專利名稱：：通過埃希氏菌屬細(xì)菌生產(chǎn)l-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體地涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法且更具體的涉及獲自大腸桿菌的基因。這些基因?qū)τ谔岣週-氨基酸生產(chǎn)能力是有用的，例如L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-精氨酸。
背景技術(shù)：
：傳統(tǒng)的L-氨基酸工業(yè)生產(chǎn)方法是發(fā)酵方法，通過利用來源于自然環(huán)境中微生物菌株或特定修飾的突變株來提高L-氨基酸生產(chǎn)能力的。已經(jīng)公開了很多提高L-氨基酸生產(chǎn)能力的技術(shù)，例如通過重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(參見例如US4,278,765)。這些技術(shù)的基礎(chǔ)是提高在氨基酸生物合成中的酶活性和/或使被L-氨基酸產(chǎn)物反饋抑制的酶脫敏(參見例如，日本專利申請No56-18596(1981),W095/16042或美國專利No.5，661，012和6,040,160)。在另一方面，提高的氨基酸分泌可以增強L-氨基酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力，擁有增強表達(dá)L-賴氨酸分泌基因(lysE基因)的埃希氏菌屬細(xì)菌菌株己被公開(WO9723597A2)。另外，編碼適合于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的分泌蛋白的編碼基因也已經(jīng)公開(美國專利No.5，972，663)?，F(xiàn)在，一些編碼能提高L-氨基酸生產(chǎn)的推定的膜蛋白的大腸桿菌基因被公開?；虻念~外的拷貝使細(xì)菌具有"腿的對L-高絲氨酸的抗性并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP994190A2)。此外，rM7基因的額外的拷貝使細(xì)菌具有優(yōu)選的對L-高絲氨酸和L-蘇氨酸的抗性并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸和L-亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP1013765A1)。此外，，M/:，"6^,A:和j^^基因的額外的拷貝提高L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-丙氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP1016710A2)。盡管，3大腸桿菌K-12菌株的全長基因組序列已經(jīng)描述(BlattnerF.R.,PlunkettG，BlochC.A.etal.，Science,227，1453-1474,1997;ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz),但其中的很多ORFs，它們的功能尚不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提高L-氨基酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力并提供一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，例如通過菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-腩氨酸、L-亮氨酸或L-甲硫氨酸或L-精氨酸。此目的是通過識別編碼蛋白質(zhì)的基因而達(dá)到的，這些基因并不參預(yù)目標(biāo)L-氨基酸的生物合成途徑中但能提高其產(chǎn)量。一個例子是這種蛋白質(zhì)是一種具有L-氨基酸分泌活性的膜蛋白。在大腸桿菌全長基因纟.瞎列分析的基礎(chǔ)上，擁有4或更多個推定的跨膜片段(TMS)的蛋白質(zhì)被選擇。努力篩選的結(jié)果，本發(fā)明人從中識別了幾個基因，它們是b2682,b2683,bl242和b3434，并進(jìn)行了全面的研究?；騜2682和b2683已被認(rèn)為是被推定的CDS，它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(分別為GENEBANK登記號AE000353U00096序列的核苷酸數(shù)92到829和819到1154)。基因b2683也認(rèn)為是ygfl//?；騜1242己被認(rèn)為是推定的CDS,它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(GENEBANK登記號AE000222U00096序列的核苷酸數(shù)8432到9079)。基因b1242也認(rèn)為是yc/!五。基因b3434已被認(rèn)為是推定的CDS，它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(GENEBANK登記號AE000420U00096序列的核苷酸數(shù)1463到2056)?；騜3"4也認(rèn)為是j^g見本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過提高b2682，b2683，b1242或b3434基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，菌株的L-氨基酸生產(chǎn)能力也被提高，因此，本發(fā)明已經(jīng)完成。本發(fā)明如下1)一種L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌，該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(Escherichia),該細(xì)菌經(jīng)過修飾以致于該細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下A)或B)，和C)或D)定義的蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞中的活性來提高B)—種包含序列表中SEQIDNO:3所示氨基駿序列的蛋白質(zhì)；C)一利'包含在序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、添加一個或多個氨基酸而形成的氨基駒,列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；D)—種包含序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；E)—種包含在序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性;。(在下文中，如上述A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)被稱為"本發(fā)明第一實施方案的的蛋白質(zhì)"，能提高上述蛋白質(zhì)活性的埃希氏菌屬細(xì)菌被稱為"本發(fā)明第一實施方案的細(xì)菌")2)根據(jù)上述的細(xì)菌，A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌，或通過改變細(xì)菌染色體DNA上的表達(dá)調(diào)控序列而提高。3)根據(jù)上述的細(xì)菌，其中的轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進(jìn)行的。4)一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。5)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。6)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以提高蘇氨7)一根據(jù)Jl^方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。8)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以提高//v操縱子的表達(dá)。9)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。10)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以提高脯氨酸生物合成基因的表達(dá)。11)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-亮氨酸。12)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以提高操縱子的表達(dá)。13)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-甲硫氨酸。14)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以提高w"調(diào)節(jié)子的表達(dá)。15)-—種L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌，該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬，該細(xì)菌經(jīng)過修飾以致于該細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下E)或F)定義的蛋白質(zhì)在細(xì)5菌細(xì)胞中的活性來提高F)—禾中包含序列表中SEQIDNO:11所示氨基,列的蛋白質(zhì)；G)—種包含在序列表中SEQIDNO:ll所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；(在下文中，如上述E)或F)定義的蛋白質(zhì)有時被稱做"本發(fā)明第二實施方案的蛋白質(zhì)"，能提高上述蛋白質(zhì)活性的埃希氏菌屬細(xì)菌是指"本發(fā)明第二實施方案的細(xì)菌")16)根據(jù)上述的細(xì)菌，E)或F)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼E)或F)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌，或通過改變細(xì)菌染色體DNA上的表達(dá)調(diào)控序列而提高。17)根據(jù)上述的細(xì)菌，轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進(jìn)行的。18)—種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。19)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。20)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌己經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以提高蘇氨酸操縱于的表達(dá)。21)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。