專(zhuān)利名稱(chēng)：棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記。具體地，本發(fā)明涉 及利用RFLP技術(shù)篩選棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記的方法，以及公布 了所述分子標(biāo)記的序列。另外，本發(fā)明公開(kāi)了所述分子標(biāo)記在棉花育種特別是“三系”抗蟲(chóng) 棉育種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉花(G. hirsutum)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。長(zhǎng)期以來(lái)，棉花雜交種生產(chǎn)需要進(jìn)行 人工去雄，這項(xiàng)工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力。利用不育系、保持系、恢復(fù)系進(jìn)行“三系配套”育種可以大大 提高棉花育種的效率。2005年本課題組建成我國(guó)第一個(gè)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗蟲(chóng)棉花三系育種體 系，總體技術(shù)達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。利用該項(xiàng)技術(shù)體系，本課題組已培育了大量的優(yōu)質(zhì)棉花品系。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是指植物不能產(chǎn)生有功能花粉的現(xiàn)象。1962年，美國(guó)育種 家Meyer選育出棉花兩個(gè)胞質(zhì)雄性不育系，但不育性不穩(wěn)定，很難用于制種。1973年他又選 出一個(gè)具有哈克尼西棉胞質(zhì)的雄性不育系，不育性穩(wěn)定，已三系配套，但恢復(fù)系的恢復(fù)能力 弱。后來(lái)發(fā)現(xiàn)了加強(qiáng)修飾恢復(fù)基因，并將該基因轉(zhuǎn)育到相應(yīng)的恢復(fù)系中，提高了恢復(fù)系的恢 復(fù)能力。1985年賈占昌用海島棉和陸地棉進(jìn)行雜交，育成細(xì)胞質(zhì)雄性不育系104-7A，不育 度100%，不育性穩(wěn)定。本課題組所用的不育系P30A是通過(guò)保持系P30B與104-7A多代回 交后得到的高代不育系?；謴?fù)系Y18R是原不抗蟲(chóng)256R恢復(fù)系與sGK321A不育系雜交，從 分離的可育后代中經(jīng)過(guò)多代自交，得到的具有雜交優(yōu)勢(shì)的恢復(fù)系，其胞質(zhì)為不育胞質(zhì)。迄今為止，只有水稻、玉米、小麥、高粱、矮牽牛、小蘿卜、向日葵、油菜、甜菜等植物 的不育基因被克隆出來(lái)，它們均為線粒體上的嵌合基因。但棉花不育基因的成功克隆尚未 見(jiàn)報(bào)道，相關(guān)研究報(bào)道也較少。鞏養(yǎng)倉(cāng)等分析了哈克尼西棉不育系和保持系線粒體基因組 的差異，發(fā)現(xiàn)atpA，nad6，C0XIII等基因的雜交條帶存在差異，并在不育系atpA基因編碼序 列后發(fā)現(xiàn)一段486bp的特異序列。利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種，不僅減少了盲目性，而且可以減少連鎖累贅， 提高選擇效率。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)依其所用的分子生物學(xué)技術(shù)，大致可以分為 以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記和以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記。常用的標(biāo)記 篩選的方法主要有分離群體分群分析法(Bulked SegregantAnalysis)和近等基因系法 (Near-isogenic Lines)0隨著生物技術(shù)的發(fā)展，棉花的分子標(biāo)記的研究也日漸受到關(guān)注。目前被廣泛應(yīng)用 于棉花的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP，RAPD，AFLP, SSR, STS等，研究的領(lǐng)域涉及遺傳圖譜的 構(gòu)建、基因標(biāo)記和基因定位、親緣關(guān)系分析、品種純度鑒定、標(biāo)記輔助選擇等多個(gè)方面，并取 得了重要進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是以棉花同核異質(zhì)系細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B以及它們 的衍生系為基礎(chǔ)，篩選與不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)相連鎖的分子標(biāo)記，以期定位棉花不育基因， 為實(shí)際生產(chǎn)中三系雜交棉的育種提供輔助手段，并為進(jìn)一步分離、克隆不育基因奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)相連鎖的分子標(biāo)記；本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的分子標(biāo)記在棉花育種中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明利用同核異質(zhì)系細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B以及它們 的衍生系為基礎(chǔ)，篩選與不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)相連鎖的分子標(biāo)記的方法包括如下步驟a).利用同核異質(zhì)系細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B與其他棉花品種進(jìn)行 雜交，產(chǎn)生衍生系；b).用CTAB法提取不育系和保持系的葉片總DNA ；c). RFLP分析，并對(duì)RFLP片段進(jìn)行克隆和測(cè)序；d).將RFLP標(biāo)記向SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化；e).數(shù)據(jù)分析。其中利用RFLP技術(shù)對(duì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育同核異質(zhì)系進(jìn)行篩選，獲得RFLP標(biāo)記，然后將 其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，并對(duì)衍生系進(jìn)行分析，從而獲得標(biāo)記與可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)之間的關(guān)系。根據(jù)植物atpA基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，從棉花基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，用 ROCHE 公司的 DIG HighPrime Labeling and Detection Starter Kit II 對(duì) DNA 片段進(jìn)行 標(biāo)記做成探針，用這些探針對(duì)P30A、P30B、Y18R及其衍生系的DNA樣品的EcoR I.Hind III 酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果atpA基因在三系之間表現(xiàn)出多態(tài)性。