專利名稱：：與控制可變剪接和rna加工的核糖開關(guān)有關(guān)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文公開的發(fā)明主要涉及基因表達(dá)領(lǐng)域，具體涉及基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：精確遺傳控制是活體系統(tǒng)的一個(gè)基本特征，因?yàn)榧?xì)胞必須通過改變基因表ii^式來對多種生化信號和環(huán)境信號作出應(yīng)答。大多數(shù)已知的遺傳控制機(jī)制涉及到蛋白因子的使用，所述蛋白因子會感受到化學(xué)或物理刺激，然后通過與相關(guān)DNA或信使RNA序列選擇性相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。蛋白可采用復(fù)雜形狀并行使使活體系統(tǒng)可準(zhǔn)確地感受到它們的化學(xué)和物理環(huán)境的多種功能。對代謝物有應(yīng)答的蛋白因子通常通過結(jié)合DNA以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始(如lac阻遏蛋白；Matthews,K.S.,andNichols,J.C"1998，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.5S，127-164)或通過結(jié)合RNA以控制轉(zhuǎn)錄終止(如PyrR蛋白；Switzer，R丄"etal.，1999，Prog.NucleicAcidsRes.Mol.Biol.62，329-367)或翻剩如TRAP蛋白；Babitzke,P"andGollnick，P.，2001，J.Bacteriol.7^5，5795-5802)來發(fā)揮作用。蛋白因子通過多種機(jī)制如變構(gòu)調(diào)節(jié)或翻譯后修飾來應(yīng)答于環(huán)境刺激，并擅長利用這些機(jī)制來作為高反應(yīng)性遺傳開關(guān)(如參見Ptashne，M.，andGann，A.(2002).GenesandSignals.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。除了蛋白質(zhì)因子廣泛參與基因控制之外，還已知RNA也可在基因調(diào)節(jié)中有活躍的作用。最近的研究逐漸揭示出小的非編碼RNA在選擇性靶向和破壞mRNA從而導(dǎo)致基因表達(dá)的下調(diào)方面的重要作用(參見例如Hannon，GJ.2002，NatureWS，244-251和該文章的參考文獻(xiàn))。這種RNA干擾過程利用了短RNA通過Watson-Crick堿基互補(bǔ)而選擇性識別目標(biāo)mRNA耙標(biāo)的能力，在該過程之后被結(jié)合的mRNA通過蛋白質(zhì)的作用而被破壞。在這一系統(tǒng)中RNA為分子識別的理想媒介物，因?yàn)橥ㄟ^進(jìn)化過程產(chǎn)生新的靶標(biāo)特異性RNA因子要比產(chǎn)生具有新的高特異性RNA結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)因子容易得多。雖然蛋白質(zhì)可以滿足生物學(xué)對于酶、受體和結(jié)構(gòu)功能的大部分需求，但是RNA也具有這些能力。例如，RNA具有足夠的結(jié)構(gòu)塑性，能形成多種具有很高的酶活力和精確的分子識別能力的核酶結(jié)構(gòu)域(Cech&Golden,BuildingacatalyticactivesiteusingonlyRNA.In:J/reiA^4『wWR.F.Gesteland，T.R.Cech，J.F.Atkins,eds.,pp.321-350(1998);Breaker,7/iv//nselectionofcatalyticpolynucleotides.C/re/w.iev.97，371-3卯(1997))和受體結(jié)構(gòu)域(Osborne&Ellington,Nucleicacidselectionandthechallengeofcombinatorialchemistry.C/re附.及ev.97,349-370(1997);Hermann&Patel，Adaptiverecognitionbynucleicacidadapters.5Wewce287，820-825(2000))。此外，上述能力還可以組合產(chǎn)生可被效應(yīng)物分子選擇性調(diào)節(jié)的變構(gòu)核酶(Soukup&Breaker,EngineeringprecisionRNAmolecularswitches./Voc.TV"http://.5"c/.USA96，3584-3589(1999);Seetharamanetal"Immobilizedriboswitchesfortheanalysisofcomplexchemicalandbiologicalmixtures.AWure5/Cec/fo/.19，336-341(2001))?？勺兗艚舆^程涉及mRNA前體上剪接位點(diǎn)的選擇性使用。可變剪接使得可從單個(gè)基因產(chǎn)生多種蛋白，從而使得產(chǎn)生具有不同功能的蛋白。可變剪接事件可通過多種方式出現(xiàn)，包括外顯子跳躍、相互排斥的外顯子的使用以及5'和/或3'剪接位點(diǎn)的差異選擇。對于許多基因來說(例如同源基因、癌基因、神經(jīng)肽、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和肌肉收縮蛋白)，可變剪接以發(fā)育或組織特異的方式調(diào)控。因此，可變剪接在基因表達(dá)中起到關(guān)鍵的作用。最近的研究已揭示出可變剪接在復(fù)雜生物體的表達(dá)策略中的重要性。mRNA前體(mRNAprecursor)(mRNA前體(pre-mRNA))的可變剪接在調(diào)控哺乳動物基因表達(dá)中起到重^ft用?？勺兗艚拥恼{(diào)節(jié)出現(xiàn)在多種譜系的細(xì)胞中，并且是大量基因的表達(dá)程序的一部分。最近，已經(jīng)逐漸明確的是，可變剪接可控制蛋白同種形的產(chǎn)生，所述同種型有時(shí)具有完全不同的功能。在細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面具有不同性質(zhì)且有時(shí)具有相對性質(zhì)的癌基因和原癌基因蛋白同種型經(jīng)由可變剪接產(chǎn)生。這類基因的實(shí)例見Makela，T.P.etal.1992，Science256:373;Yen,J.etal.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5077;Mumberg，D.etal.1991，GenesDev.5:1212;Foulkes，N.S.andSassone-Corsi，P.1992，Cell68:411。同時(shí)，可變剪接經(jīng)常用于控制在程序性細(xì)胞死亡中涉及的蛋白的產(chǎn)生，所述蛋白例如Fas、Bcl-2、Bax和Ced-4(Jiang,Z.H.andWuJ.Y"1999，ProcSocExpBiolMed220:64)。mRNA前體的可變剪接可產(chǎn)生一種阻遏蛋白，而在不同條件下可從相同mRNA前體產(chǎn)生一種激活子(BlackD.L.2000,Cell103:367;Graveley，B.R.2001，TrendsGenet.17:100)。本領(lǐng)域需要可以用于經(jīng)核糖開關(guān)(riboswitch)調(diào)節(jié)可變剪接的方法和組合物。
發(fā)明內(nèi)容本文公開了一種可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一個(gè)編碼如下一種RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地連接于一個(gè)編碼區(qū)的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的剪接，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)是異源的，并且其中對剪接的調(diào)節(jié)影響所述RNA的加工。所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)所述RNA的可變剪接。所述核糖開關(guān)可包含一個(gè)適體Uptamer)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。所述RNA可進(jìn)一步包含一個(gè)內(nèi)含子。所述核糖開關(guān)可在所述RNA的3'非翻譯區(qū)。所述內(nèi)含子可在所述RNA的3'非翻譯區(qū)。RNA加工位點(diǎn)可在所述內(nèi)含子中。所述內(nèi)含子的剪切可從所述RNA上除去所述RNA加工位點(diǎn)，從而影響所述RNA的加工。對所述RNA加工的影響可包括由所述RNA加工位點(diǎn)調(diào)節(jié)的所述RNA加工的消除。對所述RNA加工的影響可包括轉(zhuǎn)錄終止的改變。對所述RNA加工的影響可包括所述RNA降解的增加。對所述RNA加工的影響可包括所述RNA更新的增加。所述核糖開關(guān)可與所述內(nèi)含子的3，剪接位點(diǎn)部分重疊。所述內(nèi)含子的剪接可降低或消除所述核糖開關(guān)被激活的能力。所述剪接點(diǎn)可為5'剪接位點(diǎn)。所述核糖開關(guān)可在所述RNA的內(nèi)含子內(nèi)。RNA加工也可不依賴或不參與剪接而被調(diào)節(jié)或影響。所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可包括所述內(nèi)含子中的剪接位點(diǎn)。所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可包括在所述內(nèi)含子末端的剪接位點(diǎn)(即所述5，剪接位點(diǎn)或3，剪接位點(diǎn))。所述RNA可進(jìn)一步包括一個(gè)內(nèi)含子，其中所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域包括所述內(nèi)含子中的分支位點(diǎn)。所述剪接點(diǎn)可在所述核糖開關(guān)被激活時(shí)具有活性。所述剪接位點(diǎn)也可在所述核糖開關(guān)未被激活時(shí)即具有活性。所述核糖開關(guān)可由觸發(fā)分子例如硫胺素焦磷酸(TPP)激活。所述核糖開關(guān)可以是一種TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可激活剪接。所述核糖開關(guān)可抑制可變剪接。所述核糖開關(guān)可改變RNA的剪接。所述RNA可具有分支結(jié)構(gòu)(branchedstructure)。所述RNA可以是mRNA前體?？刂萍艚拥倪m體區(qū)域可位于例如P4莖和P5莖?？刂萍艚拥倪m體區(qū)域還可出現(xiàn)于例如環(huán)5。控制剪接的適體區(qū)域還可出現(xiàn)于例如P2莖。因此，表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域例如可與P4和P5序列、環(huán)5序列和/或P2序列相互作用。僅當(dāng)觸發(fā)分子未結(jié)合于上述適體結(jié)構(gòu)域時(shí)，所述適體序列通常才可用于與所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域相互作用。例如，所述剪接位點(diǎn)和/或分支位點(diǎn)可位于相對于所述適體5'端的-130至-160之間的位置。所述RNA可進(jìn)一步包括第二個(gè)內(nèi)含子，其中所述第二內(nèi)含子的3'剪接位點(diǎn)位于相對于所述適體結(jié)構(gòu)域5'端的-220至-270之間的位置。還公開了一種用于影響RNA加工的方法，包括將包含核糖開關(guān)的構(gòu)建體導(dǎo)入所述RNA,其中所述核糖開關(guān)能夠調(diào)節(jié)RNA剪接，其中所述RNA包含一個(gè)內(nèi)含子，并且其中對剪切的調(diào)控影響到對所述RNA的加工。所述核糖開關(guān)可包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。所述核糖開關(guān)可在所述RNA的內(nèi)含子內(nèi)。所述核糖開關(guān)可由觸發(fā)分子例如TPP激活。所述核糖開關(guān)可以是一種TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可激活剪接。所述核糖開關(guān)可抑制剪接。所述核糖開關(guān)可改變對RNA的剪接。所述剪接可以非天然地發(fā)生?？刂萍艚拥倪m體區(qū)域可出現(xiàn)于例如環(huán)5?？刂萍艚拥倪m體區(qū)域也可出現(xiàn)于例如P2莖。例如，所述剪接位點(diǎn)可位于相對于所述適體5，端的-130至-160之間的位置。所述構(gòu)建體可進(jìn)一步包括所述內(nèi)含子。還公開了一種影響基因表達(dá)的方法，所述方法包括使(a)—種包含一種構(gòu)建體的細(xì)胞與(b)有效量的核糖開關(guān)的觸發(fā)分子相接觸，從而影響基因表達(dá)，所述構(gòu)建體包含一個(gè)編碼如下一種RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地連接于一個(gè)編碼區(qū)的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的剪接，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)是異源的，并且其中對剪切的調(diào)節(jié)影響到所述RNA的加工。所述核糖開關(guān)可為TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述觸發(fā)分子可為硫胺素或TPP。所公開的方法和組合物的其他優(yōu)點(diǎn)一部分將在下文的描述中闡明，一部分可以從說明書中獲知，或者可通過實(shí)施公開的方法和組合物而得知。所公開的方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)將通過所附權(quán)利要求書中具體指明的要素和組合實(shí)現(xiàn)和獲得。應(yīng)當(dāng)理解的是，上文的一般性描述和下文的具體描述都僅僅是示例性和解釋性的，并不是對本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限制。附圖包含于本說明書中并作為本說明書的一部分，附圖闡述了所公開方法和組合物的一些實(shí)施方案，它與文字描述一起作為對所公開方法和組合物的原理的解釋。圖1顯示TPP適體在植物品種中是保守的并具有廣泛的分布。(A)多種植物品種的TPP適體序列的比對揭示了序列和結(jié)構(gòu)的高保守性。形成P1-P5莖的核苷酸以不同的陰影高亮顯示，星號標(biāo)識在全部實(shí)例之間保守的核苷酸。序列來自擬南芥(j^fl/iVimi)(Ath，NC003071;SEQIDNO:l)，ficfl爐Vfl(Bsa，EF588038;SEQIDNO:2)，甘藍(lán)(5層由C簡卿(BoI，BH250462;SEQIDN0:3)，5oec/^r"Wr/c似(Bst，DU681973;SEQIDN0:4)，番木瓜(CW/ctf/w/w拜)(Cpa，DX471004;SEQIDN0:5)，甜橙(O附s/"e"s/s)(Csi，DY305604;SEQIDN0:6)，煙草(臉C/fl朋/由c"附(Nta，EF588039;SEQIDNO:7)，本塞姆氏煙草(iV/cCVmfl&"http://^附/""")(Nbe，EF588040;SEQIDN0:8)，毛果楊(尸印"/"s/f/cA織r/m)(Ptr，JGI，populusgenome，LGJX:7897690-7897807;SEQIDNO:9)，百樂j^艮(丄C"s>戸/譜)(Lja，AG247551;SEQIDNO:10)，番癡(丄戸戸s/謹(jǐn)^c"/e"Z"附)(Les，EF588041;SEQIDNO:11)，馬鈴薯(5W"Wm附似6eras"附)(Stu，DN941010;SEQIDNO:12)，羅勒(Oc/附"附6aw7ic"附v)(Oba，EF588042;SEQIDNO:13)，牽牛(/;w附o^1wiY)(Ini，BJ566897;SEQIDNO:14)，葡萄(W他W"(/^yi)(Vvi，AM442795;SEQIDNO:15)，水稻(Oo^"sW/v<i)(Osa，NC008396;SEQIDNO:16),偏生早熟禾(i^asecw/fl)(Pse，AF264021;SEQIDNO:17)，小麥(7W/,cm附"e幼V"附)(Tae，CD879967;SEQIDNO:18)，大麥(^onfe"附v"/gare)(Hvu,BM374959;SEQIDNO:19)，高粱0^rg/i"附(Sbi，CW250951;SEQIDNO:20)，火炬松(尸/""stoe由)(Pta，CCGB，Contigl16729RTDS2—8—E12.gl—A021:551-686;SEQIDNO:21)，和小立碗蘚/mfe附)(Ppa，gnl網(wǎng)856卯1678(SEQIDNO:22)，gnl|ti|893553357(SEQIDNO:23)，gnl網(wǎng)876297717(SEQIDNO:24)，(Langetal.，2005))。/.附7的序列表示一種cDNA的剪接變體，因此缺少所述適體的5，末端。這些序列的左Pl序列為GCACC,但不包括Ppa2序列(為GCGCC)和Ini序列。這些序列的右Pl序列為GUGUGC，但不包括Lja序列(為GAGUGC)和Les序列(為GCGUGC)。(B、C)基于植物(B;SEQIDNO:25和26)或細(xì)菌和古細(xì)菌(C;SEQIDNO:27-29)的所有代表的TPP核糖開關(guān)適體的共同序列和二級結(jié)構(gòu)模型是相似的。這種交互信息反映了框中堿基對存在的可能性。P5莖上所框堿基對的p值從上到下分別為O.l、0.1、0.01、0.01和0.01。P4莖上所框戚基對的p值從上到下分別為0.01、0.01和0.1。Pl莖上和P3a莖上所框>5^對的p值為0.01。P3莖上所框堿基對的p值從左到右分別為0.1、0.01、0.01、0.01、0.01和0.01。圖2顯示rH/C3，UTR的結(jié)構(gòu)是保守的。(A)r及/C基因的3，區(qū)域的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物類型是相似的。第一個(gè)框表示所述編碼區(qū)的最后的外顯子，其帶有所示終止密碼子UAA。所述終止密碼子后為一個(gè)內(nèi)含子(不包括L.esculentu,其中所述內(nèi)含子緊接在所述終止密碼子之前)，其通常在所有轉(zhuǎn)錄物類型(1、II、II)中都被剪接。GU和AG的標(biāo)志分別標(biāo)識5'和3，剪接位點(diǎn)。編號1-6的粗線標(biāo)識長度如(B)中所描述的RNA轉(zhuǎn)錄物的6個(gè)區(qū)域。虛線表示剪接事件，而菱形符號表示所述轉(zhuǎn)錄物加工位點(diǎn)。(B)在(A)中定義的核苷酸的數(shù)目在7種植物品種中近似。區(qū)域6的堆疊柱狀圖表示不同長度的轉(zhuǎn)錄物的識別。(C)在所有檢測的品種中，用多聚T引物獲得的cDNA上2W/C3，UTR的PCR擴(kuò)增只產(chǎn)生II型RNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離RT-PCR產(chǎn)物并通過溴化乙錠染色和紫外線照射觀察。"M，，表示包含以100個(gè)g對遞增的DNA的分子量標(biāo)記道。(D)使用同(C)中使用的cDNA相同的cDNA、I和II型RNA特異的引物組合進(jìn)行RT-PCR分析。(E)用不同RT引物形成的擬南芥cDNA的I和III型RNA3，UTR的RT-PCR產(chǎn)物。RT所用引物為多聚T、隨機(jī)六聚物或結(jié)合標(biāo)示出的rH/C末端(適體末端下游221個(gè)核苷酸)或如所示的更下游(適體末端下游882個(gè)核苷酸)附近的序列特異性引物。NoRT表示使用沒有反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板源的對照反應(yīng)。圖3顯示了rH/C轉(zhuǎn)錄物類型對擬南芥中硫胺素水平改變的應(yīng)答不同。(A)對在添加有0、0.1和1mM硫胺素的培養(yǎng)基上生長14天的擬南芥的r好/C轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行qRT-PCR分析。用不同的引物組合分別檢測到I、II和III型RNA和總r好/C轉(zhuǎn)錄物。用多聚T引物或隨機(jī)六聚物產(chǎn)生cDNA以檢測I型RNA。對每種引物組合將表勤目對于用未添加硫胺素的培養(yǎng)基測得的值標(biāo)準(zhǔn)化。值是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(B)(A)中所述相同樣品的7WJC轉(zhuǎn)錄物的RNA印跡分析。將20嗎總RNA上樣到每道中并用與7H/C編碼區(qū)、I型和II型RNA的延伸3，UTR或?qū)φ辙D(zhuǎn)錄物五/F"J結(jié)合的探針分析。7^/C探針的信號示于2到3kb大小的范圍內(nèi)。3'UTR探針產(chǎn)生的信號較弱，因此將其曝光時(shí)間相對于其他探針的1天膝光延長到3天。(C)硫胺素處理對擬南芥的rH/c轉(zhuǎn)錄物的時(shí)間依賴的作用的qRT-PCR分析。幼苗在不含硫胺素的培養(yǎng)基上生長14天然后用50jiM的碌u胺素和0.25mg/ml的Tween80對其噴霧。而對照幼苗用只含Tween80的溶液處理。在4小時(shí)和26小時(shí)后收集樣品并進(jìn)行qRT-PCR分析。根據(jù)用多聚T引物生成的cDNA分析r好/C轉(zhuǎn)錄物的量并相對于未應(yīng)用硫胺素的對照樣品的值(空心條)標(biāo)準(zhǔn)化。值是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(D)在野生型(WT)和硫胺素相對改變。幼苗在不含硫胺素的培養(yǎng)基上生長12天然后通過qRT-PCR分析T^/C轉(zhuǎn)錄物類型的量。數(shù)據(jù)被相對于WT樣品的值標(biāo)準(zhǔn)化并反映三次重復(fù)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4顯示7^/C的長3'UTR造成不依賴適體功能的基因表達(dá)的降低。(A)擬南芥的rH/CIII型RNA(SEQIDNO:30和31)剪切后產(chǎn)生的所述TPP適體的二級結(jié)構(gòu)模型。Pl和P2莖上加灰色陰影的核苷酸標(biāo)識與原始未剪接適體相比的g改變。黑框內(nèi)的核苷"示發(fā)生如圖所示的改變從而生成不與TPP結(jié)合的突變Ml和M2。(B)TPP結(jié)合(A)中所示的剪接適體的直讀探測分析。各道包括未反應(yīng)的(NR)、用RNaseTl(Tl)部分消化后或用堿(-OH)部分消化后上樣的RNA。對點(diǎn)1和2進(jìn)行定量以建立(C)中所示的KD。(C)曲線表示自發(fā)剪切的RNA標(biāo)準(zhǔn)化分?jǐn)?shù)相對于(B)中點(diǎn)1和2的TPP濃度。(D)包含與螢火蟲熒光素酶(LUC)編碼區(qū)的3，末端融合的擬南芥II型或III型RNA的3，UTR的才艮告構(gòu)建體的體內(nèi)表達(dá)分析。構(gòu)建體M1和M2基于III型RNA的3'UTR,但包含(A)中所示的突變。LUC-IIIM1，包含構(gòu)建體LUC-IIIM1的反向3，UTR序列。在瞬時(shí)本塞姆氏煙草(A7cC//m6e"^"w/"mi)表達(dá)試驗(yàn)中分析才艮告構(gòu)建體并將值相對于海腎共表達(dá)熒光素酶基因的值標(biāo)準(zhǔn)化。將表^目對于包含II型RNA的3，UTR的融合構(gòu)建體標(biāo)準(zhǔn)化。所示數(shù)據(jù)是三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(E)含有擬南芥(At)或本塞姆氏煙草(Nb)的r及/cII型或III型RNA的3，UTR的EGFP才艮告融合構(gòu)建的qRT-PCR分析。將表勤目對于共表達(dá)DsRED報(bào)告基因標(biāo)準(zhǔn)化并相對于包含II型3，UTR的構(gòu)建體標(biāo)準(zhǔn)化。所示數(shù)據(jù)是兩個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5顯示核糖開關(guān)功能的體內(nèi)分析。(A)剪下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)與五GF戶3，末端融合的At77//C的完整3，區(qū)域的報(bào)告融合蛋白的擬南芥系的葉子并與葉柄在水中或含0.02。/。硫胺素的水中培育。在處理開始后的0、48和72小時(shí)檢測EGFP熒光。圖中示出了三次重復(fù)的數(shù)據(jù)的一個(gè)代表性集合，其中數(shù)字標(biāo)識一個(gè)轉(zhuǎn)基因系的不同葉子。(B)(A)中所示的葉子在三個(gè)時(shí)間的EGFP熒光定量。所示數(shù)據(jù)代表每片葉子的平均熒光密度和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖中還示出了WT葉子的平均背景熒光。(C)在水中或0.02。/o硫胺素中培育72小時(shí)的葉子的總EGFP和r好/C轉(zhuǎn)錄物的qRT-PCR分析。轉(zhuǎn)錄物總量相對于內(nèi)對照轉(zhuǎn)錄物標(biāo)準(zhǔn)化并相對于水處理樣品中的轉(zhuǎn)錄物豐度標(biāo)準(zhǔn)化。值是使用不同轉(zhuǎn)基因系的四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(D，E)在無外源硫胺素的存在下生長的擬南芥報(bào)告轉(zhuǎn)化體的EGFP和7TWC轉(zhuǎn)錄物類型的不同3，UTR的RT-PCR分析。為生成cDNA,如圖所示使用了多聚T引物、隨機(jī)六聚物或兩個(gè)不同基因特異性的引物(與所述適體末端下游221或882個(gè)核苷酸結(jié)合)。正向引物對EGFP(左)或r及/c(右)編碼區(qū)的最后一個(gè)外顯子的末端是特異的，而反向引物為多聚T引物(D)或與所述適體末端下游221個(gè)核苷酸的區(qū)域同源。(E)分離RT-PCR產(chǎn)物并如圖2的描述所述進(jìn)行觀察。M表示包含以100個(gè)堿基對遞增的DNA的分子量標(biāo)記道。NoRT表示用無反向轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板來源的對照反應(yīng)。1-1和1-2分別代表帶有未剪接的或剪接的在終止密碼子后的上游內(nèi)含子的I型RNA。(E)中多聚T反應(yīng)中最下面的帶來自所述RT反應(yīng)中剩余的多聚T引物對rHJCII型RNA的擴(kuò)增。其他未標(biāo)記的帶對應(yīng)通過全部RT-PCR產(chǎn)物的克隆和測序確認(rèn)的非特異性擴(kuò)增。圖6顯示適體突變對核糖開關(guān)功能的作用。(A)與EGFP融合的來自擬南芥基因組序列并位于rH/C的3，區(qū)域的WTTPP適體的二級結(jié)構(gòu)模型和序列(SEQIDNO:32和33)。黑框內(nèi)的核苷^JL生如圖所示的改變從而生成妨礙TPP結(jié)合的突變M2、M3和M4。(B)表達(dá)含有WT適體序列或突變型M2、M3和M4的報(bào)告構(gòu)建體的擬南芥轉(zhuǎn)化體的葉子的EGFP熒光定量。將葉子切下并在水或0.02%>琉胺素中與葉柄培育72小時(shí)后進(jìn)行熒光分析。值為至少3個(gè)使用不同轉(zhuǎn)基因系的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。(C)(B)所述的擬南芥轉(zhuǎn)化體中EGFP和7H7C轉(zhuǎn)錄物含量的qRT-PCR分析。(用對照轉(zhuǎn)錄物標(biāo)準(zhǔn)化的)轉(zhuǎn)錄物的量相對于水處理樣品中的轉(zhuǎn)錄物豐度標(biāo)準(zhǔn)化。值為2-4個(gè)使用不同轉(zhuǎn)基因系的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。(D，E)帶有突變M2或M3的擬南芥轉(zhuǎn)化體的EGFP和7H/C轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR分析。如圖5D和5E的描述所述進(jìn)行RT-PCR分析。正向引物對EGFP或7H/C編碼區(qū)的最后一個(gè)外顯子的末端是同源的，而反向引物為多聚T引物(D)或與所述適體末端下游221個(gè)核苷酸的區(qū)域互補(bǔ)(E)。Kbp表示千4^對。圖7顯示植物中核糖開關(guān)功能的機(jī)制。(A)TPP導(dǎo)致5，剪切位點(diǎn)附近的RNA結(jié)構(gòu)的改變，所述結(jié)構(gòu)對r好/cni型RNA的形成有重要作用。為進(jìn)行直讀探測，將5，端用32P標(biāo)記的起始于5'剪接位點(diǎn)(+l)上游14個(gè)核苷酸并延伸至TPP適體3，末端的擬南芥的RNA(核苷酸-14-261)在存在(+)或不存在(-)10jiMTPP的條件下培育，并且通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離所產(chǎn)生的自發(fā)切割產(chǎn)物。標(biāo)記物為用RNaseTl(Tl)或堿COH)部分消化的RNA。該圖示出了所示泳道中的帶的相對強(qiáng)度。(B)5，剪接位點(diǎn)區(qū)域和所述TPP適體的P4-P5莖之間的堿基配對潛能(SEQIDNO:34-47;互補(bǔ)核苷酸加有陰影)。互補(bǔ)核苷酸鏈也存在于所有其他可獲得的植物7W/CmRNA序列中。(C)植物中rH/CTPP核糖開關(guān)功能的模型包括控制轉(zhuǎn)錄物的剪接和可變3，末端加工。當(dāng)TPP濃度低時(shí)(左)，P4和P5莖部分與所述5，剪接位點(diǎn)相互作用從而防止剪接。位于5'剪接位點(diǎn)和所述TPP適體之間的轉(zhuǎn)錄加工位點(diǎn)得以保留，并且其作用導(dǎo)致了可高表達(dá)的具有短3，UTR的轉(zhuǎn)錄物的形成。當(dāng)TPP濃度高時(shí)(右)，TPP與所述適體共轉(zhuǎn)錄地結(jié)合，這導(dǎo)致阻止與所述5，剪切位點(diǎn)相互作用的結(jié)構(gòu)改變。