22)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以提高//v':,f'L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌，該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬，該細(xì)菌經(jīng)過修飾以致于該細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下G)或H)定義的蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞中的活性來提高H)—種包含序列表中SEQIDNO:15所示氨基!t^列的蛋白質(zhì)；I)一利，包含在序列表中SEQIDNO:15所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基,芋列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性，例如；DL-O-甲基絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-p-羥基-正纈氨酸，對S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加；(在下文中，如上述G)或H)定義的蛋白質(zhì)有時被稱做"木發(fā)明第三實施方案的蛋白質(zhì)"，能提高E)或F)蛋白質(zhì)活性的i矣希氏菌屬細(xì)菌是指"本發(fā)明第三實施方案的細(xì)菌")24)根據(jù)上述的細(xì)菌，G)或H)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼(G)或(H)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌，或通過改變細(xì)菌染色體DNA上的表達(dá)調(diào)控序列來提高。25)根據(jù)上述的細(xì)菌，其中的轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進(jìn)行的。26)—種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。27)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-精氮酸。28)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以增強精氨酸調(diào)節(jié)子的表達(dá)。29)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。30)根據(jù)上述方法，所述的細(xì)菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細(xì)菌可以增強脯氨酸生物合成基因的表達(dá)。生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQrDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高了的蛋白質(zhì)活性的L-蘇氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸。一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-纈氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-纈氨酸。此外，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-脯氨酸生產(chǎn)細(xì)菌來生產(chǎn)L-脯氨酸。此外，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-亮氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-亮氨酸。生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-甲硫氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-甲硫氨酸。進(jìn)--步的，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:ll所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-蘇氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸。一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:11所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-纈氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-纈氨酸。更進(jìn)一歩的，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:15所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-精氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-精氨酸。此夕卜，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:15所示氨基,列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-脯氨酸生產(chǎn)細(xì)菌生產(chǎn)L-脯氨酸。下面將詳細(xì)解釋本發(fā)明本發(fā)明的細(xì)菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌，該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬，該細(xì)菌經(jīng)過修飾以致于該細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞中的活性來提高。來本發(fā)明中"L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌"是指細(xì)菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時有能力在培養(yǎng)基中積累L-氨基酸的細(xì)菌，這種L-氨基酸生產(chǎn)能力可以是細(xì)菌的野生菌株具有的特性也可以是通過培育而獲得或提高的。本發(fā)明的細(xì)菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌，該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬，該細(xì)菌具有提高的蛋白質(zhì)活性，它可以提高目標(biāo)L-氨基酸的生產(chǎn)能力，具體的，本發(fā)明的細(xì)菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌，該細(xì)菌屬于埃希氏菌屬，該細(xì)菌具有提高的至少一種或兩利咱勺蛋白質(zhì)活性。術(shù)語"提高的蛋白質(zhì)活性"，是指每個細(xì)胞的活性要高于未經(jīng)修飾的菌株，例如，一種野生型埃希氏菌屬細(xì)菌。例如，將提到一個每個細(xì)胞的蛋白質(zhì)分子數(shù)增加的例子，毎個蛋白質(zhì)分子特定活性增加的一個例子等等。進(jìn)一步，一種野生型埃希氏菌屬細(xì)菌被用做對照，例如，野生型大腸桿菌菌株將被提到。具體的，本發(fā)明第一實施方案的細(xì)菌載有在細(xì)菌的染色體DNA或質(zhì)粒上至少有b2682和b2683兩個基因優(yōu)選二者超表達(dá)的DNA，且具有增強的生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸和L-甲硫氨酸。本發(fā)明的第二實施方案的細(xì)菌在細(xì)菌的染色體DNA或質(zhì)粒上載有DNA，該DNA上有bl242基因過量表達(dá)，并提高生產(chǎn):L-氨基酸的能力，例如，L-蘇氨酸和/或L-纈氨酸。本發(fā)明的第三實施方案的細(xì)菌停泊在細(xì)菌的染色體DNA或質(zhì)粒上超表達(dá)b3434基因的DNA，并具有增強的生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-精氨酸和/或L-脯氨酸。本發(fā)明第一實施方案的蛋白質(zhì)包括以下A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)中的任一個J)一種包含序列表中SEQ:rDNO:3所示氨基鵬,列的蛋白質(zhì)；K)一種包含在序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列上缺失、置換、8插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基Mi^列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；L)一種包含序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；M)—種包含在序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性;。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的類型而不同。分別來講，對蛋白質(zhì)(A)來講是可以是2-24，優(yōu)選是2-12，更雌是2-5，對蛋白質(zhì)(C)來講是可以2-11，優(yōu)選是2-7，更優(yōu)選為2-5。本發(fā)明第二實施方案的蛋白質(zhì)包括以下E)或F)定義的蛋白質(zhì)中的任一個N)—禾中包含序列表中SEQIDNO:11所示氨基敏芋列的蛋白質(zhì)；0)—種包含在序列表中SEQIDNO:ll所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(E)來講是可以是2-22，優(yōu)選是2-11，更"逾是2-5。本發(fā)明第三實施方案的蛋白質(zhì)包括以下G)或H)定義的蛋白質(zhì)中的任--個.P)—種包含序列表中SEQIDNO:15所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；Q)—種包含在序列表中SEQIDNO:15所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氮基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細(xì)菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性，例如；DL-o-甲基絲氨酸，6-重氮基—5賓—L-正亮氨酸和DL-b-羥基-去甲纈氨酸，對S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感二"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(G)來講是可以是2-20，優(yōu)選是2-10，更優(yōu)選是2-5。增加的對L-氨基酸和/或其類似物的抗性意味著具有在未修飾的菌株，或野生菌株，或本細(xì)菌的親本菌株不能生長的，含有L-氨基酸和/或其類似物最低濃度的培養(yǎng)基上生長的能力?