用于石油污染物及石油產(chǎn)品降解的固體微生物菌劑、制備方法及應(yīng)用的制作方法

專利名稱：用于石油污染物及石油產(chǎn)品降解的固體微生物菌劑、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于石油污染物降解的固體微生物菌劑、制備方法及應(yīng)用，屬于石 油污染土壤及石油產(chǎn)品泄漏突發(fā)事故應(yīng)急處理的生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物修復(fù)也有稱生物整治、生物恢復(fù)、生態(tài)修復(fù)或生態(tài)恢復(fù)，是指利用處理系統(tǒng)中 的生物，主要是微生物的代謝活動來減少污染現(xiàn)場污染物的濃度或使其無害化的過程。 由于生物修復(fù)是通過投加或刺激土壤中的生物來降解污染物，并不破壞植物生長所需的 土壤環(huán)境。其最終產(chǎn)物是C02、 H20等物質(zhì)，因此具有環(huán)境友好、不產(chǎn)生二次污染的特點。 另外，相對于傳統(tǒng)污染土壤修復(fù)技術(shù)，生物修復(fù)技術(shù)是最經(jīng)濟的一種，其費用約為熱處 理費用的1/3-1/4。迄今為止，已知能降解石油烴類的微生物共100余屬，200多種，它 們分屬于細菌、放線菌、霉菌和藻類。降解石油的細菌有假單胞菌屬、不動桿菌屬、小 球菌屬、弧菌屬等屬中的某些菌株。常見的降解石油的霉菌有曲霉、青霉、枝孢霉等屬 中的菌株。
在石油污染土壤中的生物修復(fù)過程中，石油中的主要成分烴類化合物的憎水性是微 生物進行代謝、降解存在的主要問題。生物表面活性劑是一類由微生物產(chǎn)生、分子結(jié)構(gòu) 具有親水性和疏水性基團的高分子物質(zhì),包括糖脂、脂肽、多糖-蛋白絡(luò)合物、磷脂、脂 肪酸和中性脂等。與其他表面活性劑相比，它不僅具有能降低界面張力和乳化難溶性有機 物的作用，同時還有易于生物降解和無毒的優(yōu)點。在微生物降解原油的過程中，生物表面 活性劑起到了非常重要的作用，生物表面活性劑可以促使烴類物質(zhì)乳化、分散，并改變細 胞表面的疏水性，達到加強微生物與烴類物質(zhì)間的親和力，同時也起到促使烴類物質(zhì)擴散 進入細胞的作用，從而強化微生物對石油污染物的降解。2005年張惠殊等人公開了提高石 油采收率的降粘菌及應(yīng)用(CN1566327)的專利，其中就涉及到三株可以產(chǎn)生有機酸和表 面活性劑的假單胞菌的使用，有機酸是丁酸、乙酸和十碳烯酸；表面活性劑是糖脂，而 這兩類產(chǎn)物均有利于提高石油采收率。國內(nèi)目前在石油污染的微生物修復(fù)中多采用多菌 株聯(lián)合修復(fù)，有些菌的主要功能是產(chǎn)表面活性劑，另外一些菌主要是降解石油菌。在實 際應(yīng)用過程中取得的效果不甚理想，主要原因是在惡劣的環(huán)境中達不到實驗室中菌株生 長的理想狀態(tài)，產(chǎn)表面活性劑的菌株生長受到限制就會影響到整個修復(fù)進程。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)存的微生物菌劑在生物修復(fù)過程存在的問題，本發(fā)明提供一種用于石油污染 物及石油產(chǎn)品降解的固體微生物菌劑，該菌株不僅能大量產(chǎn)生表面活性劑，而且能夠直 接利用石油污染物作為碳源，修復(fù)效果十分明顯。
本發(fā)明還提供該固體微生物菌劑的制備方法，包括制備該微生物菌劑的所使用的菌
3種，以及培養(yǎng)發(fā)酵方法。
本發(fā)明還提供該固體微生物的應(yīng)用。 本發(fā)明是通過以下具體措施來實現(xiàn)的
本發(fā)明涉及一種用于石油污染物及石油產(chǎn)品降解的固體微生物菌劑，其特別之處在 于含有銅纟錄f叚單胞菌(尸exwtfowcwoy "erwg/woy")。
上述本發(fā)明的固體微生物菌劑，最好采用以下方法制成由銅綠假單胞菌細菌發(fā)酵
液與草炭土、麩皮按重量比例O. 1 1:1: 0.2 0.5混合制成，所述銅綠假單胞菌細菌發(fā) 酵液中銅綠假單胞菌的有效活菌數(shù)為106 101()個/ ml。。
本發(fā)明還涉及上述固體微生物菌劑的制備方法，所述的銅綠假單胞菌細菌細菌發(fā)酵
液的制備，步驟如下
(1) 菌種
銅纟錄假單胞菌(尸eywt/o附o"os flgn^7'"cwfl)
(2) —級種子液