剪接發(fā)生并除去所述轉(zhuǎn)錄加工位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄繼續(xù)并且在延伸的3，UTR上的可變加工位點(diǎn)產(chǎn)生ZH/CIII型RNA。所述長3，UTR導(dǎo)致RNA降解增加，從而使rzwc的表達(dá)降低。圖8顯示不同植物品種的rff/C基因中TPP核糖開關(guān)的基因組DNA序列文本(SEQIDNO:48-54)。^H標(biāo)識rH/C開放閱讀框的終止密碼子，H^A示第一個(gè)內(nèi)仝子(以斜體顯示)的5'和3，剪切位點(diǎn)。翻和M標(biāo)識用于生成III型RNA的剪接位點(diǎn)。II型RNA的3'UTR以下劃線標(biāo)出，所述適體序列以粗體下劃線標(biāo)出。所顯示的序列的3，末端對應(yīng)擬南芥(Jni&Vfo/w/s幼"/fVwi")和稻(Oo;zfls"ftVfl)的基因注釋。對于其他植物品種，所顯示的序列與RT-PCR識別的3，末端一致。圖9顯示擬南芥的r及/C啟動子與添加硫胺素后ZH/C表達(dá)的下調(diào)無關(guān)。一個(gè)包含擬南芥的rH/C啟動子的1595bp片段的構(gòu)建體與報(bào)告基因P-葡糖苷酸酶(GUS)融合并轉(zhuǎn)化到擬南芥中。通過qRT-PCR分析在無石克胺素和添加有100jiM硫胺素的培養(yǎng)基上生長的9天大的幼苗中GUS和r及/C轉(zhuǎn)錄物的量并相對于對照轉(zhuǎn)錄物e五F-2a的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)是三種不同轉(zhuǎn)基因系和三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖10示出了r好/C的晝^達(dá)。(A)在持續(xù)光照下培育48小時(shí)的植物的總T^JC轉(zhuǎn)錄物的qRT-PCR分析。植物在在無硫胺素和添加有100fiM硫胺素的培養(yǎng)基上光/暗循環(huán)(16/8小時(shí))生長11天。在第12天的早上，植物被轉(zhuǎn)移到持續(xù)光照下，并每3小時(shí)采樣。表^目對于在無硫胺素的培養(yǎng)基上生長的植物在時(shí)間點(diǎn)0的樣品值標(biāo)準(zhǔn)化。誤差條代表重復(fù)3次的qRT-PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)偏差。無誤差條表示它們小于所示數(shù)據(jù)點(diǎn)的直徑。(B)III型RNA的qRT-PCR分析。植物材料和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法如(A)所述。圖ll示出了不同類型的r及/C轉(zhuǎn)錄物的3，UTR對報(bào)告基因表達(dá)的作用。(a)利用瞬時(shí)葉侵染試驗(yàn)表達(dá)包含egfp和擬南芥的r及/c-n或rH/C-IIIRNA的3，UTR的報(bào)告融合構(gòu)建體并在48和96小時(shí)后測量熒光。將結(jié)果與用熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體觀察到的結(jié)果比較。已知瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)(JohansenandCarrington，2001;Voinnetetal.，2003)。為評估PTGS可能的作用，在缺少或存在P19的條件下測定了兩種3，UTR變型的相對表達(dá)，所述P19是一種已知的基因沉說明書第ll/82頁默抑制子。將熒光相對于包含rH/C-II3，UTR的構(gòu)建體的值標(biāo)準(zhǔn)化。值是4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。所述兩種構(gòu)建體的活性比在P19的共表達(dá)后保持不變，說明PTGS不參與所觀察到的區(qū)別。(B)所示為包含本塞姆氏煙草7H/CII型和III型RNA的3，UTR的EGFP報(bào)告構(gòu)建體在葉侵染試驗(yàn)表達(dá)后的相對熒光。將表&目對于包含型RNA的3，UTR的構(gòu)建體的值標(biāo)準(zhǔn)化。值是兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。所述結(jié)果與用基于擬南芥的3，UTR的構(gòu)建體觀察到的結(jié)果等價(jià)。圖12示出了所述適體的5'側(cè)翼序列中TPP誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)。通過體外轉(zhuǎn)錄獲得一M始于所述5，剪接位點(diǎn)上游14個(gè)核苷酸并延伸到所述適體末端的RNA(-14-261)并用32P標(biāo)記5，末端。在缺少TPP或存在10jiMTPP的條件下進(jìn)行直讀探測反應(yīng)后，通過PAGE分離剪切產(chǎn)物。通過RNaseTl處理(Tl)或部分堿COH)消化生成標(biāo)記物。所述5'剪接位點(diǎn)的G殘基被定義為位置1和所述適體跨越核苷酸146-256。所述適體外的TPP依賴的調(diào)節(jié)主要在與所述5，剪接位點(diǎn)相鄰的區(qū)域內(nèi)被觀察到。然而，其他結(jié)構(gòu)改變揭示5，側(cè)翼以外的配體依賴的調(diào)節(jié)可能對控制所述5，剪接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)起重要作用。具體實(shí)施例方式通過參考對下文中包括的實(shí)施例和具體實(shí)施方案的具體描述，以及參考附圖及其上下文的描述，可以更容易地理解所公開的方法和組合物。信使RNA通常被認(rèn)為是遺傳信息的被動載體，它可在翻譯過程中被蛋白調(diào)節(jié)因子或小RNA調(diào)節(jié)因子和核糖體作用。已發(fā)現(xiàn)某些mRNA帶有天然適體結(jié)構(gòu)域，并且特異性代謝物與這些RNA結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。天然核糖開關(guān)具有天然RNA通常不具有的兩種特殊的功能。其一，mRNA元件可變?yōu)椴煌慕Y(jié)構(gòu)狀態(tài)，其中一種結(jié)構(gòu)可作為其靶標(biāo)代謝物的精確的結(jié)合袋。其二，由代謝物誘導(dǎo)的在結(jié)構(gòu)狀態(tài)之間的變構(gòu)互變可導(dǎo)致通過幾種不同機(jī)制之一的基因表達(dá)水平的改變。核糖開關(guān)通?？杀粍澐譃閮蓚€(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域一個(gè)選擇性地結(jié)合靶標(biāo)(適體結(jié)構(gòu)域)，另一個(gè)影響基因控制(表達(dá)平臺)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的動態(tài)相互作用導(dǎo)致對基因表達(dá)的依賴于代謝物的變構(gòu)控制。已識別了不同類別的核糖開關(guān)，這些不同類別的核糖開關(guān)表現(xiàn)出選擇性地識別激活化合物(在本文中被稱為觸發(fā)分子)。例如，輔酶B12、甘氨酸、硫胺素焦磷酸(TPP)和黃素單核苷酸(FMN)激活存在于如下的基因中的核糖開關(guān)，所述基因編碼這些化合物的代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中關(guān)鍵的酶。每一類核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域與高度保守的共有序列和結(jié)構(gòu)相一致。因此，可使用序列同源性檢索來識別相關(guān)的核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)域。已在細(xì)菌、古細(xì)菌和真核生物等多種生物中發(fā)現(xiàn)了核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)域。已報(bào)道了在真細(xì)菌中可感受10種不同的代謝物的12種以上結(jié)構(gòu)類的核糖開關(guān)(Mandal2004;Winkler2005;Breaker2006;Fuchs2006;Roth.AeubacterialriboswitchselectiveforthequeuosineprecursorpreQicontainsanunusuallysmallaptamerdomain.Nat.Struct.Mol.Biol.(2007))，并且大量的其他類正在被表征。每種核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可通過其甚至在親緣關(guān)系遠(yuǎn)的生物之間仍保持高度保守的核苷酸序列(Rodionov2002;Vitreschak2002;Vitreschak2003)和折疊結(jié)構(gòu)(Nahvi2004;Batey2004;Serga,2004jMontenge2006;Thore2006;Serga麗2006;Edwards2006)進(jìn)行區(qū)分。核糖開關(guān)通常包括一個(gè)對適體的代謝物結(jié)合應(yīng)答時(shí)可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表達(dá)平臺，但表達(dá)平臺在序列、結(jié)構(gòu)和控制機(jī)制上可廣泛地不同。適體異常的保守水平使得可使用生物信息學(xué)在不同生物中識別相似的核糖開關(guān)代表。現(xiàn)今，已經(jīng)從所有3個(gè)生命域中識別了僅與TPP核糖開關(guān)適體共有序列一致的序列(Sudarsan2003)。雖然從真菌(Sudarsan2003;Galagan2005X圖5)和植物預(yù)測的一些真核TPP適體已顯示可結(jié)合TPP(Sudarsan2003Yamauchi)，但是代謝物結(jié)合通過何種機(jī)制控制基因表達(dá)此前尚是未知的。在真菌中，每個(gè)TPP適體均位于5，非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)含子或mRNA蛋白編碼區(qū)中，這暗示mRNA剪接受代謝物結(jié)合的控制(Sudarsan2003;Kubodera2003)。在植物中，每個(gè)TPP適體殘基都位于mRNA的3，非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)或蛋白編碼區(qū)內(nèi)。已發(fā)現(xiàn)，植物TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)影響其所在的所述RNA的加工。A.核糖開關(guān)RNA的一般性結(jié)構(gòu)細(xì)菌核糖開關(guān)RNA是主要位于特定mRNA主編碼區(qū)域的5，非翻譯區(qū)(5，-UTR)的基因控制元件。結(jié)構(gòu)性探查研究(下文將詳述)發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)元件通常包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域作為配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然適體(T.Hermann,D.J.Patel，2000，287，820;L.Gold,etal"及ev/ew0/5iVc/^附/對o;1995，64，763)和與參與基因表達(dá)的RNA元件(例如Shine-Dalgarno(SD)元件；轉(zhuǎn)錄終止莖)相接的"表達(dá)平臺"。上述結(jié)論是基于下述觀察結(jié)果體外合成的適體結(jié)構(gòu)域在不存在表達(dá)平臺的條件下與合適的配體相結(jié)合(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2、3和6)。此外，結(jié)構(gòu)性探查研究表明，在獨(dú)立檢測的時(shí)候大多數(shù)核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域采用一種特定的二級和三級結(jié)構(gòu)折疊，這基本上與存在完整的5，前導(dǎo)RNA時(shí)檢測到的適體結(jié)構(gòu)相同。這表明在許多情況下，適體結(jié)構(gòu)域作為與獨(dú)立于表達(dá)平臺折疊的一個(gè)模塊單元(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2、3和6)。適體結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合狀態(tài)或未結(jié)合狀態(tài)最終通過表達(dá)平臺來反映，表達(dá)平臺可以對基因表達(dá)產(chǎn)生影響。核糖開關(guān)作為一個(gè)模塊元件的觀點(diǎn)被以下事實(shí)進(jìn)一步支持適體結(jié)構(gòu)域在多種生物之間是高度保守的(TPP核糖開關(guān)甚至在不同生物界之間都是保守的)(N.Sudarsan，etal.，iAC42003,9,644)，而表達(dá)平臺在序列、結(jié)構(gòu)和控制附帶開放閱讀框表達(dá)的機(jī)制方面都有所變化。例如，配體結(jié)合到枯草芽孢桿菌(及s"6說/s)的mRNA的TPP核糖開關(guān)上可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止(A.S.Mironov，etal.，ce//2002，111，747)。這種表達(dá)平臺與大腸桿菌(￡"c0//)幼ZMmRNA的TPP核糖開關(guān)的表達(dá)平臺在序列和結(jié)構(gòu)上均不同，大腸桿菌幼ZMmRNA的TPP核糖開關(guān)與TPP結(jié)合時(shí)會通過SD阻斷機(jī)制導(dǎo)致對翻譯的抑制(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2)。這兩種轉(zhuǎn)錄單位的TPP適體結(jié)構(gòu)域很容易被識別，并且具有幾乎相同的功能特征，但U因控制機(jī)制和實(shí)現(xiàn)該機(jī)制的表達(dá)平臺則相當(dāng)不同。核糖開關(guān)RNA的適體結(jié)構(gòu)域通常長度為~70至170個(gè)核苷酸(美國專利申請公布文本No.2005-0053951的附圖11)。這一結(jié)果有些出人意料，因?yàn)轶w外進(jìn)化實(shí)驗(yàn)識別了多種結(jié)合小分子的適體，它們的長度相當(dāng)短，并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜(T.Hermann,D.J.Patel，Sc/ewce2000，287，820;L.Gold,etal"Jwwfl/及ev/ew丑i》c/^附/s/ij1995,64，763;M.Famulok，Cw/re"f0/;/"/wi,ViS^"""ni/5,Wogj;1999，9，324)。雖然天然適體序列相對于人工適體在復(fù)雜性和信息含量上的顯著增加的原因還需要進(jìn)一步的確證，但是相信這種復(fù)雜性是形成具有高親和力和高選擇性功能的RNA受體所需要的。配體-核糖開關(guān)復(fù)合物的表觀KD值從低納摩爾量至低微摩爾量不等。還值得注意的是，當(dāng)一些適體結(jié)構(gòu)域與附帶的表達(dá)平臺相分離時(shí)，表現(xiàn)出比完整核糖開關(guān)更高的(~10至IOO倍)對靶配體的親和力(見美國專利申請公布文本No.2005-0053951的實(shí)施例2)。可以推測，對由完整的核糖開關(guān)RNA所需的多種不同的RNA構(gòu)象進(jìn)行采樣中有消耗能量，這一點(diǎn)通過配體親和力的損失而反映出來。由于適體結(jié)構(gòu)域必須作為分子開關(guān)，這可能提高了天然適體的功能性要求，這一點(diǎn)可能也有助于解釋它們?yōu)槭裁从懈鼜?fù)雜的結(jié)構(gòu)。B.TPP核糖開關(guān)輔酶硫胺素焦磷酸(TPP)是維生素B1的活性形式，它是多種蛋白催化的反應(yīng)中必需的參與者。來自所有3個(gè)生命域的生物(包括細(xì)菌、植物和真菌)使用感受TPP的核糖開關(guān)來控制負(fù)責(zé)輸入或合成硫胺素及其磷酸化衍生物的基因，這就使得該類核糖開關(guān)成為分布最廣的感受代謝物的RNA調(diào)節(jié)系統(tǒng)的成員。其結(jié)構(gòu)顯示一種折疊的RNA,其中一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域形成TPP的4-氨基-5-羥曱基-2-曱基嘧咬部分的嵌入袋，而另一個(gè)亞結(jié)構(gòu)域形成這樣的一個(gè)更寬袋，即該袋使用二價(jià)金屬離子和水分子以使得橋式連接至所述配體的焦磷酸部分。這兩個(gè)袋所處的位置可使其作為識別擴(kuò)展構(gòu)象的TPP的分子測量設(shè)備發(fā)揮功能。中央噻唑部分不被RNA識別，調(diào):胺素代謝基因的表達(dá)。天然'配體ii藥物樣類似物;可穩(wěn)定由所述核糖開關(guān)控制的二級和三級結(jié)構(gòu)元件，以調(diào)節(jié)mRNA編碼蛋白的合成。此外，該結(jié)構(gòu)可提供這樣的認(rèn)識，即折疊的RNA如何能形成與蛋白遺傳因子形成的結(jié)合袋相當(dāng)?shù)木_結(jié)合袋。在絲狀真菌粗糙脈孢菌中檢查了3種TPP核糖開關(guān)，發(fā)現(xiàn)通過控制mRNA剪接(Cheah2007),—種TPP核糖開關(guān)激活基因表達(dá)，且另兩種TPP核糖開關(guān)抑制基因表達(dá)(Cheah2007)。對于編碼TTP代謝中涉及的蛋白的NMT1mRNA前體，闡明了一種涉及核糖開關(guān)介導(dǎo)的堿基配對改變和可變剪接控制的詳細(xì)機(jī)制(Cheah2007)。這些結(jié)果證明，真核細(xì)胞利用代謝物結(jié)合的RNA來調(diào)節(jié)對關(guān)鍵生物化學(xué)過程的控制重要的RNA剪接事件。已發(fā)現(xiàn)，TPP核糖開關(guān)存在于所檢查的所有植物品種的硫胺素生物合成基因r好/C的3，非翻譯區(qū)(UTR)。所述7H/CTPP核糖開關(guān)控制具有可變3，UTR長度的轉(zhuǎn)錄物的形成，這影響mRNA穩(wěn)定性和蛋白產(chǎn)量。已發(fā)現(xiàn)，對核糖開關(guān)介導(dǎo)的可變3，末端加工的調(diào)節(jié)對r及/c表達(dá)的TPP依賴的反饋控制起關(guān)鍵作用。所述數(shù)據(jù)揭示了一種機(jī)制，其中代謝依賴的RNA折疊的改變控制mRNA的剪接和可變3，末端加工。TPP核糖開關(guān)存在于多種植物品種的硫胺素代謝基因r及/c的3'UTR中。具有可變3'UTR長度的r及/C轉(zhuǎn)錄物的形成依賴于核糖開關(guān)的功能，并根據(jù)細(xì)胞TPP水平的變化調(diào)節(jié)r及/c表達(dá)的反饋調(diào)控。所述數(shù)據(jù)表明，3'UTR長度與轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性有關(guān)，從而建立了通過3，末端加工進(jìn)行基因控制的基礎(chǔ)。本發(fā)明給出了植物中TPP核糖開關(guān)的功能的詳細(xì)機(jī)制(實(shí)施例1)，其包括r^H/CmRNA的剪接和不同3'末端加工的適體介導(dǎo)控制。前人(Sudarsanetal.，2003)已經(jīng)報(bào)道了植物品種擬南芥(Jm^Vsto/w/yZ/r<i/iVi/m)、稻(Oo^i^rftVa)和偏生早熟稻(i\<iseci/m/")的TH/C基因的3，UTR中高度保守的TPP結(jié)合適體的存在。通it^t其他植物品種的r及/c基因的測序和進(jìn)行符合所述TPP適體共有序列的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫搜索擴(kuò)大了植物TPP適體代表的收集。獲得cDNA序列后，克隆品種的基因組DNA的相應(yīng)區(qū)域并測序(具體見實(shí)驗(yàn)方法部分)，從而得到原始和加工后的mRNA分子的序列。所有可獲得的植物TPP適體序列的比對揭示了由莖Pl-P5組成的核苷酸序列和二級結(jié)構(gòu)的高度保守水平(圖1A)。植物(圖IB)和絲狀真菌(Cheahetal.，2007)的真核TPP核糖開關(guān)適體與其在細(xì)菌和古細(xì)菌中的等價(jià)物(圖1C)(Winkleretal.，2002;Rodionovetal.2002)相比的主要不同在于，細(xì)菌代表中通常總是缺少P3a莖，而真核生物中P3莖的長度是可變的。這兩個(gè)區(qū)域都不參與TPP結(jié)合(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal"2006;Thoreetal"2006;Cheahetal"2007)，因此這些不同應(yīng)該不會影響配體結(jié)合的特異性。在所有已知的單子葉植物、雙子葉植物和針葉火炬水>(P/w"stoe由)的T^/C實(shí)例的3，UTR中都發(fā)現(xiàn)了所述TPP適體。有趣的是，在莒蘚小立碗蘚(/mte"s)中，所述TPP適體存在于r〃/C的3，UTR中(Ppal)，并且也存在于與硫胺素生物合成基因THI4同源的兩個(gè)基因的3，區(qū)(Ppa2，Ppa3)。后面的發(fā)現(xiàn)和真菌也具有與多種不同基因有關(guān)的TPP適體的發(fā)現(xiàn)(Cheahetal.，2007)表明，真核生物似乎使用同一類核糖開關(guān)的變型以根據(jù)一種關(guān)鍵代謝物的濃度變化來控制多個(gè)基因。植物TPP適體的一個(gè)顯著特征是核苷酸序列的高度保守水平。在所有植物實(shí)例中大約80。/。的核苷酸(不包括P3莖)是保守的，相反，絲狀真菌中只有不到40%是保守的。植物TPP適體之間的大多數(shù)區(qū)別都存在于所述P3莖中，其在長度和序列上都可發(fā)生變化。此外，所述P3莖的長度還在相同品種的TPP適體代表之間改變，如在小立碗蘚中發(fā)現(xiàn)的(圖1A)。r好/C中延長的P3莖和THI4中非常短的P3莖的存在表明，對所述適體的這一組分沒有物種特異性的要求。對植物中TPP核糖開關(guān)的調(diào)控涉及到對mRNA轉(zhuǎn)錄物的剪接和可變3，末端加工的代謝物介導(dǎo)的控制(圖7C)。當(dāng)細(xì)胞中TPP濃度低時(shí)，所述適體與所述5，剪接位點(diǎn)相互作用并阻止剪接。此內(nèi)含子帶有一個(gè)允許轉(zhuǎn)錄物剪切和多腺苷酸化的主要加工位點(diǎn)。從此位點(diǎn)的加工生成帶有3，UTR和產(chǎn)生7W/C基因高表達(dá)的rH/C-II轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)TPP濃度高時(shí)，TPP與所述適體的結(jié)合阻止與所述5，剪接位點(diǎn)配對。結(jié)果，所述5，剪接位點(diǎn)變得可接觸，并用于除去所述主要加工位點(diǎn)的剪接事件。隨后轉(zhuǎn)錄延長至lkb，并且位于下游的加工位點(diǎn)的使用產(chǎn)生帶有長很多的3，UTR的RNA。所述長3，UTR使RNA降解增加，并且7^/C表達(dá)降低。前人的研究表明，延長的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在無轉(zhuǎn)錄物加工的情況下，從而揭示了這些加工的相互關(guān)聯(lián)性(Buratowski，2005;Proudfoot，2004;Proudfootetal"2002)。TPP核糖開關(guān)還在美國專利申請公開文本No.US-2005-0053951中被詳述，No.US-2005-0053951的全部內(nèi)容以援引的方式納入本文，還具體以援引的方式納入它對TTP核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)、功能和用途的描述。被明確考慮的是，美國專利申請公開文本No.US-2005-0053951的任何主題和描述，特別是美國專利申請公開文本No.US-2005-0053951中對TTP核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)、功能和用途的任何描述均可以具體地被包括或者排除在本文公開的其他主題之外。應(yīng)理解，如不另外說明，公開的方法和組合物不限于特定合成方法、特定分析技術(shù)或具體試劑，因此可有所改變。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施方案，而不意欲作出限制。材料本文公開了可用于所7>開的方法和組合物、可與之^:合使用、可用于其制備或作為其產(chǎn)品的材料、組合物和組分。本文公開了這些和其他材料,應(yīng)理解當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互作用、分組等時(shí)，雖然可能沒有明確公開具體的這些化合物的各個(gè)體的和總體的組合以及排列的每一種，但每種都在本文中明確地考慮和描述。例如，如果公開和討論了核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域并且討論了對包括所述核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域的若干分子作出的若干修飾，那么除非特別作出相反的說明，否則每種核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域的組合和排列以及可能的修飾都會被具體考慮。因此，如果公開了一類分子A、B和C以及一類分子D、E和F，還7>開了一個(gè)組合分子的實(shí)例A-D,那么即使沒有單獨(dú)提到每種組合，每種組合也都被獨(dú)立和綜合地考慮了。因此，在此實(shí)例中，才艮據(jù)A、B和C;D、E和F;以及實(shí)例組合A-D的公開內(nèi)容，A畫E、A-F、B國D、B-E、B畫F、C-D、C國E和C-F組合的每一個(gè)都#皮具體地考慮并應(yīng)認(rèn)為被7>開。類似地，它們的任何子集或組合也被特別考慮和公開。因此，例如，根據(jù)A、B和C;D、E和F;以及實(shí)例組合A-D的公開內(nèi)容，子集A-E、B-F和C-E被具體地考慮并應(yīng)認(rèn)為被公開。此概念適用于本申請所有方面，包括但不限于制備和使用所公開組合物的方法的步驟。因此，如果有多個(gè)可實(shí)施的其他步驟，應(yīng)理解每個(gè)其他步驟都可與所公開方法的任何具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨附M合一起實(shí)施，并且每個(gè)這種組合都被具體地考慮且應(yīng)認(rèn)為被公開。A.核糖開關(guān)核糖開關(guān)是作為待表達(dá)RNA分子的一部分并且與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)會改變狀態(tài)的表達(dá)控制元件。核糖開關(guān)一般可被分為兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域一個(gè)選擇性地與把標(biāo)結(jié)合(適體結(jié)構(gòu)域)，而另一個(gè)影響基因控制(表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的動態(tài)相互作用導(dǎo)致對基因表達(dá)的代謝物依賴的變構(gòu)調(diào)控。公開了分離和重組的核糖開關(guān)、含有這種核糖開關(guān)的重組構(gòu)建體、與這種核糖開關(guān)可操作地連接的異源序列以及包含這種核糖開關(guān)、核糖開關(guān)重組構(gòu)建體和與異源序列可操作地連接的核糖開關(guān)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因生物體。例如，所述異源序列可為編碼包含報(bào)告蛋白或肽在內(nèi)的目的蛋白或肽的序列。優(yōu)選的核糖開關(guān)是天然存在的核糖開關(guān)或衍生自于天然存在的核糖開關(guān)。例如，適體結(jié)構(gòu)域可以是天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或衍生自于天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。所述核糖開關(guān)可以包括人工適體或者任選地排除人工適體。例如，人工適體包括經(jīng)體外演化和/或體外選擇設(shè)計(jì)或選擇的適體。所述核糖開關(guān)可包含天然存在核糖開關(guān)的共有序列。多種核糖開關(guān)的共有序列記載于美國申請公開文本No.2005-0053951中，例如在圖11中。植物TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)的共同序列示于圖1B中，具體實(shí)例示于圖1A中。本文公開了一種可調(diào)節(jié)的基因表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一個(gè)編碼如下一種RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地連接于一個(gè)編碼區(qū)的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的剪接，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)是異源的，并且其中剪切調(diào)節(jié)影響所述RNA的加工。所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)所述RNA的可變剪接。所述核糖開關(guān)可包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。所述RNA可進(jìn)一步包含一個(gè)內(nèi)含子。所述核糖開關(guān)可在所述RNA的3'非翻譯區(qū)中。所述內(nèi)含子可在所述RNA的3'非翻譯區(qū)中。RNA加工位點(diǎn)可在所述內(nèi)含子中。所述內(nèi)含子的剪接可從RNA上除去所述RNA加工位點(diǎn)，從而影響所述RNA的加工。對所述RNA加工的影響可包括由所述RNA加工位點(diǎn)介導(dǎo)的所述RNA的加工的消除。對所述RNA加工的影響可包括轉(zhuǎn)錄終止中的改變。對所述RNA加工的影響可包括所述RNA的降解的增加。