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，蘇格蘭黑面綿羊(ScottishBlack-facesheep)中存在著不同耐寒性的綿羊類群，其中耐寒性較差的一組，其后代不具有腎上腺素表達(dá)的應(yīng)激反應(yīng)。這種性狀為單基因效應(yīng)，以孟德?tīng)柗绞竭z傳，且為顯性遺傳(Simpson和Slee，1988)。該單基因效應(yīng)與兒茶酚胺介導(dǎo)產(chǎn)生的非顫抖熱有關(guān)(Slee和Simpson,1991)。自此，國(guó)內(nèi)外專家為定位綿羊耐寒性的主效基因做了大量努力。2000年，F(xiàn)orrest和Hickford對(duì)牛、山羊和綿羊的P3-AR基因，通過(guò)克隆測(cè)序獲得了全序列。Forrest等利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)新西蘭境內(nèi)的12個(gè)美利奴綿羊半同胞大群體的p3-AR基因開(kāi)展了突變分析，并與相應(yīng)群體的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果是位于(33-AR基因內(nèi)中的一段包含部分內(nèi)含子(intron)的區(qū)域表現(xiàn)出了高度多態(tài)性，且其多態(tài)性與藏綿羊的初生重、生長(zhǎng)率、屠宰重和耐寒性有關(guān)。擴(kuò)大研究群體后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這種相關(guān)主要集中在綿羊的耐寒性表型值上，并確立了相應(yīng)等位基因的耐寒性關(guān)聯(lián)值(Forrestetal.,2003,2006,2007)。2005年，Zhou等通過(guò)數(shù)據(jù)分析將該片段集中于內(nèi)含子調(diào)控區(qū)的一段長(zhǎng)為263bp的片段，并通過(guò)對(duì)已有系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，建立了耐寒性的商業(yè)檢測(cè)系統(tǒng)。然而該系統(tǒng)，缺乏新西蘭國(guó)外品種的數(shù)據(jù)，因此也未有涉及來(lái)自中國(guó)的綿羊品種，數(shù)據(jù)庫(kù)的存量仍顯不足。
實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒。為了克服傳統(tǒng)技術(shù)提高藏綿羊越冬耐寒性的不足，我們利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)藏綿羊的耐寒性相關(guān)基因，并通過(guò)對(duì)檢測(cè)到藏綿羊等位基因進(jìn)行分級(jí)從而得到該個(gè)體的耐寒性強(qiáng)弱。該技術(shù)不僅能檢測(cè)出藏綿羊耐寒性的強(qiáng)弱，而且能對(duì)該個(gè)體藏綿羊及進(jìn)行遺傳背景分析，從而從個(gè)體自身水平提高藏綿羊耐寒性的選育。本實(shí)用新型的目的是提供一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒。依據(jù)現(xiàn)有體系，利用ADRB3這一分子標(biāo)記基因，建立了新的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)的藏綿羊耐寒性檢測(cè)體系。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案為一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其主要特點(diǎn)是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液(4),ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)/C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)/E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒，在容器孔中還包括分別放置SSCP檢測(cè)試劑，去離子水(5)，10%過(guò)硫酸銨(7)，上樣變性緩沖液(6)，TEMED(四甲基乙二胺)(8)，聚丙烯酰胺(Arc:Bis=29:1)(9)。上述各種液體分別裝在容器內(nèi)，插入容器孔內(nèi)。上樣變性緩沖液包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025。/o二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)。所述的PCR反應(yīng)液(4)的成分用量及濃度引物各為0.75pL/10pmol，dNTP為0.9^a/2.5mm,TaqDNA聚合酶為0.2pL/2.5U/nL，10xbuffer為1.5pL含Mg2+15nM，雙純水為9.9fiL。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒的特異性擴(kuò)增引物，上下游長(zhǎng)度分別為21bp和18bp的核苷酸，序列如下上游引物為5，-ctagctcagttctttctctgc-3，；下游引物為-5，"Cccaactccaacccgacc畫(huà)3，<>所述的藏綿羊耐寒性基因?yàn)椴鼐d羊的P3-AR基因，且在P3-AR基因內(nèi)含子中一段長(zhǎng)為263bp的多態(tài)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度為263bp。