將上述菌種在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化16 32h后，轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基或 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)搖瓶活化16 32h，作為一級種子液，
(3) 細菌發(fā)酵液
將上述菌種的一級種子液接種量2% 10%轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)搖床培養(yǎng)16 32h， 轉(zhuǎn)速為150 250rpm，培養(yǎng)溫度為20 30°C。
上述本發(fā)明的固體微生物菌劑的制備方法，所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基所選用的 碳源、氮源分別是玉米淀粉、豆粕粉；最好是加入有效量的酵母粉。發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)選 配比如下豆粕粉為2 6g，玉米淀粉為1 3g，酵母粉為1 3g，K臭0. llg，CaCl20. Olg, MgS04 7H20 0. 15g， MnS04 0. 01g，蒸餾水100ml 。
本發(fā)明還涉及一種上述固體微生物菌劑的應(yīng)用，用于石油污染物或石油產(chǎn)品污染場 地進行降解處理。
本發(fā)明的固體微生物菌劑的應(yīng)用，在用于石油污染物及石油產(chǎn)品污染場地進行降解 處理時，還可添加復(fù)合肥和水，攪拌均勻，灑在污染場地。添加的復(fù)合肥為一般為離子 型的農(nóng)用復(fù)合肥。
上述應(yīng)用時，固體菌劑的添加量及復(fù)合肥的添加量可根據(jù)土壤污染的程度或石油產(chǎn) 品泄漏的程度進行調(diào)整。
本發(fā)明的技術(shù)特點是將具有能夠大量產(chǎn)生表面活性劑的石油降解菌，進行高密度發(fā) 酵培養(yǎng)，獲得高活性的細菌發(fā)酵液，然后按照一定比例與優(yōu)質(zhì)草炭土、麩皮混合拌勻， 制成固體微生物菌劑。采用本發(fā)明所述的固體微生物菌劑，在勝利油田進行了現(xiàn)場中試 實驗，配合施加一定量的復(fù)合肥，現(xiàn)場降解效果良好。本發(fā)明提供的固體微生物菌劑具 有在土壤中活性高、生長迅速、對環(huán)境不造成二次污染的優(yōu)點。
本發(fā)明所述的用于石油污染物及石油產(chǎn)品降解的固體微生物菌劑與現(xiàn)有的微生物菌 劑比較，具有如下優(yōu)點采用具有高效降解原油能力的細菌菌株，避免了真菌菌劑在降
4解石油烴過程中產(chǎn)生有毒代謝物的可能性，不會對土壤生態(tài)環(huán)境造成二次污染。本菌株 既可產(chǎn)生表面活性劑，又可高效降解石油，在實際應(yīng)用過程中避免了復(fù)合菌劑細菌間的 協(xié)同作用效果差的缺點。另一方面所選的固體載體為富含有機質(zhì)的草炭土和麩皮，質(zhì)地 疏松，營養(yǎng)豐富，微生物吸附于草炭、麩皮載體中可以二次增殖，使污染土壤的生物修 復(fù)效果大大提高。添加的復(fù)合肥為常用的農(nóng)用復(fù)合肥，既可刺激添加的細菌生長，也可 促進土著細菌的生長，從而達到加速修復(fù)進程的目的。
本發(fā)明所述固體菌劑制備過程簡單易操作，成本低廉，在石油污染土壤及石油產(chǎn)品 泄漏事故場地的生物修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的細菌是銅綠假單胞菌(尸e^^omo"oy aerwg/"wa)。該菌株分離自我國 勝利油田的污染泥土。 實施例l:細菌發(fā)酵液的制備
采用的細菌是銅綠假單胞菌(尸m"^w7W7m aen^/"ora)。將其分別經(jīng)過斜面培養(yǎng)、
搖瓶活化培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)得到細菌發(fā)酵液，具體操作步驟為
(1) 斜面培養(yǎng)基采用常規(guī)方法制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，具體步驟為牛肉