對所述RNA加工的影響可包括所述RNA的更新的增加。所述核糖開關(guān)可與所述內(nèi)含子的3，剪接位點(diǎn)部分重疊。所述內(nèi)含子的剪接可降低或消除所述核糖開關(guān)被激活的能力。所述剪接位點(diǎn)可為一個(gè)5，剪接位點(diǎn)。所述核糖開關(guān)可在所述RNA的一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)。RNA加工也可不依賴或不參與剪接而被調(diào)節(jié)或影響。所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可包括所述內(nèi)含子中的剪接位點(diǎn)。所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可包括在所述內(nèi)含子末端的剪接位點(diǎn)(即5'剪接位點(diǎn)或3，剪接位點(diǎn))。所述RNA可進(jìn)一步包括一個(gè)內(nèi)含子，其中所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域包括所述內(nèi)含子中的分支位點(diǎn)。所述剪接點(diǎn)可在所述核糖開關(guān)被激活時(shí)具有活性。所述剪接點(diǎn)可在所述核糖開關(guān)未被激活時(shí)具有活性。所述核糖開關(guān)可被一個(gè)觸發(fā)分子如焦磷酸硫胺素(TPP)激活。所述核糖開關(guān)可為TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可激活剪接。所述核糖開關(guān)可抑制剪接。所述核糖開關(guān)可改變所述RNA的剪接。所述RNA可具有分支結(jié)構(gòu)。所述RNA可為前體mRNA。所述適體受剪接控制的區(qū)域可位于例如P4和P5莖中。所述適體受剪接控制的區(qū)域也可位于例如環(huán)5中。所述適體受剪接控制的區(qū)域也可位于例如P2莖中。因此，例如，表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可與所述P4和P5序列、環(huán)5序列和/或P2序列相互作用。這些適體序列通常只在觸發(fā)分子未結(jié)合于所述適體結(jié)構(gòu)域時(shí)可與所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域相互作用。所述剪接位點(diǎn)和/或分支位點(diǎn)可位于例如相對于所述適體的5，末端的-130到-160之間的位置上。所述RNA可進(jìn)一步包括第二個(gè)內(nèi)含子，其中所述第二內(nèi)含子的3，剪接位點(diǎn)位于相對于所述適體結(jié)構(gòu)域的5'末端的-220到-270之間的位置。還公開了一種影響RNA加工的方法，包括將包含核糖開關(guān)的構(gòu)建體引入所述RNA，其中所述核糖開關(guān)能夠調(diào)節(jié)RNA的剪接，其中所述RNA包含一個(gè)內(nèi)含子，其中剪接調(diào)控影響所述RNA的加工。核糖開關(guān)可包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。所述核糖開關(guān)可在所述RNA的一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)。所述核糖開關(guān)可被一個(gè)觸發(fā)分子如TPP激活。所述核糖開關(guān)可為TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可激活剪接。所述核糖開關(guān)可抑制剪接。所述核糖開關(guān)可改變所述RNA的剪接。所述剪接可非天然地發(fā)生。所述適體受剪接控制的區(qū)域也可位于例如環(huán)5中。所述適體受剪接控制的區(qū)域也可位于例如P2莖中。所述剪接位點(diǎn)可位于例如相對于所述適體的5，末端的-130到-160之間的位置上。所述構(gòu)建體可進(jìn)一步包含所述內(nèi)含子。還公開了一種影響基因表達(dá)的方法，所述方法包括使(a)—種包含一種構(gòu)建體的細(xì)胞與(b)有效量的核糖開關(guān)的觸發(fā)分子相接觸，從而影響基因表達(dá)，所述構(gòu)建體包含一個(gè)編碼如下一種RNA的核酸分子，所述RNA包含可操作地連接于一個(gè)編碼區(qū)的核糖開關(guān)，其中所述核糖開關(guān)調(diào)節(jié)所述RNA的剪接，其中所述核糖開關(guān)和編碼區(qū)是異源的，并且其中剪切的調(diào)節(jié)影響所述RNA的加工。所述核糖開關(guān)可為TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述觸發(fā)分子可為硫胺素或TPP。所述核糖開關(guān)可改變RNA的剪接。例如，所述核糖開關(guān)的活化可允許或促進(jìn)剪接；允許或促進(jìn)可變剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可變剪接；或者允許或促進(jìn)剪接或主要剪接。再例如，失活的核糖開關(guān)或使所述核糖開關(guān)失活可允許或促進(jìn)可變剪接；阻止或降低剪接或主要剪接；阻止或降低可變剪接；或者允許或促進(jìn)剪接或主要剪接。通常，剪接調(diào)節(jié)的形式可通過所述RNA分子中的所述核糖開關(guān)與剪接位點(diǎn)、可變剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)的物理關(guān)系確定。例如，核糖開關(guān)的活化/失活一般涉及RNA中可變二級結(jié)構(gòu)(例如堿基配對的莖)的形成和/或破壞，這種結(jié)構(gòu)變化可用于阻礙或暴露功能性RNA序列。核糖開關(guān)的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域一般包含這種功能性RNA序列。因此，例如，通過以以下方式在核糖開關(guān)的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域中包含一個(gè)剪接點(diǎn)或一個(gè)分支位點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)或影響所述RNA的剪接，所述方式即所述剪接點(diǎn)或分支位點(diǎn)在所述核糖開關(guān)被激活或失活時(shí)交替地被阻礙或被暴露，反之亦然。剪接調(diào)控可影響剪接被調(diào)控的RNA的加工。例如，所述RNA中的內(nèi)含子可包括RNA加工信號或位點(diǎn)。所述RNA的剪接可導(dǎo)致所述加工信號或位點(diǎn)的消除。例如，mRNA的3，UTR中的轉(zhuǎn)錄終止信號或RNA剪切位點(diǎn)如果位于一個(gè)被剪接出所述RNA的內(nèi)含子中則可被除去。因此，通過本文所述的核糖開關(guān)對該內(nèi)含子的剪接的調(diào)控可影響所述RNA的加工。作為另一個(gè)實(shí)例，可通過內(nèi)含子或RNA加工系統(tǒng)的不同元件的剪接建立RNA加工信號或位點(diǎn)，可通過內(nèi)含子的剪接將信號或位點(diǎn)引入一個(gè)可操作結(jié)構(gòu)或從所述結(jié)構(gòu)中除去。作為另一個(gè)實(shí)例，可將RNA加工信號或位點(diǎn)引入一個(gè)與所述RNA的其他元件毗鄰的可操作結(jié)構(gòu)或從所述結(jié)構(gòu)除去。RNA加工也可被核糖開關(guān)直接影響而不受剪接調(diào)控的調(diào)節(jié)。例如，RNA加工信號或位點(diǎn)可位于一個(gè)核糖開關(guān)的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域中。這樣，通過所述核糖開關(guān)的激活對所述表達(dá)平臺的結(jié)構(gòu)關(guān)系的改變(以及并因此對所述RNA加工信號或位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)關(guān)系的改變)可通過影響所述RNA加工信號或位點(diǎn)的操作能力而影響加工。所述核糖開關(guān)可影響RNA加工。"影響RNA加工"是指所述核糖開關(guān)可直接或間接作用于RNA以允許、刺激、降低或阻止RNA加工發(fā)生。這可包括，例如，允許任何加工發(fā)生。與無核糖開關(guān)時(shí)發(fā)生的加工事件的數(shù)目相比，這可使加工增加或者減少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,或者更多。RNA加工可包括，例如，轉(zhuǎn)錄終止、RNA的3，末端的形成、多聚腺苷酸化以及RNA的降解或更新。如本文所用，RNA加工信號或位點(diǎn)是RNA中起調(diào)節(jié)、發(fā)出信號作用或?yàn)槿魏蜶NA加工事件或條件所需的序列、結(jié)構(gòu)或位置。例如，某些序列或結(jié)構(gòu)可發(fā)出轉(zhuǎn)錄終止、RNA、剪切或多聚腺苷酸化信號。核糖開關(guān)可激活或抑制剪接。"激活剪接"的意思是，核糖開關(guān)可直接或間接地作用于RNA以使剪接發(fā)生。這可包括例如使任何剪接發(fā)生(例如相對于無剪接的單剪接)或者使可變剪接發(fā)生。與無核糖開關(guān)時(shí)發(fā)生的剪接事件的數(shù)目相比，這可使剪接增加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,或者更多。"抑制剪接"的意思是，核糖開關(guān)可直接或間接地作用于RNA以抑制剪接。這可包括例如阻止任何剪接發(fā)生或者減少剪接發(fā)生(例如無剪接和單剪接)，或者阻止或減少可變剪接的發(fā)生。與無核糖開關(guān)時(shí)發(fā)生的可變剪接考;件的數(shù)目相比，這可使可變剪接減少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%,14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。核糖開關(guān)可激活或抑制可變剪接。"激活可變剪接"的意思是，核糖開關(guān)可直接或間接地作用于RNA以使可變剪接發(fā)生。與無核糖開關(guān)時(shí)發(fā)生的可變剪接事件的數(shù)目相比，這可使可變剪接增加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、560/0、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%,或者更多。"抑制可變剪接，，的意思是，核糖開關(guān)可直接或間接地作用于RNA以抑制可變剪接。與無核糖開關(guān)時(shí)發(fā)生的可變剪接事件的數(shù)目相比，這可使可變剪接減少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15。/o、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。核糖開關(guān)可影響RNA編碼的蛋白的表達(dá)。例如，對剪接或可變剪接的調(diào)節(jié)可影響待翻譯RNA的能力、改變編碼區(qū)或改變翻譯起始或終止。例如，可變剪接可導(dǎo)致不存在于正常加工的轉(zhuǎn)錄物中的起始密碼子或終止密碼子(或二者)出現(xiàn)于加工的轉(zhuǎn)錄物中。再例如，可變剪接可導(dǎo)致從加工的轉(zhuǎn)錄物去除正常的起始密碼子或終止密碼子。一種用于核糖開關(guān)調(diào)節(jié)的剪接以調(diào)節(jié)RNA編碼蛋白的表達(dá)的有效模式為，在RNA的5'非翻譯區(qū)的內(nèi)含子中導(dǎo)入一個(gè)核糖開關(guān)，并包括或利用所述內(nèi)含子中的起始密碼子，使得內(nèi)含子中的所述起始密碼子為所述可變剪接RNA中的第一起始密碼子。另一種用于核糖開關(guān)調(diào)節(jié)的剪接以調(diào)節(jié)RNA編碼蛋白的表達(dá)的有效模式為，在RNA的5'非翻譯區(qū)的內(nèi)含子中導(dǎo)入一個(gè)核糖開關(guān)，并包括或利用所迷內(nèi)含子中的短開放閱讀框，使得所述閱讀框首先出現(xiàn)在所述可變剪接RNA中。RNA分子可具有分支結(jié)構(gòu)。例如，在真菌TPP核糖開關(guān)(Cheah2007)中，當(dāng)TPP濃度低時(shí)，新轉(zhuǎn)錄的mRNA采用一種封閉第二5，剪接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，而是分支位點(diǎn)處于可剪接狀態(tài)。從第一5，剪接位點(diǎn)剪接mRNA前體可的導(dǎo)致1-3型mRNA的產(chǎn)生及NMT1蛋白的表達(dá)。當(dāng)TPP濃度高時(shí)，配體與TPP適體的結(jié)合可造成RNA折疊的變構(gòu)改變，以增加所述第二5，剪接位點(diǎn)附近的結(jié)構(gòu)柔性并且封閉所述分支位點(diǎn)附近的核苷酸。所公開的核糖開關(guān)，包括其衍生形式和重組形式，通常可來自任何來源，包括天然存在的核糖開關(guān)和從頭設(shè)計(jì)的核糖開關(guān)。任何這種核糖開關(guān)都可用于所公開方法或與之一起使用，條件是它們已被確定可調(diào)節(jié)可變剪接。然而，可定義不同類型的核糖開關(guān)，并且某些這類子類型可用于特殊方法或與之一起使用(一般如本文其他部分所述)。核糖開關(guān)類型包括例如天然存在的核糖開關(guān)、天然存在的核糖開關(guān)的衍生物和修飾形式、嵌合核糖開關(guān)和重組核糖開關(guān)。天然存在的核糖開關(guān)是具有天然存在的核糖開關(guān)序列的核糖開關(guān)。這種天然存在的核糖開關(guān)可以是天然存在的核糖開關(guān)即自然界中出現(xiàn)的核糖開關(guān)的分離或重組形式。即，所述核糖開關(guān)具有相同的一級結(jié)構(gòu)但已被分離或在新的基因或核酸環(huán)境中被工程改造。嵌合核糖開關(guān)例如可由任何類別或類型或者特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和相同類別或類型或者任何不同類別或類型的不同核糖開關(guān)的一部分構(gòu)成；可由任何類別或類型或特定類別或類型的核糖開關(guān)的一部分和任何非核糖開關(guān)序列或組分構(gòu)成。重組核糖開關(guān)是已被分離或在新的基因或核酸環(huán)境中被工程改造的核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可包含單個(gè)或多個(gè)適體結(jié)構(gòu)域。包含多個(gè)適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可表現(xiàn)出對觸發(fā)分子的協(xié)同結(jié)合，也可不表現(xiàn)出對觸發(fā)分子的協(xié)同結(jié)合(即所述適體不需表現(xiàn)協(xié)同結(jié)合)。對后一種情況，所述適體結(jié)構(gòu)域可被稱作獨(dú)立結(jié)合物。含有多個(gè)適體的核糖開關(guān)可含有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域。例如，含有兩個(gè)表現(xiàn)出對與其觸發(fā)分子協(xié)同結(jié)合的平臺結(jié)構(gòu)域。含有多個(gè)適e體的核糖開關(guān)可含有一個(gè)或多個(gè)通過接頭連接的適體。當(dāng)這種適體表現(xiàn)出與觸發(fā)分子協(xié)同結(jié)合時(shí)，所述接頭可為協(xié)同接頭。如果適體結(jié)構(gòu)域具有介于x和x-l之間的希爾(Hill)系數(shù)n——其中X是用于分析協(xié)同結(jié)合的適體結(jié)構(gòu)域數(shù)目(或所述適體結(jié)構(gòu)域上結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目)，則它們可被認(rèn)為表現(xiàn)出協(xié)同結(jié)合。因此，例如，如含有兩個(gè)適體結(jié)構(gòu)域的核糖開關(guān)(如甘氨酸應(yīng)答性核糖開關(guān))的希爾系數(shù)在2和1之間，則所述核糖開關(guān)可被認(rèn)為表現(xiàn)出協(xié)同結(jié)合。應(yīng)理解所用x值取決于進(jìn)行協(xié)同結(jié)合分析的適體結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，而不一定是核糖開關(guān)中存在的適體結(jié)構(gòu)域數(shù)目。這是合理的，因?yàn)楹颂情_關(guān)可含有多個(gè)適體結(jié)構(gòu)域，但只有某些表現(xiàn)協(xié)同結(jié)合。公開了含有異源適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域的嵌合核糖開關(guān)。即，嵌合核糖開關(guān)由一種來源的適體結(jié)構(gòu)域和另一種來源的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。所述異源來源可來自例如不同的具體核糖開關(guān)、不同類型的核糖開關(guān)或不同類別的核糖開關(guān)。所述異源適體也可來自非核糖開關(guān)適體。所述異源表達(dá)平臺也可來自非核糖開關(guān)來源。經(jīng)修飾的或衍生的核糖開關(guān)可使用體外選擇和進(jìn)化技術(shù)生產(chǎn)。通常，用于核糖開關(guān)的體外進(jìn)化技術(shù)包括產(chǎn)生一系列變種核糖開關(guān)，其中核糖開關(guān)序列的一(幾)部分發(fā)生改變而該核糖開關(guān)的其他部分保持不變。然后可對所述系列的變種核糖開關(guān)的激活、失活或阻斷(或其他功能或結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行評估，符合目的標(biāo)準(zhǔn)的變種核糖開關(guān)被選用或進(jìn)行進(jìn)一步演化。(consensusriboswitch)。共有核糖開關(guān)可用于指出改變核糖開關(guān)的哪一(些)部分來進(jìn)行體外選擇和演化。植物TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)的共同序列示于表1B。還公開了調(diào)節(jié)發(fā)生改變的被修飾核糖開關(guān)。核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)可通過將一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域可操作地連接至所述核糖開關(guān)(其是一個(gè)嵌合核糖開關(guān))的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域而被改變。然后所述適體結(jié)構(gòu)域可通過例如觸發(fā)分子對所述適體結(jié)構(gòu)域的作用來介導(dǎo)核糖開關(guān)的調(diào)節(jié)。適體結(jié)構(gòu)域可以任何合適的方式與核糖開關(guān)的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可操作地連接，包括例如通過用新的適體結(jié)構(gòu)域替換所述核糖開關(guān)正?；蛱烊坏倪m體結(jié)構(gòu)域。通常，任何可激活、滅活或阻斷適體結(jié)構(gòu)域所來源的核糖開關(guān)的化合物或條件都可用于激活、滅活或阻斷所述嵌合核糖開關(guān)。還公開了失活的核糖開關(guān)。核糖開關(guān)可通過共價(jià)方式(通過例如使部活。通過這種方式的核糖開關(guān)失活是由于例如防止核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合的改變，防止核糖開關(guān)與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)其狀態(tài)發(fā)生變化的改變，或防止核糖開關(guān)在與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)其表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域影響表達(dá)的改變。還公開了生物傳感器核糖開關(guān)。生物傳感器核糖開關(guān)是在其關(guān)聯(lián)觸發(fā)分子(cognatetrigger)存在的情況下產(chǎn)生可檢測信號的工程改造的核糖開關(guān)?？捎玫纳飩鞲衅骱颂情_關(guān)可由閾水平或高于閾水平的觸發(fā)分子觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計(jì)以在體內(nèi)或體外應(yīng)用。例如，可操作地連接至編碼用作信號或參與產(chǎn)生信號的蛋白的報(bào)告RNA的生物傳感器核糖開關(guān)，可通過對細(xì)胞或生物體進(jìn)行工程改造使其包含編碼所述核糖開關(guān)/報(bào)告RNA的核酸構(gòu)建體從而在體內(nèi)應(yīng)用。體外應(yīng)用生物傳感器核糖開關(guān)的一個(gè)實(shí)例是包含構(gòu)象依賴標(biāo)簽的核糖開關(guān)，所述標(biāo)簽的信號根據(jù)所述核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而變化。這種生物傳感器核糖開關(guān)優(yōu)選地使用取自或衍生自天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。生物傳感器核糖開關(guān)可用于多種情況和平臺。例如，生物傳感器核糖開關(guān)可與固體支持物如盤、片、帶和孔一起使用。還公開了可識別新觸發(fā)分子的經(jīng)修飾的或衍生的核糖開關(guān)。識別新觸發(fā)分子的新核糖開關(guān)和/或新適體可通過篩選得到、設(shè)計(jì)得到或從已知核糖開關(guān)衍生得到。這可通過例如以下的步驟實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生一系列核糖開關(guān)的適體變種，在目的化合物存在下評估所述變種核糖開關(guān)的激活情況，選擇被激活的變種核糖開關(guān)(或者，例如被最大程度地或最具有選擇性地激活的核糖開關(guān))和重復(fù)這些步驟直到產(chǎn)生具有所需活性、特異性、活性和特異性的組合或其他性質(zhì)的組合的變種核糖開關(guān)。通常，通過設(shè)計(jì)或改變表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域中的被調(diào)控鏈?zhǔn)蛊渑c適體結(jié)構(gòu)域的控制鏈互補(bǔ)，可使任何適體結(jié)構(gòu)域適合與任何表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域一起使用?；蛘撸筛淖兯鲞m體的序列和適體結(jié)構(gòu)域的控制鏈，從而使所述控制鏈與表達(dá)平臺中的具有重要功能的序列互補(bǔ)。公開了包含異源核糖開關(guān)和編碼區(qū)的RNA分子。即，這種RNA分子由來自一個(gè)來源的核糖開關(guān)和來自另一個(gè)來源的編碼區(qū)構(gòu)成。所述異源的源可來自例如，不同RNA分子、不同轉(zhuǎn)錄物、來自不同基因的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來自不同細(xì)胞的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來自不同生物體的RNA或轉(zhuǎn)錄物、來自不同物種的RNA或轉(zhuǎn)錄物、天然序列;s^工或工程改造的序列、特定的核糖開關(guān)、不同類型的核糖開關(guān)或者不同類別的核糖開關(guān)。本文公開的術(shù)語"編碼區(qū)"是指編碼氨基酸的核酸的任何區(qū)域。這可以包括包含密碼子或密碼子模板的核酸鏈，以及這種核酸鏈在雙鏈的核酸分子情況下的互補(bǔ)序列。不是編碼區(qū)的核酸區(qū)域可被稱作非編碼區(qū)。轉(zhuǎn)錄的信使RNA分子一般在5'端和3'端都包括非編碼區(qū)。真核mRNA分子還可以包括內(nèi)部非編碼區(qū)，例如內(nèi)含子。一些類型的RNA分子可不包括功能性編碼區(qū)，例如tRNA和rRNA分子。1.適體結(jié)構(gòu)域適體是可與特定化合物和特定類別的化合物選擇性結(jié)合的核酸區(qū)段和結(jié)構(gòu)。核糖開關(guān)具有在與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)可導(dǎo)致該核糖開關(guān)的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的適體結(jié)構(gòu)域。在功能性核糖開關(guān)中，當(dāng)觸發(fā)分子與適體結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，連接至所述適體結(jié)構(gòu)域的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變。核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域可從任何來源獲得，包括例如核糖開關(guān)的天然適體結(jié)構(gòu)域，人工適體，經(jīng)工程改造、選擇、演化或衍生得到的適體或適體結(jié)構(gòu)域。核糖開關(guān)中的適體的至少一部分通?？膳c相連的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域的一部分例如通過形成莖結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用。與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)可形成或破壞這種莖結(jié)構(gòu)。多種天然核糖開關(guān)的共有適體結(jié)構(gòu)域顯示于美國申請公開文本No.2005-0053951的圖11和本文他處。這些適體結(jié)構(gòu)域(包括其中包含的所有直接變種)可用于核糖開關(guān)。共有序列和結(jié)構(gòu)可明示序列和結(jié)構(gòu)中的變異情況。明示的變異范圍內(nèi)的適體結(jié)構(gòu)域在本文中稱為直接變種。這些適體結(jié)構(gòu)域可被修改以產(chǎn)生被修改的適體結(jié)構(gòu)域或變種適體結(jié)構(gòu)域。保守性改變。中度修改包括莖或環(huán)(其長度或長度范圍被明示)的長度改變小于或等于明示長度范圍的20%。在共有結(jié)構(gòu)顯示出特定長度的莖或環(huán)，或列出或示出長度范圍的情況下，環(huán)和莖被認(rèn)為是"明示的"。中度修改包括莖或環(huán)(其長度或長度范圍未,皮明示)的長度改變小于或等于明示長度范圍的40%。中度修改還包括適體結(jié)構(gòu)域未明示部分的功能性變種。公開的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域也可作為適體用于任何其他目的和任何其他環(huán)境。例如，在結(jié)構(gòu)變化會影響RNA的功能的情況下，適體可被用于控制核酶、其他分子開關(guān)和任何RNA分子。2.表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是核糖開關(guān)的一部分，其影響含有所述核糖開關(guān)的RNA分子的表達(dá)。表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域通常有至少一部分可與相連的適體結(jié)構(gòu)域的一部分相互作用，如通過形成莖結(jié)構(gòu)。與觸發(fā)分子結(jié)合時(shí)可形成或破壞這種莖結(jié)構(gòu)。通常情況下，所述莖結(jié)構(gòu)要么就是表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)，要么防止形成表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)。表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)是可允許、阻止、加強(qiáng)或抑制含有該結(jié)構(gòu)的RNA分子的表達(dá)的結(jié)構(gòu)。實(shí)例包括SD(Shine-Dalgarno)序列、起始密碼子、轉(zhuǎn)錄終止子，以及穩(wěn)定信號和加工信號，例如RNA剪接點(diǎn)和控制元件或多聚腺苷酸化信號和3'終止信號。對于剪接的調(diào)節(jié)，在表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域中將包括剪接點(diǎn)、可變剪接點(diǎn)和/或內(nèi)含子的分支位點(diǎn)包括在內(nèi)是有用的。這種平臺表達(dá)結(jié)構(gòu)域與核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域中的序列的相互作用可由所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域和所述適體結(jié)構(gòu)域之間的互補(bǔ)序列介導(dǎo)。B.調(diào)控構(gòu)建體如本文其他部分所述，核糖開關(guān)可用于調(diào)控或影響RNA分子的表達(dá)。所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可被可操作地連接以允許、調(diào)節(jié)或幫助這種調(diào)節(jié)和控制。將特定部分序列和結(jié)構(gòu)置于所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域序列之中、附近或與其結(jié)合是有用的。例如，公開的TPP核糖開關(guān)可在RNA的3，UTR中并與內(nèi)含子所述3，UTR的一個(gè)內(nèi)含子相連。這些結(jié)合序列可稱為核糖開關(guān)調(diào)控的構(gòu)建體或調(diào)控構(gòu)建體。