所述的檢測(cè)藏綿羊耐寒性等位基因的特異性擴(kuò)增引物的擴(kuò)增條件為94'C預(yù)變性2分鐘，94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，72。C總延伸10分鐘，4'C保存。藏綿羊ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)的核苷酸序列分別為A:ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccgagactag3gggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagecccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtaggaagcgggtcgggttggagttgggC:ctagctcagttctttetctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgccg3gactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaagccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgcttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtaggaagcgggtcgggttggagttggg6012018024026360120180240263ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60tgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒的使用方法(1)將待檢測(cè)的基因組DNA(lpL/50ng)與試劑盒中的PCR反應(yīng)液混合；擴(kuò)增條件為94'C預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60'C退火30秒，72'C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，72'C總延伸10分鐘，4'C保存(2)用步驟(1)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和藏綿羊耐寒性較強(qiáng)等位基因A和C和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SSCP檢測(cè)試劑各組分混合進(jìn)行SSCP檢測(cè)；(3)步驟(2)中檢測(cè)到的帶型與耐寒性等位基因A和C和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致的樣品為攜帶藏綿羊耐寒性較強(qiáng)等位基因的個(gè)體。本實(shí)用新型的有益效果是反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)、易操作，適用于各級(jí)畜牧獸醫(yī)教學(xué)科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型藏綿羊養(yǎng)殖企業(yè)的藏綿羊的選種?？梢詸z測(cè)藏綿羊個(gè)體自身的耐寒性性狀，從而提高藏綿羊的耐寒性選育效率，有效提高群體耐寒性。圖1是本實(shí)用新型的立體示意圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本實(shí)用新型，并非用于限定本實(shí)用新型的范圍。實(shí)施例l:一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒，包括有盒體l，襯墊2，在襯墊2上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其特征是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液4，ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣10和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣11和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣12。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒，還包括在容器孔中還分別放置SSCP檢測(cè)試劑，去離子水5，10%過(guò)硫酸銨7，上樣變性緩沖液6，TEMED(四甲基乙二胺)8，聚丙烯酰胺(Arc:Bis=29:1)9。上述各種液體分別裝在容器內(nèi)，插入容器孔內(nèi)。上樣變性緩沖液6，包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)，10%過(guò)硫酸銨，TEMED(四甲基乙二胺)，14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc:Bis=29:1)。所述的PCR反應(yīng)液4的成分及濃度為引物各為0.75nL/10pmol，dNTP為0.9pl/2.5mm，TaqDNA聚合酶為0.2nL/2.5U/nL,10xbuffer為1.5pL含Mg2+15pM,雙純水為9.9pL。所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒的特異性擴(kuò)增引物，上下游長(zhǎng)度分別為21bp和18bp的核苷酸，序列如下上游引物為5，-ctagctcagttctttctctgc隱3，；下游引物為-5，"cccaactccaacccgacc-3，《所述的藏綿羊耐寒性基因?yàn)椴鼐d羊的p3-AR基因，且在P3-AR基因內(nèi)含子中一段長(zhǎng)為263bp的多態(tài)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度為263bp。