專利名稱：：來自Bacillusthuringiensis的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白的制作方法來自5ac/7/wsf力i/r/i3^7e/^/s的半翅目和鞘翅目活性的毒素蛋白與相關(guān)申請的交叉引用本申請要求提交于2007年4月27日的美國臨時專利申請No.60/914，364和提交于2008年4月24日的美國申請No.12/109,122的優(yōu)先權(quán)。聯(lián)邦資助研究或開發(fā)相關(guān)的聲明不適用附件不適用序列表的包括序列表的紙件和本文提供的序列表的計算機可讀形式，其中含有名為"38-21(54839)SEQLIST"的文件，該文件大小為126976字節(jié)(在MS-DOS中測量的)并通過引用并入本文。該序列表由SEQIDNOs:1-59構(gòu)成。
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域一般而言，本發(fā)明涉及昆蟲抑制性的^C27/m^/i/r//^/e/l^、蛋白，更特別地，涉及抑制半翅目(hemipteran)昆蟲的及MwW/^/e刀Ws晶體蛋白。本發(fā)明描述了提供來抑制半翅目昆蟲的經(jīng)分離的多核苷酸和蛋白、轉(zhuǎn)基因植物和相關(guān)方法。本發(fā)明還提供了下述方法，用于將抑制半翅目昆蟲的A^yr/z^/e/^h晶體蛋白與另外的昆蟲控制試劑組合起來，以獲得增加的半翅目昆蟲抑制水平、半翅目昆蟲抗性管理或擴大的有害昆蟲控制譜。相關(guān)領(lǐng)域5ac/77wsf力w/ng/e刀s/s晶體蛋白革蘭氏陽性土壤細菌"ac/7/MMwr/z^/e/2Ws公知能生產(chǎn)蛋白質(zhì)性的伴胞晶體或5-內(nèi)毒素，它們對多種鱗翅目(Lepidopteran)、鞘翅目(Coleopteran)和歡翅目(Dipteran)幼蟲有毒。及^^wr/ag/e^s/s在芽孢形成期間產(chǎn)生對某些昆蟲物種有特異性毒性的晶體蛋白。AMwW/^/e/7Ws的很多不同菌林已顯示能生產(chǎn)殺昆蟲晶體蛋白，包含產(chǎn)生具有殺昆蟲活性的AMwW/^/ew/s菌林的組合物已被用作為環(huán)境可接受的殺昆蟲劑，因為它們對特定的靶標昆蟲有毒性，而對植物和其它非靶標生物沒有毒性。長久以來，天然存在的A^w/z^/e力Ws分離物的商業(yè)制劑已用于對農(nóng)業(yè)有害昆蟲的生物控制。在商業(yè)生產(chǎn)中，從發(fā)酵過程獲得的芽孢和晶體被濃縮，并被配制，以用于根據(jù)傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)實踐的葉片應(yīng)用。晶體蛋白的命名Hofteetal.，(HofteandWhiteley，Microbiol.Rev.,53:242-255，1989)的綜述描述了與已被鑒定的、對鱗翅目的昆蟲(即，毛蟲類昆蟲)具有活性的殺昆蟲性的及M盯/i^/eM/s菌林中的大多數(shù)相關(guān)的領(lǐng)域的一般狀況。該論文還描述了具有針對雙翅(即，蠅類和蚊類)和鞘翅目(即，甲蟲類)的昆蟲的殺昆蟲活性的A^w2'"g/e7w/s菌才朱。已乂人及Mw/刀g/e/^2V的若干菌才朱克隆出了編碼晶體蛋白的多種基因。Hofteetal.(1989)討論了1990年之前在及^"r/邱iei^h中鑒定出的基因和蛋白，并且展現(xiàn)了傳統(tǒng)應(yīng)用于及MwW7^/e/^/s基因和蛋白的命名和分類體系。Cry1基因編碼鱗翅目毒性的Cryl蛋白。Cry2基因編碼對鱗翅目和雙翅目都有毒性的Cry2蛋白。Cry3基因編碼鞘翅目毒性的Cry3蛋白，而Cry4基因編碼雙翅目毒性的Cry4蛋白，等等。近來，已提出了一種新的命名法，其基于氨基酸序列同源性而非昆蟲靶標特異性來對Cry蛋白加以系統(tǒng)分類。該分類體系和昆蟲抑制性的及^w&^7e/7s/s基因的全面歹寸表在NeilCrickmore網(wǎng)頁(于lifesci.Sussex,ac.uk/home/Neil—Crickmore/Bt/index.html通過互聯(lián)網(wǎng)上的CambridgeUniversity進入)中的殺昆蟲毒性蛋白(InsecticidalToxinProteins)歹'J表中有所概括。晶體蛋白毒性模式所有5-內(nèi)毒素晶體都通過攝入對昆蟲幼蟲有毒性。晶體在昆蟲中腸中的溶解使得5-內(nèi)毒素的前毒素形式釋放，在大多數(shù)情況下，其隨后被中腸蛋白酶加工為活性毒素。被活化的毒素能通過受體蛋白識別昆蟲中腸上皮的刷狀緣(brush-border)并與之結(jié)合。已從某些昆蟲幼蟲分離出了若干可能的晶體蛋白受體(Jurat-FuentesJL,AdangMJ.Biochemistry.45(32):9688，2006;GriffittsJSetal.,Science.307(5711):922，2005;Jurat-FuentesJL，AdangMJ.EurJBiochem.;271(15):3127，2004)?；钚缘鞍椎慕Y(jié)合之后是毒素分子的插入(intercalation)和聚集，從而在中腸上皮中形成孔。該過程導致滲透失衡、溶脹(swelling)、中腸上皮中排列的細胞的裂解以及最終導致幼蟲死亡。隨著分子遺傳學技術(shù)的出現(xiàn)，已分離出了若干種5-內(nèi)毒素基因，并且確定了它們的DNA序列。這些基因已被用于枸建某些經(jīng)遺傳工程改造的及M"W/^/e/^/s產(chǎn)物(已被許可用于商業(yè)使用)。近來的已開發(fā)出了新的5-內(nèi)毒素遞送系統(tǒng)，包含含有并表達經(jīng)遺傳工程改造的5-內(nèi)毒素基因的植物。已在表達5-內(nèi)毒素基因的多種轉(zhuǎn)基因作物植物(包括玉米、棉花、馬鈴薯、番茄和水稻)中良好地建立了對鱗翅目和鞘翅目害蟲的控制。與5-內(nèi)毒素基因在作物植物中表達相關(guān)的優(yōu)點包括增加的產(chǎn)率和化學殺昆蟲劑的使用減少。表達昆蟲抑制性的5-內(nèi)毒素基因的轉(zhuǎn)基因的作物的優(yōu)點已使得在作物(例如玉米和棉花)中廣泛使用。不幸的是，目前可獲得的5-內(nèi)毒素基因不能提供對困擾作物生產(chǎn)的所有有害昆蟲的控制。特別地，仍必須通過在半翅目昆蟲導致?lián)p害的作物中使用殺昆蟲劑來控制半翅目昆蟲。半翅目或"刺吸式(piercing/sucking)"昆蟲對植物尤其有害，因為已知它們還傳插_損害性植物病毒，其導致植物對細菌和真菌感染更敏感。因此需要能在作物中抑制半翅目有害昆蟲的其它材料和方法。還需要獲得具有不同作用模式的若干不同類型的半翅目昆蟲控制試劑，以作為半翅目昆蟲抗性管理工具用于轉(zhuǎn)基因植物中。既然需要半翅目昆蟲控制試劑，已公開了多種手段。美國專利No.5,723,440描述了一種CytlBal蛋白，其聲稱有針對半翅目昆蟲的活性。但是Wellman-Desbiens和Cote(J.Econ.Entomol.98(5):1469-1479.，2005)無法用半翅目昆蟲力e^erw^驗證該活性。美國專利No.5，885，963公開聲稱及^i/W/^ye/7W、i則e/e腦、Cyt毒素可用于抑制半翅目害蟲。更近來，US20060242732公開了具有針對半翅目昆蟲Ar《M/i/eo7aWs的活性的及^yr/z^/ei^/5"晶體蛋白。這些蛋白與美國專利Nos.5,723,440和5，885，963中描述的Cyt蛋白無關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容考慮到上述問題，開發(fā)了本發(fā)明。本發(fā)明首先涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列。本發(fā)明的多核苷酸序列還可編碼與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)昆蟲抑制性多肽序列具有至少大約80%、90%、95%或100%的序列同一性的多肽序列。在某些實施方式中，多核苦酸編碼SEQIDNO:5的多肽序列。本發(fā)明的經(jīng)分離的多核苷酸編碼抑制半翅目(Hemipteran)昆蟲、17異翅目(Heteropteran)昆蟲或同翅目(Homopteran)昆蟲的TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段。半翅目昆蟲可以是昆蟲，同翅目昆蟲可以是辨蟲、跳蟲(hopper)或粉虱。被編碼的TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段在4r^/s膳食中至少大約5ppm、50ppm、250ppm或500ppm(百萬分之部分數(shù))的TIC807蛋白或蛋白片段的Z^7^膳食濃度下能抑制Z/^/y。多核苷酸編碼的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段包含至少250個氨基酸殘基的肽序列?？蓪幋aTIC807的這種經(jīng)分離的多核苷酸加以修飾，以較之天然編碼序列而言改進在植物中的表達。設(shè)計來在植物中表達的編碼TIC807的多核苷酸的一種實施方式被提供為SEQIDNO:6。用于IDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。在其它一些實施方式中，設(shè)計來在植物中表達的多核苷酸編碼具有N-末端葉綠體或質(zhì)體靶向肽的TIC807蛋白。一種實施方式被提供于SEQIDNO:7中，其包含設(shè)計來在植物中表達TIC807毒素的多核苷酸，所述多核苷酸還與編碼質(zhì)體靶向肽的核香酸序列以符合讀碼框的形式相連。表達后，質(zhì)體把向肽與TIC807可操作地相連，其功能為指導TIC807毒素插入植物質(zhì)體。本發(fā)明的其它一些經(jīng)分離的多核苷酸包括在高度嚴緊條件下與天然Ac/77wsM"W/^/e/w、TIC807基因(SEQIDNO:4)或與i史計來改進TIC807的植物表達的基因(其較之SEQIDNO:4示出的天然編碼序列而言具有富集的G+C含量(SEQIDNO:6))雜交的多核苷酸。在嚴緊條件下雜交的多核苷酸可選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7構(gòu)成的組。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因植物或源于其的植物部分，其中包含TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，TIC8O7昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列。轉(zhuǎn)基因植物或18植物部分以下述濃度包舍TIC807蛋白或蛋白片段，所述濃度為每克鮮重植物組織至少大約5pg至大約25(VgTIC807蛋白或蛋白片段，或者介于這之間的任何的量。多核普酸編碼的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段包含至少250個氨基酸殘基的肽序列。轉(zhuǎn)基因植物部分可以是細胞、葉、莖、花、萼片、果、根或種子。本發(fā)明還提供了包含下述多核苷酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述多核苷酸編碼TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列。多核苷酸編碼的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段包含至少250個氨基酸殘基的肽序列。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以是細菌細胞或植物細胞。本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞可選自大麥、玉米、燕麥、水稻、黑麥、高粱、草皮草、甘蔗、小麥、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、巻心菜、油菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘類、棉花、葫蘆、桉樹、亞麻、蒜、葡萄、洋蔥、萵苣、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、楊樹、松樹、向日葵、紅花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、煙草、番茄、裝飾植物、灌木、堅果、鷹嘴豆、木豆、稷、啤酒花(hops)和牧場草植物細胞構(gòu)成的組。在某些實施方式中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞是棉花植物細胞。源于經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物宿主細胞的植物、從源于經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞的植物產(chǎn)生的種子以及來自該種子的后代植物也包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌宿主細胞可選自^gr由"er/咖、^3"7/ws、^c力er/c力/a、Sa7/zo/7e/7a、i^ei/t/o/ffo/2as和j力/zo6/"忠細菌細胞構(gòu)成的組。在某些實施方式中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌細胞是》a"7/MMi/W/^/e/7^V細胞。本發(fā)明的另一實施方式涉及帶有載體pIC17040的^c力er/c力7s菌林SIC8088的生物上純的或經(jīng)分離的培養(yǎng)物，其于2007年3月16日被保藏于AgriculturalResearchCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL)，Peoria，IllinoisU.S.A.,檢錄號為No.NRRLB-50030。本發(fā)明還提供了控制A^m的方法，所述方法包括下述步驟(a)19提供m抑制量的TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列；以及(b)使A^7^與抑制量的多肽序列接觸，由此控制A^m昆蟲。用于該方法的多肽序列還可與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)昆蟲抑制性多肽序列具有至少大約90%或100%的序列同一性。多核苷酸編碼的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段包含至少250個氨基酸殘基的肽序列。在該方法的一種實施方式中，可在步驟(a)中于A^^膳食中提供i;7^^抑制量的多肽序列，可在步驟(b)中通過令Z/^AJ進食該膳食來接觸Af^/s。在所述方法的一種更特別的實施方式中，Ar^/s膳食是轉(zhuǎn)基因植物。當該方法的Z/^^膳食是轉(zhuǎn)基因植物時，多肽序列的A^^抑制量為每克轉(zhuǎn)基因植物鮮重組織至少大約5pg至大約250pg。在該方法的其它一些實施方式中，在步驟(a)中通過將包含多肽的組合物噴霧到植物上，提供了Zj^m抑制量的多肽序列。用于所述方法的該實施方式中的組合物包含表達所述多肽的細菌細胞或細菌芽孢。在所述方法的一些特別的實施方式中，細菌細胞或細菌芽孢是A3C_/77m細胞或Aacy77M芽孢。用于該方法中的組合物還包含含有多肽的伴胞晶體。在控制Ap^m的這些方法中的任何中，植物可以是被Z7gM侵害的。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:4編碼的天然^2c/"m^z/W/^/e/Ly/;TIC807蛋白中含有的或SEQIDNO:4的互補序列中含有的序列的至少12個連續(xù)核苷酸。此類經(jīng)分離的寡核苷酸可用于檢測SEQIDNO:4或編碼與TIC807相關(guān)的昆蟲抑制性蛋白的相關(guān)多核苷酸。本發(fā)明還提供了包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53中含有的或SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的互補序列中含有的序列的連續(xù)12個核苷酸的經(jīng)分離的寡核苷酸。這些經(jīng)分離的寡核苷酸可用子檢測SEQIDNO:6或設(shè)計來用于在植物中編碼TIC807蛋白的多核苷酸或編碼TIC807蛋白的相關(guān)多核苷酸。本發(fā)明還提供了試劑盒，用于檢測樣品中的多核苷酸序列，所述試劑盒包含與SEQIDNO:6的多核苷酸序列或其互補序列特異性雜交的寡核苷酸和與所迷寡核苷酸雜交的對照多核苷酸。本發(fā)明的其它一些實施方式包括組合物，所述組合物包含至少兩條至少12個核苷酸的簡并寡核苷酸引物，其中，簡并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的多肽序列。這些寡核苷酸引物組合物可用于在植物或細菌樣品中檢測編碼TIC807蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供了在樣品中檢測或分離編碼TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟(a)選擇能產(chǎn)生擴增子的筒并寡核苷酸引物對，其中，筒并寡核苷酸引物對的核普酸序列源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列；(b)從樣品中的多核苷酸序列產(chǎn)生擴增子；以及(c)檢測或分離擴增子，由此檢測或分離樣品中編碼TIC807蛋白或TIC8O7相關(guān)蛋白的多核苷酸。在該方法中，檢測或分離的擴增子可編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%、70%或90%的序列同一性的多肽。本發(fā)明中還提供了在樣品中檢測或分離編碼TIC807蛋白的多核苷酸的其它一些方法，所述方法包括下述步驟(a)選擇簡并寡核苷酸或簡并寡核苷酸集，其中，筒并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的ITC807多肽序列；(b)將簡并寡核苷酸或簡并寡核苷酸集與樣品雜交；(c)檢測樣品中與多核苷酸的雜交，由此檢測樣品中編碼TIC807的多核苷酸，以及(d)分離在步驟(c)中通過雜交檢測到的多核苷酸。在該方法中，檢測的多核苷酸可編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%、70%或90%的序列同一性的多肽。本發(fā)明還提供了在植物中表達TIC807蛋白的方法，所述方法包括下述步驟(a)向植物細胞基因組中插入以5，至3，的方向包含下述重組雙鏈DNA分子的核酸序列，其中，所述重組雙鏈DNA分子包含i.在植物細胞中發(fā)揮功能的啟動子；ii.編碼包含TIC807昆蟲抑制性蛋自或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70°/序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻譯.核.舉酸序列，其在植物細胞中發(fā)揮功能以產(chǎn)生聚腺苦化，其中，所述啟動子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻譯核苷酸序列可操作相連；(b)獲得含有步驟(a)的核酸序列的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞，以及(c)從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞再生表達TIC807蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物。在該方法中，步驟(a)的多核苷酸序列可編碼與SEQIDNO:5具有至少90%序列同一性的TIC807蛋白或可編碼SEQIDNO:5的TIC807蛋白。該多核苷酸序列可以是SEQIDNO:6或設(shè)計來在植物中表達的編碼TIC807蛋白的另外的序列。設(shè)計來在植物中表達的多核苷酸序列包括^f旦不限于SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。多核苷酸編碼的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段包含至少250個氨基酸殘基的肽序列。在該方法的其它一些實施方式中，步驟(a)的編碼TIC807蛋白的多核苷酸序列與編碼質(zhì)體靶向多肽的多核苷酸序列可操作地相連。SEQIDNO:8的多肽包含與質(zhì)體靶向多肽(可用于本方法的某些實施方式)可操作相連的TIC807蛋白。本發(fā)明還提供了重組DNA載體，其以5，至3，的方向包含i.在植物細胞中發(fā)揮功能的啟動子；ii.編碼包含TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻譯核苷酸序列，其在植物細胞中發(fā)揮功能以產(chǎn)生聚腺苷化，其中，所述啟動子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻譯核苷酸序列可操作相連。在這些載體中，多核苷酸序列還可編碼與SEQIDNO:5具有至少90%序列同一性的TIC807蛋白或者可編碼SEQIDNO:5的TIC807蛋白。多核苷酸編碼的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段包含至少250個氨基酸殘基的肽序列。編碼TIC807蛋白的多核苷酸序列可以是設(shè)計來在植物中表達的序列。設(shè)計來在植物中表達的多核苷酸序列包括但不限于SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:WseqIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。在其它一些實施方式中，編碼TIC807蛋白的多核苷酸序列與編碼質(zhì)體靶向多肽的多核苷酸序列可操作地相連。本發(fā)明的載體可包含編碼SEQIDNO:8的多肽的多核苷酸序列，例如，所述多核苷酸序列是SEQIDNO:7。本發(fā)明的載體還可包含編碼可選擇標志物基因的多核苷酸。賦予對AMPA、莠去津、溴苯腈、茅草枯、麥草畏、草甘膦、潮霉素、曱氨蝶呤、新霉素、草銨膦、磺酰脲或2，4-D或其組合的抗性的可選擇標志物基因可用于本發(fā)明的載體。本發(fā)明還提供了從植物或種子生產(chǎn)的商品，其中，所述商品含有可檢測到的量的TIC807蛋白或編碼TIC807蛋白的多核苷酸。該商品可源于棉花植物或棉花植物種子，或者類似地，源于玉米、水稻、小麥、大豆、鷹嘴豆、木豆、甘蔗、甜菜等。例如，當所述商品源于棉花植物或棉花植物種子時，商品可以是棉絨、油、粗粉或外殼(hulls)。本發(fā)明還提供了控制至少一種有害昆蟲的方法，所述方法包括下述步驟(a)在組合物中提供至少兩種不同的有害昆蟲抑制性試劑，所述組合物包含(i)昆蟲抑制量的TIC807蛋白和昆蟲抑制量的(ii)有害昆蟲攝入后發(fā)揮功能以抑制有害昆蟲內(nèi)的生物學功能的至少一種核糖核苷酸序列和/或(iii)昆蟲抑制量的并非TIC807蛋白的至少一種昆蟲抑制性蛋白；和(b)令有害昆蟲或害蟲與抑制量的組合物接觸。在該方法中，被控制的有害昆蟲可以是半翅目昆蟲、異翅目昆蟲或同翅目昆蟲。被該方法控制的一種半翅目昆蟲是Af^/s昆蟲。被該方法控制的同翅目昆蟲可以是蚜蟲、跳蟲或粉虱。在該方法中，TIC807昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列。用于該方法的TIC807蛋白還可包含長度為至少250個氨基酸殘基的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段。當生物學功能被核糖核苷酸抑制時，ii)中有害昆蟲內(nèi)的生物學23功能可以是必要生物學功能。被該方法抑制的必要生物學功能可以是有害昆蟲的必要蛋白或核糖核酸提供的，其預(yù)測功能選自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)控，離子調(diào)控和運輸，消化酶的合成，細胞膜勢能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，細胞分裂，能量代謝，呼吸和凋亡構(gòu)成的組。Ar^/s中，必要生物學功能可被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出與選自SEQIDNO:24至SEQIDNO:39構(gòu)成的組的核苷酸編碼序列大約80至大約100%序列同一性的大約21至大約5000個連續(xù)的核苷酸。在該方法的其它一些實施方式中，并非TIC807蛋白的一種昆蟲抑制性蛋白可源于&"77mMw//^ie/^/s。并非TIC807蛋白的該昆蟲抑制性蛋白可選自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI-009、AXMI-014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI-028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128構(gòu)成的組。在其它一些實施方式中，在植物中表達并非TIC807蛋白的兩種A^ws抑制性蛋白，所述兩種ij^"s抑制性蛋白可包含TIC809和TIC810。在該方法的其它一些實施方式中，第一和第二有害昆蟲可被組合物控制。在所述方法的這些實施方式中，笫二有害昆蟲可被組合物的核糖核苷酸序列或被組合物中并非TIC807的蛋白抑制。該笫二有害昆蟲可以是鱗翅目有害昆蟲。第二有害昆蟲可被選自CrylA蛋白、CrylB蛋白、CrylC、CrylA/CrylF嵌合蛋白和Cry2Ab蛋白構(gòu)成的組的蛋白抑制。在控制至少一種有害昆蟲的方法的某些實施方式中，組合物提供了協(xié)同性的昆蟲抑制效果。在控制至少一種有害昆蟲的方法的其它一些實施方式中，組合物提供了加合性的昆蟲抑制效果。在控制至少一種有害昆蟲的方法中，組合物可以是轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供了保護植物抵擋A^^侵害的方法，所述方法包括在植物中表達力7^/s抑制量的至少兩種不同的A^m抑制性試劑，其中，所述A^"s抑制性試劑包含(i)Lygus抑制量的TIC807蛋白；(ii)Lygus抑制量的、并非TIC807蛋白的至少一種Lygus抑制性蛋白和/或(iii)Lygus抑制量的至少一種核糖核普酸序列，其被Lygus攝入后發(fā)揮功能以抑制Lygus內(nèi)的生物學功能。A^z^中的該必要生物學功能可由Z/^^的必要蛋白或核糖核酸提供，其預(yù)測功能選自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)控，離子調(diào)控和運輸，消化酶的合成，細胞膜勢能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，細胞分裂，能量代i射，呼吸和凋亡構(gòu)成的組。Z/《z^中的該必要生物學功能可被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出與選自SEQIDNO:24至SEQIDNO:39構(gòu)成的組的核苷酸編碼序列大約80至大約100%序列同一性的大約21至大約5000個連續(xù)的核苷酸。在該方法的某些實施方式中，并非TIC807蛋白的抑制性蛋白可源于》a"7/m^wrii^j'e/^is。