；蛘咭馕吨斜任葱揎椀木鷉未，或野生菌株，或本細(xì)菌的親本菌株在含有L-氨基酸和/或其類似物的培養(yǎng)基上生長更快的能力。更具體的，大腸桿菌菌株在37'C含有合適條件的L-氨基酸和/或其類似物瓊月旨培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如果大腸桿菌菌株形成了一個比37。C，大腸桿菌菌株在固體Adams培養(yǎng)基上經(jīng)過2-4天培養(yǎng)后形成的未修飾菌株或野生型菌株大的菌落，則可以說大腸桿菌菌株已經(jīng)增加了對L-氨基酸和/或其類似物的抗性。術(shù)語"合適的條件"是指鵬、pH、供氣或基本營養(yǎng)或其它的選擇。L-氨基酸類似物通過3，4-二氫脯氨酸，DL-硫代異亮氨酸，DL-o-甲基絲氨酸，4-氮雜亮氨酸，正亮氨酸，L-o-氟代苯丙氨酸和DL-o-氟代苯丙氨酸，高絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-P-羥基-正纈氨麟例證。上面提及到L-氨基酸或它們的類似物存在的條件下，未修飾的菌株或野生型菌株不能生長時的濃度，依據(jù)使用的化合物的結(jié)構(gòu)不同進(jìn)行變化是值得注意的(從DL-硫代異亮氨酸的0.5fig/ml到DL-o-甲基絲氨酸的9600pg/ml)。例如，假設(shè)是3，4-二氫脯氨酸，一般濃度是7-70^g/ml，優(yōu)選是20-25)ag/ml;假設(shè)是DL-硫代異亮氨酸，一般濃度是0.5-5pg/ml，"戰(zhàn)是0.9-U|ag/ml;假設(shè)是DL-o-甲基絲氨酸，一般濃度是1100-9600|Lig/ml，優(yōu)選是3000-3500pg/ml;假設(shè)是4-氮雜亮氨酸，一般濃度是15-150iag/ml，優(yōu)選是40-50(ig/ml;假設(shè)是正亮氨酸，一般濃度是150-1500jig/ml，優(yōu)選是450-550|dg/ml;假設(shè)是L-o-氟代苯丙氨酸，一般濃度是0.6-6嗎/ml，優(yōu)選是1.5-2^g/ml;假設(shè)是DL-o-氟代苯丙氨酸，一般濃度是2-20^ig/ml，優(yōu)選是5-7(ig/ml;假設(shè)是高絲氨酸，一般濃度是330-3300ng/ml，優(yōu)選是900-1100jig/ml;假設(shè)是6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，--般濃度是5-50|ig/ml，優(yōu)選是12-18^ig/ml;假設(shè)是DL-P-羥基-正纈氨酸，一般濃度是25-250)Lig/ml，優(yōu)選是70-90|ag/ml。對L-氨基酸或它們的類似物敏感意味著細(xì)菌有比它的未經(jīng)修飾菌株或野生菌株在含有最低濃度的L-氨基酸或它們的類似物的培養(yǎng)基上擁有更長增殖期的能力?；蛘呤牵瑢-氨基酸或它們的類似物敏感意味著細(xì)菌在它的未經(jīng)修飾菌株或野生菌株能生長的，含有最低濃度的L-氨基酸或它們的類似物的培養(yǎng)基上不能生長。這種L-氨基酸類似物是通過S-(2-氨乙基)半胱氨酸來例證的。上面提及的濃度假設(shè)是對于S-(2-氨乙基)半胱氨酸，一般濃度是0.2-2%g/ml,優(yōu)選是0.5-1.0ng/mL本發(fā)明的細(xì)菌也包括通過將編碼A)或B)，和C)或D)，或E)或F)，或G)或H)蛋白的DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌或通過改變細(xì)菌染色體DNA上的表達(dá)調(diào)控序列而將本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的活性提高的菌株。所述的在本發(fā)明中對細(xì)菌進(jìn)行修飾的DNA編碼推定的膜蛋白質(zhì)。進(jìn)一步，該DNA編碼具有4個或更多個跨膜節(jié)段的蛋白質(zhì)。這樣的DNA可以編碼具有L-氨基酸分泌活性的蛋白質(zhì)。更進(jìn)一步，該DNA通過b2683，b2683，W242和b3434基因表示。必須要注意的是b2682基因的編碼區(qū)728-738和b2683基因的編碼區(qū)1-11是部分重疊的。這兩個基因可以通過例如使用SEQIDNO:l和SEQIDNO:2公開的核苷酸作為引物進(jìn)行PCR而獲得，為一個PCR產(chǎn)物。基因b1242可以通過例如使用SEQIDNO:9和SEQIDNO:10公開的核苷酸作為弓胸進(jìn)行PCR而獲得?；騜3434可以通過例如使用SEQIDNO:13和SEQIDNO:14公開的核苷酸作為引物進(jìn)行PCR而獲得。對大腸桿菌全基因組序列分析可以篩選出編碼具有4個或更多個推定的TMS蛋白質(zhì)的基因。己知功能的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)運蛋白在PaulsenI.T.,SliwinskiM丄，SaierM.H.的文章中描述(丄Mol.Biol.，l998,227,537)LintonK.J和HigginsC.F.(MolecularMicrobiology,1998,28(l)，5)也對它進(jìn)行了排除篩選，在其余的基因篩選的結(jié)果中，幾個編碼推定膜輸出蛋白的基因關(guān)閉了。發(fā)現(xiàn)b2682和b2682基因超表達(dá)，或b1242或b3434基因超表達(dá)提高了L-氨基酸生產(chǎn)菌的L-氨基酸生成。本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)A)或C)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸/,列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的類型而不同。分別來講，對蛋白質(zhì)(A)來講是可以是2-24，優(yōu)選的是2-12，更優(yōu)選是2-5，對蛋白質(zhì)(C)來講是可以2-11，優(yōu)選的是2-7，更優(yōu)選是2-5。進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)A)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(E)來講是可以是2-22，優(yōu)選的是2-11，更優(yōu)選是2-5。更進(jìn)一步，本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)E)ii的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(G)來講是可以是2-20，{尤選的是2-10，更優(yōu)選是2-5。編碼與A)，C),E)或G)定義的蛋白質(zhì)在實質(zhì)上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過例如對編碼A)，C)，E)或G)定義的蛋白質(zhì)核苷酸序列進(jìn)行定向位點誘變而獲得，所以一個或更多氮基酸殘基會被缺失、置換、插入、增加。這種修飾的DNA可以通過常規(guī)的試劑處理和條件生成突變的方法獲得。這種處理包括使用羥胺處理編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或用紫外線輻射或例如N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理細(xì)菌含的DNA。本發(fā)明的DNA包括在不同菌株中和在埃希氏菌屬細(xì)菌天然多樣的菌株中分離的突變體。編碼這些突變體的DNA可以通過分離DNA而獲得，它們可以與基因b2862，b2863，b1242或b3434雜交，或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下部分雜交，并且它們編碼的蛋白質(zhì)可以提高L-氨基酸的生產(chǎn)，術(shù)語"嚴(yán)謹(jǐn)條件"是指可以形成所謂的特異的雜交時，而非特異的雜交沒有形成時—的條件。例如，嚴(yán)謹(jǐn)條件包括DNA有高度同源性時的雜交條件，例如DNAs相互之間擁有70%同源性時。或者，嚴(yán)謹(jǐn)條件可以通過構(gòu)成Southern雜交清洗時的普通條件來例證，例如，60。C,1XSSC,0.1%SDS，優(yōu)選的是0.1XSSC，0.1%SDS。使用編碼突變體的，并能與基因b2862，b2863，b1242或b3434雜交的DNA作為探針，含有部分SEQIDNO:3或SEQIDNO:5的核苷酸序列的DNA也可以作為探針。這樣的探針可以通過使用基于SEQEDNO:3、5、11、15而生產(chǎn)的寡聚核苷酸作為引物，使用含有SEQIDNO:3、5、11、15的核苷酸的DNA片段作為模板進(jìn)行PCR而制備。當(dāng)長度約為300bp的DNA片段被用做探針時，雜交的沖洗條件為，例如，50°C，2XSSC和0.1。/。SDS。用編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌意味著將DNA傳入細(xì)菌細(xì)胞，例如通過傳統(tǒng)的方法來提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)并提高細(xì)菌細(xì)胞中該蛋白質(zhì)的活性。提高基因表達(dá)的技術(shù)包括增加基因拷貝數(shù)。在埃希氏菌屬細(xì)菌中傳入一個含有基因的載體能起到增加l該基因拷貝數(shù)的功能。為此目的，最好使用多拷貝載體。多拷貝載體是通過pBr322，pMW119，pUC19，pET22b或其它相似的載體來例證的。此外，也可以通過例如同源重組或相似方法來在細(xì)菌染色體上弓l入基因的多拷貝，而達(dá)到提高基因表達(dá)的目的。為了提高了兩個或多個基因的表達(dá)，基因可以一起位于同一個質(zhì)粒上，也可以位于不同的質(zhì)粒上。一個基因位于染色體上，而另一個位于質(zhì)粒上也是可以的。在另一方面，可以通過改變基因的表達(dá)調(diào)控序列而提高基因表達(dá)。改變基因的表達(dá)調(diào)控序列包括在基因原有的表達(dá)調(diào)，^列例如啟動子中引入突變，而使基因表達(dá)提高(WO00/18935),也可以將本發(fā)明的DNA置于強啟動子的控制下。例如/"c啟動子，印啟動子，/rc啟動子，A噬菌體中被認(rèn)為是強啟動子的PL啟動子，強啟動子可以與多拷貝基因耳^使用。本發(fā)明所述的細(xì)菌可以通過向本身能產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌中引入上述DNA而獲得。也可以通過賦予已經(jīng)含有DNA的細(xì)菌這種產(chǎn)生L-氨基酸能力而獲得所述的細(xì)菌。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-蘇氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株VL2054(VKPMB-8067)，VNIIGenetika472T23(美國專利N05,631,157)，VKPMB-3996(美國專利NO5，175,107和NO5,976,843)，KCCM-10132(WO009660A1)，KCCM-10133(WO009661A1)或類似的菌株可以使用。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-纈氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株H』1(VKPMB-8066),NRRLB-12287和NRRLB-12288(美國專利NO4，391,907)，VKPMB-4411(美國專利N05,658,766)，VKPMB-7707(歐洲專利申請EP1016710A2)或類似的菌株可以使用。