膏3g，蛋白胨5g， NaC15g，蒸餾水1000ml， pH7. 2 7. 4，瓊脂1. 5% 2%，攪拌均勻， 于1. 05kg / cm2， 121. 3'C條件下滅菌20 30min。滅菌后做成斜面，分別在超凈工作臺上， 無菌接種保藏的菌株到試管斜面上，菌種在25 30。C條件下培養(yǎng)16 32h，待菌苔長滿 斜面?zhèn)溆茫?br> (2) 種子液的制備液體培養(yǎng)基仍為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將配制好的液體培養(yǎng)基 分裝入150 250ml三角瓶內(nèi)，裝液量為20 60ml，與121. 3。C滅菌30min。待冷卻至40 。C左右，挑取一環(huán)斜面菌苔接種于三角瓶內(nèi)，然后置于搖床上培養(yǎng)，調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速為150 250rpm， 20 3(TC條件下培養(yǎng)16 32h，待培養(yǎng)基混濁后裝入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。
(3) 細菌發(fā)酵液的制備將活化好的細菌的種子液，按照2% 10% (v/v)的接 種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下豆粕粉為2 6g，玉米淀粉為1 3g，酵 母粉為l 3g， K2HP04 0. llg， CaCl20. Olg, MgS04 7H20 0. 15g， MnS04 0. Olg，蒸餾水 lOOml。接種后置于搖床上培養(yǎng)22h，溫度為20 3(TC，搖床轉(zhuǎn)速為150 250rpm。此條 件下得到高活性的細菌發(fā)酵液，銅綠假單胞菌的有效活菌數(shù)為107 109個/1111。 實施例2:細菌對原油的降解能力試驗
將活化好的細菌，分別從其斜面上挑取一環(huán)菌苔，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)活化 16 32h后，制成一定濃度的菌懸液，再按照2 10%的接種量轉(zhuǎn)接到原油培養(yǎng)基內(nèi)，置 于20 30'C搖床上培養(yǎng)5 12d，轉(zhuǎn)速為150 250rpm。以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。 培養(yǎng)結(jié)束時，向培養(yǎng)液中加入二氯甲烷(DCM)，離心打破水包油乳液，有機相用顆粒狀 無水硫酸鈉過濾脫水后置于預(yù)先恒重的燒杯中，室溫氮氣吹脫至恒重，采用重量法測定 培養(yǎng)液中殘油含量。采用下面公式計算石油烴的生物降解率(ri%):
ri (%) =co。_cox / co。X100
5式中"。為對照培養(yǎng)液中殘油含量；"x為測試菌培養(yǎng)液中殘油含量。 從下表可以看出，該細菌在液體搖瓶內(nèi)對原油的降解能力均較高，隨著時間延長，降 解率逐漸升高，28d時降解率可以達到71.738/。(見下表)。
銅綠假單胞菌降解原油的測定實驗 處理時間(d) 有效活菌數(shù)(107) 降解率(％) 7 6.2 23.89
14 37.3 41.31
21 47.5 66.73
28 _ 66.4 72.88
實施例3:固體菌劑的制備方法，具體操作步驟為-
(1) 按實施例1的方法制備銅綠假單胞菌細菌發(fā)酵液。
(2) 稱取草炭土 100g、麩皮20g，裝入500mL燒杯內(nèi)，包扎后于121. 3。C滅菌30min 2h，滅菌后待用。
(3) 將步驟(1)的細菌發(fā)酵液與步驟(2)的草炭、麩皮按比例為0.5: 1: 0.2 混合，于超凈工作臺上充分拌勻，置于室溫條件下儲存。兩天后測定所制固體菌劑內(nèi)細 菌的有效活菌數(shù)，銅綠假單胞菌的有效活菌數(shù)為107 109個/ml。
實施例4:固體菌劑應(yīng)用效果試驗
采用本發(fā)明制備的固體菌劑在勝利油田某一污染區(qū)域進行現(xiàn)場應(yīng)用效果試驗。具體
試驗方法為