并非TIC807蛋白的A^m抑制性蛋白可選自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI-009、AXMI—014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI—028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128構(gòu)成的組。在其它一些實施方式中，在植物中表達并非TIC807蛋白的兩種Zj^/s抑制性蛋白，所述兩種Af^a抑制性蛋白可包含TIC809和TIC810。在該方法中，TIC807昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列。用于本方法的TIC807蛋白還可包含長度為至少250個氨基酸殘基的TIC807昆蟲抑制性蛋白片段。在該方法的某些實施方式中，A^m抑制性試劑的表達提供了協(xié)同性的A^m抑制效果。在該方法的其它一些實施方式中，Ar^/s抑制性試劑的表達提供了加合性的At^aj抑制效果。通過使用"i亥方、法，可^f呆護;f直if勿^氐擋Af^us力esj5ei"i/5"或Z7gys7//7eo7ar/s。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的蛋白，其中所述經(jīng)分離的蛋白包含SEQIDNO:5中含有的、長度為至少9個氨基酸的多肽序列。所述經(jīng)分離的蛋白可具有長度為至少12、16、32或250個氨基酸的多肽序列。長度為至少32個氨基酸的經(jīng)分離的蛋白可具有與SEQIDNO:5內(nèi)含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約80%、90%或95%序列同一性的多肽序列。長度為至少250個氨基酸時，本發(fā)明的經(jīng)分離的蛋白可以是昆蟲抑制性蛋白。至少250個氨基酸的經(jīng)分離的昆蟲抑制性蛋白可抑制Zj^z/a在某些實施方式中，至少250個氨基酸的經(jīng)分離的昆蟲抑制性蛋白以至少大約5ppm、50ppm、250ppm或500ppm蛋白的Z，s膳食濃度抑制A^m。經(jīng)分離的蛋白還可以是SEQIDNO:5的蛋白。經(jīng)分離的蛋白還可包含載劑蛋白。該載劑蛋白可以是清蛋白或KLH蛋白。本發(fā)明的經(jīng)分離的蛋白還可包含選自指示劑、氨基酸間隔、氨基酸接頭、信號序列、葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列、液泡靶向序列、停止轉(zhuǎn)移序列、跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白純化配體或其組合構(gòu)成的組的共價修飾。本發(fā)明還提供了與TIC807蛋白或源于其的肽表位特異性結(jié)合的抗體，其中，TIC807蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供了用于在樣品中檢測TIC807蛋白的試劑盒，所述試劑盒包含a)與TIC807蛋白或源于其的肽表位特異性結(jié)合的抗體，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9個連續(xù)氨基酸；和b)包含SEQIDNO:5的至少9個連續(xù)氨基酸的對照TIC807蛋白或肽表位。下面參考附圖，詳細描述本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點以及本發(fā)明的多種實施方式的結(jié)構(gòu)和操作。附圖簡述本發(fā)明的附圖被包括進申請文件并作為其一部分，闡釋了本發(fā)明的實施方式，并和說明書一起解釋了本發(fā)明的原則。在附圖中圖1闡釋了TIC807(SEQIDNO:5)和Cryl5Aa(SEQIDNO:264丄)之間的Needleman—Wunsch全局t匕對。圖2闡釋了J^n^sc"r/咖介導的植物轉(zhuǎn)化載體pMONl05863，其含有靶向質(zhì)體的TIC807植物表達盒和新霉素選擇盒(位于"r由"er/u邁邊界序歹U之內(nèi))。圖3闡釋了J^ro6ac&W咖介導的植物轉(zhuǎn)化載體pMON105864，其含有靶向質(zhì)體的TIC807植物表達盒和新霉素選擇盒(位于々i"c^"eW咖邊界序歹'J之內(nèi))。優(yōu)選實施方式詳述I.定義在本文中使用時，提到昆蟲抑制時，短語"加合性效果"指通過組合至少兩種不同的昆蟲抑制性試劑獲得的下述抑制效果，其a)定量上等于兩種試劑的組合的預(yù)期加合效果，和/或b)定性上等于每種試劑自身施用獲得的效果的組合。定量效果的例子包括但不限于指示兩種昆蟲抑制性試劑針對已知昆蟲革巴標的增加的昆蟲抑制活性的LC5。、EC5。、IC5。、百分比死亡率或百分比發(fā)育遲緩值的改變。加合性定性效果的例子包括但不限于反映出每種昆蟲抑制性試劑展示的譜(即，一種試劑提供的半翅目昆蟲抑制和另一試劑提供的鱗翅目昆蟲抑制的組合)的簡單組合的擴展的昆蟲抑制鐠(即，半翅目和鱗翅目昆蟲)。短語"共有序列"在本文中使用時表示這樣氨基酸、DM或RM序列它們是通過比對兩條或多條同源序列以及得到代表共同的氨基酸、DNA或RNA序列的新的序列而制造出的。術(shù)語"構(gòu)建體"在本文中使用時表示源于任何來源的、能基因組整合或自主復制的任何重組多核苷酸分子，例如，質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復制多核苷酸分子、噬菌體或線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RM多核苷酸分子，其中包含這樣的多核苷酸分子，其中，一個或多個多核苷酸分子已以功能可操作的方式相連(即，可操作地相連)。短語"生物功能等同物"在本文中使用時表示這樣的肽、多肽和蛋白，它們含有與本發(fā)明的TIC807蛋白相似的序列或結(jié)構(gòu)特征，并且展示出與本發(fā)明的TIC807蛋白相同或相似的昆蟲抑制活性。生物功能fR物還包括這樣的肽、多肽和蛋白，它們能與針對TIC807蛋白產(chǎn)生的單克隆/或多克隆抗體反應(yīng)(即，特異性結(jié)合)，并且展示出與TIC807蛋白相同或相似的昆蟲抑制活性。短語"DNA構(gòu)建體"在本文中使用時表示任何下述DNA分子，其中，已共價相連了兩條或多條一般不同的DNA序列。DNA構(gòu)建體的例子包括但不限于源于任何來源的、能基因組整合或自主復制的質(zhì)粒、粘粒、病毒、BACs(細菌人工染色體)、YACs(酵母人工染色體)、植物微型染色體、自主復制序列、噬菌體或線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA序列?？赏ㄟ^多種方法來裝配DNA構(gòu)建體，所述方法包括但不限于重組DM技術(shù)、DNA合成技術(shù)、PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)或者技術(shù)的任何組合。有關(guān)DNA構(gòu)建體的上下文中，短語"異源啟動子，，在本文中使用時指i)源于與可操作相連的結(jié)構(gòu)基因不同的來源的啟動子，或ii)源于與可操作相連的結(jié)構(gòu)基因相同的來源的啟動子，但是啟動子的序列較之其最初形式有所修飾。短語"高度嚴緊雜交條件"指這樣的核酸雜交條件，所述條件包含大約1XSSC的鹽濃度、大約0.1%SDS的去垢劑濃度和大約50。C的溫度或者其等同條件。術(shù)語"同源體，，在本文中使用時表示通過DM序列或被編碼的蛋白序列的同一性而與第二基因相關(guān)的基因。是同源體的基因可以是通過物種形成事件分開的基因(見"直向同源體")。是同源體的基因還可以是通過遺傳復制事件分開的基因(見"平行同源體")。同源體可來自相同或不同的生物，其可在相同或不同的生物中執(zhí)行相同的生物學功能。術(shù)語"昆蟲"在本文中使用時表示Arachnid、鞘翅目、Ctenophalides、雙翅目、半翅目、同翅目、異翅目、膜翅目或鱗翅目昆蟲的任何胚胎、幼蟲、蛹或成年形式。術(shù)語"昆蟲抑制量"表示導致對昆蟲生長、昆蟲發(fā)育、昆蟲生殖、昆蟲進食行為、昆蟲交配行為的任何可測量到的抑制和/或昆蟲在植物上進食導致的負面影響的任何可測量到的減少的TIC807多肽、核糖核苷酸或并非TIC807蛋白的蛋白的量。類似地，"A^7^抑制量"指導致對Af5""s生長、Ar^/s發(fā)育、Ar^/s生殖、Ar^/s進食行為、Z/^ta交配行為的任何可測量到的抑制和/或Arg^在植物上進食導致的負面影響的任何可測量到的減少的TIC807多肽、核糖核苷酸或并非TIC807蛋白的蛋白的量。在本文中使用時，提到"經(jīng)分離的DNA分子"時，這表示，DNA分子是單獨或與其它組合物組合存在的，但并非在其天然環(huán)境中。例如，只要在植物基因組的DNA中天然發(fā)現(xiàn)的編碼序列、內(nèi)含子序列、非翻譯引導序列、啟動子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等處于其天然狀態(tài)下被觀察到的植物基因組中，它們就不被認為是與植物基因組分離的。但是，只要結(jié)構(gòu)和組分并不在植物基因組中，在本公開文本中，這些組分中的每種或者這些組分的亞部分就是"經(jīng)分離的，，。類似地，只要核苷酸序列不在結(jié)構(gòu)最初纟皮觀察到的^c277m^wri/^2'e/w、細菌的MA中，編碼Ac/77ws^iyr/i^/e/^2'51殺昆蟲蛋白或者該蛋白的任何殺昆蟲變體的核苷酸序列就將是經(jīng)分離的核苷酸序列。就本公開文本的目的而言，編碼與天然及""/\'/7^'<5/^/<核苷酸序列所編碼的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的人工核苷酸序列將被認為是經(jīng)分離的。就本公開文本的目的而言，任何轉(zhuǎn)^^因核苷酸序列，即，插入植物細胞基因組中的DM的核苷酸序列將被認為是經(jīng)分離的核苷酸，無論其是否存在于用于轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因事件發(fā)生的植物細胞的質(zhì)粒中，還是在轉(zhuǎn)基因事件的基因組中，以可被檢測到的量存在于源于轉(zhuǎn)基因事件的組織、后代、生物樣品或商品中。如果DNA分子可從細胞或組織或勻漿(來自植物或種子或植物器官)提取，或者可從提取自細胞或組織或勻漿(來自植物或種子或植物器官)的DNA或RNA作為擴增子產(chǎn)生，那么核苷酸序列或源于其的任何片段將因此被認為是經(jīng)分離的或可分離的，其中任何植物或種子或植物器官都源于從轉(zhuǎn)基因事件29獲得的一類材料。短語"有害昆蟲攝入后發(fā)揮功能以抑制生物學功能的核糖核苷酸序列"指這樣的RNA序列，其包含與昆蟲基因組內(nèi)的核苷酸序列編碼的RNA分子基本同源的序列，其提供對昆蟲的抑制。在本文中使用時，提到核酸或多肽序列時，術(shù)語"基本同源，，或"基本同源性"指這樣的核酸或多肽序列，其與另一核苷酸或多肽序列具有大約65%至大約70%的序列同一性，或者更優(yōu)選大約80%至大約85°/。的序列同一性或最優(yōu)選大約90%至大約95%的序列同一性，至大約99°/?；?00%的序列同一性。在本文中使用時，在提到昆蟲抑制時，短語"協(xié)同性效果，，指通定量上大于兩種試劑的組合的預(yù)期加合效果，和/或b)定性上不同于各試劑單獨施用獲得的任何效果。定量效果的例子包括但不限于指示兩種昆蟲抑制性試劑針對已知昆蟲靶標的增加的昆蟲抑制活性的LC5。、EC5Q、IC5Q、百分比死亡率或百分比發(fā)育遲緩值的改變。協(xié)同性定性效果的例子包括但不限于不反映每種昆蟲抑制性試劑單獨展示的鐠(即，一種試劑提供的半翅目昆蟲抑制和另一試劑提供的鱗翅目昆蟲抑制的組合)的簡單組合的擴展的昆蟲抑制語(即，半翅目、同翅目和鱗翅目昆蟲抑制)。在本文中使用時，短語"TIC807蛋白"表示展示出與SEQIDNO:5含有的相應(yīng)多肽序列有至少70%的序列同一性的至少250個氨基酸的昆蟲抑制性蛋白。在本文中使用時，短語"TIC807相關(guān)蛋白"表示展示出與SEQIDN0:5含有的相應(yīng)多肽序列有至少45%的序列同一性的至少250個氨基酸的昆蟲抑制性蛋白。在本文中使用時，短語"可操作相連"表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在啟動子的上下文中，"可操作相連"表示，啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時，"可操作相連，，表示啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物將高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5，非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的。可以可操作相連的核酸序列包括但不限于提供基因表達功能的序列(即，基因表達元件，例如啟動子、5，非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3，非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子)，提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即，T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)，提供選擇性功能的序列(即，抗生素抗性標志物、生物合成基因)，提供可計分標志物功能的序列(即，報道子基因)，體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即，多接頭序列，位點特異性重組序列)和提供復制功能的序列(即，細菌的復制起點、自主復制序列、著絲粒序列)。在本文中使用時，短語或術(shù)語"序列同一性，，、"序列相似性，，或"同源性"用于描述兩條或多條核苷酸序列之間的關(guān)系。兩條序列之間的"序列同一性"百分比是通過在比較窗上對兩條被最優(yōu)對齊的序列加以比較來測定的，其中，為了對兩條序列進行最優(yōu)對齊，比較窗中序列的部分較之參照序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即，缺口)。通過這樣來計算百分比測定兩條序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)，產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較窗中總位置數(shù)再用結(jié)果乘以100,產(chǎn)生序列同一性百分比。較之參照序列而言在每個位置都相同的序列被認為與參照序列相同，反之亦然。如果第一核苷酸序列展示出與第二序列或參照序列的完全互補性，那么第一核苷酸序列(當以5，至3，觀察時)就被認為是第二或參照核苷酸序列(當以3，至5，觀察時)的"互補序列"或與之互補。在本文中使用時，當序列之一以5，至3，讀出的每個核苷酸與另一序列以3，至5，讀出的每個核苷酸互補時，核酸序列分子就被認為展示出"完全互補性"。與參照核苷酸序列互補的核苷酸序列將展示出與參照序列的反向互補序列相同的序列。在本文中使用時，短語"SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列"指SEQIDNO:5中與另一多肽序列比對時產(chǎn)生最高百分比同一性的多肽序列。在本文中使用時,"比較窗"表示至少6個連續(xù)位置(通常大約50至大約100，更通常大約IOO至大約150個)的概念片斷，其中，在兩條序列被最優(yōu)對齊后，將序列與同樣連續(xù)位置數(shù)的參照序列相比較。為了對兩條序列最優(yōu)對齊，比較窗較之參照序列(不包含添加或缺失)可包含大約20%或更少的添加或缺失(即，缺口)。關(guān)于序列分析的詳纟田討論，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)參照用于WisconsinGenetics軟件包7.0版，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,Wis.，USA中的序列比對的詳細方法或參照Ausubeletal.(1998)。在本文中使用時，術(shù)語"再生"指從植物種子、植物細胞、植物細胞組、植物愈傷組織或植物切片中的任何一種獲得整抹植物的任何方法。在本文中使用時，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"表示將外源DNA序列(例如載體、重組DM分子)引入細胞或原生質(zhì)體的工藝，其中，外源DNA被引入染色體或能自主復制。短語"轉(zhuǎn)基因植物"表示源于經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞或原生質(zhì)體的植物或其后代，其中，植物DNA含有引入的外源DNA分子(在同一物種的天然、非轉(zhuǎn)基因植物上本來并不存在)。短語"穩(wěn)定的RNA"、"穩(wěn)定的dsRNA"和"穩(wěn)定的siRNA"指正義向和反義向的、被短序列(允許RNA分子中形成發(fā)卡或莖環(huán)結(jié)構(gòu))分開的經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNA的組合。在本文中使用時，短語"維管組織"指植物維管束中含有的任何紐織或細胞，其包括但不限于韌皮部、原生韌皮部、次生韌皮部、木質(zhì)部、原生木質(zhì)部或次生木質(zhì)部細胞或組織。在本文中使用時，術(shù)語"載體"指可用于轉(zhuǎn)化(即，向宿主細胞中引入異源DNA)目的的任何重組多核苷酸構(gòu)建體。II.本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明包括編碼TIC807昆蟲抑制性蛋白的多種多核苷酸。當與合適的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止和/或聚腺苷化序列可操作地相連時，此類多核苷酸可用于在宿主細胞中生產(chǎn)TIC807昆蟲抑制性蛋白。此類多核苷酸還可用作為探針，以分離編碼TIC807蛋白的同源或基本同源的多核苷酸。編碼TIC807的多核苷酸的一種來源是"acW/i^MwW/^/e/2s/s菌林，其含有SEQIDNO:4的TIC807多核苷酸，這編碼SEQIDNO:5的TIC807多肽。該多核苷酸序列最初分離自Mwi/^/e/^"宿主，因此適于在其它細菌宿主中表達編碼的TIC807多肽。例如，可用SEQIDNO:4來在細菌宿主(包括但不限于爿^To6acfer/w/w、Asci7/ws、^sc力er/c力/a、5^/fflo/ze/7a、jPsei/^/o邁OQ351和y力/zoW咖細菌宿主細胞)中表達TIC80蛋白。SEQIDNO:4探針也可用作為探針，以分離編碼TIC807蛋白的同源或基本同源的多核苷酸。此類探針可用于鑒定源于^c/"^菌林的同源或基本同源的多核苷酸。還可從TIC807多肽序列從頭合成編碼TIC807蛋白的多核苷酸?？赏ㄟ^使用遺傳密碼從TIC807多肽序列推導出多核苷酸基因的序列?？墒褂糜嬎銠C程序，例如"BackTranslate，，(GCGPackage,Acclerys，Inc.SanDiego，CA),將肽序列轉(zhuǎn)化為編碼肽的相應(yīng)核苷酸序列，可用于獲得相應(yīng)核苷酸編碼序列的TIC807多肽序列的例子包括但不限于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列。此外，可設(shè)計本發(fā)明的合成TIC807多核苷酸序列，使得它們將在植物中表達。美國專利No.5,500，365描述了一種方法，用于合成植物基因，以改善合成的基因編碼的蛋白的表達水平。該方法涉及對外來轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)基因序列的修飾，以使得它們能更高效地被植物轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯和表達。在植物中良好表達的基因的特征包括可能導致不想要的內(nèi)含子剪接或聚腺苷化(基因轉(zhuǎn)錄物編碼區(qū)域中)的序列的消失，但同時基本保留殺昆蟲蛋白的毒性部分的氨基酸序列。美國專利No.5,689,052中公開了一種類似的方法用于獲得轉(zhuǎn)基因在單子葉植物中的增加的表達。設(shè)計來在植物中表達TIC807蛋白的示例性多核苷酸序列包括4旦不限于SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。III.用于分離和/或檢測編碼TIC807蛋白的多核苷酸的經(jīng)分離的寡核苷酸、試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了用于鑒定、檢測或分離編碼TIC807蛋白的多核苷酸的經(jīng)分離的寡核苷酸。在一種實施方式中，經(jīng)分離的寡核苷酸包含在SEQIDNO:4的MwW/^ye/LsisTIC807編碼基因中含有的或SEQIDNO:4的互補序列中含有的序列的至少12個連續(xù)核苷酸。此類寡核苷酸可用于基于雜交或PCR的方法，以從"ac/W"i^力wiv'力《/e/^/s的菌林鑒定或分離編碼TIC807蛋白的多核苷酸。此類寡核苷酸還可用于驗證編碼TIC807的多核苷酸在宿主細胞中的存在與否。還應(yīng)認識到，當其包含與SEQIDNO:4錯配的其他序列時，寡核苷酸還可用于誘變SEQIDNO:4。此類"誘變"寡核苷酸可用于鑒定具有增強的昆蟲抑制活性的TIC807變體。在另一實施方式中，經(jīng)分離的寡核苷酸包含在SEQIDNO:6的多核普酸中含有的或SEQIDNO:6的互補序列中含有的序列的至少12個連續(xù)核苷酸。SEQIDNO:6的多核苷酸是特別設(shè)計來在轉(zhuǎn)基因植物中表達的，且編碼SEQIDNO:5的TIC80蛋白。在還一些實施方式中，經(jīng)分離的寡核苷酸包含SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQID34NO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核苷酸中含有的或SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的互補序列中含有的序列的至少12個連續(xù)核苷酸。此類寡核苷酸可用于基于雜交或PCR的方法，以在源于轉(zhuǎn)基因植物的樣品中檢測SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53多核苷酸。當樣品是核糖核酸樣品時，寡核苷酸可用于基于雜交或PCR的方法，以對TIC807轉(zhuǎn)基因表達加以定量。當樣品是脫氧核糖核酸樣品時，寡核苷酸可用于基于雜交或PCR的方法，以測定樣品中TIC807轉(zhuǎn)基因的存在與否。預(yù)計，源于SEQIDNO:6的寡核苷酸可用于測定TIC807轉(zhuǎn)基因在源于商品的脫氧核糖核酸樣品中存在與否。鑒于利用寡核苷酸的某些核酸檢驗方法的敏感性極高，預(yù)計可使用源于SEQIDNO:6的寡核苷酸來檢驗源于下述庫來源的商品中的TIC807轉(zhuǎn)基因，所述庫來源中，僅商品的一部分源于含有SEQIDNO:6的轉(zhuǎn)基因植物。還應(yīng)認識到，當其包含與SEQIDNO:6錯配的其他序列時，寡核苷酸可用于誘變SEQIDNO:6。此類"誘變"寡核香酸可用于鑒定具有增強的昆蟲抑制活性和/或增強的在轉(zhuǎn)基因植物宿主細胞中的表達的TIC807變體。當然應(yīng)當理解，本發(fā)明的寡核苷酸還可包含與編碼TIC807蛋白的多核苷酸序列不相同或互補的其它序列。其它序列可包括但不限于用作為協(xié)助克隆、誘變或檢測的適配子(adapter)的序列。本發(fā)明的寡核苷酸還可包含其它共價修飾。共價修飾將包括但不限于可檢測的標記，例如同位素、熒光團和半抗原。生物素是一種特別有用的半抗原。本發(fā)明還包括用于檢測樣品中TIC807多核苷酸序列的試劑盒，其中包含與SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:35M、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核苷酸序列或其互補序列特異性雜交的至少一種寡核苷酸。在本發(fā)明的試劑盒的上下文中，術(shù)語"特異性雜交"表示寡核苷酸將能雜交和檢測來自經(jīng)SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的一個或多個拷貝轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的樣品中的SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53，但不特異性雜交和檢測不含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的對照非轉(zhuǎn)基因植物中的任何序列。這些試劑盒還可包含與所述寡核苷酸雜交的對照多核苷酸、使用指導和/或用于將寡核苷酸與SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53雜交或檢測雜交的試劑。在某些應(yīng)用(包括但不限于使用聚合酶鏈式反應(yīng)的那些應(yīng)用)中，試劑盒將天然包含多于一種的、與SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核苷酸序列特異性雜交的寡核苷酸。IV.簡并寡核苷酸、簡并寡核苷酸組合物和使用方法本發(fā)明還包括簡并寡核苷酸、包含筒并寡核苷酸的引物和使用此類寡核苷酸以鑒定、檢測或分離編碼TIC807蛋白的多核苷酸的方法。雖然此類簡并寡核苷酸源于SEQIDNO:5,但本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，此類寡核苷酸可用于鑒定多種TIC807蛋白以及TIC807相關(guān)蛋白。此類TIC807蛋白預(yù)計與SEQIDNO:5具有至少70%、80%、90%、95%、98°/?；?00%的氨基酸同一性,并且具有昆蟲抑制活性。TIC807相關(guān)蛋36白與SfiQIDNO:5具有至少45%的序列同一性，并且具有昆蟲抑制活性。從肽序列設(shè)計簡并寡核苷酸引物是通過使用遺傳密碼來完成的，其中，合成對應(yīng)于每種被編碼的氨基酸的密碼子。簡并寡核苷酸可包含寡核苷酸的下述庫，所述庫含編碼給定肽序列的所有可能的序列。備選地，簡并寡核苷酸還可包含含有中性堿基(即，在給定位置足以與所有核苷酸進行堿基配對的堿基)的序列。中性堿基包括但不限于^ti。在簡并寡核苷酸引物或探針的設(shè)計和使用中的相關(guān)考慮是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)，SambrookandRussel1，ColdSpringHarborPress2001)。本發(fā)明公開了并要求保護下述組合物，所述組合物包含至少兩條來自SEQIDNO:5的多核苷酸序列的至少12個核苷酸的簡并寡核苷酸引物。此類組合物可用于基于雜交或聚合酶鏈式反應(yīng)的方法，用于分離或檢測編碼TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸。該組合物的簡并寡核苷酸還可包含與編碼TIC807蛋白的多核苷酸序列不相同或互補的其它序列。