此外，已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-脯氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株NRRLB-12403和NRRLB-12404(GB2075056)，VKPMB-8012(俄羅斯專利申請NO2000124295),專利DE3127361中描述的突變質(zhì)粒，BloomF.R.etal描述的突變質(zhì)粒(The15thMiamiwintersymposium,1983,p.34)或類似的菌株可以使用。己經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-亮氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌B-7368和VKPMB-7388(RU2140450)，W1485atpA401/pMWdAR6，W14851ip2/pMWdAR6禾nAJ12631/pMWdAR6(EP0872547)或類似的菌株可以使用。己經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-甲硫氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株AJ11539(NRRLB-12399)，AJ11540(NRRLB-12400),AJ11541(NRRLB-12401)AJ11542(NRRLB-12402)(GB2075055)，或類似的菌株可以iOT。進(jìn)一歩，已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-精氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株AJ11531和AJ11538(JP56106598A2)，AJ11593(FERMP-5616)和AJ11594(FERMP-5617)(日本專利公開N0575693)或類似的菌株可以使用。本發(fā)明所述的細(xì)菌可以進(jìn)一步提高包括在L-氨基酸生物合成中一個或更多個基因的表達(dá)。對于L-蘇氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過蘇氨酸操縱子來例證的，它最好包含一個編碼被L-蘇氨酸反饋抑制的門冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶基因(日本專利公開N0.1-29559)。對于L-纈氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過//v操縱子，不很好表達(dá)蘇氨酸脫氨基氫酶，其弱化作用被抑制的//vG"7WEZM操縱子來例證的(日本專利公開N0.8-47397)。對于L-脯氨酸產(chǎn)生菌株，這利堪因是通過L-脯氨酸生物合成基因來例證的，它優(yōu)選用被L-脯氨酸反饋抑制的谷氨酸激酶基因pwi5表示(DE3127361)。對于L-亮氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過亮氨酸操縱子，也就是/^操縱子來例證的，它最好包含一個編碼被L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合成酶基因(俄羅斯專利公開99114325)。對于L-甲硫氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過甲硫氨酸調(diào)節(jié)子來例證的。甲硫氨酸調(diào)節(jié)子含有編碼抑制氨基酸生物合成的活性減低的蛋白質(zhì)的突變基因。這種基因是通過編碼從大腸桿菌中得到的L-甲硫氨酸生物合成相關(guān)抑制蛋白，在抑制甲硫氨酸生物合成的活性上減低的變異型基因w^J來例證的aP2000-157267A2)。進(jìn)一歩，這一基因為精氨酸調(diào)節(jié)子例證，其優(yōu)選包含其L-精氨酸反饋抑制被脫敏的N-乙酰基谷氨酸合成酶基因(RajagopalB.S.等Apple.Environ.Microbiol.1998,U.64.No.5,Pl805-1811)。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第一實施方案的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-纈氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-纈氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-纈氨酸的步驟。此外，本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-脯氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細(xì)菌，在培養(yǎng)基巾產(chǎn)生和積累L-脯氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-脯氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-亮氨酸的方^^括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-亮氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-亮氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-甲硫氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-甲硫氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方^^括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第二實施方案的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-纈氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-纈氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-纈氨酸的歩驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-精氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第三實施方案的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-精氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-精氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-脯氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-脯氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-脯氨酸的步驟。本發(fā)明所述的在培養(yǎng)基及相似物中培養(yǎng)、分離純化L-氨基酸，在使用微生物進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)時，可以使用與傳統(tǒng)發(fā)酵方法中相同的方法進(jìn)行。用來培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以時合成培養(yǎng)基也可以是天然培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基包括碳源、氮源和礦物質(zhì)，如果必要，還可以包括微生物生長需要的合適數(shù)目的營養(yǎng)物質(zhì)。碳源可以包括各利'碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，和各種有機酸。取決于所用微生物的同化方式，包括乙醇和甘油的醇也可以使用。至于氮源，各種胺鹽，例如氨和硫酸胺，包括例如胺的其他氮，天然氮源例如蛋白胨，大豆水解物和微生物發(fā)酵的消化物都可以使用。培養(yǎng)最好在例如振蕩培養(yǎng)，有氧攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進(jìn)行，溫度在20-40。C，最好在30-38。C。培養(yǎng)時的pH值一般在5-9，最好在6.5-7.2。pH值可以用氨水，碳酸鈣，各種酸，各利'堿和緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。通常，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-5天導(dǎo)致目的氨基酸在培養(yǎng)基中積累。在培養(yǎng)后，可以通過離心或膜過濾的方法將培養(yǎng)基中的固體出去，例如細(xì)胞。然后可以通過離子交換，濃縮和結(jié)晶的方法收集和純化目的氨基酸。附圖的簡要說明圖1顯示了質(zhì)粒pAlacZ的結(jié)構(gòu)本發(fā)明最佳實施方式下面將通過實施例更具體的解釋本發(fā)明，在下例中如未說明，氨基酸是L-構(gòu)型。實施例l:將b2682，b2683,b1242和b3434基因克隆至pAlacZ上為了克隆b2682，b2683，bl242和b3434基因使用了pAlacZ質(zhì)粒。質(zhì)粒pAlacZ衍生自質(zhì)粒pET-22b(+)(Novagen，Madison。WI，USA)。用酶Bgl1I和Xbal處理pET-22b(+)質(zhì)粒，將其與質(zhì)粒pMB9-lac(FullerR,Gene，19，43-54，1982)用相同內(nèi)切酶處理帶有PlacUV5啟動子的PCR產(chǎn)物的片段連接。對于擴增PteUV5啟動子片段可以使用SEQIDNO:7和SEQIDNO:8描述的PCR引物。通過克隆質(zhì)粒p正L250的SalI-BamHI的片段(DymakovaE.etal.,Gene,19,43-54,1982)，最后的質(zhì)粒增加了/acZ基因的部分結(jié)構(gòu)(237bp，沒有啟動子)。獲得的質(zhì)粒pAlacZ的圖譜在附圖1中表示?？寺〈竽c桿菌b2682和b2683推定閱讀框(b2682和b2683基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個引物在SEQIDNO:l和2中已經(jīng)描述。PCR反應(yīng)在PE-2400上，以40sec.95。C,40sec.47。C40sec.72。C,30循環(huán)的條件下進(jìn)行。如此，1158bp的包含了b2682禾nb2683基因的線形DNA片段就獲得了。將該片段用XbaI和BamHI內(nèi)切酶處理并插入到已經(jīng)用相同的酶處理了的多拷貝載體質(zhì)粒pAlacZ上。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYGAZH，攜帶的b2682和b2683兩個基因處于乳糖啟動子(P,acUV5)的控制下。類似的，克隆大腸桿菌M242推定閱讀框(b1242基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個弓嫩在SEQIDNO:9和10中已經(jīng)描述。