atpA在不育胞質(zhì)(不育系和 恢復(fù)系)和可育胞質(zhì)(保持系)中各有兩個(gè)拷貝，不育胞質(zhì)中EcoRI限制片段大小分別是 2. 2kb，3. 3kb ；可育胞質(zhì)中EcoRI限制片段大小分別是2. 3kb，5. Ikb0用atpA 探針繼續(xù)對(duì)衍生系 P53A，P53B, P80A, P80B, S25-4A，S25-4B 進(jìn)行 RFLP 分 析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與P30A，P30B之間的差異一致。設(shè)計(jì)針對(duì)atpA基因的反向引物，用反向PCR(IPCR)法分別將以上所述的4條 EcoRI限制片段擴(kuò)增出來(lái)，電泳檢測(cè)片段大小與預(yù)期一致后，將每一條片段迅速與T載體 PMD18-T進(jìn)行酶連反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞(E. coli T0P10)中，在含IPTG、X_gal和氨 芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選，隨機(jī)挑取20個(gè)白色菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后提取 質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定及電泳檢測(cè)，獲得3個(gè)能酶切出與IPCR條帶大小一致的克隆子，交 由上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，獲得atpA基因全部EcoRI限制片段的DNA序列不育 胞質(zhì)中atpA基因的兩條EcoR I限制片段長(zhǎng)度分別為2194bp、3297bp ；可育胞質(zhì)中atpA基 因的兩條EcoR I限制片段長(zhǎng)度分別為2225bp、5083bp。其中不育胞質(zhì)中的2194bp片段和 可育胞質(zhì)中的2225bp片段包含的是全長(zhǎng)的atpA基因拷貝；不育胞質(zhì)中的3297bp片段和 可育胞質(zhì)中的5083bp片段包含的是截短型的atpA基因拷貝。在不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)截短 型atpA編碼序列3 ‘端下游分別存在一段555bp和515bp的差異序列，根據(jù)這兩段序列設(shè) 計(jì)引物，分別獲得用于鑒定不育胞質(zhì)的SCAR555標(biāo)記和用于鑒定可育胞質(zhì)的SCAR515標(biāo)記， 其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別是470bp和333bp。利用上述SCAR標(biāo)記，我們可以快速鑒定“三系”抗 蟲(chóng)棉不同品種的胞質(zhì)類(lèi)型。2009年7月27日將分別含有SCAR555和SCAR515DNA片段的 兩個(gè)菌種保存到中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，入冊(cè)編號(hào)分別為=CGMCCNo.3214 禾Π CGMCCNo. 3213。表1用于鑒定可育胞質(zhì)和不育胞質(zhì)的SCAR標(biāo)記分析表
引物名稱(chēng)堿基數(shù)引物序列Tm (°C )
權(quán)利要求
棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記，其特征在于擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物對(duì)分別具有SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于分別具有SEQID No. 1和SEQ ID No. 2 的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記在育種中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的分子標(biāo)記具有SEQID No. 1的核 苷酸序列，可用于鑒定三系雜交棉中的不育系及其不育系的衍生系。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的分子標(biāo)記具有SEQID No. 1的核 苷酸序列，可用于鑒定三系雜交棉中的恢復(fù)系及其恢復(fù)系的衍生系。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的分子標(biāo)記具有SEQID No. 2的核 苷酸序列，可用于鑒定三系雜交棉中的保持系及其保持系的衍生系。
7.用于SCAR分析來(lái)獲得棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記的引物對(duì)，其特征 在于分別具有SEQ IDNo. 3,SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于SCAR分析來(lái)獲得棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子 標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于所獲得的分子標(biāo)記分別具有SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的核 苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用RFLP技術(shù)鑒定棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記的方法，包括步驟a)利用同核異質(zhì)系細(xì)胞質(zhì)雄性不育系P30A、保持系P30B、恢復(fù)系Y18R與其他棉花品種進(jìn)行雜交，產(chǎn)生衍生系；b)用CTAB法提取不育系、保持系、恢復(fù)系及衍生系的葉片總DNA；c)RFLP分析，并對(duì)RFLP片段進(jìn)行克隆和測(cè)序；d)將RFLP標(biāo)記向SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化；e)數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明公開(kāi)了棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記分別具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列以及棉花雄性不育胞質(zhì)和可育胞質(zhì)的分子標(biāo)記在棉花育種特別是“三系”雜交棉育種中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101985650SQ20091015742
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者孟志剛, 張曉 , 張銳, 郭三堆 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所;郭三堆