其它序列可包括但不限于用作為協(xié)助克隆、誘變或檢測的適配子的序列。本發(fā)明的筒并寡核苷酸還可包含其它共價修飾。共價修飾將包括但不限于可檢測的標記，例如同位素、熒光團和半抗原。生物素是一種特別有用的半抗原。本發(fā)明特別包括簡并寡核苷酸引物在分離或檢測樣品中編碼TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸的基于PCR的方法中的用途。簡言之，選擇能產(chǎn)生擴增子的簡并寡核苷酸引物對，將其與含有編碼TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸的樣品一起用于聚合酶鏈式反應(yīng)。用于該方法的樣品的合適來源包括但不限于多種^3C2'/7w51MyWi^/e/Ly/s菌林。當寡核苷酸對應(yīng)于預(yù)測的正義和反義鏈序列，并且處于5，至3，的方向(將引導DNA聚合酶介導的對與另一相反寡核苷酸互補的DM鏈的合成)，簡并寡核苷酸能產(chǎn)生擴增子。筒并寡核苷酸引物源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列?？赏ㄟ^使用插入型染料，產(chǎn)生擴增子，來檢測該擴增子。還可通過將經(jīng)分離的擴增子片段克隆進質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或其它克隆載體來分離擴增子。一旦被克隆，還可通過測序，以測定擴增子編碼的蛋白與TIC807(SEQIDNO:5)的百分比同一性，來對該擴增子進行進一步分析。預(yù)計，可通過這些方法檢測或分離編碼與SEQIDNO:5至少70%或者至少90%相同的TIC807蛋白或與SEQIDNO:5至少45%相同的TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸。隨后可針對昆蟲抑制活性來篩選此類TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白。簡并TIC807寡核苷酸還可用作為探針，用于基于雜交的方法，所述方法檢測或分離編碼TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸。用于檢測樣品中編碼TIC807蛋白的多核苷酸的方法首先包括選擇源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列的筒并寡核苷酸或簡并寡核苷酸集。這些簡并寡核苷酸還可包含可檢測的標記，例如，同位素、熒光團和半抗原。生物素是一種特別有用的半抗原。樣品包括但不限于，源于多種^c/〃M^wi"/i^/e/^h菌林的樣品。樣品可以是源于一種或多種Asc//7^Mw/z^/e/^/s菌林的質(zhì)粒、粘粒或噬菌體克隆的文庫?？稍诤线m的雜交嚴緊度條件下將簡并寡核苷酸或簡并寡核苷酸集與樣品雜交。這些條件與簡并寡核苷酸長度、簡并程度、它們的G+C含量、想要的或計劃的樣品中靶序列的百分比序列同一性以及其它因子相關(guān)。通過包括但不限于放射測量、熒光測量、發(fā)光測量和/或基于ELISA的方法的方法來檢測與多核苷酸的雜交。檢測之后，可通過系列稀釋和再雜交來分離多核苷酸。上文列出的關(guān)于簡并寡核苷酸設(shè)計、寡核苷酸標記、文庫制備、雜交、檢測和分離的所有步驟都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見MolecularCloning:ALaboratoryManual(ThirdEdition)，SambrookandRussel1，ColdSpringHarborPress,2001)。預(yù)計，可通過這些方法檢測或分離編碼與SEQIDNO:5至少70%或者至少90%相同的TIC807蛋白或與SEQIDNO:5至少45%相同的TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸。在無晶體突變型(acrystallifeorus)"ac2'/7M^^/力^^/^2、菌林中表達之后，隨后可針對昆蟲抑制活性來篩選此類TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白。TIC8O7或TIC807相關(guān)蛋白可抑制半翅目害蟲，例如丄/^/s。備選地，TIC807或TIC807相關(guān)蛋白可抑制其它有害昆蟲，包括Arachnid、鞘翅目、Ctenophalides、雙翅目、膜翅目或鱗翅目害蟲，或可既抑制半翅目害蟲又抑制其它家族的有害昆蟲。V.包含TIC807細菌表達盒的DM構(gòu)建體為在細菌宿主中表達TIC807蛋白，可將編碼TIC807的多核苷酸與合適的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列(在細菌宿主中有功能的)可操作相連，以產(chǎn)生細菌表達盒。在細菌細胞中有功能的啟動子和終止信號可源于細菌基因、噬菌體基因或合成方法。然后可通過標準的重組DNA技術(shù)，將這些表達盒轉(zhuǎn)到包含復制起點和可選擇標志物(或稱"可選擇標記")的合適的細菌載體中。在本發(fā)明的實踐中，在^ci^^宿主中發(fā)揮功能的細菌啟動子、終止信號和載體特別有用于TIC807多肽的表達。在很多情況下，包含其內(nèi)源啟動子和終止序列的TIC807基因可用于在Ac/77^宿主細胞(包括但不限于》aci/7M"w/z^/e/w/s宿主)中表達TIC807蛋白。對于此類實驗而言，使用在Aco7/和、ci/7^宿主中都有功能的穿梭載體是特別有用的。此類穿梭載體的例子包括但不限于下述載體，例如美國專利No.5，650，308中的描述的pEG854。這些穿梭載體包括允許轉(zhuǎn)化^"77m宿主的抗生素抗性標志物基因。優(yōu)選的5sc277mMwW/z^'e/^2宿主包括但不限于，無晶體突變型(acrystalliferous)(Cry蛋白缺卩備型)及^^wr/ag/eDs/s宿主菌林，例如EG10368和EG10650(在美國專利No.5，759，538中描述)。當TIC807蛋白在無晶體突變型(Cry蛋白缺陷型)AM盯2'/^/ei^y^宿主菌林中表達時，在宿主細胞中誘導芽胞形成后，TIC807蛋白易于作為伴胞晶體分離。因此這種易用的^c/"z^""r/i^/e/Ly"表達系統(tǒng)可用于針對昆蟲抑制活性對大量TIC807蛋白變體加以測試。VI.包含TIC807植物表達盒的DNA構(gòu)建體已良好建立起了用于單子葉植物或雙子葉植物的表達盒。表達盒是DNA構(gòu)建體，其中多種啟動子序列、編碼序列和聚腺苷化序列可操作地相連。通常，典型地，表達盒包含與感興趣的序列(與聚腺苷化或終止子區(qū)域可操作相連)可操作相連的啟動子。在某些情況下(包括但不限于在單子葉植物中表達轉(zhuǎn)基因)，包括內(nèi)含子序列也可能是有用的。當包括內(nèi)含子序列時，其典型地放在轉(zhuǎn)基因的5，非翻譯引導區(qū)域中。在某些情況下，在轉(zhuǎn)基因中并入特定的5，非翻譯序列以增強轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性或促進轉(zhuǎn)錄物高效翻譯也可能是有用的。多種啟動子可用于本發(fā)明的實踐。一類寬范圍的有用的啟動子被稱為"組成型，，啟動子,因為在植物整個發(fā)育期間在大多數(shù)植物器官中都有活性。例如，啟動子可以是病毒啟動子，例如，CaMV35S或FMV35S啟動子。CaMV35S和FMV35S啟動子在多種經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物組織和大多數(shù)植物器官(例如，愈傷組織、葉、種子和根)中都有活性。CaMV35S和FMV35S的增強的版本或復制版本在本發(fā)明的實踐中特別有用(美國專利No.5,378，619)。其它有用的胭脂氨酸合酶(NOS)和章魚堿(OCS)啟動子(在A.tumefaciens的腫瘤誘導質(zhì)粒上進行)，花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子、玉米泛素啟動子、水稻Actl啟動子和Figwort花葉病毒(FMV)35S啟動子(見，例如，美國專利No.5，463，175)。應(yīng)當理解，這組示例性的啟動子是非限制性的，本發(fā)明的實踐中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能利用并非本文明確提到的其它啟動子。在某些植物組織中具有活性的啟動子(即，組織特異性啟動子)還可用于驅(qū)動TIC807蛋白或其它昆蟲抑制性試劑的表達。鑒于某些半翅目有害昆蟲是"刺吸式"昆蟲，其典型地通過將其吸管插入宿主植物的維管組織來進食，指導昆蟲抑制性試劑在轉(zhuǎn)基因植物的維管組織中表達的啟動子特別有用于本發(fā)明的實踐。多種花椰菜花葉病毒(包括但不限于CaMV35S、CaMV19S、FMV35S啟動子及其增強的版本或復制版本)典型地在維管組織中遞送高水平的表達，因此可用于TIC807蛋白或其它昆蟲抑制性試劑的表達。限于韌皮部的病毒，例如，水稻東格魯病毒(Bhattacharyya-Pakrasietal-，PlantJ.4[1]71-79，1993)和鴨跖草黃斑駁病毒(Medberryetal.,PlantCell4:185-192，1992)，也含有在維管組織中具有活性的有用啟動子。為控制在韌皮部上進食的半翅目昆蟲，可使用韌皮部細胞特異性或韌皮部優(yōu)先的啟動子來在轉(zhuǎn)基因植物的韌皮部表達TIC807蛋白或其它昆蟲抑制性試劑。有用的韌皮部特異性啟動子的例子包括但不限于，PP2型基因啟動子(美國專利No.5，495,007)、蔗糖合酶啟動子(YangandRussell,Proc.Natl.Acad.Sci,USA87:4144-4148，1990)、谷氨酰胺合成酶啟動子(Edwardsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:3459-3463，1990)和韌皮部特異性質(zhì)膜H+-ATP酶啟動子(DeWittetal.，PlantJ.l[l]:121-128，1991)、野黑櫻苷水解酶啟動子(美國專利No.6,797,859)和水稻蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白(美國專利No.7,186,821)。為控制在木質(zhì)部組織上進食的半翅目害蟲，可使用多種在木質(zhì)部組織(包括但不限于原生木質(zhì)部或次生木質(zhì)部)上具有活性的啟動子。在木質(zhì)部組織中具有活性的啟動子包括但不限于與類苯基丙烷生物合成途徑相關(guān)的啟動子，例如苯丙氨酸解氨酶(PAL)啟動子、肉桂酸酯4-羥化酶(C4H)啟動子、香豆酸酯3-羥化酶啟動子、0-曱基轉(zhuǎn)移酶(OMT)啟動子、4-香豆酸酯CoA連接酶(4CL)啟動子(美國專利No.6,831,208)、肉桂酰-CoA還原酶(CCR)啟動子和肉桂基醇脫氫酶(CAD)啟動子。轉(zhuǎn)錄增強子元件也可與在植物細胞中有活性的任何啟動子或為了在植物細胞中的活性而需要增強子的任何基礎(chǔ)啟動子組合使用。轉(zhuǎn)錄增強子元件可在多種植物細胞中活化轉(zhuǎn)錄，其長度通常為100-200個堿基對。可通過化學合成活通過從包括此類元件的調(diào)控元件分離來獲得增強子元件，其可包含額外的側(cè)翼核苷酸，其中含有協(xié)助隨后操作的有用限制性酶位點。典型地，增強子元件可放置于與啟動子相連的mRNAcap位點的5，的區(qū)域，其也可位于cap位點的3，的區(qū)域(即，在5，非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子中，或在3，聚腺苷化位點的3，)，以提41供可操作相連的基因的增加的表達水平。增強子也可被多聚化(以有限的相連拷貝存在)以提供可操作連接的增加的表達。多聚化的增強子包括但不限于，增強子以任何方向或方向組合的二聚、三聚或四聚拷貝。增強子通常源于植物病毒啟動子，特別是雙鏈DNACulimoviridae組(包含花椰菜花葉病毒和badnaviruses)的那些。植物病毒啟動子或衍生的植物病毒增強子可提供轉(zhuǎn)基因植物中可操作相連的基因的強組成型表達。源于這些啟動子的片段的增強子已顯示出能有效增強啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因在植物中的表達的性能?？捎糜诜蛛x增強子的植物病毒的例子包括但不限于花椰茱花葉病毒(CaMV)(見例如Odeletal.，Nature313:810,1985)、玄參花葉病毒(美國專利No.5，378，619)、康乃馨風化環(huán)病毒(CERV)(Hulletai.，(1986)EMBOJournal5:3083-3090)、木薯脈花葉病毒(CsVMV)(Calvertetal.(1995)J.Gen.Virol.76:1271—1278和美國專利No.6,963,021)、紫茉莉花葉病毒(固V)(Deyetal.(1999)PlantMolBiol.40:771-82)、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)(Stavoloneetal.(2003)PlantMolBiol.53:663-73)、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)(Xieetal.(2003)PlantMolBiol.53:1-14)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)(美國專利No.6，963，021)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)(美國專利No.5，850，019)。雙份重復的增強子被用于CaMV35S和FMV35S啟動子的增強版本。還可將多種5，非翻譯引導序列與感興趣的編碼序列在植物表達盒中可操作相連。因此，植物表達盒可含有一條或多條5，非翻譯引導序列(作用于增加可操作相連的、編碼TIC807或其它感興趣蛋白的核酸編碼序列的表達)。在不被理論束縛的情況下，此類5，非翻譯引導序列可增加得到的mRNA的翻譯效率和/或增加得到的mRNA的穩(wěn)定性，以提供可操作相連的被編碼的感興趣蛋白在轉(zhuǎn)基因植物的增加的水平。其它可用的5，引導序列的例子包括但不限于，dSSU、PetHSP705'和GmHSP17.95'非翻譯引導序列。源于非翻譯引導序列(來自紫花苜蓿花葉病毒衣殼蛋白基因的衣殼蛋白基因mRNA)的翻譯增強子序列可被放到啟動子和感興趣的基因之間，以增強可操作相連的感興趣的基因的翻譯效率(美國專利No.6,037,527)。內(nèi)含子也可被包括進DNA表達構(gòu)建體，尤其是感興趣的序列要在單子葉植物中表達的情況下。對于單子葉植物應(yīng)用而言，可使用下述內(nèi)含子，例如，玉米hsp70內(nèi)含子(美國專利No.5，424，412)、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子l(Callisetal.，1987)、蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasiletal.，1989)或7JC稻Actl內(nèi)含子(McElroyetal.,1990)。可使用的雙子葉植物內(nèi)含子包括已可操作整合進轉(zhuǎn)基因的下述內(nèi)含子，例如，CAT-1內(nèi)含子(CazzonnelliandVelten，2003)、pKANNIBAL內(nèi)含子(Wesleyetal.，2001;Collieretal.，2005)、PIV2內(nèi)含子(Mankinetal.，1997)和"超級泛素"內(nèi)含子(美國專利No.6，596，925;Collieretal.，2005)。應(yīng)當理解，該組示例性內(nèi)含子是非限制性的，本發(fā)明的實踐中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用本文沒有明確提到的其它內(nèi)含子。在本發(fā)明的其它一些實施方式中，編碼提供TIC807蛋白在亞細胞細胞器中的定位的肽的序列可與編碼TIC807多肽的序列可操作相連。預(yù)期，與信號序列可操作相連的TIC807多肽能進入分泌途徑，并被細胞器(例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER))保留或者靶向液泡，這通過將合適的駐留或靼向肽與TIC807多肽C-末端可操作相連來實現(xiàn)。液泡靶向肽的例子包括但不限于來自大麥植物凝集素基因的CTPP液泡靶向信號。ER草巴向肽的例子包括但不限于包含KDEL氨基酸序列的肽。不被理論束縛的情況下，TIC807多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡中的定位可提供想要的性質(zhì)，例如，在轉(zhuǎn)基因植物中的增加的表達和/或在轉(zhuǎn)基因植物中抑制昆蟲的增加的效果。TIC807蛋白向植物質(zhì)體(包括但不限于葉綠體)的定位也特別包括在本發(fā)明內(nèi)。典型地，通過將葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列與TIC807蛋白的N-末端可操作相連來實現(xiàn)質(zhì)體定位?？捎糜谠谵D(zhuǎn)基因植物中定位TIC807蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(或CTPs)可源于核編碼的、靶向質(zhì)體的植物蛋白。核編碼的、靶向質(zhì)體的植物蛋白包括但不限于涉及脂質(zhì)、淀粉或氨基酸生物合成的蛋白以及光合作用的蛋白?？墒褂玫奶囟ǖ娜~綠體轉(zhuǎn)運肽包括但不限于來自核編碼的顆粒結(jié)合型淀粉合酶基因、質(zhì)體脂肪酸去飽和酶基因、EPSPS基因和RUBISCO小亞基基因的CTPs。一種示例性的CTP是Jra62V0;^/sEPSPSCTP。本文提供了與TIC807蛋白可操作相連的、編碼haW^jw"EPSPSCTP的示例性核酸(SEQIDNO:7)。不被理論束縛的情況下，TIC807多肽在質(zhì)體中的定位可提供想要的性質(zhì)，例如，在轉(zhuǎn)基因植物中的增加的表達和/或在轉(zhuǎn)基因植物中抑制昆蟲的增加的效果。有文獻提出，通過使用葉綠體靶向肽，例如，CrylBb(美國專利申請No.10/525318)、Cry2Ab(美國專利No.6,489,542)和Cry3Bb(美國專利No.6,501,009),增加其它》ac^7M^wr/i7^'e;7;y/;y蛋白的表達。不被理論束綽的情況下，TIC807多肽在轉(zhuǎn)基因植物中的增加的表達可提供增加的昆蟲抑制水平、擴大的有害昆蟲抑制譜和/或增加的有害昆蟲抗性管理程度。如上文所述，感興趣的序列還可與含有聚腺苷化信號的3，非翻譯區(qū)域可操作相連。該聚腺苷化信號提供了聚腺苷酸序列向RNA3，末端的添加。J^ro6ac&r/咖才艮瘤誘導(Ti)質(zhì)粒胭脂氨酸合酶(N0S)基因3，和豌豆ssRUBISC0E9基因3，非翻譯區(qū)域含有聚腺苷酸信號，它們代表了可用于本發(fā)明實踐的此類3，非翻譯區(qū)域的非限制性例子。應(yīng)當理解，該組示例性聚腺苷化區(qū)域是非限制性的，本發(fā)明的實踐中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用本文沒有明確提到的其它聚腺苷化區(qū)域。典型地，包含上文所述的植物表達盒的DM構(gòu)建體保持在多種栽體中。載體含有提供載體復制的序列和宿主細胞中共價相連的序列。例如，細菌載體將含有允許載體在一種或多種細菌宿主中復制的復制起點。^i7^aWeWM7介導的植物轉(zhuǎn)化載體典型包含允許在Aco7/和^^ro&c,er/咖兩者中均能復制的序列以及定位于允許表達盒整合進植物染色體的位置一條或多條"邊界，，序列。此類J^o^c"r/咖載體可^皮文造,以用于」^ro6ac^er/wz7fw/ze/ac/e力s或」g/o6acfer2'"/zr力/么^e刀(^中。典型地，載體中還包括編碼賦予對抗生素的抗性的可選擇標志物的基因，以提供它們在細菌宿主中的保持。VII.昆蟲抑制性轉(zhuǎn)基因植物和獲得昆蟲抑制性轉(zhuǎn)基因植物的方法本發(fā)明還提供了獲得能抑制昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法。首先，使用本文所述的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將適于在多種雙子葉和單子葉植物中表達TIC807蛋白的表達載體引入植物、植物細胞或植物組織。接著，通過從獲得了表達載體的植物、植物細胞或植物組織再生轉(zhuǎn)基因植物，來獲得含有或包含TIC807表達載體的轉(zhuǎn)基因植物。最后的步驟是獲得表達昆蟲抑制量的TIC807多肽的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明包括的、表達昆蟲抑制量的TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因植物包括但不限于，大麥、玉米、燕麥、水稻、黑麥、高粱、草皮草、甘蔗、小麥、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、巻心菜、油菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘類、棉花、葫蘆、桉樹、亞麻、蒜、葡萄、洋蔥、萵苣、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、楊樹、松樹、向日葵、紅花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、煙草、番茄、裝飾植物、灌木、堅果、鷹嘴豆、木豆、稷、啤酒花和牧場草植物?？赏ㄟ^例:i。J^ro6a"eriM7介導的轉(zhuǎn)^:、A力/么oWw/B介導的專爭4匕、W/20r力h062'咖介導的轉(zhuǎn)化、顆粒介導的轉(zhuǎn)化、DNA轉(zhuǎn)染、DNA電穿孔或"晶須(whiskers)，，介導的轉(zhuǎn)化等方法將TIC807表達載體引入宿主植物的染色體。用于轉(zhuǎn)化植物的合適方法包括可通過其將DM引入細胞的任何方法，例如，美國專利No.5，384，253中闡釋的電穿孔；美國專利Nos.5，015,580、5，550，318、5，538，880、6,160,208、6,399,861和6，403，865中闡釋的微粒轟擊；美國專利Nos.5，635，055、5,824,877、5,591,616、5,981，840和6，384，301中闡釋的J^ro6a"er/咖介導的轉(zhuǎn)化；以及美國專利No.5，508，184中闡釋的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等。上面提到的引入轉(zhuǎn)基因的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，它們被描述于美國專利No.20050289673(J^ro6a"er/咖介導的對玉米的轉(zhuǎn)化)、美國專利No.7，002，058(」^ro&c&W咖介導的對大豆的轉(zhuǎn)化)、美國專利No.6，365,807(顆粒介導的對水稻的轉(zhuǎn)化)和美國專利No.5，004，863(J^ro&c"r/咖介導的對棉花的轉(zhuǎn)化)。通過應(yīng)用例如這些技術(shù)，基本上任何植物物種的細胞都可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且這些細胞可發(fā)育成轉(zhuǎn)基因植物。特別有用于棉花轉(zhuǎn)化范疇的其它技術(shù)被描述于美國專利Nos.5,846.797、5，159，135和6，624,344中；特別公開了用于轉(zhuǎn)化"ra^/cs植物的技術(shù)，例如，在美國專利No.5，750，871中；以及公開了用于轉(zhuǎn)化大豆的技術(shù)，例如，在Zhangetal.，1999和美國專利No.6,384，301中；以及W09506722中公開了用于轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)。在Broothaerts，etal.，Nature.2005，10;433:629-33中描述使用細菌(例如W力j'zo6/咖或i7/7or力y^W咖)來轉(zhuǎn)化植物的方法。還應(yīng)當理解，TIC807表達栽體可包含被位點特異性重組酶(包括Cre、Flp、Gin、Pin、Sre、pinD、Int-B13和R)識別的順式作用位點特異性重組位點。然后可使用通過用位點特異性重組酶將DNA分子在特定位置整合進轉(zhuǎn)基因植物基因組的方法(美國專利No.7，102，055)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將知道，這些基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中的任何都可用于將表達載體引入植物細胞、植物組織或植物的染色體中。本發(fā)明還包括使用包含兩種分離的T-DM分子的植物轉(zhuǎn)化載體，其中一種T-DNA含有感興趣的一種或多種基因(即，感興趣的一種或多種昆蟲抑制性基因)，另一T-DNA含有可選擇和/或可計分標志物基因。在這兩種T-DNA載體中，包含感興趣的一種或多種基因的一種或多種植物表達盒被含有在一組T-DNA邊界序列內(nèi)，包含可選擇和/或可計分標志物基因的一種或多種植物表達盒被含有在另一組T-DNA邊界序列內(nèi)。在一些優(yōu)選的實施方式中，植物表達盒側(cè)翼的T-DNA邊界序列包含左和右T-DNA邊界序列，它們被可操作地定向，以提供植物表達盒向植物基因組的轉(zhuǎn)移和整合。當在^ro6ac"W咖介導的植物轉(zhuǎn)化中用合適的^ro6ac"W咖宿主時，兩種T-DNA載體提供了含有感興趣的一種或多種基因的一種T-DM分子在一處染色體位置上的整合以及含有可選擇和/或可計分標志物的另一T-DNA在另一染色體位置上的整合。首先通過針對標志物基因加以選擇和/或計分以及針對感興趣基因的表達進行篩選，獲得既含有感興趣的基因又含有可選擇和/或可計分標志物基因的轉(zhuǎn)基因植物。含有標志物基因和感興趣基因兩者的不同的轉(zhuǎn)基因植物品系隨后被異型雜交，獲得標志物基因和感興趣基因分隔的后代轉(zhuǎn)基因植物群?？赏ㄟ^DM、RM或蛋白分析技術(shù)的組合鑒定出僅含感興趣基因的后代植物。使用兩種T-DNA載體的方法被描述于美國專利No.6,265,638、美國專利No.5，731，179、美國專利申請/〉開文本No.2003110532A1和美國專利申請公開文本No.20050183170A1中。還可將引入植物微型染色體(包含植物著絲粒，提供了重組微型染色體在轉(zhuǎn)基因植物中的保持)的方法用于實踐本發(fā)明(美國專利No.6,972,197)。在本發(fā)明的這些實施方式中，轉(zhuǎn)基因植物具有作為染色體外元件的微型染色體，其并不整合進宿主植物的染色體。典型地，轉(zhuǎn)基因植物通過下述方法獲得將感興趣的基因(本情況下，TIC807表達盒)與可選擇標志物基因相連，通過上文所述的方法中的任何一種將連接的轉(zhuǎn)基因引入植物細胞、植物組織或植物，以及在植物生長需要所述可選擇標志物基因表達的條件下再生或者回收轉(zhuǎn)基因植物?？蛇x擇標志物基因可以是編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白、草胺膦乙?