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYCHE，攜帶的bU42基因處于孚L糖啟動子(PlacUV5)的控制下?？寺〈竽c桿菌b3434推定閱讀框(b3434基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個引物在SEQIDNO:13和14中已經(jīng)描述。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYHGN，攜帶的bl242基因處于乳糖啟動子(PlaeUV5)的控制下。實施例2:擴增的b2862，b2683基因?qū)Υ竽c桿菌菌株TG1,基ltA其類似物抗性的影響。大腸桿菌菌株TG1(pYGAZH)TG1(pYCHE)，TG1(pYHGN)和含有未插入片段質(zhì)粒的TG1菌株(對照菌株)在附加100ixg/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。所有菌株的過夜后的培養(yǎng)物用附加100ug/ml氨節(jié)青霉素和ffTG0.5mM的新鮮LB培養(yǎng)^f希釋25倍，在37。C有氧培養(yǎng)2小時。對數(shù)生長期的培養(yǎng)物用0.9%的NaCl溶液稀釋使在附加100lig/ml氨節(jié)青霉素和IPTG0.5mM和氨基酸或其類似物的Adams固體培養(yǎng)基平板上大約有1000個細(xì)胞接種。在37。C培養(yǎng)2-4天后，記錄擁有雜種質(zhì)粒的TG1菌株和對照TG1菌株之間在形成菌落的數(shù)目和大小上的不同。實驗結(jié)果如表1。1:抑制劑培養(yǎng)基中的濃度對含有質(zhì)粒〖。TG1菌株生長的影響pYGAZHpYCHEpYHGN脯氨酸3000NoNoNo3,4-二麵氨酸23RNoNo聽氨酸18000NoNoNoDL-硫代歸」氨酸1RNoNoo-甲基蘇氨酸6NoNoNoL-絲氨酸2800NoNoNoDL-絲氨酸3600NoNoNoDL-異翔污絲氨酸140NoNoNoDL-o畫甲基絲氨酸3200RRR4德亮氨酸45RNoNo6德謹(jǐn)-5-氧-L-正亮氨酸15NoNoR纈氨酸7RNoNo甲硫氨酸38000NoNoNo正亮氨酸500RNoNo半胱氨酸1600NoNoNo高絲氨酸1000NoNoNoDL-(3-羥基-去甲纈氨酸80NoRRL沃門冬氮酸-P-異羥訴100NoNoNo精氨酸4300NoNoNo賴氨酸5000NoNoNoS-(2-氨乙基)半胱氨酸0.75NoSS組氨酸3000NoNoNoL鄉(xiāng)酸異招污200NoNoNoDL-l,2,4-三噸-3-丙氨酸80NoNoNo苯丙氨酸13000NoNoNoP"氟微丙氨酸6NoNoNoL-o-氟代苯丙氨酸1.7RNoNoDL-o-氟代苯丙氨酸6RNoNo色氨酸12500NoNoNoDL斗氟代苯色氨酸0.1NoNoNo4-甲基色氣酸0.25NoNoNo7-甲基色氨酸100NoNoNoDL-a-甲基色氨酸400NoNoNom-氟-DL-酪氨酸0.5NoNoNoNo-與對照菌株沒有不同R-有更多的菌落或菌落更大S-與對照菌株相比具有更少的菌落或菌落更小實施例3:用含有質(zhì)茅立pYGAZH的菌株生產(chǎn)蘇氨酸蘇氨酸生產(chǎn)菌株VL2054是通過將含有處于P^UV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株被命名為VL2054(pYGAZH)。菌株VL2054是菌株VKPMB-3996的衍生物，在染色體上a)口標(biāo)蘇氨酸操縱子位于Pr啟動子的控制下。b)野生型基因e)染色休上沉默的編碼轉(zhuǎn)氫酶的基因(睡基因)和Tn5(tdh::Tn5，Kans)上沉默的編碼卡那霉素抗性基因(&")d)突變體//V」442菌株VL2054已經(jīng)于2001年1月30日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM){呆'藏(Russia113545,Moscow,1Dorozhnyproezd，1)，〈呆藏號為VKPMB-8067,并于2002年根據(jù)布達(dá)佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株VL2054(pMacZ)和菌株VL2054(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-llg/l;NaCl-0.4g/l;MgS〇4~0,4g/l;K2HP03-lg/l;FeSO4-10mg/l;MnS04-10mg/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-40g/l;如果必要的話氨節(jié)青霉素—300mg/1)，在32。C通風(fēng)^fTF培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的02ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32。C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48或72小時。18發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-22g/l;NaCl-0,8g/l;MgSO4~0.8g/l;K2HPOr2g/l;FeSO4-20mg/l;MnSO4-20mg/l;硫胺-0.2mg/l;酵母提取物-lg/l;CaCO3-30g/l;蔗糖誦80g/l;氨,青霉素—300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法領(lǐng)l淀培養(yǎng)基中蘇氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30%)-12ml，水-8ml。結(jié)果見表2。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了蘇氨酸產(chǎn)生菌株VL2054的蘇氨酸積尹_&系里。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例4:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)纈氨酸纈氨酸生產(chǎn)菌株H-81是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株已經(jīng)于2001年1月30日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia113545，Moscow,lDorozhnyproezd,1),保藏號為VKPMB-8066，并于2002年根據(jù)布達(dá)佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株H-81(pAlacZ)和菌株H-81(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-18^1;K2HP04-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5^1;蔗糖-60g/l;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/D，在通風(fēng)剝牛下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加BPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32"C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48或72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-1.8g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04-1.2g/l;CaCOr20g/l;硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g/l;氨芐青霉素-300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540ran處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法觀淀培養(yǎng)基中纈氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙西g-80ml，NH4OH(30%)-15ml,水-45ml。結(jié)果見表3。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株H-81的纈氨酸表3:有質(zhì)粒的IPTG48小時72小時H-81OD540Val，g/1Val/ODOD，Val，g/1Val/ODNO-3411.60.343210.30.32+3411.70.343010.10.34p厶lacZ-3410.50.313010.00.33+207.80.39259.00.36pYGAZH-2910.50.363112.80.41+2210.80.492312.30.53參考實施1:MilvA缺陷型L脯氨酸菌株生產(chǎn)L-脯氨酸野生型大腸桿菌K12菌株(VKPMB-7)細(xì)胞，在37。C經(jīng)過誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(0.1mg/ml)處理后20分鐘，清洗后涂布在附加1.25mg/ml蛋白胨，10mg/mlL-脯氨酸，0.05mg/l2,3,5-氯化三苯基四唑的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37。C經(jīng)過3天培養(yǎng)后大多數(shù)生長出的菌落是紅色。少數(shù)不能氧化L-脯氨酸的菌落為白色。其中的一個菌落被用親本來獲得對(3，4-二氫脯氨酸和氮雜環(huán)丁烷-2-羧化物)有抗性的突變體，氨基酸類似物被以2mg/mlf生成的突變體中的一ii株能生產(chǎn)L-脯氨酸。最好的L-脯氨酸產(chǎn)生菌株702是用在ilvA基因被插入的氯霉素(Cm)抗性基因(Cmf)打斷的菌株TG1上生長的噬菌體P1處理的。獲得的Cm抗性轉(zhuǎn)導(dǎo)體，702ilvA，變成了L-異亮氨酸缺陷型，比L-異亮氨酸營養(yǎng)型的親本702具有更高的L-脯氨酸生產(chǎn)能力(見表4)。發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括60g/l蔗糖，25^1硫酸胺，2^1K2HP04,I-MgSO4,0.1mg/l硫胺，50mg/L1-異亮氨酸和25g/l白堊(pH7.2)，蔗糖和白堊單獨滅菌。在試管內(nèi)放入2ml培養(yǎng)基，接種一環(huán)被測試的微生物，在37XT振蕩培養(yǎng)2天。21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>菌株702和菌株702ilvA己經(jīng)分別于2000年6月25日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia113545,Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，保藏號為VKPMB-8011和VKPMB-8012。