在本文中，所述調(diào)控構(gòu)建體可包括所述核糖開關(guān)(包括適體結(jié)構(gòu)域和表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域)、所述調(diào)控內(nèi)含子(其可包括表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域和部分所述適體結(jié)構(gòu)域)和其他外源3'UTR序列。所述外源3，UTR序列任選地包括來自所述核糖開關(guān)的序列。這可倚賴于例如所述核糖開關(guān)和調(diào)控構(gòu)建體的設(shè)計(jì)、對所述內(nèi)含子是否發(fā)生剪接或如何影響RNA加工。為方便，所述選項(xiàng)之一——"所述RNA的活'性和/或主要形式中的3，UTR序列，可稱為活性3，UTR序列。作為一個(gè)實(shí)例，所述rH/CII型RNA的3，UTR序列是這些RNA的活性3，UTR序列。由于所公開的核糖開關(guān)和構(gòu)建體可調(diào)控和影響RNA加工，因此所述調(diào)控構(gòu)建體也可包括并非是所述核糖開關(guān)、所述內(nèi)含子或所述活性3，UTR序列的一部分的其他序列。例如，所公開的rH/CRNA包括活性3，UTR序列的3'末端序列和所述核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域之間的序列(見圖8)。這些序列可稱為間隔3，UTR序列。所公開的構(gòu)建體和RNA可包含核糖開關(guān)、內(nèi)含子、活性3，UTR序列和間隔3，UTR序列。如上面和本文其他部分所述，這些元件和序列的某些可部分重疊。這些構(gòu)建體的實(shí)例在實(shí)施例1中描述并示于圖8。圖8顯示這些調(diào)控構(gòu)建的天然形式的實(shí)例。使用同一天然調(diào)控構(gòu)建體的核糖開關(guān)、內(nèi)含子、活性3，UTR序列和間隔3，UTR序列是有用的。因此，例如，天然基因中從終止密碼子到所述核糖開關(guān)的3，末端的整個(gè)區(qū)域可一起用于與異源編碼序列可操作地連接的調(diào)控構(gòu)建體中。實(shí)施例l描述了這些構(gòu)建體的實(shí)例。或者，來自不同調(diào)控構(gòu)建體的不同序列可被替代，或者不同或衍生的核糖開關(guān)或適體結(jié)構(gòu)域可與其他內(nèi)含子、活性3，UTR序列和/或間隔3，UTR序列結(jié)合。例如，共有或衍生的適體結(jié)構(gòu)域可用于調(diào)控構(gòu)建體。C.觸發(fā)分子觸發(fā)分子是可激活核糖開關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子和其他可激活核糖開關(guān)的化合物。天然或正常觸發(fā)分子是給定的天然核糖開關(guān)本來就有的觸發(fā)分子，或者對于某些非天然核糖開關(guān)而言是這樣的觸發(fā)分子該核糖開關(guān)針對該觸發(fā)分子被設(shè)計(jì)或該核糖開D.化合物還公開了可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物和含有這些化合物的組合物。核糖開關(guān)通過結(jié)合或去除觸發(fā)分子來起到控制基因表達(dá)的作用。化合物可用于激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)。核糖開關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他激活化合物)可用于激活核糖開關(guān)。觸發(fā)分子以外的化合物通?？捎糜跍缁罨蜃钄嗪颂情_關(guān)。核糖開關(guān)也可通過例如從所述核糖開關(guān)所在處除去觸發(fā)分子而失活。核糖開關(guān)可通過例如與不激活該核糖開關(guān)的觸發(fā)分子類似物結(jié)合而被阻斷。還公開了(例如通過改變所述RNA的剪切或加工)改變RNA分子或編碼RNA分子的基因的表達(dá)的化合物，其中所述RNA分子包含核糖開關(guān)。這可通過使化合物與所述RNA分子接觸來實(shí)現(xiàn)。核糖開關(guān)通過結(jié)合或去除觸發(fā)分子來起到控制基因表達(dá)的作用。因此，將包含核糖開關(guān)的目的RNA分子置于激活、滅活或阻斷所述核糖開關(guān)的條件下，可(例如通過改變所述RNA的剪切或加工)改變所述RNA的表達(dá)。表達(dá)可因例如轉(zhuǎn)錄被終止或核糖體與所述RNA的結(jié)合受到阻斷而改變。與觸發(fā)分子的結(jié)合可減少或阻止所述RNA分子的表達(dá)，或者可促進(jìn)或增加所述RNA分子的表達(dá)，這取決于核糖開關(guān)的性質(zhì)。還公開了用于調(diào)節(jié)RNA分子或編碼RNA分子的基因的表達(dá)的化合物。還公開了通過激活、滅活或阻斷合物。如果所述基因?qū)兴募?xì)胞或生物體的存活是必需的，那么激活、滅活或阻斷所述核糖開關(guān)可導(dǎo)致所述細(xì)胞或生物體的死亡、瘀滯或虛弱。還公開了通過激活、失活或阻斷核糖開關(guān)來調(diào)節(jié)經(jīng)分離、工程改造或重組得到的含有所述核糖開關(guān)的基因或RNA的表達(dá)的化合物。由于本文公開的核糖開關(guān)可控制可變剪接，所以激活、滅活或阻斷所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。核糖開關(guān)作為對這種調(diào)節(jié)的一級控制的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是核糖開關(guān)觸發(fā)分子可以是非抗原小分子。還公開了識別可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的方法。例如，述核糖開關(guān)的激活情況來識別。如果所述核糖開關(guān)被激活，那么所述測試化合物就被識別為可激活所述核糖開關(guān)的化合物。可用任何合適的方式評估核糖開關(guān)的激活情況。例如，核糖開關(guān)可被連接至一個(gè)報(bào)告RNA，然后在存在和不存在所述測試化合物的情況下測量所述報(bào)告RNA的表達(dá)、表達(dá)水平或表達(dá)水平的變化。作為另一個(gè)實(shí)例，所述核糖開關(guān)可包括一個(gè)構(gòu)象依賴標(biāo)簽，其信號根據(jù)所述核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而改變。這種核糖開關(guān)優(yōu)選地使用取自或衍生自天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域?？梢钥闯?，對核糖開關(guān)的激活情況進(jìn)^f亍評估^^用或不^^用對照測定或測量均可。識別滅活核糖開關(guān)的化合物的方法可按類似方式進(jìn)行。對阻斷核糖開關(guān)的化合物的識別可通過任何合適的方法來完成。例如，可在已知可激活或滅估所述核糖開關(guān)的激活或失活的測定。如果未觀察到在所述測試化合物不存在的情況下可觀察到的激活或失活，那么所述測試化合物被識別為阻斷所述核糖開關(guān)被激活或滅活的化合物。還公開了通過識別可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物和并所識別出的化合物而制得的化合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物識別方法與生產(chǎn)所識別出的化合物的方法結(jié)合使用而實(shí)現(xiàn)。例如，可通過下述方法制備化合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)被待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)的待測化合物作為所述化合物。還公開了通過檢測某種化合物對核糖開關(guān)的激活、滅活或阻斷作用并生產(chǎn)該經(jīng)檢測的化合物而制得的化合物。這可以通過例如將本文其他部分公開的化合物激活、滅活或阻斷評估方法與生產(chǎn)經(jīng)檢測的化合物的方法結(jié)合使用而實(shí)現(xiàn)。例如，可通過下述方法制^f匕合物使待測化合物和核糖開關(guān)相接觸，評估核糖開關(guān)的激活，以及如果核糖開關(guān)被待測化合物激活，則制備該激活核糖開關(guān)待測化合物作為所述化合物。檢測化合物激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的能力指的是對以前并不知道可否激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的鑒定，以及對已知可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物的激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的能力的評估。還公開了用于激活核糖開關(guān)的具體化合物。可用于TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)的化合物包括具有下式的化合物該化合物可結(jié)合TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)或其衍生物，其中R，帶正電，其中R2和R3每一個(gè)均獨(dú)立地為C、O或S，其中R4為CH3、NH2、OH、SH、H或不存在，其中Rs為CH3、NH2、OH、SH或H，其中&為C或N,并且其中每個(gè)"=，，獨(dú)立地代表單鍵或雙鍵。還考慮了在按上述定義的化合物中其中Ri為磷酸根、二磷酸根或三磷酸根的情況。在上述定義范圍內(nèi)的每一種化合物都意圖在并應(yīng)被認(rèn)為是在本文中具體地公開。此外，在上述定義范圍內(nèi)可識別的每個(gè)亞群都意圖在并應(yīng)被認(rèn)為是在本文中具體地公開。因此，特別考慮了任何化合物或化合物的亞群可具體包括在用途中或從用途中排除，或者包括在化合物列表中或從化合物列表中排除。例如，作為一種選擇，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義但并不是TPP、TP或硫胺素，那么該組也是^皮考慮到的。作為另一個(gè)實(shí)例，如果有某一組化合物，其中每種化合物都符合上述定義而且能激活TPP應(yīng)答性核糖開關(guān)，那么該組也是被考慮到的。硫胺素焦磷酸(TPP)是TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)的觸發(fā)分子，可激活TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。吡夂硫胺素焦磷酸可激活TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。吡啶硫胺素和吡咬硫胺素焦磷酸可獨(dú)立地及具體地包括在本文公開的化合物、觸發(fā)分子和方法中，或者從本文公開的化合物、觸發(fā)分子和方法排除。硫胺素和硫胺素焦磷酸可獨(dú)立地及具體地包括在本文公開的化合物、觸發(fā)分子和方法中，或者從本文公開的化合物、觸發(fā)分子和方法排除。E.構(gòu)建體、載體和表達(dá)系統(tǒng)所公開的核糖開關(guān)可在任何合適的表達(dá)系統(tǒng)中使用。重組表達(dá)可以使用例如質(zhì)粒等載體來有效實(shí)現(xiàn)。載體可包括與核糖開關(guān)編碼序列可操作地連接的啟動子和待表達(dá)的RNA(例如，編碼蛋白的RNA)。載體還可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的其他元件。本文所述的載體指的是包含外源DNA的任何栽體。因此，載體是可將外源核酸不降解地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中的媒介，它包括啟動子，可在它轉(zhuǎn)入的細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。栽體包括但不限于質(zhì)粒、病毒核酸、病毒、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體。可以生產(chǎn)多種適于攜帶核糖開關(guān)調(diào)節(jié)的構(gòu)建體的原核和真核的表達(dá)載體。這類表達(dá)栽體包括例如pET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC和酵母載體。載體可在例如各種體內(nèi)和體外環(huán)境中使用。病毒載體包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營養(yǎng)病毒(neuronaltrophicvirus)、辛德畢斯病毒(Sindbis)和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還可使用與上述病毒具有共同的使其適于用作載體的性質(zhì)的任何病毒家族。由Verma(1985)描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括鼠類馬羅尼白血病病毒MMLV和表現(xiàn)MMLV作為載體所需性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常，病毒栽體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶EI轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動子。當(dāng)被基因工程改造用作載體時(shí)，通常要移除病毒的一個(gè)或多個(gè)早期基因，并將一個(gè)基因或基因/啟動子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA。"啟動子"通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對固定的位置發(fā)揮功能的一個(gè)或多個(gè)DNA序列。"啟動子，，包括與RNA聚合酶發(fā)生基本相互作用所需的核心元件和轉(zhuǎn)錄因子，還可包括上游元件和應(yīng)答元件。"增強(qiáng)子"通常指的是為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對不固定的位置發(fā)揮功能的DNA序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins，1981)或3，(Luskyetal.，1983)。此外，增強(qiáng)子除了可以在編碼序列本身之中(Osborneetal.，1984)，也可以在內(nèi)含子中(Banerjieta1.，1983)。它們的長度通常為10bp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子的功能是增加鄰近的啟動子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子與啟動子類似，也經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子經(jīng)常對表達(dá)的調(diào)節(jié)有決定性作用。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體還可包括可以影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3，非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位也包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像mRNA—樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。多腺苷酸化信號在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺苷酸化信號。載體可包括編碼標(biāo)記物產(chǎn)物的核酸序列。使用這種標(biāo)記物產(chǎn)物來確定基因是否被送遞至細(xì)胞以及在送遞后是否被表達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記物基因?yàn)榫幋ap-半乳糖普酶的大腸桿菌lacZ基因和綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物可為篩選標(biāo)記物。當(dāng)這類篩選標(biāo)記物被成功地轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中時(shí)，如果將宿主細(xì)胞置于篩選壓力下，則被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以存活。目前廣泛使用的有兩類不同的篩選策略。第一類A^于細(xì)胞代謝，使用離開添加培養(yǎng)基就不能生長的突變細(xì)胞系。第二類為顯性篩選，它指的是在任何細(xì)胞類型中都可使用而不必使用突變細(xì)胞系的篩選方案。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長的藥物。含有新基因的那些細(xì)胞可以表達(dá)使細(xì)胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可以在篩選中存活。這類顯性篩選的實(shí)例中使用的藥物有新霉素(SouthernandBerg，1982)、霉酚酸(MulliganandBerg，1980)或潮霉素(Sugdenetal"1985)。可以使用遺傳物質(zhì)的直接轉(zhuǎn)移來獲得基因轉(zhuǎn)移，所述遺傳物質(zhì)包括在質(zhì)粒、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、粘粒和人工染色體中，但不限于此，或者通過細(xì)胞或載體例如陽離子脂質(zhì)體中的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移來獲得基因轉(zhuǎn)移。這類方法為本領(lǐng)域所熟知，并且可以很容易的使之適用于本文所述的方法。轉(zhuǎn)移載體可為任何可將基因送遞至細(xì)胞內(nèi)的核苷酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)，或者作為送遞基因的總體策略的一部分，例如作為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或重組腺病毒的一部分(Rametal.CancerRes.53:83-88，(1993))。用于轉(zhuǎn)染的合適手段包括病毒栽體、化學(xué)轉(zhuǎn)染子或物理-機(jī)械方法例如電穿孔和DNA的直接擴(kuò)散，這些手段描述于例如，Wolff,J.A.，etal.，Science,247，1465-1468，(1990);和Wolff，J.A.Nature,352，815-818，(1991)。1.病毒栽體優(yōu)選的病毒載體為腺病毒、腺伴隨病毒、皰滲病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)營養(yǎng)病毒、辛德畢斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的那些病毒。還優(yōu)選的是與上述病毒具有共同的使其適于用作載體的性質(zhì)的任何病毒家族。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠類馬羅尼白血病病毒MMLV和表現(xiàn)MMLV作為載體所需性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以比其他載體病毒攜帶更大的基因載量，即攜帶轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記物基因，因此是常用的載體。但是它們不能用于非增殖細(xì)胞。腺病毒載體相對穩(wěn)定并易于操作、具有高滴度、可在氣溶膠制劑中送遞并可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞。Pox病毒載體較大并具有多個(gè)可插入基因的位點(diǎn)，它們對熱穩(wěn)定，可在室溫下儲存。優(yōu)選的實(shí)施方案為經(jīng)過基因工程改造的病毒載體，這樣可以抑制宿主生物由病毒抗原引起的免疫反應(yīng)。優(yōu)選的這種類型的栽體應(yīng)攜帶白細(xì)胞介素8或10的編碼區(qū)域。病毒栽體與大多數(shù)將基因?qū)爰?xì)胞的化學(xué)或物理方法相比，具有更高的處理能力(導(dǎo)入基因的能力)。通常，病毒栽體包括非結(jié)構(gòu)性早期基因、結(jié)構(gòu)性晚期基因、RNA聚合酶m轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和殼體化必需的反向末端重復(fù)序列以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動子。當(dāng)被基因工程改造用作載體時(shí)，通常要移除病毒的一個(gè)或多個(gè)早期基因，并將一個(gè)基因或基因/啟動子盒插入到病毒基因組中代替被移除的病毒DNA。這種類型的構(gòu)建體可以攜帶最多達(dá)約8kb的外源遺傳物質(zhì)。被移除的早期基因的必需功能通常由經(jīng)過基因工程改造而反式表達(dá)早期基因的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系提供。i.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體38逆轉(zhuǎn)錄病毒為屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的動物病毒，包括任何類型、亞科、屬或向性。Verma，I.M.，Retroviralvectorsforgenetransfer.InMicrobiology-1985，AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232，Washington,(1985)總體描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體，上述文獻(xiàn)以援引的方式納入本文。將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因療法的方法的實(shí)例描述于美國專利No.4,868,116和4,980,286;PCT申請WO90/02806和WO89/07136;以及Mulligan,(Science260:926-932(1993))等文獻(xiàn)中，以上文獻(xiàn)中的教導(dǎo)以援引的方式納入本文。逆轉(zhuǎn)錄病毒本質(zhì)上是一個(gè)包裝，它將核酸負(fù)栽包裹在內(nèi)。核酸負(fù)載攜帶有包裝信號，這使得復(fù)制出的子代分子可以被有效地包裝在包衣中。除了包裝信號以外，還有許多復(fù)制和復(fù)制病毒的包裝所需要的順式作用分子。通常逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括參與蛋白質(zhì)衣殼形成的gag、pol和env基因。通常使用待轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞的外源DNA來替代gag、pol和env基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常包括用于摻入至包衣的包裝信號，起動gag轉(zhuǎn)錄單位的信號序列，逆轉(zhuǎn)錄必需的元件(包括引物結(jié)合位點(diǎn)以結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄的tRNA引物)，在DNA合成過程中引導(dǎo)RNA鏈轉(zhuǎn)換的末端重復(fù)序列，作為DNA合成中第二鏈合成起始位點(diǎn)的富含嘌呤的序列5，至3，LTR，以及可使DNA狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)錄病毒插入到宿主基因組中的LTR末端附近的特異性序列。gag、pol和env基因的移除可以使得約8kb的外源序列被插入到病毒基因組中、,iL^轉(zhuǎn)錄以及在復(fù)制后被包裝到新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。根據(jù)每種轉(zhuǎn)錄物的大小，上述核酸量足夠送遞一至多個(gè)基因。優(yōu)選地，在插入物中與其他基因一起含有陽性或陰性的篩選標(biāo)記物。由于在大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，復(fù)制機(jī)制和包裝蛋白(gag、pol和env)已經(jīng)被移除，通常通過將載體置于包裝細(xì)胞系中來生產(chǎn)載體。包裝細(xì)胞系為已被含有復(fù)制和包裝機(jī)制但不含任何包裝信號的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。當(dāng)攜帶所選DNA的栽體被轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞系中時(shí)，包含目的基因的栽體通過輔助細(xì)胞提供的順式機(jī)制而被復(fù)制并包裝到新的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。而具有該機(jī)制的基因組因?yàn)闆]有必需的信號而不被包裝。ii.腺病毒載體對于復(fù)制缺陷型腺病毒的構(gòu)建，前人已有所描述(Berkneretal.，J.Virology61:1213-1220(1987);Massieetal"mol.Cell.Biol.6:2872-2883(1986);Haj-Ahmadetal"J.Virology57:267-274(1986);Davidsonetal"J.Virology61:1226-1239(1987);Zhang"Generationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposome-mediatedtransfectionandPCRanalysis"BioTechniques15:868-872(1993))。使用這些病毒作為載體的優(yōu)點(diǎn)是它們散播至其他細(xì)胞類型的程度是有限的，因?yàn)樗鼈兛梢栽诔跏几腥镜募?xì)胞中復(fù)制，但是它們不能形成新的感染性病毒顆粒。重組腺病毒在直接體內(nèi)送遞至下列組織時(shí)已表現(xiàn)出可獲得很高的基因轉(zhuǎn)移效率氣道上皮、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮、CNS實(shí)質(zhì)以及多種其他組織位點(diǎn)(Morsy，J.Clin.Invest.92:1580-1586(1993);Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92:381-387(1993);Roessler，J.Clin.Invest.92:1085-1092(1993);Moullier，NatureGenetics4:154-159(1993);LaSalle,Science259:988-990(1993);Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129-25134(1992);Rich,HumanGeneTherapy4:461-476(1993);Zabner，NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch73:1201-1207(1993);Bout,HumanGeneTherapy5:3-10(1994);Zabner，Cell75:207-216(1993);Caillaud，Eur.J.Neuroscience5:1287-1291(1993);和Ragot，J.Gen.Virology74:501-507(1993))。重組腺病毒與野生型或復(fù)制缺陷型腺病毒一樣，通過結(jié)合特異性細(xì)胞表面受體而完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用而內(nèi)化(ChardonnetandDales,Virology40:462-477(1970);BrownandBurlingham，J.Virology12:386-396(1973);SvenssonandPersson,J.Virology55:442-449(1985);Seth,etal"J.Virol.51:650-655(1984);Seth，etal"mol.Cell.Biol.4:1528-1533(1984);Vargaetal"J.Virology65:6061-6070(1991);Wickhametal"Cell73:309-319(1993))。一種優(yōu)選的病毒栽體為基于移除了El基因的腺病毒的載體，這些病毒在例如人類293細(xì)胞的細(xì)胞系中產(chǎn)生。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，El和E3基因都被從腺病毒基因組中移除。另一類病毒載體是基于腺伴隨病毒(AAV)。這種缺陷型細(xì)小病毒是一種優(yōu)選的載體，因?yàn)樗梢愿腥驹S多種細(xì)胞類型，并且對人類沒有致病性。AAV型栽體可以轉(zhuǎn)運(yùn)4至5kb的基因，并且已知野生型AAV可以穩(wěn)定地插入到第19號染色體上。具有這種位點(diǎn)特異性整合性質(zhì)的載體為優(yōu)選的。這種載體的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案是由Avigen，SanFrancisco,CA生產(chǎn)的P4.1C載體，它可包含單純皰瘆病毒胸苷激酶基因、HSV-tk和/或標(biāo)記物基因，例如編碼綠色熒光蛋白GFP的基因。在病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中插入的基因經(jīng)常含有啟動子和/或增強(qiáng)子以輔助對所需基因產(chǎn)物的表達(dá)的控制。啟動子通常為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對固定的位置時(shí)可以發(fā)揮功能的一個(gè)或多個(gè)DNA序列。"啟動子"包含與RNA聚合酶發(fā)生基本相互作用所需的核心元件和轉(zhuǎn)錄因子，還可包含上游元件和應(yīng)答元件。2.