；D(zhuǎn)移酶蛋白、草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合酶(EPSPS)蛋白、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白、二氫蝶酸合酶蛋白、磺酰脲不敏感的乙酰乳酸合酶蛋白、莠去津不敏感的Q蛋白、能降解溴苯腈的腈水解酶蛋白、能降解茅草枯的脫面酶蛋白、2，4-氯苯氧乙酸酯單氧合酶蛋白、曱氨蝶呤不敏感的二氫葉酸酯還原酶蛋白和氨基乙基半胱氨酸不敏感的章魚堿合酶蛋白的基因。用于與每種基因組合使用的相應(yīng)的選擇性試劑可以是新霉素(用于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白選擇)、草胺膦(用于草胺膦乙酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白選擇)、草甘膦(用于草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合酶(EPSPS)蛋白選擇)、潮霉素(用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白選擇)、磺胺嘧啶(用于二氬蝶酸合酶蛋白選擇)、氯磺隆(用于磺酰脲不敏感的乙酰乳酸合酶蛋白選擇)、莠去津(用于莠去津不敏感的Q蛋白選擇)、溴苯腈47(用于腈水解酶蛋白選擇)、茅草枯(用于脫鹵酶蛋白選擇)、2，4-氯苯氧乙酸(用于2,4-氯苯氧乙酸酯單氧合酶蛋白選擇)、曱氨蝶呤(用于甲氨蝶呤不敏感的二氫葉酸酯還原酶蛋白選擇)或氨基乙基半胱氨酸(用于氨基乙基半胱氨酸不敏感的章魚堿合酶蛋白選擇)。轉(zhuǎn)基因植物還可這樣獲得將感興趣的基因(即，在本情況下，TIC807表達盒)與可計分標志物基因相連，通過上文所述的方法中的任何一種將連接的轉(zhuǎn)基因引入植物細胞，以及從針對可計分標志物基因的表達測試為陽性的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物?？捎嫹謽酥疚锘蚩梢允蔷幋ap-葡糖苷酸酶蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、P-半乳糖苷酶蛋白、源于luc基因的熒光素酶蛋白、源于lux基因的熒光素酶蛋白、唾液酸酶蛋白、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白、胭脂氨酸合酶蛋白、章魚堿合酶蛋白或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移霉蛋白的基因。當表達載體被引入植物細胞或植物組織中時，典型地，通過在促進整抹植物形成的條件下，培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞或組織，來將這些細胞或組織再生為整林植物(即，再生葉、莖、根，以及在某些植物中，生殖組織的過程)。從單個植物原生質(zhì)體或多種外植體來發(fā)育或再生轉(zhuǎn)基因植物是本領(lǐng)域7>知的(Horsch，R.B.etal.1985)。典型地，這種再生和生長過程包括下述步驟選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，以及在能產(chǎn)生生根幼植物的條件下培養(yǎng)選擇的細胞。之后，在合適的植物生長培養(yǎng)基(例如土壤)中栽種得到的轉(zhuǎn)基因生根嫩枝(或嫩芽)。備選地，可將轉(zhuǎn)基因引入分離的植物嫩枝分生組織，不經(jīng)歷愈傷組織階段組織培養(yǎng)物即再生植物(美國專利No.7,002,058)。當轉(zhuǎn)基因直接引入植物，或者更特異性地，引入植物的分生組織中時，可從植物收獲種子，并針對轉(zhuǎn)基因的存在進行選擇或計分。在有性生殖的轉(zhuǎn)基因植物物種的情況下，可從經(jīng)自交(自花授粉)或異型雜交(即，用作為花粉供體或受體)的植物收集種子，以建立和保持轉(zhuǎn)基因植物品系。并非有性生殖的轉(zhuǎn)基因植物可被營養(yǎng)繁殖，以建立和保持轉(zhuǎn)基因植物品系。在本文中使用時，轉(zhuǎn)基因植物品系表示源于轉(zhuǎn)化事件(其中轉(zhuǎn)基48因插入植物基因組中的一處或多處位置)的轉(zhuǎn)基因植物。在一個相關(guān)子、來自此類種子的后代以及最初的轉(zhuǎn)基因植物的后代的種子。此類后代和種子將具有穩(wěn)定并入其基因組中的編碼TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因，此類后代植物將以Mendelian方式遺傳穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因引入所提供的性狀。具有并入其基因組中的編碼一種或多種TIC807蛋白或多肽的轉(zhuǎn)基因DNA片斷的所有此類轉(zhuǎn)基因植物都是本發(fā)明的方面。還應(yīng)認識到，可通過使用PCR或可特異性檢測DNA構(gòu)建體中序列的其它方法，來鑒定含有本文所述的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物以及源于其的材料。一旦再生或回收了轉(zhuǎn)基因植物，可使用多種方法來鑒定或獲得表達昆蟲抑制量的TIC807的轉(zhuǎn)基因植物。一種通常的方法組是進行檢^^,以測量產(chǎn)生的TIC807的量。例如，利用了識別TIC807的抗體的多種基于抗體的檢驗方法可用于對產(chǎn)生的TIC807的量加以定量。此類基于抗體的檢驗的例子包括但不限于ELISAs、RIAs或下述其它方法，其中，用酶、同位素、熒光團、鑭系元素等對識別TIC807的抗體進行可檢測標記。通過在此類檢驗中使用經(jīng)純化或經(jīng)分離的TIC807蛋白作為參照標準(即，提供已知量的TIC807),可測定植物組織中存在的TIC807的量(相對每克植物材料的摩爾或相對每克植物材料的質(zhì)量)。典型地，TIC807蛋白將以"百分比之部分"或"ppm"上的水平在轉(zhuǎn)基因植物中表達，其中，以克計的量的鮮重植物組織中存在微克水平的TIC807蛋白。在這種情況下，相對每1g鮮重植物組織而言1微克的TIC807將代表1ppm的TIC807濃度。TIC807蛋白的昆蟲抑制量是至少5ppm(即，每克鮮重植物組織5pgTIC807蛋白)。在一些優(yōu)選的實施方式中，TIC807蛋白的昆蟲抑制量是至少50ppm(即，每克鮮重植物組織50pgTIC807蛋白)。在一些更優(yōu)選的實施方式中，TIC807蛋白的昆蟲抑制量是至少250ppm(即，每克鮮重植物組織50jugTIC807蛋白)。備選地，可測定轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的TIC807mRNA的量，以鑒定出表達昆蟲抑制量的TIC807蛋白的植物。用于將產(chǎn)生的蛋白的量與產(chǎn)生的RNA的量關(guān)聯(lián)起來的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括下述方法，例如，構(gòu)建標準曲線，將特定的RNA水平(即，TIC807mRNA)與TIC807蛋白(通過免疫方法或其它方法測定的)關(guān)聯(lián)起來。典型地，用于對TIC807mRNA進行定量的方法包括將多核苷酸與TIC807mRNA特異性雜交，或與源于TIC807RNA的PCR產(chǎn)物或cDNA(互補DNA)特異性雜交。此類多核苷酸探針可源于編碼TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因的正義和/或反義鏈核苷酸序列?？赏ㄟ^下述方法來檢測多核苷酸探針與TIC807mRM或cDNA的雜交，所述方法包括但不限于使用經(jīng)同位素、熒光團、鑭系元素或半抗原(例如生物素或地高辛)標記的探針。當TIC807RNA處于溶液中或者被固定于例如膜的固體支持物上時，可檢測經(jīng)標記探針的雜交。當通過使用定量性的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)對TIC807RNA加以定量時，可通過使用上述任何經(jīng)標記的多核苷酸探針，通過使用插入型染料(例如溴化乙碇或SYBR綠)，或使用含有熒光團和淬滅劑的雜交探針(使得當通過用于PCR反應(yīng)(艮卩，TaqMan反應(yīng)；AppliedBiosystems,FosterCity,CA)中的聚合酶的5，核酸酶活性釋放熒光團時，或者當熒光團和淬滅劑被聚合酶介導的互補鏈合成代替(即Scorpion或MolecularBeacon探針)時，僅檢測到來自熒光團的發(fā)射)，來檢測源于TIC807的PCR產(chǎn)物。用于進4亍qRT-PCR分4斤以對mRNA水平加以定量的多種方法被良好表征(Bustin，S.A.;JournalofMolecularEndocrinology29,23，2002)。還可用能被識別錯配核酸復合體的酶活性活化的熒光探針(即，Invader，ThirdWave，Technologies,Madison,WI)來對RNA加以定量。本領(lǐng)域:技術(shù)人員還將理解，RNA定量技術(shù)，例如QuantitativeNucleicAcidSequenceBasedAmplification(Q-NASBATM)可用于對編碼TIC807蛋白的mRNA加以定量并對表達植物加以鑒定。還可通過直接針對昆蟲抑制對植物加以檢驗，來鑒定出表達昆蟲抑制量的TIC807的轉(zhuǎn)基因植物。鑒于Z/^/s是食植物類的、刺吸式昆蟲，必須以允許昆蟲從植物或其相關(guān)組織進食的方式，對毒素蛋白進行植物內(nèi)表達和測試。在對用于轉(zhuǎn)化的植物物種(將允許對毒素蛋白加以測試)的選擇中，若干因素是關(guān)鍵的。植物應(yīng)當須易于轉(zhuǎn)化，源于植物的組織應(yīng)當是有害昆蟲偏好的類型。就此目的而言，優(yōu)選使用具有葉或足夠大的表面積(足以加上障礙，抑制有害昆蟲的運動，并且使得生物體從植物器官進食)的其它器官的植物。此外，植物器官的維管組織相對器官表面來說必須足夠近，以允許有害昆蟲探測到、穿透并且隨后進食。還優(yōu)選地，用于轉(zhuǎn)化中的植物是易于被誘導以從未分化愈傷組織發(fā)育的類型。有害昆蟲(例如Aj^m)在棉花植物上進食時，典型地，主要在花芽或棉桃上進食。棉花轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域公知的，但是，從植物細胞的轉(zhuǎn)化到完全發(fā)育的棉花植物所需的時間太長，對于篩選目的來說沒有實用性。因此，當在經(jīng)TIC807蛋白轉(zhuǎn)化的棉花細胞上研究Z;^m的進食時，未分化的棉花愈傷組織將是優(yōu)選的初始轉(zhuǎn)基因植物測試材料。用含有編碼TIC807蛋白的基周的構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化棉花細胞。在Petri皿中，轉(zhuǎn)化后令愈傷組織在組織培養(yǎng)物中發(fā)育。然后將Z/^Ay蛹放進含有愈傷組織的Petri皿中。Petri皿的封閉蓋阻止了Zj^^蛹的逃逸。將阻止Z/^/;y逃逸但允許Petri皿中氣體交換的任何材料，例如Parafilm,可用于封閉Petri亞蓋。一定百分比的A^^蛹將發(fā)現(xiàn)愈傷組織并進食。然后在考慮到背景死亡(沒有在愈傷組織上進食的那些昆蟲發(fā)生的)的情況下，計算死亡率和發(fā)育遲緩的計分。還將Arg"蛹放在未經(jīng)TIC807編碼基因轉(zhuǎn)化的對照愈傷組織上，作為愈傷組織上正常蛹生長的對照。TIC807蛋白介導的抑制的備選組織是葉組織。具有表面積足以放置防止A^i/;逃逸的障礙的葉組織的任何植物都可^f吏用。例如，可用含有編碼毒素蛋白的基因或感興趣的一種或多種基因(已針對單子葉或雙子葉植物表達進行了優(yōu)化)的構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化紫花苜蓿、玉米、大豆或萵苣細胞。令經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞發(fā)育為愈傷組織，隨后再生為植物。然后，當植物達到足夠的成熟水平，例如，當葉生長到允許使用物理障礙防止Z;^z^逃逸的大小時，令有害昆蟲(例如，A^"蛹)進食。防止Zygws逃逸的障礙可以是任何商業(yè)可獲得的或自制的、允許Zj^m蛹與吖組織接觸并允許昆蟲探測葉的維管組織并進食的設(shè)備。與Mowry(1993)(J.Agric.Entomol.10:181-184)所述類似的孩史蟲籠(clipcages)將足以裝納A^m蛹以進食。然后在考慮到背景死亡(沒有在葉組織上進食的那些昆蟲發(fā)生的)的情況下，測定死亡率和發(fā)育遲緩計分。還將A^^蛹放在未經(jīng)TIC807編碼基因轉(zhuǎn)化的對照葉上，作為愈傷組織上正常蛹生長的對照?？捎弥参飪?nèi)昆蟲抑制檢驗，來鑒定下述轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物能抑制刺和/或吸來自植物細胞和組織的流體的大量有害昆蟲(應(yīng)當受限于檢驗組織)中的任何。特別地，此類昆蟲抑制檢驗可用于測試表達TIC807和/或其它昆蟲抑制性試劑的植物。其它昆蟲抑制性試劑包括但不限于，i)核糖核苷酸序列，所述有害昆蟲攝入后發(fā)揮功能，抑制所述昆蟲內(nèi)的生物學功能，和ii)昆蟲抑制性的非TIC807蛋白。這些有害昆蟲包括刺然后吸韌皮部汁液或細胞內(nèi)含物的那些有害昆蟲以及浸軟進食區(qū)附近的細胞然后通過吸管攝取從浸軟的細胞釋放的流體的那些有害昆蟲。TIC807蛋白和本文所述的其它昆蟲抑制性試劑靶向的昆蟲包括多種半翅目、同翅目和異翅目昆蟲。本發(fā)明特別包括，通過使用TIC807和本文所述的其它昆蟲抑制性試劑，對昆蟲(例如A^m、粉鼠、跳蟲和辨蟲)的抑制。VIII.轉(zhuǎn)基因植物昆蟲控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的包含編碼TIC807或其殺昆蟲片段的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物可用于控制昆蟲侵害的方法。轉(zhuǎn)基因的大麥、玉米、燕麥、水稻、黑麥、高粱、草皮草、甘蔗、小麥、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、巻心菜、油菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑橘類、棉花、葫蘆、桉樹、亞麻、蒜、葡萄、洋蔥、萵苣、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、楊樹、松樹、向日葵、紅花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、煙草、番茄、裝飾植物、灌木、堅果、鷹嘴豆、木豆、稷、哞酒花和牧場草可用于這些方法。本發(fā)明特別包括被TIC807蛋白抑制的半翅目有害昆蟲攻擊的轉(zhuǎn)基因植物(例如紫花苜蓿、油菜、棉花、萵苣和草莓植物)。本發(fā)明進一步特別包括包含編碼TIC807或其殺昆蟲片段的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因棉花植物，所述植物受到保護，以抵擋A^^種的昆蟲侵害。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物對于控制刺和/或從植物細胞和組織吸流體的昆蟲物種特別有效，所述昆蟲包括但不限于Miridae科的盲蝽(plantbug),例如，西部牧草盲蝽(Z/^/s力e"er^物種)、牧草盲蝽(At^a///zeo7aWs物種)和灰豆棒(palelegumebugs)(Z/^ye//5^)和臭蝽(Stinkbug,尸e/^",'c^e科的物種)。本發(fā)明包括表達抑制特定有害昆蟲的TIC807蛋白的特定類型的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明特別包括表達抑制半翅目昆蟲(包括Z/^/s、跳蟲和蟲牙蟲)的TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花植物。表達SEQIDNO:5的TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花植物預(yù)計能抑制A^tas力ewerw或Ar^Ay///zeohr/i本發(fā)明還特別包括表達SEQIDNO:5的TIC807蛋白并且抑制A^^的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿、油菜、萵苣和草莓植物。首先通過本文所述的方法中的任何一種來鑒定表達昆蟲抑制量的TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因植物?？稍谑芸丨h(huán)境條件下(即，在封閉的生長腔或溫室中)進行初始昆蟲抑制。還可在田間測試中令轉(zhuǎn)基因植物受到昆蟲侵害，并將其與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾容^。典型地，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参飳ū粴⒗ハx劑處理過的植物和未受處理的植物。展示出最佳昆蟲抑制活性的轉(zhuǎn)基因植物品系(即，源于明顯的轉(zhuǎn)基因事件(包含轉(zhuǎn)基因向不同基因組位置的插入)的轉(zhuǎn)基因植物)被選用于潛在的開發(fā)，以用于多種不同的遺傳背景(即，遺傳上不同的栽培種、品種和/或雜交種質(zhì))。將轉(zhuǎn)基因種質(zhì)滲入進另外的種質(zhì)并且生產(chǎn)種子庫(主要包含轉(zhuǎn)基因種子)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，轉(zhuǎn)基因可以以純合狀態(tài)固定于想要的遺傳背景中。一旦轉(zhuǎn)基因在該背景中固定，純合的轉(zhuǎn)基因植物可用于生產(chǎn)非雜交作物的轉(zhuǎn)基因種子。備選地，純合轉(zhuǎn)基因植物可用作為花粉供體或受體，以生產(chǎn)雜交作物的轉(zhuǎn)基因種子。本發(fā)明包括表達抑制特定有害昆蟲的TIC807蛋白的特定類型的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明特別包括表達抑制半翅目昆蟲(包括Ar^/s、跳蟲和蟲牙蟲)的TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花植物。表達SEQIDNO:5的TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花植物預(yù)計能抑制A^"s力e^er^或Ap^as72'/eohWs。本發(fā)明還特別包括表達SEQIDNO:5的TIC807蛋白并且抑制A^^的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿、油菜和草莓植物。IX.非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗椒ê徒M合物本文公開的TIC807蛋白組合物特別可用作為昆蟲抑制性試劑，用于局部和/或系統(tǒng)性地應(yīng)用到田間作物、草、水果和蔬菜以及裝飾植物上。更特定地，TIC807可用于包含昆蟲抑制量的TIC807蛋白組合物的組合物中。在這方面，由針對》ac/77"s力"r/z^/e"Ws芽孢的TIC807晶體蛋白制備物制成的TIC807蛋白組合物特別有用。TIC807蛋白組合物可包含SEQIDNO:5的氨基酸序列或展示出與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列至少70%序列同一性的至少250個氨基酸的昆蟲抑制性蛋白。昆蟲承卩制性纟且合物還可包含^sc/77wst6ui7刀^7ei^/s細月包,或這些細胞的培養(yǎng)物，或者表達一種或多種本發(fā)明的TIC807晶體蛋白的一種或多種A^w2'/^7MS2、細胞的混合物。在某些方面，可能想要制備含有多種晶體蛋白(天然或經(jīng)修飾的)的組合物，用于處理一種或多種類型的易感昆蟲。本發(fā)明包括可使用本文公開的蛋白，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何配制方法，來制備昆蟲抑制性組合物?？赡芟胍渲票磉_一種或多種TIC807DNA片斷的細胞培養(yǎng)物(優(yōu)選地，細菌細胞培養(yǎng)物，例如^3"77m^wr/i^/e/25"2、培養(yǎng)物)的全細胞制備物、細胞提取物、細胞懸浮物、細胞均質(zhì)物、細胞裂解物、細胞上清液、細胞濾出液或者細胞沉淀團，以生產(chǎn)編碼的TIC807蛋白或肽。用于制備這些制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括，例如，對表達感興趣的TIC807肽的細菌細胞(例如5a"77"sSIC8091、SIC8092、SIC8093和SIC8094細胞)的一種或多種培養(yǎng)物進行干燥、凍干、均質(zhì)、提取、過濾、離54心.沉淀或濃縮。在一種實施方式中，昆蟲抑制性組合物包含油可流動的懸浮液，其包含經(jīng)裂解或未經(jīng)裂解的細菌細胞、芽孢或晶體，其中含有一種或多種本文公開的新穎的晶體蛋白。優(yōu)選地，細胞是A細胞，但是，本發(fā)明包括表達本文公開的新穎的核酸片斷并且產(chǎn)生晶體蛋白的任何此類細菌宿主細胞j皮認為是有用的，例如，^c//7^spp.，包才舌及/Z7egateriw/H、及sw6fy7/s;及cerews,j6^c力er/c力/sspp.，，包括S.co7/和/或/^ew^o/z70flasspp.，包括戶.c，c/a、戶.aerw^7'力o》a和戶./7uoi"esce"s。備選地，油可;充動懸'浮'液可由下述組合物中的一種或多種的組合構(gòu)成經(jīng)裂解的或未經(jīng)裂解的細胞、芽孢、晶體和/或經(jīng)純化的晶體蛋白。在第二實施方式中，昆蟲抑制性組合物包含水可分散的顆?；蚍勰Ｔ擃w?；蚍勰┛砂?jīng)裂解的或未經(jīng)裂解的細菌細胞、芽孢或晶體(其含有本文公開的新穎的晶體蛋白中的一種或多種)。這些組合物的優(yōu)選來源包括細菌細胞，例如，及Mw/z^/e";y2、細胞，但是，本發(fā)明也包括經(jīng)本文公開的DNA片斷轉(zhuǎn)化并表達晶體蛋白的5ac/7/ws、i5^c力er/c力/a和T^ew^o/z70/2as屬的細菌也是有用的。備選地，顆?；蚍勰┛捎上率鼋M合物中的一種或多種的組合構(gòu)成經(jīng)裂解的或未經(jīng)裂解的細菌細胞、芽孢、晶體和/或經(jīng)純化的晶體蛋白。在第三種重要的實施方式中，昆蟲抑制性組合物包含可潤濕的粉末、噴霧、乳劑、膠體、水性或有機溶液、塵末、沉淀團或膠態(tài)濃縮物。此類組合物可含有如上文所述的未經(jīng)裂解的或經(jīng)裂解的細菌細胞、芽孢、晶體或細胞提取物，它們含有本文公開的新穎的晶體蛋白中的一種或多種。優(yōu)選的細菌細胞是A"wW"p'e/^/s細胞，但是，本發(fā)明也包括經(jīng)本文公開的DNA片斷轉(zhuǎn)化并表達晶體蛋白的細菌，例如及/ffeg"eW亂A^f/6〃7/s、Acerew51、co7/或？5"ewd咖o/M51spp.細胞，它們也是有用的。此類干燥形式的殺昆蟲組合物可被配制為潤濕后立即溶解，或者備選地，以受控釋放、緩釋或其它時間依賴性方式溶解。備選地，此類組合物可由下述組合物中的一種或多種的組合55枸成經(jīng)裂解的或未經(jīng)裂解的細菌細胞、芽孢、晶體和/或經(jīng)純化的晶體蛋白。在第四種實施方式中，昆蟲抑制性組合物包含經(jīng)裂解的或未經(jīng)裂解的細菌細胞、芽孢、晶體或經(jīng)裂解的或未經(jīng)裂解的細菌細胞、芽孢和/或晶體的混合物的水性溶液或懸浮液或細胞培養(yǎng)物，例如，上文描述的含有一種或多種本文公開的新穎的晶體蛋白的那些。此類水性溶液或懸浮液可作為經(jīng)濃縮貯液提供(在應(yīng)用前被稀釋)或者可作為即用型稀釋溶液提供。對于涉及細菌細胞的應(yīng)用的這些方法而言，可在任何方Y(jié)更的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有TIC807蛋白基因的細菌宿主，其中，DNA構(gòu)建體提供了選擇性優(yōu)點，提供選擇培養(yǎng)基，使得基本上全部或全部細胞都保留及Mi/W/^/eiL2、基因?？砂凑諅鹘y(tǒng)方法收獲這些細胞。備選地，可在收獲之前對這些細胞進行處理。當殺昆蟲組合物包含含有感興趣的經(jīng)修飾的晶體蛋白的及Mur/z^/e/^/s細胞、芽孢和/或晶體時，可以以多種方法來配制此類組合物。它們可用作為可潤濕的粉末、顆粒或塵末，這通過與多種惰性材料，例如，無機礦物質(zhì)(層狀硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)或植物性材料(粉末化的玉米芯、稻殼、胡桃殼等)混合來實現(xiàn)。制劑可包括延展劑-粘著劑佐劑、穩(wěn)定劑、其它殺蟲添加劑或表面活性劑。液體制劑可以是基于水的或者非水性的，它們可用作為泡沫、懸浮液、可乳化濃縮物等。成分可包括流變試劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑或聚合物。備選地，可通過天然或重組細菌表達系統(tǒng)，體外制備TIC807蛋白，并對其進行分離，以用于隨后的田間應(yīng)用。在活性殺生物制劑中配制之前，此類蛋白可以處于粗制細胞裂解物、懸浮液、膠體等中，或者備選地，可以經(jīng)純化、精制、緩沖和/或其它加工。類似地，在某些情況下，可能想要從表達晶體蛋白的細菌培養(yǎng)物分離晶體和/或芽孢，以及將此類晶體和/或芽孢的溶液、懸浮液或膠態(tài)制備物作為活性生物殺昆蟲組合物應(yīng)用。與應(yīng)用方法無關(guān)，活性組分的量以昆蟲抑制量應(yīng)用，這將根據(jù)下迷因素變化，所述因素例如，待控制的特定的半翅目、同翅目或異翅目昆蟲，待處理的特定植物或作物，環(huán)境條件，以及昆蟲抑制性組合物應(yīng)用的方法、比率和量?？赏ㄟ^將細菌細胞、晶體和/或芽孢懸浮液或經(jīng)分離的蛋白組分與想要的農(nóng)業(yè)可接受的載劑一起配制，來制造本文描述的昆蟲抑制性組合物。在以合適的方式施用之前，可對組合物加以配制，例如凍干的、冷凍干燥的、干燥的或處于水性載劑、介質(zhì)或合適稀釋劑(例如鹽水或其它緩沖液)中的。經(jīng)配制的組合物可以是下述形式塵末或顆粒材料，或者是(植物或礦物)油中的懸浮液，或者水或油/水乳劑，或者作為可潤濕粉末，或與適于農(nóng)業(yè)應(yīng)用的任何其它載劑材料組合。合適的農(nóng)業(yè)載劑可以是固體或液體的，它們是本領(lǐng)域公知的。術(shù)語"農(nóng)業(yè)可接受的載劑"包括通常用于殺昆蟲劑配制技術(shù)的所有佐劑，例如，惰性組分、分散劑、表面活性劑、增粘劑(tackifiers)、粘結(jié)劑等，這些是殺昆蟲劑配制領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的。制劑可與一種或多種固體或液體佐劑混合，可通過多種方式來制備，例如，通過使用傳統(tǒng)配制技術(shù)，進行均質(zhì)混合、摻合和/或?qū)⒗ハx組合物與合適的佐劑一起碾碎來實現(xiàn)。通過傳統(tǒng)方法，優(yōu)選通過噴霧，將本發(fā)明的昆蟲抑制性組合物應(yīng)用至靶標半翅目、同翅目或異翅目昆蟲的環(huán)境，典型地，應(yīng)用到待保護的植物或作物的葉上。