實施例5:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)脯氨酸脯氨酸生產(chǎn)菌株702ilvA是通過將含有處于PteUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株702ilvA,作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株702ilvA(pAlacZ)和菌株702ilvA(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-18g/l;K2HP03-MgS04—1.2g/l;硫胺-O.lmg/I;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-60g/l;異亮氨酸-50mg/l;如果必要的話氨芐青毒素—300mg/1)，在32。C通風(fēng)條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ral加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32°C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)40小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04-1.2g/l;CaCO3-20mg/l;硫胺-O.lm-;異亮氨酸-50mg/l;氨芐青霉素-300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中脯氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，NH4OH(30%)-5ml，7K-25ml。結(jié)果見表5。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了脯氨酸產(chǎn)生菌株702iWA的脯氨酸積累量。表5:有質(zhì)粒的702ilvAIPTG40小時OD540Pro，g/1Pro/ODNO-254.00.16234.10.18p△lacZ-245.30.22+225.00.23pYGAZH-215.00.242310.60.46參考實施2:通過ilvE缺陷型L-亮氨酸菌株生產(chǎn)L-亮氨酸野生型大腸桿菌K12菌株(VKPMB-7)細(xì)胞，在37。C經(jīng)過誘變劑N-甲基-N—硝基—N—亞礎(chǔ)基胍(0.05mg/ml)處理后20力H巾，用生理溶液清洗4次后后涂布在附加4.0DL-氮雜亮氨酸的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37。C經(jīng)過5天培養(yǎng)后，挑出生長出的藤客在L-瓊脂平t肚劃線純化。獲得的能抵抗DL-氮雜亮氨酸的突變體中的一個菌落被用來誘導(dǎo)L-歸氨酸和L-纈氨酸的雙營養(yǎng)缺陷型。獲得的菌株大多數(shù)需要L-異亮氨酸禾卩L-纈氨酸才能生長，這表明，雙營養(yǎng)缺陷型菌株是依賴與ilvE基因的突射形成的。在獲得的雙營養(yǎng)缺陷型菌株中，選出了最好L-亮氨酸生產(chǎn)菌株505，產(chǎn)量為1.8g/Ll-亮氨酸。發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括60g/l蔗糖，25g/l硫f刻安，2g/lK2HP04,lg/1MgS04，0.1mg/l硫胺，100mg/L1-異亮氨酸，100mg/Ll-纈氨酸和25g/1白堊(pH7.2)，蔗糖和白堊-斜蟲滅菌。在試管內(nèi)放入2ml培養(yǎng)基，接種一環(huán)被測試的微生物，在37'C振蕩培養(yǎng)2天。大腸桿菌菌株505已經(jīng)分別于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia113545，Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，保藏號為VKPMB-8011和VKPMB-8124,并于2002年根據(jù)布達(dá)佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。實施例6:用含有質(zhì)茅立pYGAZH的菌株生產(chǎn)亮氨酸亮氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌505是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株505，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株505(pAlacZ)和菌株505(pYGAZH)各取20個菌落接種一環(huán)于加有附加或未附加氨節(jié)青霉素的L-肉湯培養(yǎng)的20-ml的試管中，在32'C通風(fēng)條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.1ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中(內(nèi)徑22mm)，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32r轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NHj)2S04-15g/l;K2HP04-1.5g/l;MgS04X7H2CM.0g/l;CaCO3-20^l;(單獨滅菌)硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g/l;(單獨滅菌)異亮氨酸-0.3g/l;纈氨酸-0,3g/l;氨節(jié)青霉素-150mg/i,如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中亮氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-80mJ，NH4OH(30%)-25ml，水-50ml。結(jié)果見表6。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了亮氨酸產(chǎn)生菌株505的亮氨酸積累量。表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>參考實施3:Mm正亮氨酸有抗性的L"甲硫氨酸菌株生產(chǎn)L甲硫氨酸無質(zhì)粒的蘇氨酸和亮氨酸缺陷性菌株大腸桿菌C600被作為親本菌株，首先，大腸桿菌C600菌株的亮氨酸突變體可以通過將在大腸桿菌K12菌株上生長的P1噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)得到，在37'C經(jīng)過誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍處理后，得到了可以抵抗8g/lL-高絲氨酸的突變體菌株44。突變體菌株44是L-蘇氨酸缺陷型，突變體菌株44已經(jīng)在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏號為VKPMB-2175。從菌株44中用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍誘變出的菌株對甲硫氨酸類似物，正亮氨酸具有抗性。L-肉湯培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物中的細(xì)胞被離心下來，用含有50ug/mlN-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍的生理溶液(0.9。/。NaCl)重新懸浮，細(xì)胞在37t:，N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍中暴露30分鐘后離心，用生理溶液清洗4次后后涂布在附加0.5mg/ml蘇氨酸和2.5mg/ml或5mg/ml正亮氨酸的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37t:經(jīng)過5天培養(yǎng)后，挑出生長出的菌落在L-瓊脂平板上劃線純化。其中最好的L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌株是菌株218。菌株218的試管培養(yǎng)在32匸振蕩培養(yǎng)3天，培養(yǎng)基中L-甲硫氨酸達(dá)到了lg/1。作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最低M9培養(yǎng)基包括蔗糖(4%)，硫酸胺(2.5%),蘇氨酸(0.5g/l)，CaC03(25g/l)。蔗糖和白堊單獨滅菌。菌株218己經(jīng)于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏號為VKPMB-8125，并于2002年根據(jù)布達(dá)佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。進(jìn)一步，通過整合來源于枯草芽孢桿菌屬的pycA基因(俄羅斯專利申請99121636)將噬菌體P1介導(dǎo)的ppc基因缺失引入到菌株218，結(jié)果菌株218pycA失去了對正亮氨酸的抗性。所以，可以用上述方法重新給予菌株對正亮氨酸的抗性。在獲得的菌株中，最好L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌菌株73，在上述條件下，產(chǎn)量約為1.0g/lL-甲硫氨酸。大腸桿菌菌株73己經(jīng)于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏號為VKPMB-8126，并于2002年根據(jù)布達(dá)佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。實施例7:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)甲硫氨酸甲硫氮酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌73是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株73，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株73(pAlacZ)和菌株73(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-〗8^1;K2HP03-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-10g/l;蔗糖-60g/l;蘇氨酸-400mg/l;如果必要的話氨芐青霉素^00mg/1)，在32。C通風(fēng)條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2mi加或不加IFTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32^:轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)4S小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.