所述的檢測(cè)藏綿羊耐寒性等位基因的特異性擴(kuò)增引物的擴(kuò)增條件為:94'C預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60'C退火30秒，72'C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，72'C總延伸10分鐘，4'C保存。藏綿羊耐寒性基因ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣10/C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣11/E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣12的核苷酸序列分別為A:ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60cgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcggggctgaggaagctgcgagtgcgaattcttccccagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263C:ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60cgagactegagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263ctagctcagttctttctctgcccaaaattcttaccatcacgcgagctggctttgacttgc60tgagactagagggcaaccccccattccctgccccaccccatccccgcgccagtccccaag120ccttcgggctcagttctggtttctttggaaagtctgatagccccgaaggtgaggattcgc180ttccggaatgaaggctagcagggctgaggaagctgtgagtgcgaattcttcctcagtagg240aagcgggtcgggttggagttggg263藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒的使用方法，(1)將待檢測(cè)的基因組DNA(ltiL/50ng)與試劑盒中的PCR反應(yīng)液混合；擴(kuò)增條件為94'C預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60。C退火30秒，72'C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，72'C總延伸IO分鐘，4'C保存(2)用步驟(1)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和藏綿羊耐寒性較強(qiáng)等位基因A、C、E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SSCP檢測(cè)試劑各組分混合進(jìn)行SSCP檢測(cè)；(3)步驟(2)中檢測(cè)到的帶型與耐寒性等位基因A、C、E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致的樣品為攜帶藏綿羊耐寒性較強(qiáng)等位基因的個(gè)體實(shí)施例2:1.材料和方法1.1試驗(yàn)材料和方法l丄l試驗(yàn)材料本試驗(yàn)共采集甘加羊50只，采于甘南藏族自治州。血樣不加抗凝劑直接利用FTA試紙收集，陰干后待用。1.2試驗(yàn)方法1.2.1藏綿羊基因組DNADNA提取按照WhatMan公司的提取方法進(jìn)行。步驟如下(1)用取樣器從FTA采樣紙上取1個(gè)直徑為1.2mm的圓盤(pán)(Disk)，放入預(yù)先編號(hào)的PCR管中。(2)在每個(gè)樣品中加入200nL的20mM的NaOH溶液，使之充分與小圓盤(pán)(Disk)混勻，室溫下放置40mins(待小圓盤(pán)(Disk)的顏色變?yōu)榘咨?，必要時(shí)可以加熱至7(TC左右以加快洗脫速度)。(3)棄管內(nèi)NaOH液，加入200pL的TE緩沖液，室溫放置5min后棄TE緩沖液(一定要棄盡液體部分)。(4)PCR管敞口放置過(guò)夜，待管內(nèi)殘留液揮發(fā)盡后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.2.2PCR擴(kuò)增根據(jù)Forrest等報(bào)道的全序列與Byun等檢測(cè)到的耐寒性相關(guān)多態(tài)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)ADRB3基因第一內(nèi)含子一段長(zhǎng)為263bp區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。上下游長(zhǎng)度分別為21bp和18bp的核苷酸，序列如下上游引物為5，-ctagctcagttctttctctgc-3，；下游弓I物為5，-cccaactccaacccgacc-3，。藏綿羊耐寒性基因?yàn)椴鼐d羊的P3-AR基因，且在P3-AR基因內(nèi)含子中一段長(zhǎng)為263bp的多態(tài)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。引物的擴(kuò)增條件為94t:預(yù)變性2分鐘，94'C變性30秒，60'C退火30秒，72°C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，72'C總延伸10分鐘，4'C保存。擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度為263bp。檢測(cè)藏綿羊耐寒性等位基因的檢測(cè)試劑盒，包括15nl的PCR反應(yīng)體系，其成分的用量及濃度為引物各為0.75pL/10pmol，dNTP為0.9nl/2.5mm，DNA聚合酶為0.2nL/2.5U4iL，10xbuffer為1.5pL含Mg2+15^iM，模板DNA為洗滌過(guò)的半徑為1.2mm8的FTA試紙小圓盤(pán)，雙純水為10.9nL;產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.2.3SSCP檢測(cè)0.7^1PCR產(chǎn)物和6^1的上樣緩沖液[98%甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)、10%甘油]，95'C變性5min，迅速插入冰中使之保持變性。樣品在14。/。非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr:Bis=29:1)中電泳。電泳結(jié)束后,進(jìn)行銀染顯帶。銀染法顯色后拍照。2.結(jié)果與分析2.1SSCP檢測(cè)辨型與耐寒性評(píng)估SSCP分析配膠表2.14%聚丙烯酰胺凝膠配置表214%聚丙烯酰胺凝膠配置14%聚丙烯酰胺凝膠04)40%聚丙烯酰胺10xTBE10。/o過(guò)硫酸胺aTEMED雙蒸水33ml5.5ml660pl66(a170mla過(guò)硫酸胺需要新鮮配制將擴(kuò)增產(chǎn)物每管加入IO(HU上樣緩沖液(95%甲酰胺，20mMEDTA，0.05%溴酚藍(lán)，0.05%二甲苯菁)，置于加熱板95'C加熱5mins，之后迅速轉(zhuǎn)置碎冰上，上樣于14%的聚丙烯酰胺凝膠(16x18cm,l.Omm夾片，34孔梳子)包括0.5xTBE[44.5mMTris，44.5mM硼酸，lmMEDTA(PH8.0)]。樣品在ProteanIIXicell(Bio-Rad,HerculesCA,USA)200v下電泳22hrs,電泳在22t:恒溫室內(nèi)25'C水浴下進(jìn)行。電泳完畢后，將膠片從電泳槽中取出，放入預(yù)先配制好的固定液[0.P/。AgNO3+固定液(10n/。醋酸+25n/。乙醇)]靜置4mins后用真空泵吸盡殘液，用雙蒸水洗滌30s，吸盡殘液。加入染色液(2Q/。NaOH+lml40Q/。甲醛)，大約等待15mins后條帶便會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，吸盡殘液，加入固定液，將膠片小心轉(zhuǎn)置于紙上，即可讀膠。等位基因辨型。根據(jù)所得條帶對(duì)膠片進(jìn)行辨型，其中標(biāo)準(zhǔn)樣品及帶型為耐寒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)物。不同等位基因型所代表的藏綿羊耐寒性級(jí)數(shù)見(jiàn)表3:表3不同ADBR3等位基因型所代表的藏綿羊耐寒性級(jí)數(shù)等位基因Genbank登錄號(hào)_分級(jí)(1-5分)AAF3142001BAF3142013CAF3142022DAF314203'5EAF3142041FAF3142054GDQ2679395HDQ2694973IEU37畫(huà)2IEU3714043數(shù)據(jù)錄入與轉(zhuǎn)換將所得SSCP等位基因型進(jìn)行可能的表型值轉(zhuǎn)換，如AD基因型可相應(yīng)轉(zhuǎn)換為1，5表型值。根據(jù)圖3可知，分值為1時(shí)羔羊凍死風(fēng)險(xiǎn)最低，在l-3之間為低凍死風(fēng)險(xiǎn)，3-5之間為高凍死風(fēng)險(xiǎn)，5為最高凍死風(fēng)險(xiǎn)。SSCP檢測(cè)辨型與耐寒性評(píng)估見(jiàn)表4表4甘加羊耐寒性評(píng)估表品種個(gè)體編號(hào)ADRB3等位基因型耐寒性風(fēng)險(xiǎn)值Tibet-GJS1Tibet-GJS2Tibet-GJS3Tibet-GJS4Tibet-GJS5Tibet-GJS6Tibet-GJS7Tibet-GJS8Tibet-GJS9Tibet-GJS10Tibet-GJS11Tibet-GJS12Tibet-GJS13Tibet-GJS14Tibet-GJS15Tibet-GJS16Tibet-GJS17Tibet-GJS18Tibet-GJS20Tibet-GJS19Tibet-GJS21Tibet-GJS22Tibet-GJS23Tibet-GJS24Tibet-GJS25Tibet-GJS26Tibet-GJS27Tibet-GJS28Tibet-GJS29Tibet-GJS30Tibet-GJS31Tibet-GJS32Tibet-GJS33Tibet-GJS34Tibet-GJS35Tibet-GJS36Tibet-GJS37Tibet-GJS38Tibet-GJS40Tibet-GJS41Tibet-GJS42Tibet-GJS43Tibet-GJS44EU3714053EU3714065EU3714071231CCGCACBFCCCCBFCCCBCCT.JFFBCCCCFCCECHCCCACCCCHTibet-GJS45CC2，2Tibet-GJS46CF2,4Tibet-GJS47CC2,2Tibet-GJS48CC2,2Tibet-GJS49CC2,2Tibet-GJS50CC2，2Tibet-GJS51CE2,1Tibet-GJS52CC2,2Tibet-GJS53AC1,2從結(jié)果中可以得知具體藏綿羊個(gè)體的耐寒性風(fēng)險(xiǎn)值，其值為各等位基因風(fēng)險(xiǎn)值的算術(shù)平均數(shù)，數(shù)字越高，凍死風(fēng)險(xiǎn)越大。如第5號(hào)羊具有AA基因型分別具有1，l的風(fēng)險(xiǎn)值，那么該羊只的凍死風(fēng)險(xiǎn)值為(1+1)/2=1。