對現(xiàn)場進行模擬原位修復(fù)，挖3個邊長為2m深0.5m的土坑(編號為T , 28， 3#)，取 含油土壤6m3，充分攪拌均勻，分成三份，1#區(qū)域為空白對照，土壤中加入水，28區(qū)域為 加入大約500克的固體菌劑、和水，3#區(qū)域為500克的固體菌劑和1-3%的肥料。將拌勻 的這些土壤加入挖好的坑內(nèi)，每隔一周翻動土壤一次，并進行通風(fēng)強化，每隔兩天取樣 測定總石油烴含量，試驗處理為三次重復(fù)，以減少試驗誤差。總石油烴含量的測定采用 常規(guī)的重量法，計算公式為石油總烴(g/kg) 二蒸發(fā)瓶中殘留物重/鮮土重* (l一含 水率％)*1000。在現(xiàn)場進行為期1個月的修復(fù)后。1#空白對照的最終降解率為20. 189%。 2#固體菌劑的降解率為35.826%, 3#活性污泥的降解率為65.743%。由此可以看出，固 體草炭菌劑和肥料組的修復(fù)效果最優(yōu)，達到了 65%以上。
權(quán)利要求
1、一種用于石油污染物及石油產(chǎn)品降解的固體微生物菌劑，其特征在于含有銅綠假單胞菌(Pesudomonas aeruginosa)。
2、 如權(quán)利要求l所述的固體微生物菌劑，其特征在于是由銅綠假單胞菌細菌發(fā)酵 液與草炭土、麩皮按重量比例O. 1 1:1: 0.2 0.5混合制成，所述銅綠假單胞菌細菌發(fā) 酵液中銅綠假單胞菌的有效活菌數(shù)為10e 10"個/ml。
3、 一種權(quán)利要求2所述固體微生物菌劑的制備方法，其特特征在于所述的銅綠假單胞菌細菌細菌發(fā)酵液的制備，步驟如下(1) 菌種銅纟錄假單胞菌(尸esMc/o附o"os "erwgz77(wa)(2) —級種子液將上述菌種在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化16 32h后，轉(zhuǎn)接到液體LB培養(yǎng)基或 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)搖瓶活化16 32h，作為一級種子液，(3) 細菌發(fā)酵液將上述菌種的一級種子液接種量2% 10%轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)搖床培養(yǎng)16 32h， 轉(zhuǎn)速為150 250rpm，培養(yǎng)溫度為20 30°C。
4、 如權(quán)利要求3所述的固體微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3) 中的發(fā)酵培養(yǎng)基所選用的碳源、氮源分別是玉米淀粉、豆粕粉。
5、 如權(quán)利要求4所述的固體微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3) 中的發(fā)酵培養(yǎng)基還有酵母粉。
6、 如權(quán)利要求5所述的固體微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中 的發(fā)酵培養(yǎng)基如下豆粕粉為2 6g，玉米淀粉為1 3g，酵母粉為l 3g， K2HP04 0. llg， CaCl20. Olg， MgS04'7H20 0. 15g， MnS04 0. 01g，蒸餾水100ml 。
7、 一種權(quán)利要求1或2所述的固體微生物菌劑的應(yīng)用，其特征在于用于石油污染 物或石油產(chǎn)品污染場地進行降解處理。
8、 如權(quán)利要求7所述的固體微生物菌劑的應(yīng)用，其特征在于所述的固體微生物菌 劑添加肥料和水，攪拌均勻，灑在污染場地。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于石油污染物及石油產(chǎn)品降解的固體微生物菌劑，及其制備方法和應(yīng)用，屬于石油污染土壤及石油產(chǎn)品泄漏突發(fā)事故應(yīng)急處理的生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。固體微生物菌劑是由銅綠假單胞菌細菌發(fā)酵液與草炭土、麩皮按重量比例0.1～1∶1∶0.2～0.5混合制成，所述銅綠假單胞菌細菌發(fā)酵液中銅綠假單胞菌的有效活菌數(shù)為10⁶～10¹⁰個/ml。本發(fā)明的固體微生物菌劑具有在土壤中活性高，生長迅速，對環(huán)境不造成二次污染的優(yōu)點，用于在石油污染土壤及石油產(chǎn)品泄漏事故場地的生物修復(fù)。
文檔編號C12N1/20GK101486980SQ20091001421
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日
發(fā)明者洋 于 申請人:洋 于