喊MgS04—L2g/1;CaCO3-20mg/l;硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g/l;蘇氨酸-400mg/l;酵母提取物-10g/l;氨芐青霉素-300mg/l，如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中甲硫氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30%)-15ml,水-45ml。結(jié)果見表7。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了甲硫氨酸產(chǎn)生菌株73的甲硫氨酸積累量。表7:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例8:用含有質(zhì)粒pYCHE的菌株生產(chǎn)蘇氨酸蘇氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌VL2054是通過將含有處于PteUV5啟動子控制下的b1242基因的質(zhì)粒pYCHE轉(zhuǎn)入而得到的。得到的菌株被命名為VL2054pYCHE。將菌株VL2054,作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株VL2054(pAlacZ)和菌株VL2054(pYCHE)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-llg/l;NaCl-0.4g/l;MgS04"0.4g/l;K2HPOrlg/1;FeSO4-10mg/l;MnSO4-10mg/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-40g/l;如果必要的話氨芐青霉素-300m^1)，在32'C通風(fēng)條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32匸轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)45小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-22g/l;NaCl-O.，；MgSO4~0.，；K2HPOr2g/l;FeSCV20m^l;MnSO4-20mg/l;硫胺-0,2mg/I;酵母提取物-lg/l;CaCO3-30g/l;蔗糖-80g/l;氨節(jié)青霉素-300mg/1,如果必要的話；EPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540應(yīng)處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中蘇氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30%)-12ml,水-8ml。結(jié)果見表8。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYCHE提高了蘇氨酸產(chǎn)生菌株VL2054的蘇氨酸積累表8:有質(zhì)粒的VL2054IPTGOD540Thr，g/1Thr/ODNO-214.80.23+204.70.24p△lacZ-164.60.29+133.00.23pYCHE-206.20.31+207.00.35實施例9:用含有質(zhì)粒pYCHE的菌株生產(chǎn)纈氨酸纈氨酸生產(chǎn)譜'株H-81是通過將含有處于PlaeUV5啟動子控制下的M242基因的質(zhì)粒pYCHE轉(zhuǎn)入而得到的。將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株H-81(pAlacZ)和菌株H-81(pYCHE)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;硫胺-O.lmg/1;酵母提取物-0.5^;蔗糖-60g/l;如果必要的話氨節(jié)青霉素-300mg/1),在通風(fēng)條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮28發(fā)酵培養(yǎng)基，在32'C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)45小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.，；MgS04—1.2g/l;CaCOr20^;硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g1;氨節(jié)青霉素-300m^,如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在土咅養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中纈氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30%)-15ml，zK-45ml。結(jié)果見表9。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYCHE提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株H-81的纈氨酸積累量。表9:有質(zhì)粒的H-81IPTGOD540VaVODNO-3411.60.34+3411.70.34pAlacZ一3410.50.31+207.80.39pYCHE-3214.00.44+3013.90.46實施例10:用含有質(zhì)粒pYHGN的菌株生產(chǎn)精氮酸精氨酸生產(chǎn)菌株382是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b3434基因的質(zhì)粒pYHGN轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株382已經(jīng)于2000年4月10日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia113545,Moscow,1Dorazhnyproezd，1)，保藏號為VKPMB-7962。將菌株382，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株382(pAlacZ)和菌株382(pYHGN)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-25g/l;K2HPO4-2.0g/l;MgS047H2O~1.0g/l;硫胺-0.2mg/l;酵母提取物-5^1;蔗糖-60g/l;如果必要的話氮芐青霉素-300mg/1)，在通風(fēng)^#下培養(yǎng)過夜。每個±咅養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32"轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-25g/l;K2HPO4-2.0g/l;MgS047H2O1.0^1;硫胺-0.2mg/l;酵母提取物-5g/l;蔗糖-60g/l;CaCO3-20l;氨節(jié)青霉素—100mg/l,如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nrn處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中精氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下..異丙醉-80ml，乙酸乙酯-40m1，，NHtOH(30%)-25ml，水-50mJ。結(jié)果見表IO。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYHGN提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株382的纈氨酸積累量。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例11:用含有質(zhì)粒pYHGN的菌株生產(chǎn)脯氨酸脯氨酸生產(chǎn)菌株702ilvA是通過將含有處于P^UV5啟動子控制下的b3434基因的質(zhì)粒pYHGN轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株702ilvA，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株702ilvA(pAlacZ)和菌株702ilvA(pYHGN)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2SQr18g/l;K2HP03-1.8&1;MgS04—1.2g/I;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-60g/l;異亮氨酸-50mg/l;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/l)，在32。C通風(fēng)劍牛下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20mi的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32"轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)40小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04-1.2g/l;CaCO3-20mg/l;硫胺-0.1m^l;蔗糖-60g/l;異亮氨酸-50mg/l;氨節(jié)青霄素—300mg/1，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中脯氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，NH4OH(30%)-5ml，水-25ml。結(jié)果見表ll。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYHGN提高了脯氨酸產(chǎn)生菌株702ilvA的脯氨酸積累量。31表ll:有質(zhì)粒的702ilvAIPTG40小時OD540Pro,g/1Pro/ODNO-25400,16+234.10.18p△lacZ-245.30.22+225.00.23pYHGN-245.90.25+177.10.4232序列表〈110〉味之素株式會社<120>通過大腸桿菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法〈130>P-8206F〈140〉〈141>2002--<150>RU2001103865〈151〉2001-02-13<150>RU2001104998〈151>2001-02-26<150>RU2001104999<151>2001-02-26<150>RU2001117632〈151>2001-06-28<150>RU2001117633〈151〉2001-06-28<160>16<170〉PatentlnVer.2.0〈210〉1<211〉26〈212>應(yīng)〈213〉人工序列<220〉〈223〉人工序列描述引物〈400〉1ggtctagacaatcgttaagcgtacac26<210>233<211>26<212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223>人工序列描述引物〈400〉2ccggatccga'tatagtaacgacagtg26〈210〉3<211〉738〈212〉DNA<213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)〈220〉<221〉CDS〈222〉(1).