根據(jù)特異于特定害蟲、待處理的作物和特定環(huán)境條件的條件，來設(shè)置殺昆蟲應(yīng)用的強度和持續(xù)時間。活性成分與載劑的比例將自然取決于殺昆蟲組合物的化學性質(zhì)、溶解性和穩(wěn)定性以及所用的特定的制劑。其它應(yīng)用技術(shù)，例如，撒粉(dusting)、撒布(sprinkling)、浸濕(soaking)、土壤注射、種子包覆、幼苗包覆、噴霧、充氣、噴薄霧(misting)、霧化等，也是可行的，在某些情況下可能是必須的，例如，導致根或莖干侵害的昆蟲，或者用于精致的植被或裝飾植物。這些應(yīng)用流程也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本發(fā)明的昆蟲抑制性組合物可單獨或與其它化合物(包括但不限于其它殺蟲劑)組合用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明的方法還可與其它處理(例如，表面活性劑、去垢劑、聚合物或時間釋放制劑)組合使用。本發(fā)明的殺昆蟲組合物可被配置，以用于系統(tǒng)或局部使用。用于環(huán)境、系統(tǒng)性或葉應(yīng)用的昆蟲抑制性組合物中的昆蟲抑制性試劑的濃度將在很大范圍內(nèi)變化，這取決于特定的制劑的性質(zhì)、應(yīng)用手段、環(huán)境條件以及昆蟲抑制活性的程度。典型地，組合物中的昆蟲抑制性試劑將以按重量計至少大約1°/。的濃度存在于應(yīng)用的制劑中，其可多至按重量計大約99%(含)。組合物的干制劑可以是組合物按重量計的大約1%至大約99%,而液體制劑將通常包含按重量劑大約1%至大約99%或更多的活性成分。包含完整細菌細胞的制劑將通常含有大約104至大約10"個細胞/mg組合物。在一種或多種應(yīng)用中，昆蟲抑制性制劑可根據(jù)需要施用給特定的植物或粑標區(qū)域，典型的田間應(yīng)用率(每公項)在大約lg至大約lkg、2kg、5kg或更多活性成分的概數(shù)范圍內(nèi)。XI.商品本發(fā)明還包括可用本發(fā)明的組合物和方法獲得的商品。此外，本發(fā)明特別包括，一種或多種優(yōu)點可能與源于本發(fā)明的商品相關(guān)。預(yù)計，使用TIC807昆蟲抑制性蛋白和相關(guān)方法可提供具有降低的殺蟲劑殘留水平的商品。在某些情況下，種植者將被鼓勵使用更少的殺蟲劑，例如，有機磷、氨基甲酸鹽、新類煙堿(neonicotinoid)和擬除蟲菊酯殺昆蟲劑。種植、收獲、加工或者接觸本發(fā)明的商品的人向這些殺蟲劑的暴露也因此預(yù)計有所降低。殺蟲劑的使用降低還預(yù)計能提供降低的商品生產(chǎn)成本、降低的環(huán)境污染水平以及降低的不想要的對有益(非靶標)昆蟲和動物群的副作用。本發(fā)明還包括，使用本發(fā)明將提供具有較低生產(chǎn)成本的商品，這因為包括但不限于增加的產(chǎn)率和/或減少的殺昆蟲劑使用等因素。XII.將TIC807昆蟲抑制性蛋白與其它昆蟲抑制性試劑組合使用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明包括下述若干方法，通過所述方法，增加了對特定有害昆蟲的抗性或?qū)θ舾深愑泻ハx的更廣的抗性。兩種方法都需要將有害昆蟲與TIC807蛋白和另外的昆蟲抑制性試劑的組合相接觸。該另外的昆蟲抑制性試劑可抑制與TIC807所抑制的相同的半翅目有害昆蟲，以使得半翅目昆蟲對TIC807蛋白或其它半翅目昆蟲抑制性試劑的抗性發(fā)生率減少。備選地，該另外的昆蟲抑制性試劑可抑制TIC807不抑制的昆蟲，以擴展獲得的昆蟲抑制譜。昆蟲對某些殺昆蟲劑發(fā)展出抗性的潛力已被文獻很好地記錄。使用表達昆蟲抑制性試劑的經(jīng)遺傳修飾作物的大多數(shù)昆蟲抗性管理策略都依賴于使用庇護區(qū)域，其中包含缺乏昆蟲抑制性基因的作物植物。理論上，庇護提供了這樣的區(qū)域，其中，攜帶有非抗性遺傳等位基因座的非抗性昆蟲種群保留下來，從而降低了在昆蟲種群中發(fā)展出抗性的潛力。但是，庇護策略遭遇很多缺點。首先，種植者必須接受種植昆蟲抑制性基因的面積上的產(chǎn)量降低。笫二，庇護是否能有效控制昆蟲種群中顯性抗性等位基因座尚不清楚。一種備選的昆蟲抗性管理策略可利用表達兩種不同的昆蟲抑制性試劑(通過不同的作用模式運作)的轉(zhuǎn)基因作物。在這種情況下，對昆蟲抑制性試劑之一有抗性的任何昆蟲將受到另一昆蟲抑制性試劑的控制，由此降低了在昆蟲種群中發(fā)展抗性的機會。此外，在田間，單種作物可能經(jīng)歷過同時存在的多種不同類的有害昆蟲。例如，在生長季，棉花植物可能受到半翅目害蟲(例如Af^/;)和鱗翅目害蟲(例如5^o化;^eraez/g"a(甜菜夜蛾)、j7e7/o^2zea(沖帛鈴蟲)和/或^i/coFe，a,/zi^ra(夜盜蛾))兩者的攻擊。對這些害蟲中的每種有活性的不同的抑制性試劑的表達將提供對棉花植物的更好的保護，并且，由于有害昆蟲導致的損失降低，這將增加英畝產(chǎn)量?？膳cTIC807蛋白組合用于昆蟲抗性管理或擴展的昆蟲抑制鐠的59第一組昆蟲抑制性試劑包含下述核糖核苷酸序列，其被所述有害昆蟲攝入后，所述序列發(fā)揮功能以抑制所述有害昆蟲內(nèi)的生物學功能。選自特定的害蟲細胞的天然的、涉及必要生物學途徑的序列的特定核苷酸序列可以以導致形成雙鏈RNA或者甚至是穩(wěn)定的雙鏈RNA的方式在細胞中表達。通過用核糖核苷酸抑制靶標有害昆蟲的必要基因產(chǎn)物，生物體無法法發(fā)育，最終死亡。在美國專利申請公開文本No.20060021087中對使用此類核糖核苷酸序列來控制有害昆蟲(例如Z/^/s)進行了描述。靶向提供下述必要生物學功能的必要昆蟲基因，以進行抑制，所述生物學功能包括但不限于肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)控，離子調(diào)控和運輸，消化酶的合成，細胞膜勢能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，細胞分裂，能量代謝，呼吸和凋亡?？杀灰种频睦ハx基因包括但不限于編碼V-ATP酶蛋白、泛素蛋白、多聚半乳糖醛酸酶蛋白、果膠酶蛋白、GABA神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白、EFIa蛋白、細胞色素P-450單氧合酶蛋白、表皮蛋白前體蛋白、CHD3蛋白和20S蛋白酶蛋白的基因。基于核糖核苷酸的昆蟲控制試劑還可包含針對多種昆蟲靶向基因的序列。為控制A^M，本發(fā)明特別包括針對SEQIDNO:24至SEQIDNO:39的抑制性核糖核苷酸或針對SEQIDNO:24至SEQIDNO:39的抑制性核糖核苷酸的組合。SEQIDNO:24至SEQIDNO:39在昆蟲控制中的用途在美國專利申請公開文本No.20060021087中公開。當多種昆蟲基因被靶向以阻遏時，可按照Filiatti，美國申請公開文本No.2004-0029283Al中闡釋和公開的，制造多順反子DM元件?？墒褂枚喾N方法來在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)針對靶標害蟲的抑制性核糖核苷酸。通常，抑制性dsRNA和昆蟲靶標基因的部分工相至少大約80%的序列同一性，或者大約90%的序列同一性，或者大約95%的序列同一性，或者大約99%的序列同一性，或者甚至大約100%的序列同一性。備選地，RNA的雙鏈體區(qū)域可在功能上被定義為能與輩巴標基因60轉(zhuǎn)錄物的一部分雜交的核苷酸序列。展示出更高同源性的較全長短的序列能補償較長但較少同源性的序列。相同核苷酸序列的長度可以是至少25、50、100、200、300、400、500或1000個堿基。通常，應(yīng)當使用超過20-100個核苷酸的序列，雖然超過大約200-300個核苷酸的序列將是優(yōu)選的，超過500-1000個核苷酸的序列將是尤其優(yōu)選的，這取決于靶標基因的大小。在另一實施方式中，可通過"間隔序列，，分開的反向重復來產(chǎn)生晃蟲抑制性核糖核苷酸。間隔序列可以是這樣的區(qū)域，其中包含在需要的時侯協(xié)助各重復之間形成二級結(jié)構(gòu)的任何核苷酸序列。在本發(fā)明的一種實施方式中，間隔序列是mRNA的正義或反義編碼序列的一部分。備選地，間隔序列可包含能與核酸分子共價相連的核苷酸或其同源體的任何組合。間隔序列可包含長度為至少大約10-100個核苷酸的核苷酸序列，或者備選地，長度為至少大約100-200個核苷酸，長度為至少大約200H00個核苷酸，或者長度為至少大約400-500個核苷酸。用于生產(chǎn)dsRNA的轉(zhuǎn)基因序列可包含啟動子，其與內(nèi)含子編碼序列和源于靶標基因中的序列的發(fā)卡RM可操作相連(MikiandShimamoto，PlantCellPhysiol.Apr2004;45(4):490-495)。備選地，用于生產(chǎn)siRNA的轉(zhuǎn)基因可包含與發(fā)卡RNA可操作相連的RNApolIII啟動子(etal.，NucleicAcidsRes.Dec22004;32(21):el71)。發(fā)卡RNA可包含正義鏈靶標基因序列的大致19-24個核苷酸的5，序列，接著是大約8-IO個核苷酸的間隔核苷酸，接著是反義序列的大致19-24個核苷酸的序列(其能與前面的正義鏈序列堿基配對)。但是，也可使用含有98至853個的范圍內(nèi)的核苷酸的正義/反義臂的、表達發(fā)卡MA的植物轉(zhuǎn)基因(Wesleyetal.，PlantJ.2001，27(6):581-90)。用于發(fā)卡RNAs的轉(zhuǎn)基因介導的表達的載體和方法公開于美國專利申請Nos.20050164394、20050160490和20040231016中?？膳cTIC807蛋白組合使用用于昆蟲抗性管理或擴大的昆蟲抑制揭的第一組昆蟲抑制性試劑包含并非TIC807的昆蟲抑制性蛋白?？墒褂迷从诩癕wri/^/eas/^尸力ofor力a^/ws和/或Ze/or力a^/iAy的多種昆蟲抑制性蛋白。為控制刺吸式昆蟲(例如AF^/s),可將若干非TIC807昆蟲抑制性蛋白與TIC807在植物中組合表達，以獲得更好的控制和/或抗性管理。在植物中與TIC807—起表達的此類分子可包括ET79、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128(PCTUS2006/033867)、AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038(WO06/107761)、AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021(W006/083891)、AXMI-010(WO05/038032)、AXMI-003(WO05/021585)、AXMI-008(US2004/0250311)、AXMI-006(US2004/0216186)、AXMI-007(US2004/0210965)、AXMI-009(US2004/0210964)、AXMI-014(US2004/0197917)、AXMI-004(US2004/0197916)、AXMI-028和AXMI-029(WO06/119457)和AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004(WO04/074462)。關(guān)于抑制性蛋白分子的組合，TIC809(示為SEQIDNO:10)和TIC810(示為SEQIDNO:l2)以前已在生物檢驗中顯示出對西部牧草盲蝽(WTPB)，A^"s力esperusKnight有抑制性(PCTUS2006/033867)。TIC809和TIC810的融合蛋白——TIC127(示為SEQIDNO:14)和TIC128(示為SEQIDNO:16)也可對Zj^m有活性。編碼TIC127的多核普酸包含編碼TIC809的核酸分子，該分子與編碼TIC810的核酸分子通過多接頭核苷酸序列(示為SEQIDNO:17,編碼SEQIDNO:18中示出的氨基酸接頭)相連。編碼TIC128的多核苷酸包含編碼TIC810的核酸分子，該分子與編碼TIC809的核酸分子通過多接頭核苷酸序列(示為SEQIDNO:l7，編碼SEQIDNO:18中示出的氨基酸接頭)相連。TIC807與TIC127或TIC128的組合表達可提供對的增強的控制。可用下述植物表達構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化雙子葉植物，例如，棉花，所述構(gòu)建體含有經(jīng)雙子葉植物優(yōu)化的、編碼TIC807(示為SEQIDNO:6)的核苦酸序列以及TIC809(示為SEQIDNO:9)和TIC810(示為SEQIDNO:11)，或TIC127(示為SEQIDNO:200880020577.113)弟.TIC128(示為SEQIDNO:15)，以提供對At^aj的增強的抗性或者抑制Ar^/s屬內(nèi)含有的其它物種。為控制鱗翅目害蟲，本發(fā)明特別包括TIC807蛋白與鱗翅目活性蛋白(例如，CrylA蛋白(美國專利No.5,880,275)、CrylB(美國專利No.10/525,318)、CrylC(美國專利No.6,033,874)、CrylF，CrylA/F嵌合體(美國專利Nos.7，070,982、6，962，705和6,713,063)和Cry2Ab蛋白(美國專利No.7，064，249))的組合。編碼TIC807蛋白分子和其它昆蟲抑制性試劑(例如雙鏈RNA分子和/或非TIC807蛋白)的DM序列可通過直接轉(zhuǎn)化、通過育種或其組合方式，組合于單種植物中?？蓪瑔幼雍屠ハx抑制性試劑編碼載:。、當兩種k蟲抑制性試;是蛋白時，可通i蛋白":感性接頭或者甚至自身加工蛋白酶切割位點，將針對每種的編碼區(qū)域分開(見美國專利No.5,846,767)。當昆蟲抑制性試劑每種被引入不同的轉(zhuǎn)基因植物中時，可雜交這些植物，以獲得含有所有的昆蟲抑制性試劑編碼轉(zhuǎn)基因的植物。還預(yù)計，TIC807蛋白分子與其它昆蟲抑制性試劑(例如雙鏈RNA分子和/或非TIC807蛋白)的組合可帶來意料不到的協(xié)同性昆蟲抑制性效果，這是單獨使用TIC807殺昆蟲蛋白、單獨使用抑制性核糖核苷酸或者單獨使用非TIC807昆蟲抑制性蛋白時觀察不到的。協(xié)同性效果包括但不限于i)LC5。、EC5。、IC5。、百分比死亡率或百分比發(fā)育遲緩值的定量改變，和ii)不反映每種昆蟲抑制性試劑單獨展示的譜(即，一種試劑提供的半翅目昆蟲抑制和另一試劑提供的鱗翅目昆蟲抑制的組合)的簡單組合的昆蟲抑制譜定性改變(即，半翅目、同翅目和鱗翅目昆蟲抑制)。協(xié)同性定量效果的例子包括但不限于在組合中觀察到的比加合性更大的LC5。、EC5Q、和/或ICs。的減少、或百分比死亡率或百分比發(fā)育遲緩值中的任何的增加。協(xié)同性定性效果的例子包括但不限于用昆蟲試劑的組合對有害昆蟲的控制是單獨用任何成員時都看不到的。在這種情況下，通過組合控制的新的有害昆蟲可以是昆蟲目(即半翅目)內(nèi)的，其中，昆蟲抑制性試劑僅抑制單獨使用時針對的昆蟲目內(nèi)的其它有害昆蟲。XIII.經(jīng)分離的TIC807蛋白和生物等同物本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的TIC807蛋白。在一種實施方式中，TIC807蛋白包含與SEQIDNO:5具有至少70°/。序列同一性的至少250個氨基酸的蛋白，并且展示出昆蟲抑制活性。本文包括的生物功能等同物的肽、多肽和蛋白應(yīng)當與TIC807多肽序列的序列或其中的相應(yīng)部分具有大約70%或更高的序列同一性，優(yōu)選大約85%或更高的序列同一性，以及最優(yōu)選大約90%至95%或更高的序列同一性。在本發(fā)明的某些實施方式中，的生物功能等同物的肽、多肽和蛋白與TIC807的序列(SEQIDNO:5)具有80%或80%以上，優(yōu)選大約85%、86%、87%、88%、89%或更高的序列同一性，以及最優(yōu)選大約90%、91%、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。與TIC807生物功能等同的肽、多肽和蛋白包括但不限于在TIC807蛋白序列中含有保守氨基酸取代的氨基酸序列?？杀蝗〈勋@得生物等同物的TIC807蛋白的例子包括但不限于TIC807蛋白序列(SEQIDNO:5)。在此類氨基酸序列中，序列中的一處或多處氨基酸可被電荷和極性與原有氨基酸類似的另一氨基酸取代，即，保守氨基酸取代，這產(chǎn)生沉默改變。TIC807多肽序列內(nèi)的氨基酸的取代可選自天然存在的氨基酸所述的類別中的其它成員。氨基酸可被分入下述四組(l)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。這若干組內(nèi)代表性的氨基酸包括但不限于U)酸性(負電荷)氨基酸，例如，天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(正電荷)氨基酸，例如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸，例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非極性(疏水)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。200880020577.1可將這些組之一中的一個氨基酸取代為同組的另一氨基酸，來制進TIC807多肽序列中的保守氨基酸改變。TIC807的生物功能等同物可具有IO處或更少的保守氨基酸改變，更優(yōu)選地，7處或更少的氨基酸改變，最優(yōu)選地，5處或更少的保守氨基酸改變。編碼核苷酸序列(基因、質(zhì)粒DNA、cMA或合成DNA)因此將具有相應(yīng)的堿基取代，這令其得以編碼TIC807的生物功能等同物形式。如所指出的，可在本發(fā)明的肽和編碼它們的DNA片斷的結(jié)構(gòu)中制造修飾和改變，但仍獲得編碼具有想要的特征的蛋白或肽的功能分子。下述討論基于對蛋白氨基酸的改變，以制造等同物或者甚至有所改進的第二代分子。在本發(fā)明的某些特別的實施方式中，經(jīng)突變的TIC807蛋白可用于增加蛋白的昆蟲抑制活性，由此增加植物細胞中重組轉(zhuǎn)基因的表達和/或昆蟲抑制活性?？筛鶕?jù)表1給出的密碼子，通過改變DNA序列的密碼子來實現(xiàn)氨基酸改變。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>例如，在蛋白結(jié)構(gòu)中，某些氨基酸可被其它氨基酸取代，而不會導致生物化學活性或生物學活性有可觀損失。鑒于界定蛋白生物學功能活性的是蛋白的交互能力和性質(zhì)，因此可在蛋白序列中制造某些氨基酸序列(當然，根本的DNA編碼序列)取代，但獲得具有類似性質(zhì)的蛋白。發(fā)明人由此提出可在公開的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)DNA序列中制造多種改變，而不會導致生物利用性或活性的可觀損失。在制造此類改變時，可考慮到氨基酸的水指數(shù)(hydropathicindex)。氨基酸水指數(shù)對于賦予蛋白交互生物學功能的重要性通常是本領(lǐng)域所理解的(KyteandDoolittle，JMolBiol.157(1):105-32，1982)。公認，氨基酸的相對水指數(shù)特征為得到的蛋白的二級結(jié)構(gòu)作出貢獻，這進而界定了蛋白與其它分子(例如酶、底物、報道子、DNA、抗體、抗原等)的相互作用。基于其疏水性和電荷特征，每種氨基酸都被分配了水指數(shù)(KyteandDoolittle，Ibid)。它們是異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);曱硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。本領(lǐng)域中已知，某些氨基酸可被具有近似水指數(shù)或計分的其它氨基酸取代，但仍得到具有相似生物學活性的蛋白，即，仍獲得生物功66能等同物蛋白。在制造此類改變時，水指數(shù)在+2之內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，在+1之內(nèi)的那些是特別優(yōu)選的，在+0.5之內(nèi)的那些是進一步更優(yōu)選的。還應(yīng)當理解，對相似氨基酸的取代可基于親水性有效進行。美國專利No.4，554，101指出，蛋白的最大的局部平均親水性(由其相鄰氨基酸的親水性控制)與蛋白的生物性質(zhì)相關(guān)。如美國專利No.4，554，101指出的，已向氨基酸殘基分配了下述親水性值精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+0.1);谷氨酸(+3.0.+0.1);絲氨酸(+G,3);天冬酰胺(+Q.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(G);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5.+0.1);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。TIC807多肽中的非保守取代還應(yīng)認識到，可在TIC807多肽序列中制造非保守取代，以獲得是本文公開的TIC807多肽的功能生物等同體的TIC807多肽。在這些情況下，可針對對真菌生長的抑制，對非保守取代進行筒單地測試，以鑒定出提供給定的TIC807多肽的功能生物等同體的非保守取代。TIC807的片段和變體雖然本發(fā)明的昆蟲抑制性多肽優(yōu)選包含TIC807蛋白序列，但與該昆蟲抑制性蛋白具有相同或相似昆蟲抑制活性的該序列片段和變體也包括在本發(fā)明內(nèi)。因此，具有昆蟲抑制活性的、TIC807蛋白中至少250或更多個氨基酸的連續(xù)序列也是本發(fā)明所預(yù)期的。具有本發(fā)明預(yù)期的昆蟲抑制活性的TIC807片段或變體也可在TIC807蛋白序列中包含氨基酸取代、缺失、插入或添加。本發(fā)明的昆蟲抑制性多肽優(yōu)選包含TIC807蛋白序列(SEQIDNO:5)，具有與該特定TIC807蛋白相同或相似的昆蟲抑制活性的、該序列的片段和變體也包括在本發(fā)明內(nèi)，這是本發(fā)明所預(yù)期的。因此，具有昆蟲抑制活性的、SEQIDNO:5中至少250或更多個氨基酸的連續(xù)序列是本發(fā)明所預(yù)期的。昆蟲抑制性的TIC807片段還可包含SEQIDNO:5的309個氨基酸的TIC807序列中的至少260、至少270、至少280、至少290或至少300個氨基酸。具有本發(fā)明預(yù)期的昆蟲抑制活性的片段或變體也可在SEQIDNO:5所示的序列中包含氨基酸取代、缺失、插入或添加。成熟TIC807蛋白的片段可以是截短形式的，其中，一個或多個氨基酸從N-末端、C-末端、蛋白中部或這些的組合處缺失，但仍具有昆蟲抑制活性，這也是本發(fā)明所預(yù)期的。這些片段可以是TIC807的天然存在的突變體或合成突變體，并且保留有TIC807的昆蟲抑制活性?？捎糜讷@得具有昆蟲抑制活性的截短的衍生物的一種優(yōu)選TIC807蛋白是SEQIDNO:5的TIC807蛋白。TIC807的變體包括下述形式，其中，一處或多處氨基酸已被插入天然序列。這些變體也可以是TIC807的天然存在的突變體或合成突變體，并且保留有TIC807的昆蟲抑制活性。前述的組合，即氨基酸缺失和添加都含有的昆蟲抑制性多肽的形式也被本發(fā)明所包括。其中也可存在氨基酸取代。本發(fā)明所包括的TIC807的片段和變體優(yōu)選應(yīng)當與具有SEQIDNO:5所示的相應(yīng)氨基酸序列的成熟TIC807蛋白的相應(yīng)區(qū)域具有大約70-75°/?；蚋叩男蛄型恍裕鼉?yōu)選大約80%、85%、88%或更高的序列同一性，以及最優(yōu)選地，大約90%至95%或更高的氨基酸序列同一性。結(jié)構(gòu)功能關(guān)系用于設(shè)計昆蟲抑制性TIC807變體的用途本發(fā)明還包括將結(jié)構(gòu)功能關(guān)系用于設(shè)計其它昆蟲抑制性TIC807蛋白變體的用途。首先，可通過對TIC807晶體的晶體學分析來獲得結(jié)構(gòu)。預(yù)計此類結(jié)構(gòu)揭示了TIC807蛋白中對TIC807的昆蟲抑制活性做出貢獻的昆蟲受體結(jié)合、昆蟲腸中孔形成、與TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性中涉及的結(jié)構(gòu)域。還預(yù)計，對TIC807和其它相關(guān)蛋白的比較可允許推斷出對TIC807蛋白的殺昆蟲活性做出貢獻的蛋白結(jié)構(gòu)域。在該方面，注意到，TIC807具有與MTX樣蛋白家族的一定相似性。該Mtx樣蛋白家族是按"3"7/^5s/力e"'cy51蛋白Mtx2(ThanabaluandPorter,Gene.170(1):85，1996;NCBI檢錄No.2211294A)和Mtx3(Liuetal.，ApplEnvironMicrobiol.62(6):2174，1996;NCBI檢錄No,AAB36661)命名的，其包括Cryl5Aa(SEQIDNO:41)、Cry33Aa(NCBI檢錄No.AAL26871)、Cry23Aa(NCBI檢錄No.AAF76375)、Cry38Aa(NCBI檢錄No.AAK64559)、CryC35(NCBI檢錄No.CAA63374)、機D蛋白(NCBI檢錄No.AAA22332)和CryNT32(NCBI檢錄No.AAL26870)。還認為，TIC807與氣溶素蛋白家族距離上相關(guān)，該家族包括cryET33(WO97/17600)和TIC901(美國專利申請No.20060191034)。氣溶素是這樣的一組蛋白，其多聚化，并在膜中形成孔，已知它們是毒素(Parkeretal.,Mol.Microbiol.19(2):205，1996)。特別地，晶體結(jié)構(gòu)測定表明，氣溶素的e-折疊結(jié)構(gòu)域參與形成膜孔(RossJohnetal.，JStructBiol.121(2):92,1998)?？捎脕碜云渌麺TX沖羊或氣溶素家族蛋白的相似結(jié)構(gòu)域代替TIC807蛋白的結(jié)構(gòu)域，以鑒定出參與對TIC807的昆蟲抑制活性做出貢獻的昆蟲受體結(jié)合、昆蟲腸中孔形成、與TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性中涉及的結(jié)構(gòu)域?？杀容^來自結(jié)構(gòu)域代替實驗的數(shù)據(jù)，或者將其推廣至Mtx樣蛋白家族成員的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，以闡明提供不同的殺昆蟲活性、改進的殺昆蟲活性、改進的結(jié)合特征、改進的孔形成能力的結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)鑒定了TIC807蛋白中提供TIC807蛋白的昆蟲抑制性質(zhì)(即，昆蟲受體結(jié)合、昆蟲腸中孔形成、與TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性)的某些蛋白結(jié)構(gòu)域，還預(yù)計，這些區(qū)域可被廣泛地誘變。一旦被誘變，可對進行變體TIC807蛋白進行生物化學檢驗(即，昆蟲受體結(jié)合、昆蟲腸中孔形成、與TIC807的多聚化、蛋白酶敏感性和/或蛋白酶抗性)或生物學檢驗(即，昆蟲抑制檢驗)，以鑒定出賦予改進的生物化學和/或昆蟲抑制活性的那些變體。本發(fā)明還包括對鑒定出的這些變體再進行重復的誘變和檢驗輪次?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的(Steinmer，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747,1994;Yuanetal.