病毒啟動子和增強(qiáng)子得，例如，諸如下列病毒的基因組多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選巨細(xì)胞病毒；或者來源于異源哺乳動物啟動子例如p肌動蛋白啟動子。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以方便地以同樣包括SV40病毒復(fù)制起始位點(diǎn)的SV40限制性片段的形式獲得(Fiersetal.，Nature,273:113(1978))。人類巨細(xì)胞病毒的即時(shí)早期啟動子可以方便地以HindmE限制性片段的形式獲得(Greenway，PJ.etal.，Gene18:355-360(1982))。當(dāng)然，來自宿主細(xì)胞或相關(guān)物種的啟動子也在此有用。"增強(qiáng)子"通常指的是為位于與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相對不固定的位置發(fā)揮功能的DNA序列，它可以在轉(zhuǎn)錄單位的5，(Laimins，L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3，(Lusky，M丄.，etal"Mol.Cellbio.3:1108(1983))。此外，增強(qiáng)子除了可以在編碼序列本身之中(Osborne，T.R，etal.，mol.Cellbio.4:1293(1984))，也可以在內(nèi)含子中(Banerji,J.L.etal"Cell33:729(1983))。它們的長度通常為10bp至300bp之間，并且以順式方式發(fā)揮作用。增強(qiáng)子的功能是增加鄰近的啟動子的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子還經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子還經(jīng)常含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強(qiáng)子經(jīng)常對表達(dá)的調(diào)節(jié)有決定性作用。雖然許多來自哺乳動物基因的增強(qiáng)子的序列是已知的(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)，但是通常還是使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。優(yōu)選的實(shí)例為在復(fù)制起點(diǎn)下游(lateside)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點(diǎn)下游的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。啟動子和/或增強(qiáng)子可以被能觸發(fā)它們功能的光或特異性化學(xué)事件特異性地激活?？梢杂美缢沫h(huán)素和地塞米;^等試劑來調(diào)節(jié)系統(tǒng)。也有一些方法通ii暴露于例如y輻照的輻照方法或烷基化化療藥物來增強(qiáng)病毒載體的基因表達(dá)。優(yōu)選地，啟動子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有真核細(xì)胞類型中都是有活性的。這種類型的一種優(yōu)選的啟動子為CMV啟動子(650個(gè)堿基)。其他優(yōu)選的啟動子為SV40啟動子、巨細(xì)胞病毒(全長啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTF。已顯示所有的特異性調(diào)節(jié)元件都可被克隆和用于構(gòu)建在特定細(xì)胞類型例如黑素瘤細(xì)胞中選擇性表達(dá)的表達(dá)載體。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子已被用于在神經(jīng)膠質(zhì)來源的細(xì)胞中選擇性表達(dá)基因。用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體還可包含可以影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域在編碼組織因子蛋白的mRNA的非翻譯部分中以多腺苷酸化區(qū)段的形式被轉(zhuǎn)錄。3，非翻譯區(qū)還包括轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位也包括多腺苷酸化區(qū)域。這一區(qū)域的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它增加了被轉(zhuǎn)錄的單位像mRNA—樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。多腺苷酸化信號在表達(dá)構(gòu)建體中的鑒定和用途已經(jīng)廣為人知。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中使用同源的多腺苷酸化信號。在轉(zhuǎn)錄單位的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多腺苦酸化區(qū)域來自SV40早期多腺苷酸化信號，由大約400個(gè)堿基組成。還優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄單位單獨(dú)包括其他標(biāo)準(zhǔn)序列或包括其他標(biāo)準(zhǔn)序列和上述序列，改進(jìn)構(gòu)建體的表達(dá)或穩(wěn)定性。3.標(biāo)記物栽體可包括編碼標(biāo)記物產(chǎn)物的核酸序列J吏用這種標(biāo)記物產(chǎn)物來確定基因是否被送遞至細(xì)胞以及在送遞后是否M達(dá)。優(yōu)選的標(biāo)記物基因?yàn)榫幋aP-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因和綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物可為篩選標(biāo)記物。用于哺乳動物細(xì)胞的篩選標(biāo)記物的實(shí)例為二氳葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素和噤呤霉素。當(dāng)這類篩選標(biāo)記物被成功地轉(zhuǎn)移至哺乳動物宿主細(xì)胞中時(shí)，如果將宿主細(xì)胞置于篩選壓力下，則被轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞可以存活。目前廣泛使用的有兩類不同的篩選策略。第一類是基于細(xì)胞代謝，使用離開添加培養(yǎng)基就不能生長的突變細(xì)胞系。兩個(gè)實(shí)例為CHODHFR-細(xì)胞和小鼠LTK-細(xì)胞。這些細(xì)胞在不添加如胸苷或次黃嘌呤營養(yǎng)物的情況下就不能生長。由于這些細(xì)胞缺乏完整的核苷酸合成途徑中必需的某些基因，因此除非在添加培養(yǎng)基中提供那種沒有的核苷酸，否則細(xì)胞就不能存活。另一種補(bǔ)充培養(yǎng)基的方式是將完整的DHFR或TK基因?qū)肴狈ο鄳?yīng)基因的細(xì)胞中，由此改變它們的生長需求。未被DHFR或TK基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將不能在非添加培養(yǎng)基上生長。第二類為顯性篩選，它指的是在任何細(xì)胞類型中都可使用而不必使用突變細(xì)胞系的篩選方案。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長的藥物。那些細(xì)胞可以表達(dá)使細(xì)胞具有藥物抗性的蛋白質(zhì)，從而可以在篩選中存活。這類顯性篩選的實(shí)例中使用的藥物有新霉素(SouthernP.andBerg,P.，J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan，R.C.andBerg，P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.etal"mol.Cell.Biol.5:410-413(1985))。這三個(gè)實(shí)例使用了真核控制下的細(xì)菌基因來分別賦予細(xì)胞對于合適的藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他的還有新霉素類似物G418和噤呤霉素。F.生物傳感器核糖開關(guān)還公開了生物傳感器核糖開關(guān)。生物傳感器核糖開關(guān)是經(jīng)過基因工程改造的核糖開關(guān)，它們在存在它們的同種觸發(fā)分子時(shí)產(chǎn)生可檢出的信號?？捎玫纳飩鞲衅骱颂情_關(guān)可以在觸發(fā)分子達(dá)到或超過閾值水平時(shí)被觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計(jì)為體內(nèi)應(yīng)用或體外應(yīng)用。例如，與編碼作為信號的蛋白質(zhì)或參與產(chǎn)生信號的蛋白質(zhì)的報(bào)告RNA可操作地連接的控制可變剪接的核糖開關(guān)可通過基因工程改造細(xì)胞或生物，使其含有編碼該核糖開關(guān)的核酸構(gòu)建體從而在體內(nèi)應(yīng)用。用于體外的生物傳感器核糖開關(guān)的一個(gè)實(shí)例是包括構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的核糖開關(guān)，由該標(biāo)簽產(chǎn)生的信號隨核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而變化。優(yōu)選地，這種生物傳感器核糖開關(guān)使用天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域或由天然存在的核糖開關(guān)衍生的適體結(jié)構(gòu)域。G報(bào)告蛋白和報(bào)告肽為評估核糖開關(guān)或生物傳感器核糖開關(guān)的激活，可以使用報(bào)告蛋白或報(bào)告肽。報(bào)告蛋白或報(bào)告肽可以由通過核糖開關(guān)調(diào)節(jié)其表達(dá)的RNA編碼。實(shí)施例中描述了一些特異性報(bào)告蛋白的使用。報(bào)告蛋白和報(bào)告肽的使用已為人所熟知，并可以容易地適于與核糖開關(guān)一起使用。報(bào)告蛋白可為任意可檢出的或產(chǎn)生可檢出信號的蛋白質(zhì)或肽。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)或肽的存在可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如放射免疫測定、放射性標(biāo)記、免疫測定、酶活性測定、吸附、熒光、發(fā)光和蛋白質(zhì)印跡)檢測。更優(yōu)選地，即使在報(bào)告蛋白的水平比較低的情況下，仍然可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對其水平定量?？捎玫膱?bào)告蛋白包括螢光素酶、綠色熒光蛋白以及它們的衍生物，例如北美螢火蟲(Photinuspyralis)的螢火蟲螢光素酶(FL)和海參(Renillareniformis)的海參螢光素酶(RL)。H.構(gòu)象依賴性標(biāo)簽構(gòu)象依賴性標(biāo)簽指的是具有下述性質(zhì)的所有標(biāo)簽:在標(biāo)簽所連接的分子或化合物(例如核糖開關(guān))的形式或構(gòu)象發(fā)生改變的基礎(chǔ)上，該標(biāo)簽可以產(chǎn)生熒光強(qiáng)度或波長的變化。在使用探針和引物的情況下，使用的構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的實(shí)例包括分子信標(biāo)(molecularbeacon)、Amplifluors、FRET探針、可切割的FRET探針、TaqMan探針、蝎形引物(scorpionprimer)、焚光三聚體寡聚物(fluorescenttriplexoligos)包括但不限于三聚體分子信標(biāo)或三聚體FRET探針、熒光水溶性綴合聚合物、PNA探針和QPNA探針。這類標(biāo)"g——具體而言它們的功能原理——可適于與核糖開關(guān)一起使用。一些類型的構(gòu)象依賴性標(biāo)簽綜述于SchweitzerandKingsmore,Curr.Opin.Biotech.12:21-27(2001)中。莖淬滅標(biāo)簽是構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的一種形式，它是位于核酸上的熒光標(biāo)簽，這樣當(dāng)莖結(jié)構(gòu)形成時(shí)淬滅部分會接近熒光標(biāo)簽以使得標(biāo)簽發(fā)出的熒光被淬滅。當(dāng)莖結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)(例如當(dāng)含有標(biāo)簽的核糖開關(guān)被激活時(shí))，淬滅部分就不再接近熒光標(biāo)簽，熒光就會增強(qiáng)。這種效應(yīng)的實(shí)例可見于分子信標(biāo)、熒光三聚體寡聚物、三聚體分子信標(biāo)、三聚體FRET探針和QPNA探針中，它們的操作原理也可適于與核糖開關(guān)一起使用。莖激活標(biāo)簽是構(gòu)象依賴性標(biāo)簽的一種形式，它是通過莖結(jié)構(gòu)的形成可以增強(qiáng)或改變熒光的標(biāo)簽或標(biāo)簽對。莖激活標(biāo)簽可包括受體熒光標(biāo)簽和供體部分，當(dāng)受體和供體相互接近時(shí)(當(dāng)包括標(biāo)簽的核酸鏈形成莖結(jié)構(gòu)時(shí))，熒光共振能量由供體向受體的轉(zhuǎn)移會使受體發(fā)熒光。莖激活標(biāo)簽通常為位于核酸分子(例如核糖開關(guān))上的標(biāo)簽對，這樣當(dāng)核酸分子中形成莖結(jié)構(gòu)時(shí)受體和供體就會相互接近。如果莖激活標(biāo)簽的供體部分本身就是熒光標(biāo)簽，那么當(dāng)它不與受體接近時(shí)(也就是未形成莖結(jié)構(gòu)時(shí))它就會以熒光的形式釋放能量(通常這種熒光的波長與受體熒光的波長不同)。當(dāng)莖結(jié)構(gòu)形成時(shí)，總體的效果是供體熒光減少和受體熒光增加。FRET探針為使用莖激活標(biāo)簽的一個(gè)實(shí)例，它的操作原理也可適于與核糖開關(guān)一起^L用。I.檢測標(biāo)簽為幫助對核糖開關(guān)的激活、失活或阻斷進(jìn)行檢測和量化，或?qū)颂情_關(guān)的激活、失活或阻斷后產(chǎn)生的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測和量化，可以在檢測探針或者檢測分子中導(dǎo)入檢測標(biāo)簽，或者在表達(dá)的核酸或蛋白質(zhì)中直接導(dǎo)入檢測標(biāo)簽。本文中所述的檢測標(biāo)簽為可以與核酸或蛋白質(zhì)直接或間接地相連接、并由此直接或間接地產(chǎn)生可以測量的可檢測信號的任何分子。許多這種標(biāo)簽均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知?？捎糜谒_方法的合適的檢測標(biāo)簽的實(shí)例為放射性同位素、熒光分子、磷光分子、酶、抗體和配體。合適的熒光標(biāo)簽的實(shí)例包括異硫氰酸熒光素(FITC)、5,6-羧甲基熒光素、德克薩斯紅(Texasred)、硝基苯-2-氧雜-l，3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹酰氯、羅丹明、氨基曱基香豆素(AMCA)、曙紅、藻紅、BODIPY、CascadeBlue、OregonGreen、芘、麗絲胺(lissamine)、加氧雜蒽(xanthenes)、吖啶、噁溱、藻紅蛋白、鑭系金屬離子的大環(huán)螯合物例如量子染料TM、熒光能量轉(zhuǎn)移染料例如噻唑橙乙啡啶異源二聚體、以及花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其他特異性熒光標(biāo)簽的實(shí)例包括3-羥基芘5，8，10-三磺酸、5-羥色胺(5-HT)、酸性品紅、茜素*酮、茜素紅、別藻藍(lán)蛋白、M香豆素、蒽l^y旨酸、阿斯屈拉崇(Astrazon)亮紅4G、阿斯屈拉崇橙R、阿斯屈拉崇紅6B、阿斯屈拉崇黃7GLL、阿的平(Atabrine)、金胺(Anramine)、Aurophosphine、AurophosphineG、BAO9(雙氨基苯基噁二唑)、BCECF、硫酸小檗堿、雙苯酰胺、布蘭科福爾(Blancophor)FFG溶液、BlancophorSV、BodipyFl、亮磺基黃素FF(BrilliantSulphoflavinFF)、鈣黃綠素藍(lán)(CalcienBlue)、鈣綠(CalciumGreen)、卡爾科弗盧爾(Calcofluor)RW溶液、卡爾科弗盧爾白(CalcofluorWhite)、爾科弗盧爾白ABT溶液、爾科弗盧爾白標(biāo)準(zhǔn)溶液、Carbostyryl、CascadeYellow、兒茶酚胺、查納克林(Chinacrine)、科里膦O、香豆素-鬼筆環(huán)肽、CY3.18、CY5.18、CY7、Dans(l畫二曱基氨基-萘國5-磺酸)、Dansa(二^J^^t酸)、丹酰NH-CH3，二M苯基噁二唑(DAO)、二曱基氨基-5-磺酸、二吡咯亞曱基二氟化硼、聯(lián)苯亮黃素7GFF、多巴胺、藻紅ITC、吖咬橙(Euchrysin)、FIF(曱醛謙導(dǎo)熒光)、FlazoOrange、Fluo3、熒光胺、Fura-2、Genacryl亮紅B、Genacryl亮黃IOGF、Genacryl粉紅3G、Genacryl黃5GF、GloxalicAcid、粒狀藍(lán)(GranularBlue)、血吟淋(Haematoporphyrin)、Indo誦l、IntrawhiteCf液體、雷可福(Leucophor)PAF、雷可福SF、雷可福WS、麗絲胺羅丹明B200(RD200)、螢黃CH(LuciferYellowCH)、螢黃VS、蘇丹紅(MagdalaRed)、MarinaBlue、麥西隆(Maxilon)亮黃素10GFF、麥西隆亮黃素8GFF、MPS(MethylGreenPyronineStilbene，甲基綠焦寧均二苯乙烯)、光神霉素、NBD胺、硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)、去曱腎上腺素、核堅(jiān)牢紅(NuclearFastRed)、核黃(NuclearYellow)、尼龍山(Nylosan)亮黃素E8G、噁二唑、Pacific藍(lán)、堿性副品紅(Feulgen)、PhorwiteAR溶液、PhorwiteBKL、PhorwiteRev、PhorwiteRPA、膦3R、酞菁(Phthalocyanine)、藻紅蛋白R、PolyazaindacenePontochromeBlueBlack、p卜啉、Primuline、普施安黃(ProcionYellow)、焦寧(Pyronine)、焦寧B、Pyrozal亮黃素7GF、芥奎吖因(QuinacrineMustard)、羅丹明123、羅丹明5GLD、羅丹明6G、羅丹明B、羅丹明B200、羅丹明BExtra、羅丹明BB、羅丹明BG、羅丹明WT、5-羥色胺、塞夫隆(Sevron)亮紅2B、塞夫隆亮紅4G、塞夫隆亮紅B、塞夫隆橙、塞夫隆黃L、SITS(Primuline)、SITS(均二苯乙烯異硫磺酸，StilbeneIsothiosulphonicacid)、均二苯乙烯、Snarf1、磺基羅丹明BCanC、磺基羅丹明GExtra、四環(huán)素、瘞漆紅R、硫黃素S、硫黃素TCN、硫黃素5、Thiolyte、ThiozolOrange、TinopolCBS、純藍(lán)(TrueBlue)、Ultralite、熒光素鈉(Uranine)B、優(yōu)微添(Uvitex)SFC、二曱^^(XyleneOrange)和XRITC。可用的熒光標(biāo)簽為熒光素(5-氣基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、羅丹明(5，6-四曱基羅丹明)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。這些熒光染料的最大吸收和發(fā)射波長分別為FITC(490nm;520nm)、Cy3(554nm;568nm)、Cy3.5(581nm;588nm)、Cy5(652nm;672nm)、Cy5.5(682nm;703nm)、Cy7(755nm;778nm)，這l吏得它們可以同時(shí)被檢測。熒光素染料的其他實(shí)例包括6-氯基熒光素(6-FAM)、2，，4，，1，4，-四氯熒光素(TET)、2，，4，，5，，7，，1，4-六氯熒光素(HEX)、2',7，國二甲氧基-4，，5，-二氯-6-羧基羅丹明(JOE)、2，-氯-5，-氟-7，，8，-稠苯-1，4-二氯-6-絲熒光素(NED)和2，-氯-7，-苯基-l，4-二氯-6-絲熒光素(VIC)。熒光標(biāo)簽可由各種來源商購獲得，包括AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway,NJ;MolecularProbes,Eugene,OR;和ResearchOrganics,Cleveland,Ohio。所關(guān)注的其他標(biāo)簽包括那些僅當(dāng)它們所連接的探針與靶分子特異性46結(jié)合時(shí)產(chǎn)生信號的標(biāo)簽，其中這類標(biāo)簽包括Tyagi&Kramer,NatureBiotechnology(1996)14:303和EP0070685Bl中所述的"分子信標(biāo)"。所關(guān)注的其他標(biāo)簽包括美國專利No.5,563,037、國際申請WO97/17471和WO97/17076中所述的那些標(biāo)簽。被標(biāo)記的核苷酸是檢測標(biāo)簽的一種可用形式，可以在合成過程中直接導(dǎo)入被表達(dá)的核酸中?？梢灾苯訉?dǎo)入核酸中的檢測標(biāo)簽的實(shí)例包括核苷酸類似物例如BrdUrd(5-溴脫氧尿苷，HoyandScWmke，MutationResearch2卯:217-230(1993))、氨基烯丙基脫氧尿苷(Henegariuetal:，NatureBiotechnology18:345-348(2000))、5-甲基胞嘧啶(Sanoetal"Biochim.Biophys.Acta951:157-165(1988))、溴尿核苷(Wansicketal，J.CellBiology122:283-293(1993))和經(jīng)生物素修飾的核苷酸(Langeretal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:6633(1981))或經(jīng)過例如地高辛抗原(digoxygenin)的合適的半抗原修飾的核苷酸(Kerkhof，Anal.Biochem.205:359-364(1992))。合適的熒光標(biāo)記的核苷酸有異硫氰酸熒光素-dUTP、花青國3畫dUTP和花青-5-dUTP(Yuetal，NucleicAcidsRes"22:3226-3232(1994))。對于DNA而言優(yōu)選的核苦酸類似物檢測標(biāo)簽為BrdUrd(溴脫氧尿苷、BrdUrd、BrdU、BUdR,Sigma誦AldrichCo)。其他用于將檢測標(biāo)簽導(dǎo)入DNA的可用的核苷酸類似物為AA-dUTP(氨基烯丙基脫氧尿苷三磷酸，Sigma-AldrichCo.)和5-曱基-dCTP(RocheMolecularBiochemicals)。一種用于將檢測標(biāo)簽導(dǎo)入RNA的可用的核苷酸類似物為生物素-16-UTP(生物素-16-尿苷-5，-三磷酸，RocheMolecularBiochemicals)?？蓪晒馑谻y3和Cy5連接至dUTP上用于直接標(biāo)記。Cy3.5和Cy7可以以抗生物素蛋白或抗地高辛抗原綴合物的形式用于帶有生物素或地高辛抗原標(biāo)簽的探針的二級檢測。被導(dǎo)入核酸的例如生物素的檢測標(biāo)簽，隨后可以使用本領(lǐng)域公知的靈敏方法進(jìn)行檢測。例如，使用鏈親和素-堿性磷酸酶綴合物(Tropix，Inc.)可以檢測生物素，這種綴合物可以與生物素結(jié)合并隨后通過適當(dāng)?shù)孜锏幕瘜W(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(例如，化學(xué)發(fā)光底物CSPD:3-(4-甲氧基螺-[l，2，-二環(huán)氧丙烷-3-2，-(5，-氯)三環(huán)[3.3丄13，7]癸烷1-4-基)苯基磷酸二鈉(disodium，3畫(4國methoxyspiro國[l，2，—dioxetane-3國2，畫(5，-chloro)tricycl0[3.3丄l3，7]decane]畫4畫yl)phenylphosphate);Tropix，Inc.)。標(biāo)簽也可以是可檢測的酶，例如堿性磷酸酶、大豆過氧化物酶、辣纟艮過氧化物酶和聚合酶，檢測例如使用化學(xué)信號放大法或使用能發(fā)光的酶的底物(例如化學(xué)發(fā)光的1，2-二環(huán)氧丙烷底物)或能產(chǎn)生熒光信號的酶的底物。結(jié)合了兩個(gè)或多個(gè)上述檢測標(biāo)簽的分子也可被認(rèn)為是檢測標(biāo)簽。任何已知的檢測標(biāo)簽都可與本發(fā)明公開的探針、標(biāo)簽、分子和方法一起使用，以便標(biāo)記和檢測本發(fā)明公開方法所產(chǎn)生的激活的或失活的核糖開關(guān)或核酸或蛋白質(zhì)。用于檢測和測量檢測標(biāo)簽產(chǎn)生的信號的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可以通過閃爍計(jì)數(shù)或直接顯示法來檢測放射性同位素；可用熒光分光光度計(jì)來檢測熒光分子；可用分光光度計(jì)或直接照相顯示的方法檢測磷光分子；可通過檢測或可視化酶促反應(yīng)的產(chǎn)物來檢測酶。可通過檢測與抗體偶聯(lián)的二級檢測標(biāo)簽來檢測抗體。本文所述的檢測分子為偶聯(lián)了一個(gè)或多個(gè)檢測標(biāo)簽的與待測化合物或組合物相互作用的分子。J.序列相似性應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所使用的術(shù)語同源性和同一性的含義是相同的，都是指相似性。因此，例如，如果在兩個(gè)序列(例如非天然序列)之間使用同源性這一詞語，應(yīng)當(dāng)理解這并不一定是指著兩個(gè)序列之間的進(jìn)化關(guān)系，而是著眼于它們的核酸序列之間的相似性或關(guān)聯(lián)性。為了測量序列的相似性，確定兩個(gè)進(jìn)化上相關(guān)的分子之間相似性的很多方法都可以常規(guī)地應(yīng)用于兩個(gè)或多個(gè)核酸或蛋白質(zhì)，而無需考慮它們在進(jìn)化上是否相關(guān)?？傮w而言，應(yīng)當(dāng)理解的是，為了定義本文所公開的核糖開關(guān)、適體、表達(dá)平臺、基因和蛋白質(zhì)的已知變體和衍生物或可能出現(xiàn)的種類，一種方法是通過定義變體和衍生物與特定已知序列的同源性。本文公開的具體序列的這種同一性在本文其他部分也有所討論?？傮w而言，本文所公開的核糖開關(guān)、適體、表達(dá)平臺、基因和蛋白質(zhì)的變體與指定序列或天然序列通常有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同k間的同源性。例如:可以在序列比;并使同源性達(dá)到^高水平后i"T算同源性。計(jì)算同源性的另一種方法可以通過乂〉開的算法進(jìn)行?？蒦:用下列算法進(jìn)行用于比較的序列優(yōu)化比對Smi也andWatermanAdv.Appl.Math.2:482(1981)中所述的局部同源性算法；NeedlemanandWunsch，J.MoLBiol.48:443(1970)中所述的同源性比對算法；PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)中所述的相似性檢索方法；或者這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)形式(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI);或者通過審查的方式進(jìn)行。通過例如Zuker，M.Sc/e"ce244:48-52，1989;Jaegeretal.TV"汰顛&86:7706-7710，1989;Jaegeretal.Me也odsEnzymol.183:281-306,1989中公開的算法，可以獲得核酸的相同類型的同源性，上述文獻(xiàn)中至少與核酸比對有關(guān)的素材以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，通?？梢允褂萌魏畏椒ǎ谀承┣闆r下這些不同的方法所得到的結(jié)果可能不同，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，如果使用上述方法中的至少一種發(fā)現(xiàn)了同一性，則該序列可被稱為具有指定的同一性。例如，如本文所使用的，所述的具有與另一序列相比的特定百分比同源性的序列，是指具有由上述任意一種或多種計(jì)算方法所計(jì)算出的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker計(jì)算方法，第一序列被計(jì)算為與第二序列具有80%的同源性，即使按照其他任何計(jì)算方法都計(jì)算出該第一序列與第二序列不具有80%的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列與第二序列仍具有80%的同源性。另一個(gè)實(shí)例，如果使用Zuker計(jì)算方法和Pearson和Lipman計(jì)算方法，第一序列被計(jì)算為與第二序列具有80%的同源性，即使通過Smith和Waterman計(jì)算方法、Needleman和Wunsch計(jì)算方法、Jaeger計(jì)算方法或任意其他計(jì)算方法計(jì)算，第一序列與第二序列不具有80%的同源性，那么，如本文所定義的，第一序列與第二序列仍具有80%的同源性。再一個(gè)實(shí)例，如果使用每一種計(jì)算方法，第一序列都被計(jì)算為與第二序列具有80%的同源性(盡管實(shí)際上不同的計(jì)算方法常得到不同的計(jì)算的同源性百分比)，那么如本文所定義的，第一序列與第二序列具有80%的同源性。K.雜交和選擇性雜交術(shù)語雜交通常意為至少兩種核酸分子例如引物或探針與核糖開關(guān)或基因間的序列驅(qū)動的相互作用。