(735)<400〉3MetGlu1gaaggaGluGlygcctttAlaPhegaaageGluSer50gtcattVallie65ctgaccLeuThrageSertgcCysgcgAla35gttValaccThrgtcValcctProaaaLys20ttcPhectgcgtageLeuArgSertgggcgtttTrpAlaPheactThr5gacAspggtGlyccacagcctgetProGinProAlaatgMetcgtArg100ggcGlyagtttaSerLeuctgaatLeuAsntttttcPhePhegcgatgAlaMetgC￡lAla85attliectgLeutecSerctgLeu70stgMetattlieacgThrtgcCys55gcaAlagatAspcagGingatAspccgattProlie25gcgaccAlaThr40ateattlieliegccAlagttValcgtArgg兆GlugggGlycgcArgctgLeu105gttValcctggttegProGlySer10gttattagtVallieSercgtctgggaArgLeuGlytatgcaggcTyrAlaGly60agtagtttgSerSerLeu75catgtgttgHisVaJLeu90caaaaategGinLysSertttgccgccPheAlaAlagcgaccAlaThrtatattTyrlie30ttctctPheSer45gcg紹cAlaSertggattTrplietatggcTy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213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<400〉12MetlieGinThrPhePheAspPheProValTyrPheLys1510GlyLeuPheAlaLeuValAsnProValGlylieliePro2025SerMetThrSerTyrGinThrAlaAlaAlaArgAsnLys354045ThrAlaAsnLeuSerValAlalielie丄euTrplieSer505560GlyAspThrlieLeuGinLeuPheGlylieSerlieAsp657075lieAlaGlyGlylieLeuValValThrlieAlaMetSer8590GlyLysLeuGlyGluAspLysGinAsnLysGinGluL>ys100105AlaValArgGluSerlieGlyValValProLeuA丄aLeu115120125AlaGlyProGlyAlalieSerSerThrlieValTrpGly130135140HisSerlieSerTyrLeuPheGlyPhePheValAlalie145150155AlaLeuCysCysTrpGlyUuPheArgMetAlaProTrp165170ValLeuArgGinThrGlylieAsnVallieThrArglie180185LeuLeuMetAlaLeuGlylieGluPhelieValThrGly195200205liePheProGlyLeuLeuAsn210215PhePhelie15ValPhelie30ThrAsnLeuLeuPheLeuSerPheArg80MetlieSer95SerGluThr110ProLeuMetThrArgTyrAlaLeuPhe160LeuValArg175MetGlyLeu190lieLysGly<210>〈211〉〈212〉〈213〉1328DM人工序列〈220〉<223>人工序列描述引物<400>13ggtct卿gtccgcggcaattatcaggg28<210〉14<211>29<212〉腿<213>人工序列<220〉<223〉人工序列描述引物<400>14ccagatctggtagttgtgacgctaccggg29〈210〉15<211〉594<212〉腿〈213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<220〉<221>CDS〈222〉(1)..(591)<400〉15atgaatMetAsn1ccgetcProLeuccg肪3ProLysctggtgLeuVal50cttageLeuSer65tttctgPheLeugaaateGlulieggaGly卿Arg35atgMetctsLeuatelieaacAsn20eggArgctgLeucgaArggccAlaagegggcUccgattlie5Ct￡LLeueggArggtgValgcaAlasttlie85gcatctSercctProgcaAlattcPheg肪Glu70aaaLysgcaAlaattlieateliectgLeu55accThrgcaAlattcPheatgMet40tUPhegtcValatgattMetlieggtgaagaggttttaValLeu10atgtecMetSer25gtgcgaValArggcgggtAlaGlytecattSerliettccccPhePro90ccatttttgateLeuliegtsctgValLeugagttgGluLeugagaaaGluLys60tctggcSerGly75agegetSerAlaategtgctgattLeulieaaacatLysHis30cttattLeulie45attctglieLeuatggatMetAsp15actgsaThrGlugetetcAlsLeugcatttAlaPheggcateattctgGlylielieLeu80teaggaaatageSerGlyAsnSer95ccgttggcaatt48恥144192240288336SerGlyLeuccgttaProLeucatcagHisGin130gcctggAlaTrp145cgtctgArgLeugtcVal115tacTyrggcGlyctgLeuttgattctgLeulieLeuatgtggMetTrpatgMet195Pro100gccAlaAlaGlyGluGlugggGlyccgaatProAsnggcaccGlyTh.rggcGlygtgVal180犯gLysg鄧Glu165atgMetgggGlyccgProcagGinmPhe150LysactThr3tgMet135gtcValgggGlya/tggcaMetAlat犯attlie120gggGlyETtCliegtgValThrProPhelie105etcgccacgLeuAlaThrcatctggtgHisLeuValctgLeuAsnGin185etacagLeuGin155gcacttAlsl>eu170atgttcMetPheValProctgatgLeuMet125attgetlieAla140tcttegSerSergaacgcGluArgetcgacLeuAspLeuAlalie110ttgttgtctLeuLeuSerctgctgctgLeuLeuLeuetatttttaLeuPheLeu160ctgatgggaLeuMetGly175ggcattcgaGlylieArg190384432■528576594<210〉16〈211〉197<212>PRT〈213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<400〉16MetAsnGlu1ProLeuProLysLeuVal50LeuSer65PheLeuSerGlyProLeuGlyArg35MetLeulieLeuVal115lieAsn20ArgLeuArgAlaPro100Alalie5LeuArgValAlalie85AlaGlySerProAlaPheGlu70LysGlyProAlaAlaVallielieLeu55ThrMetGluThrPheMet25MetVal40PheAlaVslSerliePheGluPro105lieLeu120LeuLeu10SerValArgGluGlyGlulieSer75ProSer90PhelieAlaThrlieLeuLeuLysLeuLeu45Lyslie60GlyGlyAlaSerValProLeuMet125lieMetAsp15HisThrGlu30lieAlaLeuLeuAlaPhelielieILeu80GlyAsnSer95LeuAlalie110LeuLeuSerHisGinTyrProAsnGinMetGlyHisLeuVallieAlaLeuLeuLeu130135140AlaTrpGlyGlyThrPheVallieLeuLeuGinSerSerI>euPheLeu145150155160ArgLeuLeuGlyGluLysGlyValAsnAlaLeuGluArgLeuMetGly165170175LeulieLeuValMetMetAlaThrGinMetPheLeuAspGlylieArg180185190MetTrpMetLysGly19權(quán)利要求1.一種屬于埃希氏菌屬的L-氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌，其中該細(xì)菌經(jīng)過修飾以致于該細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)通過提高以下A)定義的蛋白質(zhì)在所述細(xì)菌細(xì)胞中的活性來提高A)包含序列表中SEQIDNO15所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中A)定義的蛋白質(zhì)的活性M3i將編碼A)定義的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)菌，或ffl31改變細(xì)菌染色體上戶;MDNA的皿調(diào)控序列來提高。3.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)菌，其中其中的轉(zhuǎn)化是通過多拷貝載體進(jìn)行的。4.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-3中任一項的細(xì)菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的L-氨基酸是L-精氨酸。6.根據(jù)權(quán)禾腰求5的方法，其中通過增加賴氨酸調(diào)節(jié)子的拷貝數(shù)或改變精氨酸調(diào)節(jié)子的表達(dá)調(diào)抝芊列對所述細(xì)菌進(jìn)行了修飾，以致于該細(xì)菌增強了精氨酸調(diào)節(jié)子的表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。8.根據(jù)權(quán)利要求7方法，其中通過增加脯氨酸生物合成基因的拷貝數(shù)或改變加嵐酸生物合成基因的表達(dá)調(diào)控序列對所述細(xì)菌進(jìn)行了修飾，以致于該細(xì)菌增強了脯氨酸生物合成基因的表達(dá)。全文摘要本發(fā)明提供了一種使用埃希氏菌屬細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸，L-纈氨酸，L-脯氨酸，L-亮氨酸，L-甲硫氨酸和L-精氨酸的生產(chǎn)方法。所述細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)能力通過提高b2682和b2683基因，或b1242基因，或b3434基因編碼的蛋白質(zhì)的活性被提高。文檔編號C12P13/10GK101597589SQ200910159450公開日2009年12月9日申請日期2002年2月13日優(yōu)先權(quán)日2001年2月13日發(fā)明者E·A·塔波利納,E·B·沃羅施洛瓦,E·M·霍爾格斯,K·V·賴巴克,M·M·古斯亞蒂納申請人:味之素株式會社