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.69(3):373，2005)或其它完全不同的方法所提供的、用于經(jīng)分離蛋白的分子進化的多種流程，來產(chǎn)生TIC807蛋白變體。至少9個氨基酸的經(jīng)分離的TIC807蛋白在本發(fā)明的其它一些實施方式中，提供了下述經(jīng)分離的蛋白，其包含SEQIDNO:5中含有的長度為至少9個氨基酸的多肽序列。本發(fā)明包括至少9個氨基酸的TIC807肽序列的至少兩種不同的用途。首先，本發(fā)明包括，可將至少9個氨基酸的TIC807肽序列取代進不同的蛋白序列，以在得到的經(jīng)TIC807肽取代的蛋白上賦予TIC807蛋白的昆蟲抑制活性中的全部或亞組。TIC807肽序列賦予的昆蟲抑制性活性可包含對半翅目害蟲(包括但不限于A^m)的抑制。在不被理論束縛的情況下，我們相信，當插入另一蛋白時，由于上文指出的理由中的全部或任何，至少9個氨基酸的TIC807肽序列可提供1)改進的晶體形成，2)改進的蛋白穩(wěn)定性或降低的蛋白酶降解，3)改進的昆蟲膜受體識別和結(jié)合，4)昆蟲中腸內(nèi)皮中改進的寡聚化或通道形成，和5)改進的殺昆蟲活性或殺昆蟲特異性。來自SEQIDNO:5的至少12、至少16、至少32、至少50或至少IOO個氨基酸殘基的較大的TIC807肽序列也可被取代進不同的蛋白序列，以獲得經(jīng)昆蟲抑制性的TIC807肽取代的蛋白。可通過下述技術(shù)來合成經(jīng)TIC807肽取代的蛋白，所述技術(shù)包括但不限于位點特異性誘變(Kunkel，T.A.etal.Meth.Enzymol.154:367，1987)、DNA改組((Stemmer，W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747，1994)、PCRTM重疊延伸(Hortoneta1.,Gene77:61，1989)、<壬<可蛋白分子進4^方法(Yuanetal.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.69(3):373,2005)、直接合成、這些方法的組合，或者通過提供經(jīng)TIC8(H取代的蛋白的其它完全不同的方法來進行。特別地，本發(fā)明包括通過將至少9個氨基酸的TIC807肽序列插入或取代進源于70^c^/i^Mi/r/z^/e/2W;的昆蟲抑制性蛋白而獲得的經(jīng)TIC807取代的蛋白。可^皮TIC807多肽取代以獲得具有昆蟲抑制活性的經(jīng)TIC807取代的蛋白的示例性^"'77mMwW"鄉(xiāng)ye/2Ws蛋白包括但不限于Cryl5Aal(Brown&Whiteley,1992，JBacteriol174549-557;SEQIDNO:41)、CryET29(美國專利No.6，093，695)、CytlBal(美國專利No.5,723,440)、"aci/7y^f力wri"^7e/^/sisraelensisCyt毒素(美國專利No.5，885，963)和另外的活性A"77"《MwW邱/ew/s晶體蛋白AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038(美國專利申請公開文本No.20060242732中公開的)?？杀籘IC807多肽取代以獲得具有昆蟲抑制活性的經(jīng)TIC807取代的蛋白的其它蛋白包括但不P艮于Mtx2(ThanabaluandPorter,Gene.170(1):85，1996;NCBI檢錄No.2211294A)、Mtx3(Liuetal.,ApplEnvironMicrobiol.62(6):2174，1996;NCBI檢錄No.AAB36661)、Cryl5Aa(SEQIDNO:41)、Cry33Aa(NCBI檢錄No.AAL26871)、Cry23Aa(NCBI檢錄No.AAF76375)、Cry38Aa(NCBI檢錄No.AAK64559)、CryC35(NCBI檢錄No.CAA6337.4)、40KD蛋白(NCBI檢錄No.AAA22332)、CryNT32(NCBI檢錄No.AAL26870)、cryET33(W097/17600)和TIC901(美國專利申請公開文本No.20060191034)。本發(fā)明還包括，大約250至大約309個氨基酸之間的經(jīng)分離的TIC807蛋白還可用于抗體生產(chǎn)或昆蟲抑制。本發(fā)明的這些經(jīng)分離的TIC807多肽序列與SEQIDNO:5內(nèi)含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%，至少大約90%，至少大約95%或100%的序列同一性。這些TIC807蛋白還可包含共價相連的指示劑、氨基酸間隔、氨基酸接頭、信號序列、葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列、液泡靶向序列或停止轉(zhuǎn)移序列。本發(fā)明還包括，SEQIDN0:5的至少9個連續(xù)氨基酸的經(jīng)分離的TIC807肽序列可用作為免疫原或表位，以制備識別TIC807蛋白的抗體。此類抗體可用于檢測轉(zhuǎn)基因植物中、源于轉(zhuǎn)基因植物的商品中、微生物或重組DM表達文庫(含有克隆的TIC807序列)中的TIC807蛋白。TIC807多肽長度可以是至少9、至少12、至少16或至少32個氨基酸。當TIC807肽序列長度為至少32個氨基酸時，其與SEQIDNO:5內(nèi)含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約80°/。、90%或95%的序列同一性。肽可與載劑蛋白(例如KLH或清蛋白)相連，以協(xié)助抗體生產(chǎn)。鑒定出適用于疫苗中的TIC807蛋白免疫決定表位和/或其功能等同物是相當簡單的。例如，技術(shù)人員可利用Hopp在美國專利No.4,554,101中教導的方法，其中教導了基于親水性來從氨基酸序列鑒定和制備表位。還可使用若干其它文章中描述的方法以及基于它們的軟件程序來鑒定表位核心序列(見，例如，美國專利No.4,554,101)。這些"表位核心序列"的氳基酸序列也可容易地并入肽中，這通過應(yīng)用肽合成或重組DNA技術(shù)來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的TIC807肽通常將在大約9至大約20個氨基酸的長度概數(shù)內(nèi)，更優(yōu)選地，大約9至大約15個氨基酸的長度。我們提出，較短的抗原性TIC807蛋白源的肽在某些情況下將提供優(yōu)點，例如，在免疫檢測檢驗的制備中。示例性的優(yōu)點包括易于制備和純化、相對較低成本和改進的生產(chǎn)重現(xiàn)性以及有好處的生物分布性。我們提出，可通過制備下述合成肽來實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)點，所述合成肽包括經(jīng)修飾的和/或延伸的表位/免疫原性核心序列，這導致產(chǎn)生了針對TIC807蛋白(以及特別針對TIC807相關(guān)序列)的"通用，，表位肽。在本發(fā)明中一些特別的方面，這些表位核心序列作為特殊多肽抗原的親水區(qū)域被鑒定。我們提出，這些區(qū)域代表了最可能促進T-細胞或B-細胞刺激以及因此誘發(fā)特異性抗體生產(chǎn)的區(qū)域。在本文中使用時，表位核心序列是相對較短的氨基酸段，其與本文公開的針對TIC807蛋白的抗體上的抗原結(jié)合位點"互補"并因此將與其結(jié)合。此外或備選地，表位核心序列是這樣的序列，其誘發(fā)與針對本發(fā)明的肽組合物的抗體有交叉反應(yīng)性的抗體。因此，可根據(jù)其對想要的蛋白抗原與相應(yīng)的針對蛋白的抗血清的結(jié)合的竟爭或者可能代替的能力，從操作上對本發(fā)明的某些表位核心序列加以定義。通常，認為多肽抗原的大小并不關(guān)鍵，只要其至少長到能攜帶給定的一種或多種核心序列即可。本文公開內(nèi)容中預(yù)計最小的有用核心72序列將通常是長度為大約9個氨基酸的概數(shù)，概數(shù)為10至20個氨基酸的序列是更優(yōu)選的。因此，該大小通常對應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明制備的最小的肽抗原。但是，如果需要的話，抗原的大小也可以更大，只要其含有基本表位核心序列即可。XIV.TIC807抗體組合物和制造抗體的方法在一些特別的實施方式中，本發(fā)明包括與本文公開的TIC807蛋白結(jié)合的抗體(單克隆或多克隆)的用途。用于制備和分析抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(見,例如,UsingAntibodies:ALaboratoryManual:ColdSpringHarborLaboratory,1999)。產(chǎn)生單克隆抗體(mAbs)的方法通常從與制備多克隆抗體相同的品系開始。簡言之，通過用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物對動物免疫，制備多克隆抗體，從經(jīng)免疫的動物收集抗血清?？墒褂脤挿秶膭游镂锓N來生產(chǎn)抗血清。典型地，用于生產(chǎn)抗血清的動物是兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠和山羊。因為兔有相對較大的血液體積，兔是生產(chǎn)多克隆抗體的優(yōu)選選擇。如本領(lǐng)域公知的，給定的組合物的免疫原性可有所變化。因此通常必須要對宿主免疫系統(tǒng)進行強化，這可通過將肽或肽免疫原與載劑偶聯(lián)來實現(xiàn)。示例性的優(yōu)選載劑是鑰孔戚血藍蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其它清蛋白，例如，卵清蛋白、小鼠血清清蛋白或兔血清清蛋白也可用作為載劑。用于將肽、多肽或蛋白與載劑蛋白綴合的手段是本領(lǐng)域公知的，其包括使用戊二^、m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺和雙耦氮(biazotized)聯(lián)苯胺。還如本領(lǐng)域公知的，可使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑(已知作為佐劑)，來增強特定免疫原組合的免疫原性。示例性和優(yōu)選的佐劑包括完全Freimd，s佐劑(免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑，含有殺死的c"6erci/7cc、)、不完全Freund，s佐劑和氛氧4b鉆佐劑。用于生產(chǎn)多克隆抗體的免疫原組合物的量根據(jù)免疫原的性質(zhì)和用于免疫的動物而改變?？墒褂枚喾N途徑來施用免疫原(皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi))。可通過免疫之后在多個點從經(jīng)免疫的動物采血樣，來監(jiān)測多克隆抗體的生產(chǎn)。還可給予笫二次、強化注射。重復強化和滴定的過程，直到獲得合適的效價。當獲得想要的免疫原性水平時，對經(jīng)免疫的動物放血，分離血清并貯藏，和/或動物可用于產(chǎn)生mAbs。可使用公知技術(shù)，容易地制備單克隆抗體(mAbs)，例如美國專利No.4，196，265中示例的那些。典型地，該技術(shù)包括用選用的免疫原組合物(例如，經(jīng)純化或部分純化的抗真菌蛋白、多肽或肽)對合適的動物加以免疫。免疫組合物可以以能有效刺激產(chǎn)生抗體的細胞的方式施用。嚙齒類(例如小鼠和大鼠)是優(yōu)選的動物，但是，也可使用兔、綿羊和青蛙細胞。使用大鼠可提供某些好處，但是小鼠是優(yōu)選的，其中BALB/c小鼠是最優(yōu)選的，因為其最常使用，并且通常提供較高的穩(wěn)定融合比例。本發(fā)明還包括遺傳免疫方法，以獲得與本文公開的TIC807蛋白結(jié)合的單克隆或多克隆抗體。在這些方法中，將編碼TIC807蛋白的基因與在哺乳動物細胞中有活性的啟動子可操作相連。然后，將包含哺乳動物細胞表達盒(包含TIC807編碼蛋白)的經(jīng)分離的質(zhì)粒DNA直接注射進動物，誘發(fā)對編碼的TIC807蛋白的免疫應(yīng)答。可用作為用于遺傳免疫的注射宿主的動物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、山羊、牛或馬。雖然可使用多種注射方案，但是一種典型的方法將包括以大約100ug/注射/動物(即，針對小鼠、大鼠或兔)的劑量，注射溶于經(jīng)磷酸鹽緩沖的鹽水或其它合適的緩沖液中的質(zhì)粒DNA(濃度為大約l-2mg質(zhì)粒DNA/ml)。每只動物中，可以以2周的間隔進行大約3-4次注射。ChambersandJohnston，NatureBiotechnol.(21):1088，2003中對遺傳免疫進行了描述。協(xié)議研究機構(gòu)還進行了遺傳免疫實驗，以獲得抗體(QEDBioscienceInc.，SanDiego,CA,USA)?？捎糜谶z傳免疫的有用的哺乳動物表達盒的例子包括但不限于pRc/RSV載體(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA),或pcDNA3.1載體(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，其提供了CMV啟動子，用于表達可操作相連的基因。當高水平的抗原表達是細胞毒性時，可使用較弱的啟動子，例如SV40啟動子，來表達抗原。預(yù)計，天然TIC807基因(SEQIDNO:4)或合成TIC807基因(SEQIDNO:6)可與在哺乳動物細胞中有活性的啟動子和聚腺苷化元件可操作地相連，以獲得適于遺傳免疫的質(zhì)粒。但是，本發(fā)明還包括通過將TIC807氨基酸序列(SEQIDNO:5)翻譯回去，來設(shè)計和合成用于在哺乳動物宿主中表達的其它TIC807編碼序列。本發(fā)明還包括下述哺乳動物表達載體，所述載體還包含信號肽序列，所述序列提供可操作相連的編碼TIC807蛋白的序列的跨膜插入和/或細胞外分泌。XV.TIC807蛋白篩選和檢測試劑盒本發(fā)明包括下述方法和試劑盒，用于篩選可能含有TIC807蛋白或TIC807相關(guān)多肽或生產(chǎn)此類多肽的細胞的樣品。在本文包括的一些特定實施方式中，所述方法和試劑盒檢測TIC807蛋白。試劑盒可含有一種或多種本發(fā)明的抗體，并且還可含有用于檢測本發(fā)明的抗體和樣品之間的相互作用的試劑。提供的試劑可以是經(jīng)放射性標記、分光光度標記、熒光標記或醉促標記的。提供的試劑可包括底物，所述底物可轉(zhuǎn)化為可通過分光光度法、發(fā)光測量或熒光檢測的產(chǎn)物。試劑盒還可含有已知的經(jīng)放射標記或半抗原標記的、能與本發(fā)明的抗體結(jié)合或相互作用的試劑。試劑盒的試劑可作為液體溶液、與固體支持物相連的形式或者作為干燥粉末提供。優(yōu)選地，當試劑以液體溶液的形式提供時，液體溶液是水性溶液。優(yōu)選地，當提供的試劑與固體支持物相連時，固體支持物可以是色鐠介質(zhì)、具有多種孔的測試板或顯微鏡玻片。當提供的試劑是干燥粉末時，可通過加入合適的溶劑(可被提供)來重構(gòu)該粉末。在又一些實施方式中，本發(fā)明涉及免疫檢測方法和相關(guān)試劑盒。提出，可利用本發(fā)明的TIC807蛋白或肽，來檢測與其有反應(yīng)性的抗體，或者，可利用按照本發(fā)明制備的抗體來檢測TIC807蛋白或含有TIC80775蛋白相關(guān)表位的肽。通常，這些方法將包括首先，獲得可能含有此類蛋白、肽或抗體的樣品，將樣品與根據(jù)本發(fā)明的抗體或肽相接觸(根據(jù)可能的情況，在能有效令免疫復合體形成的條件下)，以及然后檢測免疫復合體的存在。通常，對免疫復合體形成的檢驗是本領(lǐng)域中相當公知的，這可通過應(yīng)用多種手段來實現(xiàn)。例如，本發(fā)明包括應(yīng)用ELISA、RIA、免疫印跡(點印跡)、間接免疫熒光技術(shù)等。通常，將通過使用標記，例如放射性標記或酶標簽(例如，堿性磷酸酶、馬辣根過氧化物酶等)來檢測免疫復合體的形成。當然，技術(shù)人員可發(fā)現(xiàn)使用二級結(jié)合配體(例如二抗)或生物素/親和素配體結(jié)合安排的優(yōu)點，這是本領(lǐng)域已知的。對于檢驗?zāi)康亩?，我們提出，可利用可能包含想要檢測的TIC807蛋白或肽或TIC807蛋白相關(guān)肽或抗體的基本上任何樣品。本發(fā)明中，此類實施方式可應(yīng)用對抗原或抗體樣品的滴定中、對雜交瘤的選擇中，等等。在一些相關(guān)實施方式中，本發(fā)明包括對可用于檢測TIC807蛋白或相關(guān)肽和/或抗體是否存在樣品中的試劑盒的制備。樣品可包括可能含有TIC807蛋白或肽的細胞、細胞上清液、細胞懸浮液、細胞提取物、酶級分、蛋白提取物或其它不含細胞的組合物。一般而言，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒將包括合適的TIC807蛋白、肽或針對此類蛋白或肽的抗體，以及，用于檢測抗體/抗原復合體的免疫檢測試劑、使用這些材料的指導和容納抗體或抗原和試劑的設(shè)備。典型地，免疫檢測試劑將包含與抗體或抗原相連的標記或與二級結(jié)合配體相連的標記。示例性的配體可包括具有相連標記的二抗(針對一抗)或抗原或生物素或親和素(或鏈親和素)。當然，如上文所述，本領(lǐng)域已知大量的示例性標記，所有這些標記都可用于本發(fā)明。容器將通常包括瓶(vial),其中可放置抗體、抗原或檢驗試劑，并且其優(yōu)選是被合適地小份試樣化的。本發(fā)明的實際盒還將典型地包括裝納抗體、抗原和試劑容器的設(shè)備，其處于密封，以用于商業(yè)銷售。此類容器可包括注塑或吹塑成型容器，其中裝有想要的瓶。由前文可看出，已實現(xiàn)并獲得了本發(fā)明的若干優(yōu)點。本丈中對實施方式的選擇和描述僅僅是為了最好地解釋本發(fā)明的宗旨及其時間應(yīng)用，由此使得本領(lǐng)域其他技術(shù)人員能夠在多種實施方式中最好地利用本發(fā)明，對特定用途而言可進行多種改良。實施例下文公開的實施方式僅僅是本發(fā)明代表性的，其可以多種形式實現(xiàn)。因此，本文公開的特定結(jié)構(gòu)和功能細節(jié)不應(yīng)被解釋為限制。實施例1:鑒定"s"."m/力z;r/，'e腦V菌林EG2934本實施例描述了Aac277"ir^z/r2'/^7e"5^菌才朱EG2934和源于該菌抹的晶體蛋白。""http:///mMwW/^/e/^/s菌林公知具有生產(chǎn)伴胞晶體的能力，伴胞晶體中含有針對鱗翅目、鞘翅目和雙翅目昆蟲物種的多樣殺昆蟲活性的蛋白。當通過相差顯微觀察時，這些伴胞晶體展示出多種幾何形狀，它們被描述為不規(guī)則、立方形、棒狀、偏菱形、雙錐形等。展示出鱗翅目毒性活性的AM"W/^/e/7i"/》菌林看起來比展示出針對其它昆蟲物種的A^訂//^/6/^/5菌抹更常見。展示出雙錐形的伴胞晶體通常與鱗翅目毒性的A/^wr/z^/e/^/,分離林相關(guān)。當篩選未經(jīng)分析的及MwW力口'ei^/s菌林時，這種與鱗翅目活性的雙錐形晶體結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系具有好處，其允許快速選擇出可能展現(xiàn)針對并非鱗翅目物種的昆蟲的殺昆蟲活性的菌抹。基于此點，選擇菌林EG2934，因為當通過相差顯微鏡觀察時，其含有缺乏雙錐形結(jié)構(gòu)的良好建構(gòu)的晶體。為確定該菌林生產(chǎn)的何種晶體蛋白具有殺昆蟲活性，克隆了編碼這些蛋白的基因，并在經(jīng)良好分析的無毒且無晶體突變型的及f力i;W/7g/ei^/s宿主菌林中將其表達。在及^ur//7g/e/7(sr/<y菌抹EG2934產(chǎn)生的晶體制備物中，鑒定出了大小范圍為大約35千道爾頓(kDa)至大約120kDa的四種晶體蛋白。作為常規(guī)篩選，用這些蛋白進行針對已知植物有害昆蟲的毒性測試。發(fā)現(xiàn)，命名為TIC807的來自及^r//^ye/^"菌林EG2934的一種蛋白對刺吸式昆蟲丄/^/s77/e,尸erz/s和Zt^ws//刀eo7a了/s有毒'1"生。實施例2:表征A^^r/z^7e/7Ws菌抹EG2934產(chǎn)生的晶體蛋白本實施例闡述了對從及MuW/^/ms/s菌林EG2934分離的晶體蛋白的表征以及隨后對A)^^活性毒素蛋白TIC807的初始表征。在C2芽胞形成培養(yǎng)基(Donovanetal.，Mol.Gen.Gent.214:365-372，1988)中，25至28攝氏度下，對及MwW"^7e7^/s菌4朱EG2934培養(yǎng)3至4天，或者直到芽胞完全形成，并裂解。通過離心來收集芽胞和晶體，將其重新懸浮于洗滌緩沖液(lOmMTris-HCl,0.1mMrEDTA，0.005%TritonX-100,pH6.8)中，并通過離心再次收集。將芽胞-晶體沉淀團重新懸浮于最初培養(yǎng)體積1/10的洗涂緩沖液中。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來分析1OX濃縮物中的晶體蛋白。使用牛血清清蛋白(BSA)作為標準，通過密度測量，來測定蛋白濃度。芽胞形成后，及^wr/z^2'ei7W、菌林EG2934產(chǎn)生大約120、110、65和35千道爾頓(kDA)的晶體蛋白。通過SDS-PAGE分辨來自EG2934的蛋白。電泳之后，按照標準western雜交印跡流程，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(BioRad,Hercules，CA)上。轉(zhuǎn)移后，使用標準的自動Edman降解流程，對與每張膜結(jié)合的蛋白進行N-末端測序。TIC807的N-末端氨基酸序列示為SEQIDN0:1。在可獲得的公眾數(shù)據(jù)庫中查詢，沒有鑒定出與該序列的明顯匹配，這表示TIC807蛋白可能是新穎的?；诎被嵝蛄蠸EQIDN0:1設(shè)計了兩條簡并寡核苷酸引物，它們被稱為djc-prl2(SEQIDNO:2)和djc-prl13(SEQIDNO:3),以用作為分離編碼TIC807蛋白和TIC807同源體的B.thuringiensis基因的雜交探針。實施例3:分離和分析從AM"W/^/e/zs/s菌才朱EG2934分離的TIC807本實施例闡釋了對含有編碼TIC807蛋白的DNA的噬菌體克隆的篩選。還描述了對編碼TIC807蛋白的DNA的克隆和測序。下文所述的方法還可用于回收源于其它AMwW/^/e/^"菌才朱的質(zhì)粒、粘粒或噬菌體文庫中編碼TIC807同源體的DNA序列和相關(guān)基因。用實施例2描述寡核苷酸引物djc-prl2和djc-prl3(分別是SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)作為雜交探針，以探測使用經(jīng)尺寸選擇的DM(分離自AW"W/^/e/^/s菌林EG2934)構(gòu)建的文庫。在SEQIDNO:2(AAYGCDATHAAYTAYTGGGGDCCDAARAAY)和SEQIDNO:3(TGGGGDCCDAARAAYAAYAAYGARATWCAR)的簡并寡核普酸中，Y殘基代表C或T殘基的混合物，D殘基代表A、G或T殘基的混合物，H殘基代表A、C或T殘基的混合物，R殘基代表A或G殘基的混合物，W殘基代表A或T殘基的混合物。使用其中利用了CTAB提取步驟的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology(1997)JohnWileyandSons,Inc.),制備及^w"'i^/e/^/s菌才朱EG2934的總DNA。用限制性酶&w3AI(典型用于制備基因組文庫的4堿基切割酶)沒能切動該DNA。令人吃驚地，對DNA甲基化敏感的Aw3AI同裂酶對基因組DNA進行高效消化。在1%瓊脂糖IXTBE凝膠上對經(jīng)消化的DNA進行大小分級分離。使用標準方案從凝膠切片提取7-12kb的片段，將其連接進經(jīng)BamHI消化的X-ZapExpress載體，并使用GigaPackIIIGold試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)包裝進喧菌體顆粒。噬菌體擴增后，進行平板轉(zhuǎn)染，用DuralonUV尼龍膜(Stratagene，LaJolla，CA)進行噬菌斑轉(zhuǎn)印。在標準預(yù)雜交/雜交緩沖液(含有5XSSC、0.1%N-月桂酰肌氨酸、0.02%SDS、1%封閉試劑(Roche,Indianapolis,IN，Cat.No.1585762)、0.1mg/mLpoly—A和4ug/mLpoly-dA)中，于50攝氏度下，對膜孵育數(shù)小時。使用末端轉(zhuǎn)移酶DIG-11-dUTP(DIG寡核苷酸加尾試劑盒；Roche，Indianapolis,IN,Cat.No.1417231)和廠商推薦的方案，用地高辛(DIG)在3，末端對寡核苷酸進行標記。加入經(jīng)DIG標記的寡核苷酸djc-prl2和djc-prl3的1:1混合物，在50攝氏度對膜孵育過夜。在室溫下，于3XSSC、0.1%SDS下對膜進行兩次洗滌，每次15分鐘，然后在50攝氏度下，在1XSSC、0.1%SDS中沖洗兩次，每次"分鐘。使用Roche(Indianapolis,IN)洗滌和封閉緩沖液組合和方案(Roche，Indianapolis,IN，Cat.No.11585762001)、抗DIG-堿性磷酸酶Fab片段(Roche,Indianapolis,IN,Cat.No.11093274910)和底物CSPD(3-(4-甲氧基螺甾{1,2-二氧環(huán)丁烷-3，2-(5-氯)三環(huán)[3.3.1.13，7]癸}-4-基)苯基磷酸二鈉)(Roche，Indianapolis,IN),通過化學發(fā)光，觀察雜交的噬菌斑。從初級板中撿出n個重組克隆，稀釋、涂板并用經(jīng)DIG標記的寡核苷酸進行再次探測。獲得純的克隆僅需要兩輪涂板/探測。所有12個噬菌體克隆都經(jīng)歷了切割反應(yīng)，產(chǎn)生了12個噬粒克隆。用6WI和對它們加以消化，釋放出克隆的插入。在1°/。瓊脂糖IXTBE凝膠上分辨消化物，將其印到Nytran⑧膜上，用于Southern分析。插入的大小要比預(yù)想的小得多，大小在2-5kb之間的范圍內(nèi)。但是，Southern分析證實12個克隆中有9個存在雜交DNA。使用簡并寡核苷酸djc-prl2和djc-prl3和針對插入側(cè)翼的載體序列特異的引物的組合，進行熱擴增反應(yīng)，以在噬粒克隆上對TIC807編碼區(qū)域的位置加以圖鐠定位?；谶@些結(jié)果，確定，整條基因存在于命名為pIC17039至pICl7042的四個不同的噬?？寺∩?。表2中顯示了對應(yīng)于這些噬粒克隆中每種的插入大小和菌林鑒定。表2:含有TIC807噬粒的i^c力er/c力/aco//菌抹和相關(guān)插入大小菌林喧粒估計的插入大小(千堿基)SIC8087pIC170392.3SIC8088pIC170403.5SIC8089pIC170415.5SIC8090pIC170421.5對質(zhì)粒pIC17042上的TIC807基因插入進行測序。推測的編碼區(qū)域(示為SEQIDNO:4)編碼309個氨基酸的蛋白，該蛋白示為SEQIDNO:5。對非重復蛋白數(shù)據(jù)庫進行BlastP(版本2.2.9)檢索，揭示TIC807蛋白序列與及/^訂//7#/6/^2、晶體蛋白Cryl5Aal(SEQIDNO:41)最匹配。對兩條蛋白的Needleman—Wunsch總體比對顯示，TIC807蛋白序列和Cryl5Aal蛋白序列之間有25.5%的序列同一性。