序列驅(qū)動的相互作用意為以核苷酸特異用。例如G與C相互作用和A與T相互作用即為序列驅(qū)動的相互作用。通常序列驅(qū)動的相互作用發(fā)生于核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面。兩種核酸的雜交受到本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多條件和參數(shù)的影響。例如鹽濃度、pH和反應(yīng)溫度均會影響兩種核酸分子是否會雜交。兩種核酸分子間的選擇性雜交的參數(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如,在一些實(shí)施方案中選擇性雜交條件可被定義為嚴(yán)格雜交的條件。例如，雜交的嚴(yán)格性是通過雜交和/或洗滌步驟的溫度和鹽濃度共同控制的。例如實(shí)現(xiàn)選擇性雜交的雜交條件可包括在比Tm(解鏈溫度，在該溫度下一半的分子與其雜交配對的另一部分解離)低大約12-25。C的溫度下，在高離子強(qiáng)度溶液(6xSSC或6xSSPE)中雜交，然后在所選的溫度和鹽濃度的組合的條件下洗滌，此時(shí)洗滌溫度為比Tm低大約5'C至20。C。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)容易地確定溫度和鹽濃度條件，在該實(shí)驗(yàn)中使固定在濾膜上的參照DNA的樣品與帶標(biāo)記的目的核酸雜交，然后在不同嚴(yán)格度的條件下洗滌。對于DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交而言雜交溫度通常較高一些。可4吏用如上所述的或本領(lǐng)域已知的(Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;Kunkeletal.MethodsEnzymol.1987:154:367，1987，上述文獻(xiàn)中至少與核酸雜交相關(guān)的素材通過援引的方式納入本文)條件以達(dá)到嚴(yán)格度。優(yōu)選的DNA:DNA雜交的嚴(yán)格條件可以是在約68°C(水溶液中)，在6xSSC或6xSSPE中雜交，之后在68。C洗滌。如果需要，當(dāng)所需的互補(bǔ)程度降低時(shí)，雜交和洗滌的嚴(yán)格性可作相應(yīng)減小，并且還根據(jù)尋找可變性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定。同樣，如果需要，當(dāng)所需的同源性增大時(shí)，雜交和洗滌的嚴(yán)格性可作相應(yīng)增加，并且還根據(jù)需要高同源性的任何區(qū)域中的G-C或A-T的豐富程度而定，所有這些均為本領(lǐng)域已知。另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于一種核酸與另一核酸結(jié)合的量(百分比)。例如，在一些實(shí)施方案中選擇性雜交的條件可以為至少約60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的限量核酸與非限量核酸結(jié)合時(shí)的條件。通常非限量核酸要過量例如10或100或1000倍。這類測定可在限量核酸和非限量核酸均比它們的kd低例如10倍或100倍或1000倍時(shí)的條件下進(jìn)行，或者只是一種核酸分子為比它的kd低例如10倍或100倍或1000倍時(shí)的條件下進(jìn)行，或兩50種核酸分子之一或兩者均在kd之上時(shí)的條件下進(jìn)行。另一種定義選擇性雜交的方法是通過著眼于這樣一種核酸的百分比，所述核酸是在需要雜交以促進(jìn)所需的酶操作的條件下得到酶操作的核酸。例如，在一些實(shí)施方案中選擇性雜交條件可以是至少約60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100。/。的核酸在促進(jìn)酶操作的條件下進(jìn)行酶操作時(shí)的條件，例如，如果酶操作是DNA延伸，那么選擇性雜交條件可以是至少約60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的核酸分子被延伸時(shí)的條件。優(yōu)選的條件還包括廠商所建議的或本領(lǐng)域所指出的適于酶進(jìn)行操作的條件。正如同源性一樣，應(yīng)當(dāng)理解本文公開的用于確定兩種核酸分子間的雜交水平的方法有許多種。應(yīng)當(dāng)理解這些方法和條件可提供兩種核酸分子間的不同雜交百分比，但是除非另外指明，否則滿足任何方法的參數(shù)都是足夠的。例如，如果需要80%雜交并且只要在這些方法的任意一種中所要求的參數(shù)內(nèi)發(fā)生雜交，就認(rèn)為它在本文得到了公開。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，如果組合物或方法滿足用于單獨(dú)或聯(lián)合確定雜交的這些標(biāo)準(zhǔn)的任意一條，那么它就是本文所公開的組合物或方法。L.核酸本文公開了基于核酸的多種分子，包括例如核糖開關(guān)、適體以及編碼核糖開關(guān)和適體的核酸。所公開的核酸由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物構(gòu)成。本文討論了這些分子及其他分子的非窮盡性實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解，例如當(dāng)載體在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，表達(dá)的mRNA通常由A、C、G和U組成。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，如果核酸分子通過例如外源性送遞被導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中，那么核酸分子由核苷酸類似物構(gòu)成是有利的，這樣可減少核酸分子在細(xì)胞環(huán)境中的降解。只要保留了它們相關(guān)的功能，核糖開關(guān)、適體、表達(dá)平臺以及任何其他寡核苷酸和核酸都可以由經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類似物)構(gòu)成或含有經(jīng)修飾的核苷酸(核苷酸類似物)。很多經(jīng)修飾的核苷酸是已知的，并可被用于寡核苷酸和核酸之中。核苦酸類似物是含有對堿基、糖或磷酸部分的一些類型的修飾的核苷酸。對堿基部分的修飾可以包括對A、C、G和T/U的天然性或合成性修飾，以及使用不同的噤呤或嘧啶堿，例如尿嘧啶-5-基、次黃嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌呤-9-基。經(jīng)修飾的堿基包括但不限于5-曱基胞嘧啶(5-me-C);5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺噤呤和鳥嘌呤的6-曱基或其他烷基衍生物；腺噤呤和鳥嘌呤的2-丙基或其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-囟素尿嘧啶和5-卣素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；腺噤呤和鳥噪呤的8-鹵素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羥基以及其他8-取代物；尿嘧啶和胞嘧啶的5-囟素特別是5-溴、5-三氟甲基和其他的5-取代物；7-曱基鳥嘌呤和7-曱基腺噤呤；8-氮雜鳥噤呤和8-氮雜腺噤呤；7-脫氮鳥嘌呤(7-deazaguanine)和7-脫氮腺噪呤和3-脫氮鳥噤呤和3-脫氮腺嘌呤。其他的堿基修飾物可見于例如美國專利No.3，687，808、Englischetal.，AngewandteChemie，InternationalEdition,1991,30，613、Sanghvi,Y.S.，Chapter15，AntisenseResearchandApplications,第289-302頁、Crooke，S.T.andLebleu，B.ed.，CRCPress,1993。某些核苷酸類似物例如5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧咬和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺噤呤、5-丙炔基尿嘧咬、5-丙炔基胞嘧啶和5-曱基胞嘧啶，可以增加雙鏈體形成的穩(wěn)定性。其他經(jīng)修飾的g是那些有通用威基功能的堿基。通用堿基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用堿基可取代正常的堿基，但在堿基配對上沒有偏好性。也就是說通用堿基可以與其他任何g進(jìn)行堿基配對。堿基修飾經(jīng)?？膳c例如糖修飾結(jié)合使用，例如2，-0-曱氧基乙基，以獲得獨(dú)特的屬性例如提高的雙鏈體穩(wěn)定性。有多個(gè)美國專利具體描述了很多4^修飾，例如4,845,205、5,130,302、5，134，066、5，175，273、5,367,066、5,432,272、5，457，187、5,459,255、5，484，卯8、5,502,177、5，525，711、5，552，540、5，587，469、5,594,121、5,596,091、5，614，617和5,681,941。以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于g修飾及其合成、使用和將其導(dǎo)入寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類似物還可包括糖部分的修飾。對糖部分的修飾可包括核糖和脫氧核糖的天然性修飾及合成性修飾。糖修飾包括但不限于在2'位置的下列修飾OH;F;O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的Cl至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。2，糖修飾還包括但不限于-0[(CH2)nO]mCH3、-0(CH2)nOCH3、-0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCH3、-0(CH2)n-ONH2和-0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m在1至大約10之間。在2'位置的其他修飾包括但不限于Cl至C10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基JL^、取代的曱硅烷基、RNA切割基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)、插入劑、可提高寡核苷酸藥物動力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或可提高寡核苷酸藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和其他具有類似性質(zhì)的基團(tuán)。還可以在糖的其他位置進(jìn)行類似的修飾，特別是在3'端核苷酸上或2，-5，連接的寡核苷酸中的糖的3，位置，和在5，端核苷酸的5，位置。經(jīng)<務(wù)飾的糖可含有那些在環(huán)氧橋位置用例如CH2和S進(jìn)行的修飾。核苷酸糖類似物還可具有糖模擬物，例如用環(huán)丁基部分代替五碳呋喃糖。有許多美國專利都教導(dǎo)了這類經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的制備，例如4,981,957、5，118，800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5，466，786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5，591，722、5，597，卯9、5，610，300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5，658，873、5,670,633和5,700,920，以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。核苷酸類似物可以在磷酸部分加以修飾。經(jīng)修飾的磷酸部分包括但不限于可經(jīng)過修飾而使得在兩個(gè)核苷酸之間的連接部分含有下列結(jié)構(gòu)的磷酸部分，所述結(jié)構(gòu)包括硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨烷基磷酸三酯；磷酸曱酯和其他磷酸烷基酯，包括磷酸3，-烯基酯和手性磷酸酯；次膦酸酯(phosphinate);氨基磷酸酯，包括3，-氨基氨基磷酸酯(3，-aminophosphoramidate)和氨烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫^f^氨基磷酸酉旨(thionophosphoramidates)、硫代烷基磷酸酉旨(thionoalkylphosphonates)、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)和硼坑碌酸酉旨(boranophosphates)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在兩個(gè)核苷酸之間的這些磷酸連接或經(jīng)修飾的磷酸連接可以通過3，-5，連接或2，-5，連接，連接可以包括極性的倒轉(zhuǎn)，例如3，-5，至5，-3，或者2，-5，至5，-2，。還包括各種鹽形式、混合鹽形式和游離酸形式。許多美國專利教導(dǎo)了如何制備和使用含有經(jīng)修飾磷酸的核苷酸，包括但不限于3,687,808、4，469，863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5，278，302、5，286，717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5，466，677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5，550，111、5，563，253、5,571,799、5，587，361和5，625，050，以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于經(jīng)修飾的磷酸及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，核苷酸類似物僅需要包括一種修飾，但是也可以在一個(gè)部分或幾個(gè)不同部分中包括多種修飾。核苷酸替代物為與核苷酸具有類似功能特性但不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物分子可以以Watson-Crick方式或Hoogsteen方式識別互補(bǔ)性核酸并與互補(bǔ)性核酸雜交(堿基配對)，但是它們通過非磷酸的部分連接起來。核普酸替代物在與合適的把核酸相互作用時(shí)能夠形成雙螺旋型結(jié)構(gòu)。物。核苷酸替代物不包括^準(zhǔn)的;原子:磷酸的替代物可為;么短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間連接物、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間連接物、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間連接物。這些連接物可包括具有下列結(jié)構(gòu)的連接物嗎啉代連接物(形成核苷的糖部分的一部分)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲?；?formacetyl)和硫甲酰基(thioformacetyl)骨架；亞曱基曱酰基和硫曱?；羌埽缓N骨架；M磺酸鹽骨架；亞曱基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸和磺胺骨架；酰胺骨架；以及其他帶有混合的N、O、S和CH2組成部分的連接物。許多美國專利公開了如何制備和使用這些種類的磷酸替換物，包括但不限于5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5，216，141、5,235,033、5，264，562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5，610，289、5,602,240、5,608,046、5，610，289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，以上各專利文獻(xiàn)的每一篇的全部內(nèi)容都以援引的方式納入本文，并且特別是這些文獻(xiàn)中關(guān)于磷酸替換物及其合成、使用和將其導(dǎo)入核苷酸、寡核苷酸和核酸的描述也以援引的方式納入本文。應(yīng)當(dāng)理解的是，在核苷酸替代物中核普酸的糖部分和磷酸部分都可以被例如酰胺型連接物(氨基乙基甘氨酸)(PNA)所替換。美國專利5,539,082、5,714,331和5,719,262教導(dǎo)了如何制備和使用PNA分子，上述文獻(xiàn)的每一篇都以援引的方式納入本文。(還可參見NielsenW"/.，5Wewce254:1497-1500(1991))。寡核苷酸和核酸可以由核苷酸構(gòu)成，并可以由不同類型或相同類型的核苷酸構(gòu)成。例如，在寡核苷酸中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-甲基核糖核苷酸的混合物；大約10%至約50%的核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-曱基核糖核苷酸的混合物；大約50%或50%以上的核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-曱基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-曱基核糖核苷酸的混合物；或者全部核苷酸可以是核糖核苷酸、2，-0-甲基核糖核苷酸或核糖核苷酸和2，-0-甲基核糖核苷酸的混合物。這類寡核苷酸和核酸可被稱為嵌合寡核苷酸和嵌合核酸。M.固體支持物固體支持物為可連接分子(例如觸發(fā)分子)和核糖開關(guān)(或其他由所公開的方法產(chǎn)生的或在所公開的方法中使用的組件)的固態(tài)基質(zhì)或支持物，可以與支持物相連接。核糖開關(guān)和其他分子可以直接或間接地與固體支持物相連接。例如，分析物(例如觸發(fā)分子，待測化合物)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的捕獲試劑(例如結(jié)合分析物的化合物或分子)相連接。作為另一個(gè)實(shí)例，核糖開關(guān)可以結(jié)合到固體支持物表面或與固定在固體支持物上的探針相連接。多個(gè)核糖開關(guān)、探針或其他分子以陣列、網(wǎng)格或其他組織形式連接到固體支持物上構(gòu)成陣列。可用于固體支持物的固態(tài)基質(zhì)可以包括可以與組件直接或間接連接的任何固體材料。這包括下述材料，例如丙烯酰胺、瓊脂糖、纖維素、硝酸纖維素、玻璃、金、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚氧乙烯、聚硅酸鹽、聚碳酸酯、特氟隆(聚四氟乙烯樹脂)，碳氟化合物、尼龍、硅橡膠、聚肝、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、官能化硅烷、聚丙基延胡索酸鹽(polypropylfumerate)、膠原、糖胺聚糖和聚氨基酸。固態(tài)基質(zhì)可為任何可用的形式，包括薄膜、膜、瓶、盤、纖維、編織纖維、成型聚合物、顆粒、珠粒、微顆?；蛩鼈兊慕M合。固態(tài)基質(zhì)和固體支持物可為有孔的和無孔的。芯片是一小片長方形或正方形的材料。優(yōu)選的固態(tài)基質(zhì)的形式為薄膜、珠?；蛐酒?。一種可用于固態(tài)基質(zhì)的形式是微量滴定板。在一些實(shí)施方案中，可以使用多孔栽玻片。陣列可包括多個(gè)固定于固體支持物的確定位置或預(yù)定位置的核糖開關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物或探針。固體支持物上的每個(gè)預(yù)定位置通常具有一種類型的組件(即在該位置的所有組件都是相同的)?；蛘撸诠腆w支持物上的同一預(yù)定位置可以固定化多種類型的組件。每一位置可以具有給定組件的多個(gè)拷貝。在固體支持物上的不同組件的空間隔離使得可以進(jìn)4亍分別的檢測和識別。固體支持物為一個(gè)單獨(dú)的單位或結(jié)構(gòu)雖然是有用的，但不是必需的。一系列的核糖開關(guān)、觸發(fā)分子、其他分子、化合物和/或探針可以分布于任意數(shù)目的固體支持物上。例如，一種極端的情況是每一個(gè)組件可被固定于分離的反應(yīng)管或容器中，或在分離的珠?；蛭㈩w粒上。將寡核苷酸固定化于固態(tài)基質(zhì)的方法已很成熟。可使用已知的偶聯(lián)方法將包括定位探針(addressprobe)和檢測探針的寡核苷酸偶聯(lián)至基質(zhì)上。例如，合適的附著方法描述于PeaseCa/,iVoc.iVarf.t/&491(11):5022腸5026(1994)和Khrapko"r/.，Mo/廣f/51S影25:718-730(1991)。一種將3，-胺寡核苷酸固定于酪蛋白包被的栽玻片上的方法描述于Stimpson"A^^/.爿c"fif.5W.t/S<492:6379-6383(1995)。一種將寡核苦酸附著于固態(tài)基質(zhì)上的可用的方法描述于Guo"a/,iV"c/e/""Vfe/^.22:5456-5465(1994)。固定于固體支持物上的每一組件(例如，核糖開關(guān)、觸發(fā)分子或其他分子)可以位于固體支持物的不同預(yù)定區(qū)域。不同的位置可以是不同的反應(yīng)室。每一不同的預(yù)定區(qū)域可以與其他不同的預(yù)定區(qū)域在物理上彼此分離。固體支持物上的不同預(yù)定區(qū)域之間的距離可以是固定的，也可以是可變的。例如，在陣列中每一組件可以彼此之間以固定距離排列，而與珠粒相連接的組件就不會有固定的空間關(guān)系。特別地，多個(gè)固體支持物單位(例如多個(gè)珠粒)的使用方式會導(dǎo)致不同的距離。組件可以以任何密度連接于或固定于固體支持物上。組件固定于固體支持物上的密度可以超過每立方厘米400個(gè)不同組件。組件的陣列可以有任何數(shù)目的組件。例如，陣列可以具有至少1，000個(gè)固定于固體支持物的不同組件、至少10,000個(gè)固定于固體支持物的不同組件、至少IOO，OOO個(gè)固定于固體支持物的不同組件或至少l，OOO，OOO個(gè)固定于固體支持物的不同組件.N.試劑盒上文所述的材料和其他材料可以以任意合適的組合被包裝在一起，作為用于進(jìn)行或輔助進(jìn)行所公開方法的試劑盒。如果給定試劑盒中的試劑盒組件被設(shè)計(jì)和調(diào)整為在所公開的方法中一起使用則是有用的。例如公開了用于檢測化合物的試劑盒，該試劑盒包括一種或多種生物傳感器核糖開關(guān)。該試劑盒還可包括檢測核糖開關(guān)的激活的試劑和標(biāo)簽。o.混合物公開了通過實(shí)施或準(zhǔn)備實(shí)施所公開方法而形成的混合物。例如，公開了包括核糖開關(guān)和觸發(fā)分子的混合物。不論何時(shí)，只要方法包括使組合物或組件或試劑混合或相接觸，實(shí)行該方法就會產(chǎn)生多種不同的混合物。例如，如果方法包括3個(gè)混合步驟，如果各步驟分別進(jìn)行，則在上述步驟的每一步之后都會形成一種特有的混合物。此外，不論各步驟如何進(jìn)行，在所有步驟完成之后也會形成一種混合物。本發(fā)明的公開內(nèi)容考慮了由實(shí)施所公開方法所獲得的這些混合物，以及含有例如本文所/〉開的試劑、組合物或組件的混合物。P.系統(tǒng)公開了用于實(shí)施或輔助實(shí)施所公開方法的系統(tǒng)。系統(tǒng)通常包括制造的物品的組合例如結(jié)構(gòu)、機(jī)械、裝置等，以及組合物、化合物、材料等。這些組合為已公開的或從公開的內(nèi)容可以顯而易見，這些組合均被考慮。例如，公開了和考慮了包括生物傳感器核糖開關(guān)、固體支持物和信號讀取裝置的系統(tǒng)。Q.數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)控制公開了所公開方法中使用的、由所公開方法產(chǎn)生的或從所公開方法中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)通常為在組合物或介質(zhì)中采集、編組、儲存和/或體現(xiàn)的任何形式的數(shù)據(jù)、信息和/或?qū)ο?。以例如RAM或存儲磁盤的電子形式儲存的核糖開關(guān)的結(jié)構(gòu)和激活測量結(jié)果就是一種類型的數(shù)據(jù)結(jié)輪。所公開的方法或其任意部分或由該方法制備的制品，都可以通過計(jì)算機(jī)控制來進(jìn)行控制、管理或輔助。這類計(jì)算機(jī)控制可以通過計(jì)算機(jī)控制過程或方法來實(shí)現(xiàn)，可以使用和/或產(chǎn)生數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，并可以使用計(jì)算機(jī)程序。這類計(jì)算機(jī)控制、計(jì)算機(jī)控制的過程、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)程序都被考慮到并應(yīng)理解為在本文中被/>開。方法本文公開了影響RNA加工的方法，包括將包含一種核糖開關(guān)的構(gòu)建體導(dǎo)入所述RNA，其中所述核糖開關(guān)能夠調(diào)節(jié)RNA的剪接，其中剪切調(diào)節(jié)能夠影響所述RNA的加工。例如，所述核糖開關(guān)能夠調(diào)節(jié)可變剪接。所述核糖開關(guān)可包含一個(gè)適體結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域，其中所述適體結(jié)構(gòu)域和所述表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域是異源的。所述核糖開關(guān)可在所述RNA的內(nèi)含子內(nèi)。所述核糖開關(guān)可由觸發(fā)分子例如TPP激活。所述核糖開關(guān)可以是一種TPP-應(yīng)答性核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可激活可變剪接。所述核糖開關(guān)可抑制可變剪接。所述剪接可以非天然地發(fā)生?？刂瓶勺兗艚拥倪m體區(qū)域可出現(xiàn)于例如環(huán)5?？刂瓶勺兗艚拥倪m體區(qū)域可出現(xiàn)于例如莖P2。所述剪接位點(diǎn)例如可位于相對于所述適體5，端的-130至-160之間的位置。"調(diào)節(jié)RNA剪接"是指核糖開關(guān)可控制RNA剪接，從而造成不同mRNA分子的形成，以及可能的(但不總是)不同蛋白的形成。例如，所述核糖開關(guān)可以調(diào)節(jié)可變剪接。"影響RNA加工"是指核糖開關(guān)可影響RNA加工，從而導(dǎo)致不同RNA分子形成并可能(盡管不總是)改變所述RNA表達(dá)。所述核糖開關(guān)可調(diào)控例如轉(zhuǎn)錄終止、RNA的3，末端的形成或RNA的多聚腺苷酸化。進(jìn)一步公開了用于激活、滅活或阻斷調(diào)節(jié)RNA剪接和/或影響RNA加工的核糖開關(guān)的方法。這類方法可包括例如^吏核糖開關(guān)和可激活、滅活或阻斷該核糖開關(guān)的化合物或觸發(fā)分子相接觸。核糖開關(guān)通過觸發(fā)分子的結(jié)合或移除來發(fā)揮控制基因表達(dá)的功能。化合物可用于激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)。核糖開關(guān)的觸發(fā)分子(以及其他的激活化合物)可被用于激活核糖開關(guān)。通常可使用除觸發(fā)分子以外的化合物來滅活或阻斷核糖開關(guān)(例如TPP)。還可以通過例如從核糖開關(guān)所在處移除觸發(fā)分子來滅活核糖開關(guān)。因此，所公開的滅活核糖開關(guān)的方法可以包括例如移除核糖開關(guān)所在處的或與核糖開關(guān)接觸的觸發(fā)分子(或其他激活化合物)。可以還公開了通過使一化合物與RNA分子相接觸來改變該RNA分子或編碼該RNA分子的基因的表達(dá)的方法，其中所述RNA分子包括調(diào)節(jié)剪接的核糖開關(guān)。所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)例如所述RNA分子的可變剪接和/或影響所述RNA分子的加工。核糖開關(guān)通過結(jié)合或者去除觸發(fā)因子來發(fā)揮控制基因表達(dá)的功能。因此，將包含核糖開關(guān)的目的RNA分子置于激活、滅活或者阻斷該核糖開關(guān)的條件下，可用于改變所述RNA的表達(dá)。表達(dá)可因例如轉(zhuǎn)錄被終止或核糖體與所述RNA的結(jié)合受到阻斷而改變。與觸發(fā)分子的結(jié)合可減少或防止所述RNA分子的表達(dá)，或者促進(jìn)或者增加所述RNA分子的表達(dá)，這取決于核糖開關(guān)的性質(zhì)及發(fā)生的剪接或加工的類型。還公開了通過激活、滅活或者阻斷可調(diào)控剪接的核糖開關(guān)來調(diào)控含有所述核糖開關(guān)的天然存在的基因或RNA的表達(dá)的方法。例如，所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)所述RNA的可變剪接。如果所述基因?qū)τ诤兴募?xì)胞或者生物體的生存是必需的，那么激活、滅活或阻斷所述核糖開關(guān)會造成所述細(xì)胞或者生物體的死亡、瘀滯或虛弱。例如，激活植物存活所必需的天然開關(guān)的i活控制可^剪接和/或影響,RNA加工，而所述剪接或加工轉(zhuǎn)上調(diào)或下調(diào)關(guān)鍵蛋白)。還公開了選擇和識別可激活、滅活或阻斷調(diào)節(jié)剪接的核糖開關(guān)的化合物的方法。例如，所述核糖開關(guān)可調(diào)節(jié)可變剪接。核糖開關(guān)的激活是指核糖開關(guān)結(jié)合觸發(fā)分子時(shí)其狀態(tài)的變化。核糖開關(guān)可由除觸發(fā)分子以外的化合物并以不同于與觸發(fā)分子結(jié)合的方式被激活。術(shù)語觸發(fā)分子在本文中用來指可激活核糖開關(guān)的分子和化合物。這包括核糖開關(guān)的天然或正常的觸發(fā)分子以及其他可以激活核糖開關(guān)的化合物。