實(shí)施例2:中國(guó)藏綿羊群體耐寒性多態(tài)性分析1.3統(tǒng)計(jì)分析方法序列的分析與比對(duì)利用軟件DNASTAR7.0完成，等位基因頻率的計(jì)算利用EXCEL2003進(jìn)行，基因的遺傳多態(tài)性指標(biāo)由軟件POPGENE32(V1.32)進(jìn)行計(jì)算。多態(tài)信息含量的計(jì)算由公式完成ffl附一l—m_式中pi—第i個(gè)等位基因的頻率；pj—第j個(gè)等位基因的頻率；m—該座位的等位基因數(shù)。2.4不同藏綿羊品種ADRB3等位基因頻率與基因多態(tài)性分析對(duì)中國(guó)藏綿羊群體中檢測(cè)出的12條ADRB3等位基因進(jìn)行頻率分析(表5),等位基因C在甘加羊，歐拉羊，喬科羊，小尾寒羊和美利奴灘寒雜種羊中為優(yōu)勢(shì)等位基因，頻率分別達(dá)到了56.7%，66.7%，59.5%，47.7%和44.2%，在湖羊群體中優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳達(dá)到了41.5c/。其次為等位基因C(30.9%);在中國(guó)藏綿羊群體中新發(fā)現(xiàn)的5條等位基因中等位基因I的頻率最高(2.1%)，等位基因G、H、J、K、L禾BM比例最低(0.1%-1.9%)。_表5中國(guó)藏綿羊群體ADRB3等位基因頻率(％)_等位基因~~甘加羊~iS~小尾寒羊美利奴雜種羊1"""5個(gè)中國(guó)藏綿羊群體遺傳多態(tài)性指標(biāo)見(jiàn)表6。由表6可知，中國(guó)5個(gè)藏綿羊群體共462只個(gè)體的PCR-SSCP結(jié)果表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，其中美利奴灘寒雜種羊，歐拉和喬科羊處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；從位點(diǎn)間雜合度來(lái)看，六個(gè)群體雜合度皆大于0.8，其中湖羊的雜合度最高(0.9629)，歐拉羊最低(0.8020);有效等位基因數(shù)(Ne):湖羊最大(26.9542)，歐拉羊最小(5.0505);位點(diǎn)間多態(tài)信息含量(PIC):美利奴灘寒雜種羊最高(0.6656)，歐拉羊最低(0.4506),除了歐拉羊群體，其余群體的PIC皆超過(guò)了0.5，^10q"0102430p00_02300020一2嚴(yán).o238500ooLc5o,cSCijcl016061000一7JJ03001000002.67:0989900000ABCDEFGHIGKLMll在ADRB3基因位點(diǎn)屬于中高度多態(tài)。表6中國(guó)藏綿羊群體乂D朋3基因座遺傳多態(tài)性指標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上所述僅為本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例，并不用以限制本實(shí)用新型，凡在本實(shí)用新型的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其特征是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液(4)，ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)。2.如權(quán)利要求l所述的藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒，其特征是在容器孔中還包括分別放置SSCP檢測(cè)試劑，去離子水(5)，10%過(guò)硫酸銨(7)，上樣變性緩沖液(6)，TEMED(8)，聚丙烯酰胺(9)。專利摘要本實(shí)用新型涉及動(dòng)物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及以藏綿羊耐寒性相關(guān)基因ADRB3基因的等位基因檢測(cè)試劑盒。一種藏綿羊耐寒性等位基因檢測(cè)試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設(shè)有數(shù)個(gè)容器孔，其主要特點(diǎn)是在容器孔中分別放置PCR反應(yīng)液(4)，ADRB3基因的等位基因A的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(10)和C的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(11)和E的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣(12)。本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)、易操作，適用于各級(jí)畜牧獸醫(yī)教學(xué)科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型藏綿羊養(yǎng)殖企業(yè)的藏綿羊的選種?？梢詸z測(cè)藏綿羊個(gè)體自身的耐寒性性狀，從而提高藏綿羊的耐寒性選育效率，有效提高群體耐寒性。文檔編號(hào)C12Q1/68GK201381324SQ2009201528公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2009年4月10日優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日發(fā)明者成述儒,方素櫟,果楊,羅玉柱,江胡申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)