圖1展示了對TIC807(SEQIDNO:5)和Cryl5Aa(SEQIDNO:41)的比對。雖然TIC807和Cryl5Aal蛋白并不高度保守，但蛋白的局部區(qū)域在長度多至7個殘基的連續(xù)氨基酸序列的短基序上顯示出完全序列保守性。帶有載體pIC17040的^c力eric力/aco7/菌林SIC8088于2007年3月16日被保藏于Peoria,Illinois的AgriculturalResearchCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL)，保藏號為No.NRRLB-50030。實施例4:在無毒素的及Mw/i7g/e7w/s宿主菌才朱中表達TIC807本實施例闡釋了將TIC807編碼區(qū)域克隆進質(zhì)粒以在無毒素的A^wW/^/e"Ws宿主菌林中表達的過程。本實施例還闡釋了下述工藝，通過該工藝，可以純粹針對有害昆蟲的生物檢驗的純度，來生產(chǎn)蛋白毒素，例如TIC807。用限制性核酸內(nèi)切酶和J肌I消化TIC807質(zhì)粒pIC17040和pIC17041(表1)，在1XTBE中的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳。瓊脂糖凝膠電泳之后，按照廠商方案，使用Qiagen(Valencia,CA)DNA純化試劑盒對得到的單DNA片段加以純化。類似地，用限制性核酸內(nèi)切酶和J鵬I消化五.AMw//^/e/^2、穿梭載體pEG854(Baumetal.1990),瓊脂糖凝膠電泳之后，純化大約4.3千堿基的DNA片段，其中含有Bt質(zhì)粒復制起點ori43和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)基因。將TIC807基因片段與ori43-cat基因片段連接起來，產(chǎn)生了能在AMi/i7/^/ei^/s中復制的質(zhì)粒。通過電穿孔，用連接產(chǎn)凈勿將無曰曰曰體缺卩各型(acrystalliferous)(Cry—)6勺及tAi/r/ag/e/^/s宿主菌林EG10650轉(zhuǎn)化為氯霉素抗性，產(chǎn)生了重組A"wr/i^/e7^"分離林SIC8091、SIC8092、SIC8093和SIC8094,如表3所示。表3:含有用于TIC807表達的質(zhì)粒的及"wri/^/e/^"菌林<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>在C2培養(yǎng)基中，25至28攝氏度下，對重組菌抹培養(yǎng)3至4天，或者直到芽胞完全形成，并裂解。通過離心(例如4000xg下30分鐘)來收集芽胞和晶體，將其重新懸浮于洗滌緩沖液(lOmMTris-HC1，0.1mMEDTA,0.005%TritonX-100,pH6.8)中，并通過離心再次收集。將芽胞-晶體沉淀團重新懸浮于最初培養(yǎng)體積1/10的洗滌緩沖液中。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來分析10XC2濃縮物中存在的晶體蛋白。所有四種重組菌林都產(chǎn)生了具有大約35kDa的預(yù)期表觀分子量的晶體蛋白。使用牛血清清蛋白(BSA)作為標準，通過密度測量，來測定蛋白濃度。實施食寸5:TIC807對Zj^y/s力es/7e/7Ay和Z/^ws7//7eo/ar/s有毒性本實施例闡釋了進食檢驗，以確定TIC807蛋白分子對西部牧草盲蝽(WTPB)Lygushesperus和牧草盲蝽(TPB)Lygusli腳laris有毒性。WTPB和TPB是食葉類刺吸式昆蟲，它們攻擊多種雜草和作物。WTPB和TPB通過直接進食損害來損害農(nóng)業(yè)作物(包括棉花)。因為WTPB和TPB通過刺吸進食，用于測試針對該類昆蟲的蛋白毒素的檢驗應(yīng)當允許昆蟲的天然進食行為。所使用的進食檢驗基于96孔板形式和袋系統(tǒng)，如Habibietal.(ArchivesofInsectBiochem.andPhys.50:62-74(2002))所述。人工膳食由Bio-Serv(Bio-ServDietF9644B,Frer^town,NJ)提供，其組分展示于表4中。表4:Bio—ServF9644BWTPB人工膳食<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>將518毫升經(jīng)高壓滅菌的沸水與156.3克Bio-ServDietF9644B在經(jīng)表面滅菌的摻合儀中合并。打開四個經(jīng)表面滅菌的雞蛋，將內(nèi)容物加入到含有膳食混合物的摻合儀中。對混合物加以摻合，直到光滑，對其調(diào)節(jié)至l升的體積，令其冷卻。通過將TIC807毒素蛋白制備物以想要的濃度與相當體積的摻合膳食混合物，來制備毒素樣品。大約-20亳米汞柱的真空(足以將Parafilr^推向孔)下，將一片Parafilm(PechineyPlasticPacking,Chicago,IL)》文至)J96孑L真空岐管(AnalyticalResearchSystems,Gainesville,)上。向Parafiln^孔中加入40微升測試樣品。然后將一片Mylar膜(ClearLamPackaging,Inc.,ElkGroveVillage,IL)放到Parafilm⑧上，用電燹器(BienfangSealectorII,HuntCorporation，PhiladelphiaPA)輕柔密封。然后將Paranim⑧袋放到平底96孔板上，該板含有懸浮于瓊脂糖中的At^a卵。孵化后，A^^蛹將通過刺穿它們上方存在的袋來進食。不被理論束縛的情況下，我們相信，袋中的口外消化可導致蛋白水解和降解(昆蟲攝入之前)。為確保蛋白在昆蟲膳食中完整呈現(xiàn)，每兩天換一次膳食袋。這種增強理論上允許進食檢驗期間完整毒素蛋白更長時間地存在于昆蟲膳食中。此外，鑒于為補償可能的口外消化效果不需要更大量的蛋白，可對較低濃度的可能毒素蛋白進行測試。第2天和第4天更換昆蟲膳食袋。第5天測定發(fā)育遲緩和死亡率計分，并將其與未經(jīng)處理的檢查(UTC)相比較。表5到表8闡釋了TIC807對西部牧草盲蝽(WTPB)Aj^m力e^er^和牧草盲蝽(TPB)Z/^as7/"eo7ar/s的毒性。膳食并非對于TPB最優(yōu)，相對于針對WTPB的UTC而言，UTC(未經(jīng)處理的檢查)中膳食降低了蛹的生長速率。但是，針對TPB展示了顯著的死亡率和發(fā)育遲緩。表5:針對西部牧草盲蝽(WTPB)Zj^m力e^er^的TIC807發(fā)育遲緩計分處理濃度(mg/ml)N平均發(fā)育遲緩標準偏差P>|t|UTC0.00120.000.00TIC8071.0051.600.55<0.0001表6:針對西部牧草盲蝽(WTPB)Ap^m力e^er^的TIC807百分比死亡率計分<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表7:針對牧草盲蝽(TPB)Af^/s///eo/ar"的TICS(H發(fā)育遲緩計分_<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>實施例6:合成編碼設(shè)計來在植物中表達的TCI807蛋白的基因設(shè)計并合成編碼TIC807蛋白的基因。設(shè)計來在植物中表達的該非天然編碼區(qū)域在本文中作為SEQIDNO:6提供。編碼序列的特征在于A+T的含量要HS源于^^r/agie/^is的天然TIC807編石馬區(qū)域更低，去除了天然TIC807基因的富含A+T的區(qū)域，用具有更少A+T殘基的序列來代替它們。實施例7:用于在轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物中表達TIC807蛋白的表達盒用非天然TIC807編碼區(qū)域(SEQIDNO:6)構(gòu)建了多種植物表達盒。此類表達盒可用于在植物原生質(zhì)體或植物細胞中的瞬時轉(zhuǎn)化。第一TIC807植物表達盒包含增強的CaMV35S啟動子，其與包含非天然TIC807編碼序列的編碼區(qū)域可操作相連，所述編碼序列具有與myc-蛋白表位標簽(SEQIDNO:19)的以符合讀碼框的方式的C-末端融合。該編碼區(qū)域與3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺香化位點可操作相連。該非靶向并且標簽化的5，-e35S-TIC807-myc-NOS-3，表達盒的序列作為(SEQIDNO:20)提供，其被克隆于pMON59221中。完整的5，-e35S-TIC807-myc-N0S-3，表達盒被含在pM0N59221穿梭載體的#0^/限制性片段上。第二TIC807植物表達盒包含增強的CaMV35S啟動子，其與包含N-末端^raW化/^2:Mi^葉綠體肽編碼序列(即CTP2)的編碼區(qū)域可操作相連，所述葉綠體肽編碼序列與非天然TIC807編碼序列以符合讀碼框的方式融合，所述非天然TIC807編碼序列具有與myc-蛋白表位標簽(SEQIDNO:21)的以符合讀碼框的方式的C-末端融合。該編碼區(qū)域與3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位點可操作相連。該被靶向并且標簽化的e35S-CTP2-TIC807-myc-NOS表達盒的序列作為(SEQIDNO:22)提供，其被克隆于pMON59223中。完整的5，-e35S-CTP2-TIC807-myc-NOS-3，表達盒被含在pMON59223穿梭載體的#0〃限制性片段上。第三TIC807植物表達盒包含增強的CaMV35S啟動子，其與包含非天然TIC807編碼序列(SBQIDNO:6)的編碼區(qū)域可操作相連。該編碼區(qū)域與3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位點可操作相連。該非革巴向的TIC807表達盒的序列作為(SEQIDNO:40)提供，其被克隆于pMON59224中。完整的5，-e35S-TIC807-N0S-3，表達盒被含在pMON59224穿梭栽體的vYW/限制性片段上。第四TIC807植物表達盒包含增強的CaMV35S啟動子，其與包含N-末端^ra6/^;^h葉綠體肽編碼序列(即CTP2)的編碼區(qū)域可操作相連，所述葉綠體肽編碼序列與非天然TIC807編碼序列(SEQIDNO:7)以符合讀碼框的方式融合。該構(gòu)建體編碼的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作為SEQIDNO:8提供。該編碼區(qū)域與3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位點可操作相連。該被靶向的5'-e35S-CTP2-TIC807-NOS-3，表達盒的序列作為(SEQIDNO:23)提供，其被克隆于pM0N59222中。完整的5，-e35S_CTP2-TIC807-NOS-3，表達盒被含在pMON59222穿梭載體的#0纟/限制性片段上。第五耙向質(zhì)體的表達盒包含增強的CaMVMS啟動子，其與源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻譯引導序列可操作地相連，所述引導序列與包含N-末端ArabidopsisshkG葉綠體肽編碼序列(即CTP2)的編碼區(qū)域可操作相連，所述葉綠體肽編碼序列與非天然TIC807編碼序列(SEQIDNO:6)以符合讀碼框的方式融合。該構(gòu)建體編碼的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作為SEQIDNO:8提供。該編碼區(qū)域與3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位點可操作相連。該被靼向的5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-N0S-3，表達盒的序列作為(SEQIDNO:42)提供。第六表達盒包含增強的CaMV35S啟動子，其與源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻譯引導序列可操作地相連，所述引導序列與包含非天然TIC807編碼序列(SEQIDNO:6)的編碼區(qū)域可操作地相連。該構(gòu)建體編碼的TIC807蛋白的肽序列作為SEQIDNO:5提供。該編碼區(qū)域與3，末端胭脂氨酸合酶(NOS)聚腺苷化位點可操作相連。該5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-NOS-3，表達盒的序列作為SEQIDNO:43提供。實施例8:構(gòu)建含有TIC807表達盒的^^ro&c"ri咖介導的轉(zhuǎn)化載體并轉(zhuǎn)入"r。6a"e,2'咖為構(gòu)建v^ro&WeW咖介導的轉(zhuǎn)化載體，將TIC807表達盒在J^ro6sc"W咖邊界序列之間克隆進合適的栽體，使得它們將通過含有構(gòu)建的載體的J^ro6acfer/咖宿主與可選擇標志物基因一起轉(zhuǎn)入宿主植物細胞的基因組中。更特別地，將含有完整5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-N0S-3，表達盒(SEQIDNO:42)的限制性片段克隆進^^ro6a〃eW咖植物轉(zhuǎn)化載體。類似地，含有完整5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-NOS-3，表達盒(SEQIDNO:43)的限制性片段凈皮克隆進^^Y&crer/M7植物轉(zhuǎn)化載體。通過電穿孔或通過三親雜交，將含有TIC807表達盒(即，SEQIDNO:43的非靶向盒和SEQIDNO:42的靶向盒)的載體引入^"&c"了y咖。實施例9:用TIC807J^ro6ac&W咖轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化棉花可使用與美國專利No.5,159,135所述基本相似的流程，用物來轉(zhuǎn)化棉花。'、*5為啟動用于棉花植物的轉(zhuǎn)化和再生過程，首先必須要對棉花種子進行表面滅菌，以防止對得到的培養(yǎng)物的疏忽性污染。然后令種子在合適的發(fā)芽培養(yǎng)基(含有殺真菌劑)上發(fā)芽。發(fā)芽后4-6天，未成熟植物的下胚軸部分被移出，將其切成各平均大約O.5厘米的小塊。令下胚軸外植體穩(wěn)定，在液體或瓊脂植物組織培養(yǎng)基上令其保持存活。下胚軸塊一旦被穩(wěn)定，可迅速用轉(zhuǎn)化感受態(tài)非致癌性yigro6aCe,iw/z/的懸、浮培養(yǎng)凈勿來接種它4門?？?吏用^g",o6aCer2'w范菌林，例如LBA4404。令接種過程在室溫下，即，24攝氏度下，進行3至5天。在接種時期的末端，首先需要漂洗掉過多的」^ro6ac"i"2'咖。然后可將剩下的經(jīng)處理的組織轉(zhuǎn)到第二瓊脂培養(yǎng)基上，其中含有對Agrobacterium有毒但對下胚軸組織無毒的一種或多種抗生素，其濃度足以殺死培養(yǎng)物中殘留的任何Agrobacterium。用于此類培養(yǎng)基的合適的抗生素包括羧千青霉素和頭孢噻肟。然后組織放置1至IO天的時間段，以從轉(zhuǎn)化過程回收，然后再繼續(xù)培養(yǎng)。現(xiàn)在在組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)組織，所述培養(yǎng)基除了含有其正常組分之外，還含有選擇試劑，選擇試劑對未經(jīng)轉(zhuǎn)化的棉花細胞有毒性但是對已經(jīng)具有了對選擇試劑的抗性并且表達該抗性的經(jīng)轉(zhuǎn)化棉花細胞無毒。合適的組織培養(yǎng)基是其中加入了植物激素2,4二氯苯氧基乙酸(2-4，D)、6-糠氨基嘌呤和膠凝劑的MS培養(yǎng)基。合適的選擇試劑包括抗生素和除草劑。可用作為顯性可選擇標志物的合適的抗生素性狀包括氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶-3，-II(APH-(30-II)基因(其也被稱為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(NPTII)，其編碼針對抗生素卡納霉素的抗性)和APH-(30-IV基因(其編碼針對潮霉素B的抗性)?？{霉素、G418和潮霉素B是氨基糖苷，它們將停止未經(jīng)轉(zhuǎn)化的棉花細胞的生長，但是如果表達于經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞中的話，這些抗生素會被合適的酶磷酸化。另一合適的選擇試劑是除草劑草甘膦，其可用于選擇含有草甘膦抗性的EPSPS基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化的棉花細胞。當使用pM0N105863和pMON105864時，針對對卡納霉素或另一抗生素的抗性來選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞，所述另一抗生素與卡納霉素密切相關(guān)，并且能被這些載體編碼的新霉素鱗酸轉(zhuǎn)移酶II基因(NPTII)失活。加入抗生素或除草劑的培養(yǎng)基僅允許經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞繼續(xù)茁壯生長。因此，令經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞或愈傷組織在選^f性培養(yǎng)基上生長。將存活的經(jīng)轉(zhuǎn)化的組織轉(zhuǎn)到笫二培養(yǎng)基中，以誘導體胚形成。存活的經(jīng)轉(zhuǎn)化組織將因此繼續(xù)形成為體胚，然后其可通過本發(fā)明的再生技術(shù)或通過使用棉花體胚作為其起點的任何其它備選性的植物再生方案再生。選擇過程將持續(xù)一段較長的時間，即，3-4個月，因為即使經(jīng)轉(zhuǎn)化的組織在抗生素培養(yǎng)基上生長也很緩慢。每4-6周進行一次移種，以更新營養(yǎng)物和抗生素。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞被選擇和擴增后，獲得的各細胞系可被鑒定，并可移出并單獨擴增。根據(jù)本發(fā)明的再生技術(shù)從由轉(zhuǎn)化過程得到的組織開始。這些組織是可能經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織，在合適的胚誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，它們能產(chǎn)生體胚。本文公開了用于將這些體胚再生為整抹植物的一種技術(shù)，但應(yīng)當理解，一旦產(chǎn)生了經(jīng)轉(zhuǎn)化的胚形成組織，還可使用其它技術(shù)。申請人在此使用的再生技術(shù)因此是從由轉(zhuǎn)化過程得到的組織開始的。將從棉花植物的下胚軸塊產(chǎn)生并且可能經(jīng)過轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織直接放到體胚誘導培養(yǎng)基上。在該時間點，應(yīng)當從培養(yǎng)基中移除抗生素選擇試劑，不過培養(yǎng)基也可保持不變。在體胚誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)的這些愈傷組織將形成小的胚性結(jié)構(gòu)，它們被命名為體胚。體胚出現(xiàn)和成熟可能需要長達2至3個月的時間。在體胚誘導培養(yǎng)基的瓊脂配方中，從單個愈傷組織可能出現(xiàn)大約5個至多達20個體胚。將可根據(jù)本文所述的技術(shù)，將由此產(chǎn)生的很多體胚再生為整林植物。當發(fā)育中的體胚足夠大(即，長度達到4mm或更大的大小)，并且看起來具有良好的胚發(fā)育(即，通常具有子葉和胚根)的情況下，可將它們轉(zhuǎn)到大的試管中，并放到精細蛭石上。用Stewart和Hsu(SH)培養(yǎng)基(Planta137:113(1977))加植物激素吲哚乙酸、6-糠氨基噤呤和赤霉酸浸透蛭石。最終發(fā)育出具有2至3片葉的小的幼植物。一旦建立了幼植物生長，即，2-3片葉的階段，現(xiàn)已可將植物移入具有蛭石土壤的植物罐?？砂凑招枰獙λ鼈儩菜褪┓省Ｔ诒┞督o溫室前，它們還可能需要冷強化處理(hardenoff)。當幼植物具有4-6片葉時，可對幼植物移罐，之后它們將繼續(xù)長到成熟。針對TIC807的表達，對來自幼植物的樣品進行檢驗，以鑒定具有昆蟲抑制活性的轉(zhuǎn)基因植物。實施例11:在愈傷組織中對TIC807進行植物內(nèi)測試本實施例闡釋了TIC807植物內(nèi)表達的非限制性例子，這用于針對Lygus和刺和/或吸來自植物細胞和組織的流體的其它有害昆蟲的生物檢驗。用含有編碼TIC807蛋白的感興趣的基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化棉花細胞。在這種情況下，使用前述實施例中描述的TIC807轉(zhuǎn)化載體中的TIC807表達盒，在棉花細胞中表達編碼TIC8(H蛋白的、非天然A+T富集的核酸序列。這些表達盒提供了TIC807向葉綠體的靶向(即，用5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-N0S-3，或5，-e35S-CTP2-TIC807N0S-3，表達盒)或TIC807的非靶向的(胞質(zhì))表達(即，用5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-NOS-3，或5，-e35S-TIC807-N0S-3，表達盒)。轉(zhuǎn)化載體提供了可選擇標志物，在這種情況下，用于選擇轉(zhuǎn)基因植物組織中的卡納霉素抗性?？墒褂胮MON10SS"載體或含有TICS0植物表達盒和可選擇標志物的其它等同TIC807植物表達載體。在Petri皿中，轉(zhuǎn)化和選擇后，令愈傷組織在組織培養(yǎng)基中發(fā)育。然后將蛹放進含有經(jīng)TIC807植物表達盒轉(zhuǎn)化的愈傷組織的Petri皿或微滴定板的孔。還將A^M蛹放進含有未經(jīng)TIC807植物表達盒轉(zhuǎn)化的對照愈傷組織的Petri皿或微滴定板的孔。Petri亞和微滴定板的封閉蓋防止了Z/^^蛹的逃逸。將防止Z/^/s逃逸但允許Petri皿中氣體交換的任何材料，例如Parafilm⑧，可用于封閉Petri皿蓋或微滴定板。一定百分比的Z/^/5"蛹將發(fā)現(xiàn)愈傷組織并進食。然后在考慮到背景死亡(沒有在愈傷組織上進食的那些昆蟲發(fā)生的)的情況下，計算死亡率和發(fā)育遲緩的計分。將呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的組織的Z/^/s蛹的經(jīng)修正計分與呈現(xiàn)給對照組織的A^7^蛹的經(jīng)^，正計分相比較。呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的組織的Ar^^蛹的死亡率和/或發(fā)育遲緩計分較之呈現(xiàn)給對照組織的A^"s蛹的計分顯著增加。實施例12:在葉組織中對TIC807進行植物內(nèi)測試使用前述實施例中描述的TIC807轉(zhuǎn)化載體中的TIC807表達盒，轉(zhuǎn)化紫花苜蓿、棉花、油菜、大豆或萵苣細胞。這些表達盒提供了TIC807向葉綠體的靶向(即，用5，-e35S-CTP2-TIC807-myc-N0S-3，或5，-e35S-CTP2-TIC807—N0S-3，表達盒)或TIC807的非靶向的(胞質(zhì))表達(即，用5，-e35S-TIC807-myc-N0S-3，或5，-e35S-TIC8Q7-NOS-3，表達盒)。轉(zhuǎn)化載體提供了可選擇標志物，在這種情況下，用于選擇轉(zhuǎn)基因植物組織中的卡納霉素抗性。針對對卡納霉素的抗性對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞加以選擇，并將其再生為轉(zhuǎn)基因植物。然后，當植物達到足夠的成熟水平，例如，當葉長到允許用物理障礙防止AF^/s逃逸的大小時，令有害昆蟲(例如Z7^^蛹)進食。防止丄7g"s蛹逃逸的障礙可以是任何商業(yè)可獲得的或自制的、允許Af^a蛹與葉組織接觸并允許昆蟲探測葉的維管組織并進食的設(shè)備。與M匿y(1993)(J.Agric.Entomol.10:181-184)所述類似的孩i蟲籠(clipcages)將足以裝納丄/^^蛹以進食。然后將Zj^^蛹呈現(xiàn)給來自表達TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的葉組織或不表達TIC807蛋白的對照葉組織。理想地，對照葉組織是平行選擇并再生的轉(zhuǎn)基因植物，但其中不含編碼TIC的轉(zhuǎn)基因。但是，來自相似來源和年齡的其它植物的葉組織也可使用，只要組織不含顯著量的TIC807蛋白即可。然后在考慮到背景死亡(沒有在葉組織上進食的那些昆蟲發(fā)生的)的情況下，測定死亡率和發(fā)育遲緩的計分。將呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的葉組織的Z/《z^蛹的經(jīng)修正計分與呈現(xiàn)給對照葉組織的A^^蛹的經(jīng)修正計分相比較。呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的葉組織的A^^蛹的死亡率和/或發(fā)育遲緩計分較之呈現(xiàn)給對照葉組織的Ar^/s蛹的計分顯著增加。實施例13:使用tic807組合其它昆蟲控制試劑進行昆蟲控制已經(jīng)獲得了表達胞質(zhì)TIC807蛋白或靶向TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因棉花植物，還可能想要獲得與TIC807組合表達其它昆蟲抑制性蛋白的棉花植物。本實施例闡釋了若干種方法，通過它們可實現(xiàn)對特定有害昆蟲的增加的抗性或者更廣的對若干類的有害昆蟲的抗性，以為作物植物提供更好的昆蟲保護。下文描述的所有策略也可用于增強昆蟲抗性管理程序。I)在植物中組合TIC807與昆蟲抑制性dsRNAi分子可將雙鏈RNA介導的對靶標有害昆蟲中生物功能的基因阻遏與編碼TIC807蛋白的基因組合?？杀籨sRNAi靶向的執(zhí)行關(guān)鍵生物功能的昆蟲基因如美國專利申請公開文本No.US2006/0021087所述。可令此類dsRMi分子抑制丄/^/s(與TIC807所抑制的相同的靶標昆蟲)。通過同時用dsRNAi和TIC807抑制Zj^m，經(jīng)由兩種不同的作用模式達成抑制。通過不同的作用模式實現(xiàn)的抑制預(yù)計導致改進的昆蟲抗性管理。為控制A^ws,dsRNAi分子源于SEQIDNO:4至seqidno:39(對應(yīng)于Af^/s中表達的基因)中的任何一條。在對昆蟲的控制中使用SEQIDNO:24至SEQIDNO:39在美國專利申請公開文本No.US2006/0021087有所/>開。在經(jīng)J^ro^c^eW咖介導的轉(zhuǎn)化載體(設(shè)計來表達dsRNAi分子的)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉花植物中，表達針對SEQIDNO:24至SEQIDNO:39中任何一條的dsRNAi分子。通過回收下述轉(zhuǎn)基因植物，來達成dsRNAi分子的表達，所述轉(zhuǎn)基因植物包含在這些植物中有活性的啟動子，其與長度為至少19-24個核苷酸的A^m序列(即SEQIDNO:24至SEQIDNO:39)片段和這些序列的反向互補序列可操作地相連。