天然或正常的觸發(fā)分子是給定的天然核糖開關(guān)本來就有的觸發(fā)分子，或者對于某些非天然核糖開關(guān)而言是這樣的觸發(fā)分子該核糖開關(guān)針對該觸發(fā)分子被設(shè)計(jì)或該核糖開關(guān)通過該觸發(fā)分子被選擇(正如在例如體外選擇或體外進(jìn)化技術(shù)中那樣)。不是天然的觸發(fā)分子可被稱為非天然觸發(fā)分子。還公開了識別激活、失活或阻斷調(diào)節(jié)剪接和/或影響RNA加工的核糖59開關(guān)的化合物的方法。例如，激活核糖開關(guān)的化合物可通過以下途徑識別將測試化合物和核糖開關(guān)相接觸，并且通過測量所述RNA的剪接和/或加工，或者通過測量作為所述剪接和/或加工事件結(jié)果表達(dá)的蛋白差異水平評估所述核糖開關(guān)的激活情況。如果所述核糖開關(guān)被激活，則該測試化合物被識別為可激活核糖開關(guān)的化合物。核糖開關(guān)的激活可以任何合適的方式被評估。例如，核糖開關(guān)可被連接到一報(bào)告RNA上，并在存在或不存在所述測試化合物的情況下可測量所述才艮告RNA的表達(dá)、表達(dá)水平或表達(dá)水平的變化。再如，核糖開關(guān)可包含一個(gè)構(gòu)象依賴標(biāo)簽，來自該構(gòu)象依賴標(biāo)簽的信號隨所述核糖開關(guān)的激活狀態(tài)而改變。這種核糖開關(guān)優(yōu)選^^用來自或者衍生自天然存在的核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。可以看出，對核糖開關(guān)的激活情況進(jìn)行評估使用或不使用對照測定或測量均可。識別滅活核糖開關(guān)的化合物的方法可用類似方式進(jìn)行。除了本文其他部分公開的方法，對阻斷可調(diào)節(jié)剪接和/或影響RNA加工的核糖開關(guān)的化合物的識別可以任何合適的方式完成，例如，在已知可評估^糖開關(guān)^激活或失活的分析。如果一未觀察到在所述測試化合:不存在時(shí)可觀察到的激活或失活，那么所述測試化合物被確定為阻斷所述核糖開關(guān)激活或者失活的化合物。還公開了使用調(diào)節(jié)可變剪接的生物傳感器核糖開關(guān)檢測化合物的方法。該方法可包括使一測試樣本和生物傳感器核糖開關(guān)接觸以及評估所述生物傳感器核糖開關(guān)的激活情況。生物傳感器核糖開關(guān)的激活表示在測試樣品中存在生物傳感器核糖開關(guān)的觸發(fā)分子。生物傳感器核糖開關(guān)是在其關(guān)聯(lián)觸發(fā)分子存在的情況下可產(chǎn)生可檢測信號的工程化改造的核糖開關(guān)。有用的生物傳感器核糖開關(guān)可由閾水平或高于閾水平的觸發(fā)分子觸發(fā)。生物傳感器核糖開關(guān)可被設(shè)計(jì)成體內(nèi)或體外使用。例如，調(diào)節(jié)可變結(jié)合的生物傳感器核糖開關(guān)可以被可操作地連接到編碼用作信號或者參與產(chǎn)生信號的蛋白的報(bào)告RNA,可通過對細(xì)胞或者生物體進(jìn)行工程改造使其包含編碼所述核糖開關(guān)/報(bào)告RNA的核酸構(gòu)建體從而在體內(nèi)使用。生物傳感器核糖開關(guān)體外應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例是包含構(gòu)象依賴標(biāo)簽的核糖開關(guān)，來自該核糖開關(guān)的信號的變化取決于核糖開關(guān)的激活狀態(tài)。這種生物傳感器核糖開關(guān)優(yōu)選使用來自或者衍生自天然存在的TPP核糖開關(guān)的適體結(jié)構(gòu)域。還公開了通過識別激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物以及制造所識別出的化合物制成的化合物。這可通過例如將如文中其他部分所公開的化合物的識別方法與制造所識別出的化合物的方法相結(jié)合來完成。例如，化合物可通過如下步驟制備使一測試化合物和一核糖開關(guān)相接觸，評估所述核糖開關(guān)的激活情況，并且如果所述核糖開關(guān)被所述測試化合物激活，則制造所述激活核糖開關(guān)的測試化合物作為所述化合物。還公開了通過以下方式制備的化合物檢測一化合物對一核糖開關(guān)的激活、滅活或阻斷并制造所述被檢測的化合物。這可以通過例如將本文其他部分所公開的化合物激活、失活或阻斷的評估方法與制造被檢測的化合物的方法相結(jié)合來完成。例如，可通過如下步驟制備化合物使一測試化合物和一核糖開關(guān)相接觸，評估所述核糖開關(guān)的激活情況，并且如果所述核糖開關(guān)被所述測試化合物激活，則制造所述激活核糖開關(guān)的測試化合物作為所述化合物。檢測化合物激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的能力既指識別之前未知可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)的化合物，也指在已知某種化合物可激活、滅活或阻斷核糖開關(guān)時(shí)，評估所述化合物激活、滅活或者阻斷核糖開關(guān)的能力。如果存在某一化合物時(shí)的核糖開關(guān)測定與不存在該化合物時(shí)同樣的核糖開關(guān)測定相比(即與對照測定相比)，信號增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%，則該化合物可識別為可激活核糖開關(guān)或確定具有核糖開關(guān)激活活性。所述核糖開關(guān)測定可使用任何合適的核糖開關(guān)構(gòu)建體進(jìn)行。對于核糖開關(guān)激活測定特別有用的核糖開關(guān)構(gòu)建體在本文其他地方描述?？杉せ詈颂情_關(guān)或具有核糖開關(guān)激活活性的化合物的識別可依據(jù)一個(gè)或多個(gè)具體核糖開關(guān)、核糖開關(guān)構(gòu)建體或者核糖開關(guān)類別進(jìn)行。為方便起見，被識別為可激活控制可變剪接的核糖開關(guān)的化合物可依此識別為針對具體核糖開關(guān)的化合物。實(shí)施例A.實(shí)施例l:通過mRNA的可變3，末端加工對植物中基因表達(dá)的核糖開關(guān)控制從全部三種生命領(lǐng)域的生物體中發(fā)現(xiàn)的最廣泛分布的核糖開關(guān)類別對輔酶焦磷酸硫胺素(TPP)是應(yīng)答性的，其中TPP是維生素Bl的衍生物。發(fā)現(xiàn)TPP核糖開關(guān)存在于所有被測植物品種的硫胺素生物合成基因rH/C的3，非翻譯區(qū)(UTR)中。T^/CTPP核糖開關(guān)控制具有可變3，UTR長度的轉(zhuǎn)錄物的形成，所述長度影響mRNA的穩(wěn)定性和蛋白生產(chǎn)。已證明，可變3，末端加工的核糖開關(guān)介導(dǎo)的調(diào)控對TPP依賴的r/r/c表達(dá)的反饋控制起關(guān)鍵作用。數(shù)據(jù)揭示了以下機(jī)制，其中代謝物依賴的RNA折疊的改變控制mRNA的剪接和可變3'末端加工。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了植物中核糖開關(guān)對代謝物感應(yīng)的重要性，并進(jìn)一步揭示了可變3，末端加工作為真核生物中基因控制機(jī)制的重要性。核糖開關(guān)是一般位于信使RNA非編碼部分的代謝物感應(yīng)的控制元件。細(xì)菌中核糖開關(guān)的感應(yīng)小的有機(jī)化合物(包括輔酶、氨基酸和和核苷酸4^(MandalandBreaker,2004;SoukupandSouk叩，2004;WinklerandBreaker,2005;Fuchsetal"2006;Rothetal"2007))或者錳離子(Cromieetal.，2006)的12種結(jié)構(gòu)類別時(shí)至今日已祐束征。在大多數(shù)情況下，核糖開關(guān)可分為分別負(fù)責(zé)配體結(jié)合和基因控制的適體和表達(dá)平臺區(qū)域，其代表兩種功能上不同但物理上部分重疊的結(jié)構(gòu)域?；谕ㄟ^對若干核糖開關(guān)類型的x射線晶體法鑒定的原子分辨率模型的檢查，由適體和它們的配體識別機(jī)制形成的結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度是明顯的，所述核糖開關(guān)類型包括結(jié)合鳥噤呤和腺噤呤(Bateyetal.，2004;Serganovetal"2004)、S-腺苷甲硫氨酸(MontangeandBatey，2006)、TPP(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal"2006;Thoreetal"2006)和葡糖胺畫6-磷酸(KlineandFerre-D，Amare，2006;Cochraneetal"2007)的類型。每種適體類別的配體結(jié)合核心和支持結(jié)構(gòu)的核苷酸序列在不同物種之間是高度保守的，這是因?yàn)樗鼈冃枰挥盟念惡塑账針?gòu)成一個(gè)特異配體的精確受體。相反，核糖開關(guān)的表達(dá)平臺結(jié)構(gòu)域可在物種之間，乃至在單個(gè)生物體的多種核糖開關(guān)類型之間發(fā)生很大的變化。適體的高度保守水平使得研究者可采用生物信息學(xué)方法識別新的核糖開關(guān)候選物(如GrundyandHenkin，1998;Gelfandetal.，1999;Barricketal"2004;Corbinoetal"2005;Weinbergetal"2007)，并測定已知核糖開關(guān)類型在不同生物體中的分布(如Rodionovetal.，2002;Vitreschaketal.,2003;Nahvietal"2004;Abreu-GoodgerandMerino,2005)。目前，這些研究已經(jīng)揭示，只有TPP感應(yīng)核糖開關(guān)類型的成員存在于全部三種生命領(lǐng)域中(Sudarsaneta1.，2003)。在真核生物中，TPP適體存在于植物和絲狀真菌的硫胺素代謝基因中，但核糖開關(guān)功能的機(jī)制仍有待研究(Kuboderaetal.，2003;Sudarsanetal.，2003)。在真菌粗糙鏈孢霉(A^wras/w/Yicnwstf)中，TPP適體殘基位于7VAf77mRNA的5，區(qū)內(nèi)的內(nèi)含子中，最近已發(fā)現(xiàn)TPP結(jié)合所述適體通過控制可變剪接而調(diào)控基因表達(dá)(Cheaheta1.，2007)。具體地，TPP結(jié)合所述核糖開關(guān)阻止帶有上游開放閱讀框(阻止主要ORF表達(dá)的uORF)的內(nèi)含子序列的除去。于此，已報(bào)道TPP核糖開關(guān)存在于多種植物品種中的硫胺素代謝基因r好/C的3，UTR中。具有可變3，UTR長度的r及/c轉(zhuǎn)錄物的形成倚賴于核糖開關(guān)功能并根據(jù)細(xì)胞TPP水平的改變調(diào)節(jié)rH/c表達(dá)的反饋調(diào)控。數(shù)據(jù)表明3，UTR長度與轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性相關(guān)，從而建立了通過可變3，末端加工進(jìn)行基因控制的^。本文給出了一種植物中rK/CTPP核糖開關(guān)功能的詳細(xì)機(jī)制，包括rJWCmRNA的剪接和可變3，末端加工的適體介導(dǎo)的控制。此研究進(jìn)一步揭示了不同生命領(lǐng)域的生物體中核糖開關(guān)控制的多樣性，并拓展了之前未知的真核生物基因調(diào)控方面的知識。l.結(jié)果和討論i.TPP適體廣泛分布于植物品種中前人已經(jīng)報(bào)道了在植物品種擬南芥、稻和偏生早熟禾的r及/c基因的3，UTR中存在高度保守的TPP結(jié)合適體(Sudarsanetal.，2003)。對植物TPP適體代表的收集通過對其他植物品種的r好/c基因測序和對符合TPP適體共有序列的核苷酸序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索而擴(kuò)大。獲得cDNA序列之后，克隆每個(gè)物種的基因組DNA的相應(yīng)區(qū)域并測序(細(xì)節(jié)參見實(shí)驗(yàn)方法部分)，從而獲得原始和加工后的mRNA分子的序列。所有可獲得的植物TPP適體序列的比對揭示了由莖Pl-P5組成的核苷酸序列和二級結(jié)構(gòu)的高度保守性(圖1A)。植物(圖1B)和絲狀真菌(Cheahetal.，2007)的真核TPP核糖開關(guān)適體與其在細(xì)菌和古細(xì)菌中的等價(jià)物(圖1C)(Winkleretal.,2002;Rodionovetal.2002)相比的主要不同在于，細(xì)菌代表中通?？偸侨鄙貾3a莖，而真核生物中P3莖的長度是可變的。這兩個(gè)區(qū)域都不參與TPP結(jié)合(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal.，2006;Thoreetal.，2006;Cheahetal.，2007)，因此這些不同應(yīng)該不會影響配體結(jié)合的特異性。在所有已知的單子葉植物、雙子葉植物和針葉火炬爭^的rH/c實(shí)例的3'UTR中都發(fā)現(xiàn)了所述TPP適體。有趣的是，在莒蘚小立碗蘚中，所述TPP適體存在于rH/C的3，UTR中(Ppal)，并且也存在于與硫胺素生物合成基因THI4同源的兩個(gè)基因的3，區(qū)(Ppa2，Ppa3)。后面的發(fā)現(xiàn)和真菌也具有與多種不同基因有關(guān)的TPP適體的發(fā)現(xiàn)(Cheahetal.，2007)表明，真核生物似乎使用同一類核糖開關(guān)的變型以根據(jù)一種關(guān)鍵代謝物的濃度變化來控制多個(gè)基因。植物TPP適體的一個(gè)顯著特征是核普酸序列的高度保守水平。在所有植物實(shí)例中大約80。/。的核苷酸(不包括P3莖)是保守的。相反，絲狀真菌中只有不到40%是保守的。植物TPP適體之間的大多數(shù)區(qū)別都存在于所述P3莖中，其在長度和序列上都可發(fā)生變化。此外，所述P3莖的長度還在相同品種的TPP適體代表之間改變，如在小立碗蘚中發(fā)現(xiàn)的(圖1A)。r好/C中延長的P3莖和THI4中非常短的P3莖的存在表明，對所述適體的這一組分沒有物種特異性的要求。ii.長度和序列不同的7WJC3，UTR從六個(gè)植物品種中克隆或從GenBank獲得(稻)的7^/CmRNA的3，區(qū)的核普酸序列進(jìn)行分析(圖8;細(xì)節(jié)還可參見實(shí)驗(yàn)方法部分)。有趣的是，r好/C基因的3，區(qū)的基因組結(jié)構(gòu)在這7個(gè)物種中是保守的，并且總能觀察到具有不同3，UTR長度的三種主要類型的加工后的RNA轉(zhuǎn)錄物的形成(圖2A)。rH/CORF的終止密碼子后面通常有一個(gè)通常以全部三種RNA類型被剪接的內(nèi)含子。I型(r好/C-I)RNA帶有完整的適體并可在其3，末端延伸不同的長度。III型(r好/C-III)RNA與除去所述TPP適體一部分的另一個(gè)內(nèi)含子剪接后的i型一致，而n型(r及jc-n)RNA在所述適體的上游終止。這些物種的7W/C3'UTR內(nèi)的不同區(qū)域(標(biāo)注為1-6)的長度的定量揭示，某些區(qū)域(2-5)顯示了所述UTR內(nèi)與關(guān)鍵特征有聯(lián)系的核苷酸數(shù)目的高度保守(圖2B)。相反，第一個(gè)內(nèi)含子(區(qū)域1)的長度和r及/c-i和rw/c-n的3'末端部分(區(qū)域6)的長度是高度可變的。例如，r好jc和rW/C-II可在其3，末端延伸超過1kb。某些3，UTR特征之間的長度的保守對TPP-介導(dǎo)的基因調(diào)控可起重要作用。使用反向轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)以確定7W/C轉(zhuǎn)錄物類型的量。使用多聚t引物和對所述ny/c開放閱讀框特異的引物(擴(kuò)增全部r好/c轉(zhuǎn)錄物類型)進(jìn)行的rt-pcr主要獲得r好/c-n的擴(kuò)增(圖2C)。這說明在全部檢測的物種中短轉(zhuǎn)錄物形式是最豐富的。用與r好/CmRNA的編碼區(qū)結(jié)合的探針進(jìn)行的RNA印跡分析也獲得一個(gè)與擬南芥的7^JC-II大小一致的主要信號(參見下面的進(jìn)一步討論)。用對延伸的3，區(qū)特異并不識別RNA的反向引物通過rt-pcr檢測rH/c-i和r好/c-ni(圖2D)。每個(gè)物種最少的pcr產(chǎn)物帶對應(yīng)r好/c-in，而其他帶代表源自仍保留一或兩個(gè)3，UTR內(nèi)含子的7w/c-i的產(chǎn)物，或代表少量剪接變體。用對擬南芥的r/r/c-i和r好/c-ni的3，UTR特異的探針進(jìn)行的RNA印跡分析證實(shí)，這些轉(zhuǎn)錄物類型以低拷貝數(shù)存在(參見下面的進(jìn)一步討論)并還揭示了轉(zhuǎn)錄物長度的異質(zhì)性。為評估擬南芥中的多種轉(zhuǎn)錄類型的3，末端加工是否不同，用允許所述轉(zhuǎn)錄物的特定區(qū)域擴(kuò)增的引物進(jìn)行RT-PCR。用多聚T或隨機(jī)六聚物引物產(chǎn)生的cdna未顯示r好/c-n(數(shù)據(jù)未顯示)和T7y/c-ni(圖2E)的擴(kuò)增的不同。然而，在用隨機(jī)六聚物引物產(chǎn)生的cDNA擴(kuò)增后rH/C-IPCR產(chǎn)物的相對豐度相對用多聚T衍生的cDNA顯著地上升(圖2E)。這表明大多數(shù)r好/C-IRNA不是聚腺苷酸化的，并因此代表未加工的r好jc前體轉(zhuǎn)錄物。另外，用與所述適體序列的遠(yuǎn)端下游結(jié)合的引物產(chǎn)生的cDNA獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2E)，表明7H/C-I和r好/C-HI可向擬南芥T^JC的標(biāo)記末端的下游延伸超過1kb。根據(jù)Genbank中的全長cDNA注釋(AK068703、AK065235、AK120238)，也在水稻中觀察到了具有很長3，UTR的相當(dāng)?shù)膔好/CmRNA。具有長3，UTR的mRNA的形成表明3，末端加工障礙和轉(zhuǎn)錄終止。m.硫胺素影響r好/c轉(zhuǎn)錄物水平7B7C轉(zhuǎn)錄物通過使用定量RT-PCR(qRT-PCR)獲得以確定轉(zhuǎn)錄物水平是否對增加的硫胺素濃度有所反應(yīng)。向擬南芥幼苗添加不同量的硫胺素，并用特異引物組合檢測不同ZH7C轉(zhuǎn)錄物類型。所述擴(kuò)增rw/c-n的引物組合也可與已進(jìn)行第一個(gè)3'UTR內(nèi)含子的剪接的r好/C-IRNA的子集結(jié)合。然而，后一個(gè)增產(chǎn)產(chǎn)物的貢獻(xiàn)是較小的，因?yàn)閞好/c-i轉(zhuǎn)錄物很不豐富，并且在cDNA是用多聚T引物產(chǎn)生時(shí)幾乎檢測不到(圖2E)。幼苗在含有l(wèi)mM硫胺素的培養(yǎng)基上生長后，7THC轉(zhuǎn)錄物的總量降低到幼苗在無硫胺素添加下生長時(shí)的約20%(圖3A)。T^/C-II轉(zhuǎn)錄物表現(xiàn)同等降低，但r好/c-i和r開/c-in轉(zhuǎn)錄物的拷貝數(shù)顯示變化很小或無變化。相同樣品的rna印跡分析用于確認(rèn)r及/c-n水平降低和r好/c-i和RNA水平保持相對不變(圖3B)。通過用硫胺素溶液對擬南芥幼苗噴霧后在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行r/r/c轉(zhuǎn)錄物的qRT-PCR,來評估硫胺素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物水平的改變發(fā)生的時(shí)間間隔(圖3C)。施用硫胺素后4小時(shí)，總r及/CRNA和的量降低到不添加硫胺素而測得的量的50%。26小時(shí)后，這些水平進(jìn)一步降低。有趣的是，當(dāng)在所述培養(yǎng)基中加入硫胺素時(shí)，在此分析中觀察到的的適度增加(圖3A)在所述反應(yīng)的早期階段更加顯著。由于不同的轉(zhuǎn)錄類型對硫胺素處理表現(xiàn)相應(yīng)的反應(yīng)，因此所述控制機(jī)制最可能參與RNA加工，并且所述反饋機(jī)制不太可能在啟動子調(diào)控的水平上起作用。實(shí)際上，由擬南芥轉(zhuǎn)基因系的rH/C啟動子驅(qū)動的報(bào)告子基因的表達(dá)在添加硫胺素后無變化(圖9)。預(yù)計(jì)被細(xì)胞吸收的大多數(shù)硫胺素通過成功的磷酸化反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為TPP，以產(chǎn)生比未磷酸化的維生素濃度高得多的此輔酶的濃度(Ajjawietal.，印刷中)。因此，觀察到的rHJCRNA水平總量的降低可能反映核糖開關(guān)介導(dǎo)的對增加的TPP濃度的應(yīng)答，假如TPP與植物適體的結(jié)合已知會發(fā)生的話(Sudarsanetal.，2003;Thoreetal.，2006)。在這種情況下，當(dāng)所述TPP濃度相對于在未添加硫胺素的培養(yǎng)基中生長的植物中的濃度降低時(shí)(假設(shè)所述核糖開關(guān)的動態(tài)范圍跨越此TPP濃度范圍)，應(yīng)該出現(xiàn)相應(yīng)效果。這通過比較野生型(WT)擬南芥植物和帶有硫胺素焦磷酸激酶(TPK)的雙敲除的擬南芥中的r好/c表達(dá)進(jìn)行檢測。這些突變體缺乏擬南芥中的兩種TPK異構(gòu)體，因此不能將硫胺素轉(zhuǎn)化為TPP(Ajjawietal.，印刷中)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TPK雙敲除(TPK-KO)植物在發(fā)芽的兩周內(nèi)大量地消耗儲存在種子中的TPP,所述植物依靠TPP補(bǔ)充來完成它們的生命周期(Ajjawietal,，印刷中)。如預(yù)期的，12天大的TPK-KO幼苗的7W/CRNA的qRT-PCR分析揭示了相對于WT,的量的增加和rF/C-HI的顯著降^f氐(圖3D)。另外值得注意的是，幼苗中的r及/c表達(dá)遵循一種晝夜節(jié)律，所述節(jié)律在將植物從典型日夜周期轉(zhuǎn)移至連續(xù)光照后仍然保留，并且此節(jié)律不受硫胺素處理的影響(圖10)。在總7W/CRNA和r及/c-ni中觀察到了同一種節(jié)律；表明核糖開關(guān)介導(dǎo)的反饋控制不影響所述THIIC表達(dá)的晝夜節(jié)律。iv.3'UTR長度限定基因表達(dá)水平66不同r好/CRNA類型的存在和它們應(yīng)答不同硫胺素水平的豐度變化表明TPP適體可控制RNA加工和具有不同的3，UTR的轉(zhuǎn)錄物可差別表達(dá)。前人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，擬南芥的全長適體與TPP以約50nM的表觀離解常數(shù)(KD)結(jié)合(Sudarsanetal.，2003)，并且其三級結(jié)構(gòu)(Thoreetal.，2006)與細(xì)菌TPP適體的三級結(jié)構(gòu)相似(EdwardsandFerre-D'Amare，2006;Serganovetal.，2006)。前體RNA,rH/C-l，帶有所述完整適體并因此預(yù)計(jì)會與TPP結(jié)合。相反，7W/C-ni包含大部分所述共有TPP適體序列，但5，末端的前7個(gè)核普酸由于3'UTR中的第二個(gè)內(nèi)含子的剪接被除去，并被不同的核苷酸所替換(圖4A，灰色陰影內(nèi)的序列)。使用直讀探測以測定這種改變的適體是否保留了TPP結(jié)合活性。前人已使用此試驗(yàn)通過監(jiān)測RNA與代謝物結(jié)合時(shí)的自發(fā)降解的改變模式來揭示TPP適體中的結(jié)構(gòu)改變(Sudarsanetal.，2003;Winkleretal.，2002)。所述TPP改變適體的表觀KD為約60jiM(圖4B和4C)，其比配體結(jié)合親和力損失了三個(gè)以上的數(shù)量級。此外，硫胺素不與所述改變適體結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)，并且似乎其他硫胺素衍生物也不能被此適體結(jié)合，因?yàn)樗鲞m體通過剪接交換的的區(qū)域不直接參與配體識別(EdwardsandFerre誦D'Amare，2006;Serganovetal.，2006;Thoreetal.，2006)。這些發(fā)現(xiàn)表明，一旦3'UTR的第二個(gè)內(nèi)含子的剪接發(fā)生，7^/C-III中的TPP適體的剩余部分就不再行使功能。為評估所述兩種主要3，UTR形式的可能的作用，將擬南芥的7^/C-II(188個(gè)核苷酸)和7KTC-I11(408個(gè)核苷酸)的3，UTR序列融合到熒光素酶(LUC)的編碼區(qū)，并且^f吏這些構(gòu)建體在組成型啟動子和終止元件的控制下在植物中表達(dá)。rFJC-ni可在3'末端延伸多種長度，但使用最豐富的最短形式用于所述表達(dá)分析。r好jc-m可在3，端延伸不同的長度，但是豐度最高的最短形式(對應(yīng)于GenBank編號NM179804)用于表達(dá)分析。包含rH/c-ni3'utr的融合構(gòu)建體與帶有r好/c-n3'utr的構(gòu)建提相比，LUC活性僅為約10%(圖4D)。通過引入完全阻止TPP結(jié)合但不抑制LUC表達(dá)的突變Ml和M2而排除所述III型構(gòu)建體中的改變TPP適體參與的可能。并且，使用7^/C-III3，UTR的反向互補(bǔ)序列不明顯改變LUC活性。這些數(shù)據(jù)表明，是所延伸的長度而不是所改變的TPP適體對抑制包含III型RNA的3，UTR的構(gòu)建體起抑制作用。用包含代替LUC的報(bào)告基因的構(gòu)建體獲得等同的結(jié)果，并且沉默抑制子P19的共表達(dá)排除了所觀察到的不同是由于所述報(bào)告系統(tǒng)中沉默作用的可能性(圖11)。還評估了報(bào)告基因活性的不同是否也反映在轉(zhuǎn)錄物的量中。使用qRT-PCR測定了包含擬南芥或本塞姆氏煙草(TV.6e/i幼"/mVi/ffl)的r及/c-n或的3，UTR的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄物的相對量(圖4E)。帶有兩個(gè)品種的III型RNA的長3，UTR的的構(gòu)建體以低于帶有短3，UTR的構(gòu)建體的豐度存在。由于所有報(bào)告基因構(gòu)建體都是在組成型啟動子和終止子的控制下表達(dá)的，因此轉(zhuǎn)錄起始和終止對所用構(gòu)建體都應(yīng)該是相同的。所述發(fā)現(xiàn)表明長3，UTR導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物更新的增加。因此，促進(jìn)具有延長3，UTR的mRNA產(chǎn)生的核糖開關(guān)介導(dǎo)的RNA加工的重定向會降4氐r好JC表達(dá)。此假設(shè)與前人的研究一致，所述研究表明長3，UTR誘導(dǎo)酵母(MuhlradandParker,1999)和植物(Kerteszetal.，2006)中無義介導(dǎo)的衰變(NMD)。在后一個(gè)研究中，見察到了3'UTR長度在200個(gè)核苷酸以上的mRNA的豐度的降低，這是3'UTR長度和NMD效率之間的關(guān)系。此外，所述結(jié)果表明此機(jī)制不僅參與mRNA質(zhì)量監(jiān)視(FaskenandCorbett，2005)，而且在植物中基因表達(dá)的調(diào)控中起作用。v.硫胺素反饋應(yīng)答中的核糖開關(guān)功能盡管剪接修飾的tpp適體不影響加工后的r孖/c-inRNA的表達(dá)，然而未改變的TPP適體可為可單獨(dú)調(diào)控r好/CmRNA轉(zhuǎn)錄物的加工以產(chǎn)生具有不同3，UTR長度的RNA的核糖開關(guān)的一部分。這種探索通過分析在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的擬南芥植物中包含與rw/c的完整基因組3'區(qū)(終止密碼子下游~2.2kb)融合的五GFP的報(bào)告基因構(gòu)建體的表達(dá)來進(jìn)行。硫胺素應(yīng)用導(dǎo)致蓮座期葉子中EGFP熒光的降低(圖5A和5B)。使用qRT-PCR分析，已發(fā)現(xiàn)在給予硫胺素后EGF戶和內(nèi)源T^/C轉(zhuǎn)錄物的量都降低至對照水平的約20%(圖5C)，這與對擬南芥幼苗的觀察相似(圖3)。通過RT-PCR擴(kuò)增來自轉(zhuǎn)化體的五GFP融合體和T及/C轉(zhuǎn)錄物的3'UTR序列，克隆并測序。序列分析確認(rèn)了五(^P和T^/C的等價(jià)轉(zhuǎn)錄物加工類型的形成(也參見圖2)。T^/C和五GF尸的總轉(zhuǎn)錄物量的不同可使用控制所述轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)啟動子來解釋。因?yàn)樗鰣?bào)告基因構(gòu)建體和T^/C之間的硫胺素應(yīng)答和加工后的RNA是相同的，因此可得出結(jié)論，沒有與融合的區(qū)域的其他上游序列參與所述基因控制機(jī)制。為確定硫胺素調(diào)控的作用是否通過TPP核糖開關(guān)介導(dǎo)，將降低TPP結(jié)合親和力的突變M2、M3和M4引入所述適體中(圖6A)。M2和M4突變分別妨礙所述TPP適體的莖P5和P2的形成。對M3，3個(gè)已知參與與TPP的嘧t基團(tuán)直接相互作用的核苦酸(EdwardsandFerre-D，Amare，2006;Serganovetal，2006;Thoreetal.，2006)被突變。將帶有這些變體的JH/C的3'區(qū)與五Gi，F(xiàn)融合并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到擬南芥植物中。如預(yù)料的，包含帶有所述突變適體的報(bào)告基因構(gòu)建體的植物與WT構(gòu)建體相比表現(xiàn)出對給予硫胺素的應(yīng)答的降低(M2)或完全喪失(M3和M4)(圖6B)。這些發(fā)現(xiàn)通過使用qRT-PCR測量轉(zhuǎn)錄物的相對水平而被證實(shí)。此外，包含可恢復(fù)P2形成的補(bǔ)償突變的M4報(bào)告構(gòu)建體變型表現(xiàn)出與WT相似的活性(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，TPP結(jié)合所述適體對于介導(dǎo)對細(xì)胞中變化TPP水平的應(yīng)答是必需的。然而，由所述M2構(gòu)建體表現(xiàn)的適度硫胺素應(yīng)答表明此突變可影響核糖開關(guān)功能而非僅消除所述適體對TPP的親和力(參見下面的進(jìn)一步討論)。從五GF尸-核糖開關(guān)融合體生成的mRNA的3'末端的RT-PCR分析揭示了所述突變構(gòu)建體保持II型RNA的高水平表達(dá)(圖6D)，這在WT構(gòu)建體中是典型的。然后，突變和WT核糖開關(guān)之間I型和III型RNA的兩種主要差別是明顯的。首先，III型RNA的量在M2構(gòu)建體中相當(dāng)大地降低并在M3構(gòu)建體中檢測不到(圖6E)。其次，在兩種突變體中都觀個(gè)核苷酸的條帶，也參見圖5E中的WT)。這些結(jié)果揭示了正確的核糖開關(guān)功能對與具有不同3，UTR序列和長度的mRNA的產(chǎn)生是必需的，這導(dǎo)致硫胺素依賴的基因表達(dá)的下調(diào)。vi.核糖開關(guān)功能的機(jī)制使用直讀探測以探索所述TPP核糖開關(guān)如何控制擬南芥7H/CmRNA的3，末端加工。包括第二個(gè)3'UTR內(nèi)含子的5，剪接位點(diǎn)上游14個(gè)核苷酸的適體構(gòu)建體顯示了TPP依賴的緊接所述剪接位點(diǎn)的上游8個(gè)核苷酸的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)(圖7A)。具體地，添加TPP導(dǎo)致所述5，剪接位點(diǎn)附近的核苷酸的結(jié)構(gòu)彈性的增加。因此，配體結(jié)合可增加所述剪接位點(diǎn)到所述剪接體的可達(dá)性，從而使得可除去此內(nèi)含子。對若千種植物的T好/C基因的調(diào)節(jié)5，剪接位點(diǎn)核苷酸和適體核苷酸的序列之間的堿基配對潛能進(jìn)行了研究。在檢查的全部物種中，P4-P5莖的5，端與緊接(有時(shí)是包含)所述5，剪切位點(diǎn)上游的核苷酸是互補(bǔ)的(圖7B)。這種堿基配對潛能的保守表明，所述核糖開關(guān)通過互相排斥地形成在低TPP濃度下掩蓋所述5，剪切位點(diǎn)或者在高TPP濃度下露出所述5，剪切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)而控制剪接(圖7C)。的部分硫胺素應(yīng)答性)一致。M2帶有兩個(gè)破壞所述適體的P5莖的突變(圖6A)，它們可削弱M2與TPP的相互作用并破壞碌b胺素應(yīng)答性。然而，這些突變也削弱與所述5，剪接位點(diǎn)區(qū)域的威基配對，這可使得TPP結(jié)合與此可變配對有效地竟?fàn)?，盡管預(yù)測TPP親和力是降低的。植物TPP核糖開關(guān)的一個(gè)顯著性質(zhì)是受核糖開關(guān)控制的5'剪接位點(diǎn)位于所述TPP適體的互補(bǔ)區(qū)的超過200個(gè)核苷酸的上游。所述互補(bǔ)區(qū)域之間的序列的復(fù)雜結(jié)構(gòu)組織(圖12)對于使這些位點(diǎn)在空間上靠近在一起以促進(jìn)它們的相互作用具有重要作用，這也可揭示不同植物的rH/CUTR特征之間的長度的保守性(圖2A)。有趣的是，TPP核糖開關(guān)也部分通過5，剪接位點(diǎn)附近的核苷酸和未占用的TPP適體的P4-P5區(qū)之間形成配體調(diào)節(jié)的堿基配對而控制真菌7VM77基因的可變剪接。與這些真核生物實(shí)例相反，細(xì)菌通常使用P1莖上的核苷酸以連接位于所述適體下游的表達(dá)平臺(Sudarsanetal.，2005;Winkleretal.，2002)。假定TPP適體結(jié)合配體時(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，令人驚訝的是只有部分P1和P4-P5莖用于控制目前所研究的TPP核糖開關(guān)的表達(dá)平臺功能。其中一個(gè)原因可能是需要預(yù)組織某些適體亞結(jié)構(gòu)以促進(jìn)快速配體感應(yīng)。vii.植物中TPP核糖開關(guān)功能的模型更早的研究表明，與細(xì)菌中的轉(zhuǎn)錄終止子類似的轉(zhuǎn)錄終止子也存在于真核生物中(Proudfoot，1989)。有趣的是，一段多聚尿苷區(qū)域緊接在植物所有已知TPP核糖開關(guān)實(shí)例的適體后(見圖8)，并且此元件可能參與聚合酶的釋放，與細(xì)菌中的內(nèi)在轉(zhuǎn)錄終止子一樣(YarnellandRoberts,1999;GusarovandNudler，1999)。然而，沒有識別出與如果真細(xì)菌樣轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生預(yù)期的產(chǎn)物一致的RNA轉(zhuǎn)錄物。對參與mRNA轉(zhuǎn)錄物的剪接和可變3'末端加工的代謝物調(diào)節(jié)的控制的植物中TPP核糖開關(guān)調(diào)控提出了一種不同的模型(圖7C)。當(dāng)細(xì)胞中TPP濃度低時(shí)，所述適體與所述5，剪接位點(diǎn)相互作用并阻止剪接。此內(nèi)含子帶有一個(gè)允許轉(zhuǎn)錄物剪切和多腺苷酸化的主要加工位點(diǎn)。從此位點(diǎn)的加工生成帶有3，UTR和產(chǎn)生7H/C基因高表達(dá)的r好/C-II轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)TPP濃度高時(shí)，TPP與所述適體的結(jié)合阻止與所述5，剪接位點(diǎn)配對。結(jié)果，所述剪接位點(diǎn)變得可接觸，并用于除去所述主要加工位點(diǎn)的剪接事件。隨后轉(zhuǎn)錄延長至最高達(dá)1kb,并且位于下游的加工位點(diǎn)的使用產(chǎn)生帶有長很多的3，UTR的RNA。所述長3，UTR使RNA降解增加，并且7W/C表達(dá)降低。前人的研究表明，延長的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在無轉(zhuǎn)錄物加工的情況下，從而揭示了這些加工的相互關(guān)聯(lián)(Buratowski，2005;Proudfoot，2004;Proudfootetal"2002)。對真核生物中的轉(zhuǎn)錄加工和轉(zhuǎn)錄終止如何偶聯(lián)提出了兩種不同的模型。"抗終止子"模型指出，終止位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄復(fù)合物發(fā)生導(dǎo)致終止的構(gòu)象改變(Loganeta1,1987)。相反，"魚雷"模型指出，剪切事件是轉(zhuǎn)錄終止的前提(ConnellyandManley，1988)。其他轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制也可能存在。最近的報(bào)道指出，發(fā)生在某些基因的加工位點(diǎn)下游的共轉(zhuǎn)錄剪切事件，可在控制終止中起重要作用(DyeandProudfoot,2001;Proudfoot,2004;Proudfootetal.，2002)。此外，已經(jīng)證實(shí)，自身催化的RNA剪切可參與轉(zhuǎn)錄物3'末端的形成(Teixeiraetal.，2004;Vaderetal.，1999)。盡管不能排除其他機(jī)制，但是r及/ctpp核糖開關(guān)控制可調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止的剪接和加工位點(diǎn)的現(xiàn)象與所述魚類模型一致。viii.結(jié)論所述結(jié)果揭示了一種關(guān)于TPP感應(yīng)性核糖開關(guān)如何在植物中控制基因表達(dá)和反饋控制如何維持TPP水平的機(jī)制。此外，4^研究進(jìn)一步拓展了核糖開關(guān)用于調(diào)控基因表達(dá)的已知機(jī)制的多樣性。擬南芥的TPP核糖開關(guān)管理代謝物結(jié)合以控制RNA剪接，其決定可變3，末端加工，并最終決定mRNA的穩(wěn)定性。多種植物的T^/C基因內(nèi)的序列、結(jié)構(gòu)元件和重要3，UTR特征之間的間隔的廣泛保守性表明此核糖開關(guān)機(jī)制保持在多種植物品種中。獨(dú)立于核糖開關(guān)介導(dǎo)的調(diào)控，通過調(diào)控可變3，末端加工而控制基因的可能性似乎很大，因此這種一般機(jī)制可非常廣泛地存在于真核生物中。初步結(jié)果表明r/y/c過表達(dá)在植物中引起有害效果。這突出了在植物中控制硫胺素產(chǎn)生的重要性，并可與最狄現(xiàn)的硫胺素作為植物疾病抗性的激活因子的作用聯(lián)系起來(Ahnetal.，2005;Ahnetal.，2007;Wangetal.，2006)。植物中疏胺素生物合成的控制的更深的理解也可用于代謝工程目的，這是由于植物充當(dāng)維生素Bi的初始營養(yǎng)來源。植物基因的3，區(qū)的TPP核糖開關(guān)與它們在真菌和細(xì)菌中的位置相比的獨(dú)特位置可反映對不同生物體的具體調(diào)控需要的適應(yīng)。幾乎所有已知的核糖開關(guān)都位于細(xì)菌的5'UTR(MandalandBreaker,2004;SoukupandSoukup，2004;WinklerandBreaker,2005)或真菌的5'UTR或編碼區(qū)的內(nèi)含子中(Cheahetal.，2007)，并經(jīng)常幾乎完全抑制基因表達(dá)。然而，在植物中觀察到了更精細(xì)的核糖開關(guān)調(diào)控。盡管植物可充分吸收碌u胺素，然而大部分需要必須通過內(nèi)源合成供給。與植物的自給營養(yǎng)生命周期不同，真菌和細(xì)菌有時(shí)在通過輸入滿足它們對化合物如硫氨素的完全需要的富足條件下生長，因此對在不同生命領(lǐng)域的生物體中發(fā)現(xiàn)的不同程度的調(diào)控提出了某種解釋。2.實(shí)驗(yàn)方法i.植物和植物l且織在16/8(光/暗)光照周期和60%濕度(除非另外指出)的生長室中在23。C下用土壤培育擬南芥生態(tài)型Columbia-0植抹。對于幼苗實(shí)驗(yàn)，在添加有2%蔗糖和不同濃度硫胺素的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog，1962)上并在連續(xù)光照下(除非另外指出)培育植抹。在連續(xù)光照下在土壤中培育本塞姆氏煙草植林3-5周以用于葉侵染試驗(yàn)。其他物種的植物材料來自從商業(yè)可購得的種子培育出的幼苗。ii.RNA分離和RT-PCR分析根據(jù)廠商說明用RNeasyPlantMini試劑盒(QIAGEN)從冷凍的植物組織中提取總RNA。對2-5jig總RNA進(jìn)行DNase處理，隨后根據(jù)廠商說明用SuperscriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。對于cDNA生成，使用基因特異引物或(除非另外指出)多聚T引物。cDNA用作rW/C*和EGFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄物的PCR擴(kuò)增的模板。將獲得的所有產(chǎn)物克隆到TOPO-TA克隆栽體(Invitrogen)中并通過測序(HHMIKeckFoundationBiotechnologyResourceCenteratYaleUniversity)分析。用AppliedBiosystems7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)和PowerSYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)進(jìn)行qRT-PCR。所述模板進(jìn)行連續(xù)稀釋以確定所有引物組合的引物效率。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，并通過瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線分析檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物。用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線方法分析數(shù)據(jù)并72將標(biāo)靶轉(zhuǎn)錄物的豐度標(biāo)準(zhǔn)化為前人報(bào)道(Czechowskietal.，2005)的來自基因爿77(7"3M(PP2A催化亞基)、^r5(76ft卯(EF國la)和爿"G"^^(GAPDH)的參照轉(zhuǎn)錄物。iii.植物r好/C轉(zhuǎn)錄物和基因組序列的擴(kuò)增用多聚T引物和針對終止密碼子附近的編碼區(qū)的保守部分的簡并引物克隆rH/C-IIRNA的3，UTR。對于7H/C-III轉(zhuǎn)錄物，用特異引物組合根據(jù)多聚T生成的cDNA將3，UTR擴(kuò)增為兩個(gè)片段。用一個(gè)針對所述編碼區(qū)的簡并引物和一個(gè)針對所述TPP適體的引物PCR擴(kuò)增每個(gè)3，UTR的5，部分。通過^:用一個(gè)針對所述適體的引物和一個(gè)多聚T引物獲得每個(gè)3，UTR的3'部分。克隆PCR產(chǎn)物(TOPO-TA)并測序若干獨(dú)立克隆。使用結(jié)合的序列信息以設(shè)計(jì)擴(kuò)增相應(yīng)基因組序列的引物對。根據(jù)廠商說明用植物DNAzol試劑(GibcoBRL)分離基因組DNA并將獲得的PCR產(chǎn)物克隆并測序。iv.RNA印跡分析如前人所述(Newmanetal.，1993)通過RNA印跡分析擬南芥幼苗的轉(zhuǎn)錄物。探針是對rEK:編碼區(qū)、I型和II型RNA的延伸3，UTR或?qū)φ辙D(zhuǎn)錄物EJi^A上的區(qū)域特異的。v.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉侵染試驗(yàn)為進(jìn)行瞬時(shí)基因表達(dá)分析，如CazzonelliandVelten，2006所述通過葉侵染試驗(yàn)轉(zhuǎn)染本塞姆氏煙草葉。具有多個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建體的農(nóng)桿菌系在LB培養(yǎng)基中生長過夜、離心、并將沉淀細(xì)胞重懸浮于H20中。將具有不同構(gòu)建體的細(xì)胞的OD6oo校正至相同的值(-0.8)，并將等量的農(nóng)桿菌混合，以共轉(zhuǎn)染構(gòu)建體。用螢火蟲(i^W,Vi附/^^//《)或海腎(/^"http:///re/Mybr附/s)的熒光素酶或熒光蛋白EGFP和DsRed2作為報(bào)告蛋白。用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)系統(tǒng)(Promega)測量熒光素酶活性。通常在侵染后60小時(shí)收集葉材料并冷凍于液氮中(每份樣品約100mg)。研磨后，加入100jil1X被動裂解緩沖液(PassiveLysisBuffer)(Promega)并與樣品充分混合。將樣品在水上培育l小時(shí)，然后在13000g離心20分鐘。將獲得的上清液以l:40稀釋，再加入雙熒光素酶檢測緩沖液在讀板光度計(jì)(Wallac)中測量熒光素酶活性。將縈火蟲熒光素酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化為共表達(dá)的海腎熒光素酶的活性(反之亦然)，或用Bradford蛋白試劑(BioRad)相對總蛋白量定量。為進(jìn)行熒光定量，在侵染后用TyphoonTrio+激光掃描器(AmershamBiosciences)在若干時(shí)間點(diǎn)掃描葉子。對EGFP的設(shè)置為在488nm下M和在520nmBP40下檢測。DsRed2在532nm下^L和在580nmBP30下檢測。葉子未被掃描明顯破壞，將其切開后與葉柄一起在水中培育。vi.通過FloralDip法對擬南芥的穩(wěn)、定轉(zhuǎn)染通過前人所述(CloughandBent，1998)的FloralDip法轉(zhuǎn)染擬南芥。轉(zhuǎn)染后，種子在在無菌條件下生長，所用培養(yǎng)基含有50jig/ml卡那霉素以選捧轉(zhuǎn)化體，并含有200jig/ml頭孢瘞將以防止細(xì)菌感染。在2-3周后將存活植林移植到土壤中并在進(jìn)一步生長后測定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。vii.DNA構(gòu)建體的克隆所有報(bào)告基因構(gòu)建體都基于質(zhì)粒pBinAR(H6fgenandWillmitzer，1992)，所述質(zhì)粒包含組成型啟動子CaMV35S啟動子。用引物DNA44和DNA45擴(kuò)增熒火蟲熒光素酶的編碼序列，在用BamHl和Sail限制性內(nèi)切之后，克隆到pBinAR的合適位點(diǎn)以獲得pBinARFLUC。在pBinARFLUC中，熒光素酶C末端的過氧化物體把序列被^J^^列"IAV"替換以防止過氧化物酶定位。為制備pBinARFLUC，用引物DNA46和DNA47擴(kuò)增海腎的含有熒光素酶的內(nèi)含子(CazzonelliandVelten，2003)，并在限制性內(nèi)切后克隆到pBinAR的BamHI/SalI位點(diǎn)。為制備包含熒光蛋白作為報(bào)告基因的熒光蛋白，分別用引物DNA48/49和DNA50/51擴(kuò)增EGFP和DsRed2的編碼序列。用BamHI/Sa11限制性內(nèi)切子后，將產(chǎn)物克隆到pBinAR的合適位點(diǎn)。分別用引物DNA2/52和DNA2/3擴(kuò)增擬南芥r及JCII型和III型RNA的3'UTR序列并克隆到pBinAR報(bào)告基因質(zhì)粒的Sall位點(diǎn)。為克隆基于本塞姆氏煙草的rWJC序列的相應(yīng)構(gòu)建體，分別用引物DNA53/54和DNA53/55擴(kuò)增II型和III型RNA的3'UTR。通過測序證實(shí)報(bào)告基因融合構(gòu)建體中r好JC3'UTR的序列和方向。為(在III型RNA的基礎(chǔ)上)生成所述適體突變體Ml和M2，用DNA2和DNA3擴(kuò)增擬南芥的的野生型3，UTR序列并用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆。對所述TOPOTA載體中的TH/C-III3，UTR進(jìn)行PCR誘變并通過測序證實(shí)所述核苷酸改變。隨后，通過用Sail限制性內(nèi)切使所述載體釋放出3'UTR序列并克隆到所述才艮告基因質(zhì)粒的合適位點(diǎn)。為制備包含THIC基因組中核糖開關(guān)的構(gòu)建體，用引物DNA60和DNA61從擬南芥基因組DNA中擴(kuò)增起始自的轉(zhuǎn)錄終止密碼子的2242bp的片段并克隆到所述TOPOTA載體中。因?yàn)閜BinAR包含農(nóng)桿菌源的章魚堿合成酶(OCS)終止子，其可妨礙核糖開關(guān)功能，因此用Sail和HindIII通過限制內(nèi)切除去所述OCS序列，用由兩段互補(bǔ)寡核苷酸(DNA62，DNA63)構(gòu)成的具有合適限制位點(diǎn)的連接序列重新連接所述栽體獲得載體pBinAR-term。使用這種無所述終止子序列的載體進(jìn)行隨后的克隆。用引物DNA48和DNA49擴(kuò)增EGFP的編碼序列，在用BamHl和Sail限制性內(nèi)切之后，克隆到pBinAR-term的合適位點(diǎn)。在第二步中，通過Sail消化使基因組rK/C片段從所述TOPOTA中釋放并克隆到pBinAREGFP-term的Sail位點(diǎn)。通過測序證實(shí)所述片段的序列和方向。為生成適體突變體M2、M3和M4，對含有所述r及/C3，片段的TOPOTA質(zhì)粒進(jìn)行PCR誘變，在測序證實(shí)后將所述Sail片段克隆到pBinAREGFP-term的合適位點(diǎn)。再次通過測序證實(shí)所述rW/C片段的序歹'J和方向。viii.RNA的直讀探測直讀探測基本如前人所述進(jìn)行(Sudarsanetal，2003;Winkleretal.，2002)。通過從cDNA的PCR擴(kuò)增獲得體外轉(zhuǎn)錄的DNA模板并通過包含T7啟動子的正向引物引入T7啟動子。體外轉(zhuǎn)錄、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的RNA純4匕和所述RNA的5'32P標(biāo)i己如前人所述進(jìn)4亍(Seetharamanetal.，2001)。為進(jìn)行直讀探測分析，在室溫下將標(biāo)記RNA在無TPP或含有各種TPP濃度的50mMTris畫HCl(23。C，pH8.3)、20mMMgCl2和100mMKC1中培育40分鐘。用變性10%PAGE解析剪切產(chǎn)物，用磷光成像儀(Phosphorlmager，GEHealthcare)觀察，并用ImageQuant軟件定量，通過標(biāo)準(zhǔn)化的切割RNA分?jǐn)?shù)與TPP濃度的對數(shù)值作圖，來測定表觀Ko值，其反映最大調(diào)節(jié)RNA結(jié)構(gòu)所需的TPP的一半濃度。表1.DNA引物的序列(SEQIDNO:55-131)擬南芥THIC的RT-PCR分析<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>"*"標(biāo)識,皮引入以增加qRT-PCR中的引物組合和探針的效力的核苷酸。正向和反向引物分別被簡寫為"for"和"rev"。應(yīng)理解，所公開的方法和組合物不限于所述的具體方法、方案和試劑，因而它們可有所變化。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施方案而不意欲限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只被所附的權(quán)利要求所限制。必須注意的是，除非上下文中另外明確指出，在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的"一"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指代對象。因此，例如，提及"一種核糖開關(guān)"包括多個(gè)這樣的核糖開關(guān)，提及"該核糖開關(guān)"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)核糖開關(guān)及其等價(jià)物，等等。"任選的，，或"任選地"是指后面描述的事件、情況或材料可能發(fā)生或存在，也可能不發(fā)生或不存在，且該描述包括所述事件、情況或材料發(fā)生或存在以及不發(fā)生或不存在的情形。范圍在本文中可被表示為從"大約"一個(gè)具體值，和/或到"大約"另一個(gè)具體值。當(dāng)表示為這樣一個(gè)范圍時(shí)，除非上下文另外特別指出，否則也具體地考慮和認(rèn)為公開了從前述的一個(gè)具體值和/或到前述的另一個(gè)具體值的范圍。類似地，當(dāng)通過在前面使用"大約"將數(shù)值表示為近似值時(shí)，除非上下文另外特別指出，否則應(yīng)理解成該具體數(shù)值可形成另一個(gè)應(yīng)認(rèn)為被公開的具體考慮的實(shí)施方案。還應(yīng)理解，除非上下文另外特別指出，每個(gè)范圍的端點(diǎn)在與另一個(gè)端點(diǎn)相關(guān)或獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)時(shí)都是有意義的。最后，應(yīng)該理解的是，除非文中另外特別說明，否則在明確公開的范圍中所包括的所有單個(gè)的數(shù)值和子范圍也被特別考慮和認(rèn)為被公開。不論在具體的情況下這些實(shí)施方案的全部或部分是否被明確地公開，上述的原則都適用除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語都具有與所公開方法和組合物所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文合物的實(shí)施或檢測，但是本文仍然描述了特別有用的方法、設(shè)備和材料。本文引用的出版物和因其而被引用的內(nèi)容在此特別地以援引的方式納入本文。本文不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明不能先于在先發(fā)明的這些公開內(nèi)容。且并非承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)都構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。參考文獻(xiàn)的討論說明了它們的作者的論斷，但是本申請人保留懷疑所引用文獻(xiàn)的正確性和相關(guān)性的權(quán)利。可以清楚地理解，雖然本文中提及了許多出版物，但是這些參考文獻(xiàn)并不表示承認(rèn)任何這些文件都構(gòu)成本領(lǐng)域的公知常識的一部分。'在通篇本申請的說明書和權(quán)利要求中，詞語"包含"和該詞的變化形式如"包括"和"含有"意指"包括但不限于"，而不意欲排除例如其他添加劑、組分、整數(shù)或步驟。本領(lǐng)域的技術(shù)人員僅使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)即可認(rèn)識到或能夠確定本文所述方法和組合物的具體實(shí)施方案的許多等價(jià)方案。這種等價(jià)方案意欲被隨附的權(quán)利要求所涵蓋。參考文獻(xiàn)Abreu-Goodger,C.，andMerino,E.,(2005).RibEx:awebserverforlocatingriboswitchesandotherconservedbacterialregulatoryelements.NucleicAcidsRes.W690-692.Ahn,I.P.，Kim，S.，andLee，Y.H.(2005).VitaminBlfunctionsasanactivatorofplantdiseaseresistance.PlantPhysiol.，，1505-1515.Barrick，J.E.，Corbino，K.A.,Winkler,W.C.,Nahvi，A.，Mandal，M.，Collins,J"Lee，M.,Roth,A.，Sudarsan,N.，Jona,I.,a/.(2004).NewRNAmotifssuggestanexpandedscopeforriboswitchesinbacterialgeneticcontrol.Proc.Natl.Acad.Sci.USA渭,6421-6426.Batey，R.T.,Gilbert,S.D.&MontangeR.K.Structureofanaturalguanine-responsiveriboswitchcomplexedwiththemetabolitehypoxanthine.A/ia/mt-e432，411-415(2004).Blencowe,B.J.Alternativesplicing:newinsightsfromglobalanalyses.Ce//126，37-47(2006).Borsuk,P.，a/,L-ArginineinfluencesthestructureandfimctionofarginasemRNAin卻一〃wsm腐應(yīng).5z'o/.CTew.388，135-144(2007).Buratowski,S.(2005).ConnectionsbetweenmRNA3'endprocessingandtranscriptiontermination.Curr.Opin.CellBiol.77,257-261.Buratti,E.&Baralle，F(xiàn).E.InfluenceofRNAsecondarystructureonthepre-mRNAsplicingprocess.Mo/.Ce〃5z'o/.24，10505-10514(2004).Cazzondli,C.I.，andVelten，J.(2003).Constructionandtestingofanintron-containingluciferasereportergenefromRenillareniformis.PlantMolBiolRep27，271-280.Cazzonelli，C丄，andVelten,J.(2006).Aninvivo,luciferase-based，Agrobacterium-infiltrationassaysystem:implicationsforpost-transcriptionalgenesilencing.Planta"《582-597.Cheah，M.T.，Wachter,A.，Sudarsan,N.,andBreaker,R.R.(2007).ControlofalternativeRNAsplicingandgeneexpressionbyeukaryoticriboswitches.Nature(z'mClough,S,J.，andBent,A.R(1998).Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.76,735-743.Cochrane,J.C.,Lipchock,S.V.，andStrobel,S.A.(2007).StructuralinvestigationoftheglmSribozymeboundtoitscatalyticcofactor.Chem.Biol.14,97-105.Colot,H.V.，Loros,J.J.&Dunlap，J.C.Temperature-modulatedalternativesplicingandpromoteruseinthecircadianclockgenefrequency.JWo/.5z'o/.Ce//16，5563-5571(2005).81Connelly,S"andManley,J丄.(1988).AfunctionalmRNApolyadenylationsignalisrequiredfortranscriptionterminationbyRNApolymeraseII.GenesDev2，440-452.Corbino，K.A"Barrick，J.E.,Lim,J"Welz,R.，Tucker,B丄，Puskarz,I"Mandal,M.，Rudnick,N.D.，andBreaker,R.R.(2005).EvidenceforasecondclassofS-adenosylmethionineriboswitchesandotherregulatoryRNAmotifsinalpha-proteobacteria.GenomeBiol.6，R70.Cromie，M.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方法和組合物。文檔編號C12Q1/68GK101688251SQ200880024174公開日2010年3月31日申請日期2008年5月29日優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日發(fā)明者A·瓦赫特,R·R·布雷克申請人:耶魯大學(xué)