還可令這些dsRNAi分子針對其它刺吸式昆蟲，例如，蜂蟲、跳蟲或粉虱。為控制蚜蟲，在經(jīng)J^ro&c&Ww邁介導的轉(zhuǎn)化載體(設(shè)計來表達dsRMi分子的)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉花植物中，表達源于或同源于來自美國專利申請7^開文本No.2006/0021087中的7bzc7^ersc/"yc/da或爿c7r^ow';力o/7/j^w/b的序歹廿的dsRNAi分子。為4空制逸^轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉花植物中，表達源于或同源于來自專利申請公開文本No.U.S.2006/0021087中的^鵬7ocT/"acoagu7We的序列的dsRNAi分子。為控制粉虱，可在經(jīng)J^ro6ac"r/m介導的轉(zhuǎn)化載體(設(shè)計來表達dsRNAi分子的)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉花植物中，表達合適的dsRNAi分子。通過回收下述轉(zhuǎn)基因植物，來達成dsRNAi分子的表達，所述轉(zhuǎn)基因植物包含在這些植物中有活性的啟動子，其與長度為至少19-24個核苷酸的各蟲牙蟲、跳蟲或粉虱的序列片段和這些序列的反向互補序列可操作地相連。此類dsRNAi分子還可針對鞘翅目害蟲。在這種情況下，將dsRMi分子與TIC807組合表達在轉(zhuǎn)基因植物中提供了對鞘翅目害蟲和雙翅目害蟲兩者的控制。為控制棉籽象鼻蟲^^力o/7咖ws^ra"c^、Boheinan，在經(jīng)J^ro^c,"2'咖介導的轉(zhuǎn)化載體(設(shè)計來表達dsRNAi分子的)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉花植物中，表達源于美國專利申請公開文本No.2006/0021087中所述的V-ATP酶A直向同源體序列的dsRNAi分子。通過回收下述轉(zhuǎn)基因植物，來達成dsRNAi分子的表達，所述轉(zhuǎn)基因植物包含在這些植物中有活性的啟動子，其與長度為至少19-24個核苷酸的棉籽象鼻蟲V-ATP酶A片段和這些序列的反向互補序列可操作地相連。此類dsRNAi分子還可針對鱗翅目害蟲。在這種情況下，將dsRNAi分子與TIC807組合表達在轉(zhuǎn)基因植物中提供了對鱗翅目害蟲和雙翅目害蟲兩者的控制。為控制夜盜蛾，在經(jīng)^^ro&cfer/咖介導的轉(zhuǎn)化載體(設(shè)計來表達dsRNAi分子的)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因棉花植物中，表達源93于中腸表達的夜盜蛾序列(即，來自美國專利申請公開文本No.2006/0021087的Ae7/c，ai7s/,s序歹'j)的dsRNAi分子。通過回收下述轉(zhuǎn)基因植物，來達成dsRNAi分子的表達，所述轉(zhuǎn)基因植物包含在這些植物中有活性的啟動子，其與長度為至少19-24個核苷酸的夜盜蛾片段和這些序列的反向互補序列可操作地相連。I)在植物中組合TIC807與并非TIC807的昆蟲抑制性蛋白為控制刺吸式昆蟲，例如，蚜蟲、跳蟲、Ar^/s或粉虱，可在植物中將若干毒素分子與TIC807組合表達，以獲得更好的控制。在植物中與TIC807—起表達的此類分子可包括i)ET29、ET37或TIC809和TIC810、TIC812、TIC127或TIC128(PCTUS2006/033867;美國專利No.6，093,695);ii)AXMI-027、AXMI-036和/或AXMI-038(W006/107761);Hi)AXMI-018、AXMI-020和/或AXMI-021(WO06/083891);iv)AXMI-010(WO05/038032);v)AXMI-003(WO05/021585);vi)AXMI-008(US2004/0250311);vii)AXMI-006(US2004/0216186);viii)AXMI-007(US2004/0210965);ix)AXMI-009(US2004/0210964);x)AXMI-014(US2004/0197917);xi)AXMI-004(US2004/0197916);xii)AXMI-028和/或AXMI-029(WO06/119457)和xiii)AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004(WO04/074462)。毒性蛋白分子TIC809(示為SEQIDNO:10)和TIC81Q(示為SEQIDNO:12)的組合以前已在生物檢驗中顯示出能抑制西部牧草盲蝽(WTPB)A^us力e^7erwsKnight(PCTUS2006/033867)。TIC809和TIC810的融合蛋白TIC127(示為SEQIDNO:14)和TIC128(示為SEQIDNO:16)也可對A^^有活性。編碼TIC127的多核苷酸包含編碼TIC809的核酸分子，該分子與編碼TIC810的核酸分子通過多接頭核苷酸序列(示為SEQIDNO:17，編碼SEQIDNO:18中示出的氨基酸接頭)相連。編碼TIC128的多核苷酸包含編碼TIC810的核酸分子，該分子與編碼TIC809的核苷酸分子通過多接頭核苷酸序列(示為SEQIDNO:17,編碼SEQIDNO:18中示出的氨基酸接頭)相連。TIC807與TIC12794或TIC128的組合表達可提供對Z/^/s的增強的控制?？捎孟率鲋参锉磉_構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化雙子葉植物，例如，棉花，所述構(gòu)建體含有經(jīng)雙子葉植物優(yōu)化的、編碼TIC807(示為SEQIDNO:6)的核苷酸序列以及TIC809(示為SEQIDNO:9)和TIC810(示為SEQIDNO:11),或TIC127(示為SEQIDNO:13)或TIC128(示為SEQIDNO:15)，以提供對Z/^^的增強的抗性或者抑制Ar^a屬內(nèi)含有的其它物種。毒素分子的最優(yōu)表達可能需要靶向表達，例如，靶向細胞的葉綠體。這可通過在編碼毒素的核酸分子的5，末端添加本領(lǐng)域公知能將翻譯的蛋白指導向細胞葉綠體的編碼轉(zhuǎn)運肽的核酸分子來實現(xiàn)。編碼TIC807表達盒的DNA序列可與編碼昆蟲抑制性雙鏈RNA和/或并非TIC807的昆蟲抑制性蛋白分子的DNA序列中之一或兩者組合。這些DNA分子可通過直接轉(zhuǎn)化或育種或其組合來組合，以產(chǎn)生顯示出對Ar^/s增強的抗性的良種或雜交品系。一種或多種殺昆蟲蛋白與一種或多種雙鏈RNA(都獨立對半翅目害蟲(例如A^m)有活性)的組合是優(yōu)選的，因為其提供兩種不同的作用模式(抗性管理)，導致產(chǎn)生意料不到的協(xié)同性效果，所述效果是單獨使用殺昆蟲蛋白、單獨使用雙鏈RNA、使用都針對半翅目害蟲的兩種不同的殺昆蟲蛋白的組合或者使用都針對半翅目害蟲的兩種不同的dsRNA的組合時觀察不到的。此外，4吏用昆蟲毒素蛋白和雙鏈RM分子兩者在植物中的表達，作物植物的抗性鐠可被拓寬，以除了對半翅目害蟲(例如Af^/s)之外，還含有對其它類的有害昆蟲(例如鞘翅目、鱗翅目或雙翅目)的抗性。為在轉(zhuǎn)基因植物中控制鱗翅目害蟲和半翅目害蟲，可獲得表達TIC807蛋白和一種或多種針對鱗翅目害蟲有活性的蛋白這兩者的蛋白。獲得表達鱗翅目活性蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法已被良好表征，所述蛋白例如CrylA蛋白(美國專利No.5880275)、CrylB(美國專利申請No.10/525318)、CrylC(美國專利No.6033874)、CrylF、CrylA/F嵌合蛋白(美國專利Nos.7070982、6962705和6713063)和Cry2Ab蛋白(美國專利No.7064249)。可通過將表達TIC807或95鱗翅目蛋白的各轉(zhuǎn)基因植物雜交，來獲得表達TIC807蛋白和鱗翅目活性蛋白兩者的植物。備選地，可用提供TIC807或一種或多種鱗翅目活性蛋白兩者的表達的植物轉(zhuǎn)化載體來轉(zhuǎn)化植物。實施例14:TIC807的經(jīng)純化晶體芽孢制備物對力e^erws的毒性還使用經(jīng)純化的晶體芽孢制備物，測試了TIC807對Z/^a力e^er^的毒性。通過蔗糖梯度離心，對含有TIC807蛋白的伴胞晶體進行了部分純化。用Benzonase(Novagen;10U/ml樣品)來處理TIC807蛋白的IOX濃縮的芽孢-晶體制備物，以降低樣品粘度。令經(jīng)處理的樣品在4C過夜。在適于SW28轉(zhuǎn)子的Ultraclear或Polyclear管中制備蔗糖梯度每級10mL的79%、70%和55%蔗糖(處于10mMTris-HC1、0.1mMEDTA、0.005%TritonX-100(pH7)中)。每個梯度上樣大約6-7fflL樣品(裝到離管頂部1/4英寸)。在SW28轉(zhuǎn)子中，4C下，以18K運行梯度并過夜(16-18小時)。從55-70%的界面或70-79%的界面獲得晶體。在梯度緩沖液中對晶體進行至少5倍的稀釋，通過離心(例如，4°C下8K進行20分鐘)來沉淀。將晶體沉淀團重新懸浮于緩沖液中，在相差顯微鏡下檢查，以評估芽孢污染。隨后用50mMCAPS-NaOH(pH11)來處理經(jīng)純化的晶體，在37C孵育，直到懸浮液澄清。將溶解的蛋白對25fflM碳酸鈉、10mMNaCl(pH8.O)滲析，上樣到用同樣緩沖液平衡過的Q-Sepharose柱上，用線性10mM-500mMNaCl梯度洗脫。將洗脫的蛋白對25raM碳酸鈉(pH8.5)滲析。通過SDS-PAGE分析，蛋白被評定為高度純化。在進食檢驗中觀察到，較之未經(jīng)處理的檢查而言，該TIC807蛋白制備物導致A^^力e^en^蛹的顯著死亡率和發(fā)育遲緩(質(zhì)量降低)，這展示于下表9和10中。表9:TIC807針對西部牧草盲蝽(WTPB)Af^/sAe^eTT^的發(fā)育遲緩計分<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>在用丄j^M7eo7aWs進行的進食檢驗中獲得了相似的結(jié)杲。實施例15:合成編碼TIC807蛋白的其它基因(設(shè)計來用于在植物中表達的)設(shè)計并合成編碼TIC807蛋白的其它核苷酸序列。設(shè)計來在植物中表達的這些非天然編碼區(qū)域在本文中作為SEQIDNO:44至SEQIDNO:53提供。示為SEQIDNO:44至SEQIDNO:53的編碼序列的特征在于A+T的含量要比源于萬a"77MMtfWi^/e/^/s的天然TIC807編碼區(qū)域更低，去除了天然TIC807基因的富含A+T的區(qū)域，用具有更少A+T殘基的序列來代替它們。SEQIDNO:44是其中啟動甲硫氨酸的起始密碼子從細菌起始密碼子"TTG"變?yōu)橹参锲鹗济艽a子"ATG"的天然TIC807編碼區(qū)域。實施例16:用于在轉(zhuǎn)基因細胞或轉(zhuǎn)基因植物中表達TIC807蛋白的其它表達盒笫七靼向質(zhì)體的表達盒包含增強的CaMV35S啟動子，其與源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻譯引導序列可操作地相連，所述引導序列與包含N-末端ArabidopsisshkG葉綠體肽編碼序列(即CTP2)的編碼區(qū)域可操作相連，所述葉綠體肽編碼序列與非天然TIC807編碼序列(SEQIDNO:6)以符合讀碼框的方式融合。該構(gòu)建體編碼的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作為SEQIDNO:8提供。該編碼區(qū)域與3，末端CaMV35S聚腺苷化位點(T-35S)可操作相連。該被靼向的5，-e35S-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表達盒的序列作為SEQIDNO:54提供。第八表達盒包含增強的CaMV35S啟動子，其與源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻譯引導序列可操作地相連，所述引導序列與包含非天然TIC807編碼序列(SEQIDNO:6)的編碼區(qū)域可操作相連。該構(gòu)建體編碼的TIC807蛋白的肽序列作為SEQIDNO:5提供。該編碼區(qū)域與3，末端CaMV35S聚腺苷化位點可操作相連。該5，-e35S-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表達盒的序列作為SEQIDNO:55提供。第九乾向質(zhì)體的表達盒包含SugarcaneBad證irus(ScBV)啟動子(美國專利5,994,123),其與源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻譯引導序列可操作地相連，所述引導序列與包含N-末端ArabidopsisshkG葉綠體肽編碼序列(即CTP2)的編碼區(qū)域可操作相連，所述葉綠體肽編碼序列與非天然TIC807編碼序列(SEQIDNO:6)以符合讀碼框的方式融合。該構(gòu)建體編碼的CTP2-TIC807融合蛋白的肽序列作為SEQIDNO:8提供。該編碼區(qū)域與3，末端CaMV35S聚腺苷化位點可操作相連。該被靼向的5，-P-ScBV-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表達盒的序列作為SEQIDNO:56提供。第十表達盒包含SugarcaneBadnavirus(ScBV)啟動子，其與源于甘氨酸maxHspl7.9基因的5，非翻譯引導序列可操作地相連，所述引導序列與包含非天然TIC807編碼序列(SEQIDNO:6)的編碼區(qū)域可操作相連。該構(gòu)建體編碼的TIC807蛋白的肽序列作為SEQIDNO:5提供。該編碼區(qū)域與3，末端CaMV35S聚腺苷化位點可操作相連。該5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表達盒的序列作為SEQIDNO:57提供。實施例17:構(gòu)建含有TIC807表達盒的其它J^r"ac&r/M介導的轉(zhuǎn)化載體并轉(zhuǎn)入y^ro^3"er/腿為構(gòu)建J^ro6ac"r/咖介導的轉(zhuǎn)化載體，將TIC807表達盒在J^ro^c"r/咖邊界序列之間克隆進合適的載體，使得它們將通過含有構(gòu)建的載體的J^r^ac^W咖宿主與可選擇標志物基因一起轉(zhuǎn)入宿主植物細胞的基因組中。更特別地，將含有完整5，-e35S-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表達盒(SEQIDNO:54)的限制性片段克隆進J^ro6ac^er/咖植物轉(zhuǎn)化載體，獲得pMON105863(圖2)。類似地，含有完整5'-e35S-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表達盒(SEQIDNO:55)的限制性片段被克隆進J^ro6acfer/咖植物轉(zhuǎn)化載體，獲得pM0Nl05864(圖3)。為使用不同的啟動子表達，將含有完整5，-P-ScBV-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表達盒(SEQIDNO:56)的限制性片段克隆進J^^6ac"r2'咖植物轉(zhuǎn)化載體，獲得pMON78892(圖4)。類似地，含有完整5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表達盒(SEQIDNO:57)的限制性片段被克隆進」^ro&c&W咖植物轉(zhuǎn)化載體，獲得pMON78893(圖5)。通過電穿孔或通過三親雜交，將含有TIC807表達盒(即，SEQIDNO:55和SEQIDNO:57的非靶向盒和SEQIDNO:54和SEQIDNO:56的耙向盒)的載體引入^ro6a"eri亂雙元植物轉(zhuǎn)化載體含有可選擇標志物(在圖2至5中表示為"可選擇標志物")，用于使用抗生素卡納霉素來選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞。使用壯觀霉素的抗生素選擇被用于細菌選擇。這在圖2至5中表示為"SPC/STR"，這包括針對Tn7腺苷轉(zhuǎn)移酶的啟動子、針對編碼源于S帥力W,c面麼面的3"(9)-Q-氨基糖苷腺苷轉(zhuǎn)移酶(AAD)的基因的編碼區(qū)域和來自Tn7腺苷轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域，其賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性。每個質(zhì)粒中包括兩個細菌復制起點，用于^^ro6acfer/"范f"/ge/a".e/s復制的起點(在圖2至5中表示為"Ec.oriV-RK2")和用于在^yc力eWc力2'aco7/中復制的起點(在圖2至5中表示為"Ori-322")。編碼與及co//復制起點組合使用的遏制子引物的fsc力er/c力/a編碼區(qū)域在圖2至5中表示為"Ec.rop"。用于T-DNA穩(wěn)定整合進植物基因組的左右邊界在圖2至5中被分別表示為"LB，，和"RB"。圖5還顯示了使用的另一種表達盒，其中，TIC128毒素蛋白(PCTUS2Q06/Q33867)被表達并被標記，見圖5中的"TIC128表達盒"。實施例18:在愈傷組織中對TIC807的其它植物內(nèi)測試本實施例闡釋了TIC807植物內(nèi)表達的非限制性例子，這用于針對Lygus和刺和/或吸來自植物細胞和組織的流體的其它有害昆蟲的生物檢驗。使用前述實施例中描述的TIC807轉(zhuǎn)化載體中的TIC807表達盒，轉(zhuǎn)化紫花苜蓿、棉花、油菜、大豆或玉米細胞。這些表達盒提供了TIC807向葉綠體的靶向(即，用5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807T-35S-3'或5，-P-ScBV-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表達盒)或TIC807的非靶向的(胞質(zhì))表達(即，用5，一e35S—Hspl7.9-TIC807-T—35S-3，或5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表達盒)。轉(zhuǎn)化載體提供了可選擇標志物，在這種情況下，用于選擇轉(zhuǎn)基因植物組織中的卡納霉素抗性。針對對卡納霉素的抗性對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞加以選擇，并將其再生為轉(zhuǎn)基因植物。然后，當植物達到足夠的成熟水平，例如，當葉長到允許用物理障礙防止A^"s逃逸的大小時，令有害昆蟲(例如A^ws蛹)進食。防止Zj^/s蛹逃逸的障礙可以是任何商業(yè)可獲得的或自制的、允許Z/gm蛹與葉組織接觸并允許昆蟲探測葉的維管組織并進食的設(shè)備。與Mowry(1993)(J.Agric.Entomol.10:181-184)所述類似的微蟲籠(clipcages)將足以裝納A^"s蛹以進食。然后將4^^蛹呈現(xiàn)給來自表達TIC807蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的葉組織或不表達TIC807蛋白的對照葉組織。理想地，對照葉組織是平行選擇并再生的轉(zhuǎn)基因植物，但其中不舍編碼TIC的轉(zhuǎn)基因。但是，來自相似來源和年齡的其它植物的葉組織也可使用，只要組織不含顯著量的TIC807蛋白即可。然后在考慮到背景死亡(沒有在葉組織上進食的那些昆蟲發(fā)生的)的情況下，測定死亡率和發(fā)育遲緩的計分。將呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的葉組織的A^^蛹的經(jīng)f^正計分與呈現(xiàn)給對照葉組織的Ar^a9蛹的經(jīng)修正計分相比較。呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的葉組織的A^m蛹的死亡率和/或發(fā)育遲緩計分較之呈現(xiàn)給對照葉組織的蛹的計分顯著增加。實施例19:在萵苣葉組織中對TIC807進行植物內(nèi)測試使用前述實施例中描述的TIC807轉(zhuǎn)化載體中的TIC807表達盒，轉(zhuǎn)化萵苣細胞。這些表達盒提供了TIC807向葉綠體的靶向(即，用5，-e35S-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，或5，-P-ScBV-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T-35S-3，表達盒)或TIC807的非覃巴向的(胞質(zhì))表達(即，用5，-e35S-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3，或5，-P-ScBV-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3，表達盒)。轉(zhuǎn)化載體提供了可選擇標志物，在這種情況下，用于選擇轉(zhuǎn)基因植物組織中的卡納霉素抗性。針對對卡納霉素的抗性對經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞加以選擇，并將其再生為轉(zhuǎn)基因植物。在1.2%次氯酸鈉溶液中對萵苣種子進行20分鐘的表面滅菌，接著在經(jīng)滅菌的去離子水中洗3次。在層流罩中，令種子在Petri皿中干燥過夜。然后將種子以60個種子/盤的密度鋪到phytatray(Sigma，St.Louis，MO,目錄號P1552)中的100ml0.5XHoagland，s鹽(見下表ll)上。種子在22至23攝氏度下、光照下被培養(yǎng)4-5天，光周期為16小時。通過用IOO微升細菌懸浮液接種10ml液體甘露糖醇-谷氨酸/Luria培養(yǎng)基，制備經(jīng)感興趣的植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的爿^r由"er/咖。培養(yǎng)基包含下述成分LB培養(yǎng)基，Miller(Difco#044-017-3)12.5g甘露糖醇5.0gKH2P040.25gMgS047H200.10g生物素0.001g總體積1000mlpH至7.00并高壓滅菌在28攝氏度，旋轉(zhuǎn)搖床上，對液體培養(yǎng)物進行24小時的孵育。用15ml補充有40mg/L乙酰丁香酮的胰蛋白胨酵母提取物培養(yǎng)基(5g胰蛋白胨、3g酵母提取物和20ml2mg/mL的乙酰丁香酮，總體積為1000ml，pH5.5并高壓滅菌)來稀釋5ml的首次過夜培養(yǎng)物。然后在黑暗下，用50mg/L的卡納霉素和100mg/L壯觀霉素，在28攝氏度，旋轉(zhuǎn)搖床上，對其進行24小時的孵育。將1ml過夜培養(yǎng)物加入到19ml胰蛋白胨酵母提取物培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)物的600nm波長光密度調(diào)節(jié)為0.08至0.09。在底部和頂端切下萵苣幼苗的子葉，將其在經(jīng)稀釋的Agrobacterium培養(yǎng)基中浸泡15分鐘。然后把子葉放到?jīng)]有blotting的MSO-C培養(yǎng)基上，以16小時的光周期保持于22至23攝氏度。用微孔帶密封平板。48小時后，將子葉轉(zhuǎn)至100mmX25mmPetri亞中的MSO-1培養(yǎng)基。隨后在7和14天將外植體移種至MS0-I培養(yǎng)基。隨著嫩枝發(fā)育，切下來并轉(zhuǎn)至MS0-SE培養(yǎng)基。嫩枝延長后，將其轉(zhuǎn)至含有IOOmlMSO-SEQ培養(yǎng)基的phytatray。6至8周后，將發(fā)育的嫩枝轉(zhuǎn)至含有100mlMSO-R培養(yǎng)基的Magenta盒中，在23攝氏度孵育7至14天，根開始發(fā)育。然后將嫩枝轉(zhuǎn)至含有土壤的3英寸罐，令其生長。MS0培養(yǎng)基的組成示于表11中。表ll:MS0培養(yǎng)基組分成分0.5XHoagland's鹽MSO-CMSO-IMSO-SEMSO-RMSO鹽(最小限度的鹽)3"g34.6g3"g化6gHoagland's鹽0.8g萘乙酸(1mg/ml)0.1ml0.1ml0.05ml<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807--T-35S-3,(SEQIDNO:54))來轉(zhuǎn)化萵苣植物。使用載體對照(其中僅含用于轉(zhuǎn)化的選擇盒)來轉(zhuǎn)化萵苣的對照系。從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生Fl種子。從F1種子培育植物，并取樣用于TIC807蛋白的表達。使用標準ELISA方法和TIC807多克隆抗體，針對F1后代，測定蛋白表達水平?；赥IC807蛋白表達水平，選擇植物用于A^"s力e^ei""W則試。從選擇的Fl后代取葉樣品，使用實施例18所述的檢驗方法，針對4r^s力e^er^毒性加以測試。表12中展示了來自選擇的轉(zhuǎn)基因萵苣品系的數(shù)據(jù)。品系事件A028和A055明顯要比對照(即，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的萵苣品系SVR3606)表現(xiàn)更好。對表達TIC807蛋白的品系的總體分析展示了較之經(jīng)對照轉(zhuǎn)化的植物而言顯著的死亡率。表12:侵害后6天，15只侵害的幼嫩蛹(n=16)在經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的萵苣葉上的Zj^m力e"er^死亡率百分比的均值土標準誤差<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>實施例21:TIC807對馬鈴薯曱蟲(ColoradoPotatoBeetle)有毒性本實施例闡釋了昆蟲毒素分子TIC807對鞘翅目的馬鈴薯甲蟲(CPB)Z一/刀o&渭d/e固"細^的毒性。j吏用人工膳食(由13.2g/L瓊脂(Serva11393)、140.3g/LBio-Serve預(yù)混合物(Bio-Serve，F(xiàn)renchtown,NJCatalog#F9380B)、5ml/L氫氧化鉀(18.3%w/w)和1.25ml/L福爾馬林(37%)構(gòu)成)，進行CPB生物檢驗。將膳食分發(fā)至96孔板中的200微升小份試樣中，在樣品應(yīng)用之前筒單干燥。每個孔應(yīng)用20微升測試樣品，用滅菌水作為未經(jīng)處理的檢查(UTC)。在加入昆蟲幼蟲之前，令板干燥。用細毛刷向每個孔中加入1只新生幼蟲(CPB)。用聚脂薄膜密封板，用昆蟲針(insectpin)通風。每種處理測試40只幼蟲。將生物檢驗板在27攝氏度、60%的相對濕度下、完全黑暗下孵育10-12天。針對幼蟲死亡率對板計分。使用JMP4統(tǒng)計軟件(SASInstitute,Cary，NC)來分析數(shù)據(jù)。喂給CPB時，TIC807展示出死亡率。表13顯示了TIC807的平均百分比死亡率。因此，本發(fā)明的TIC807蛋白可用于控制鞘翅目昆蟲。受本發(fā)明的TIC807蛋白控制的鞘翅目昆蟲包括但不限于馬鈴薯甲蟲、金針蟲和棉籽象鼻蟲。表13:TIC807針對馬鈴薯曱蟲(CPBUe;〃刀o^a"ac/ece/z〃/2ea"的百分比死亡率計分<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>實施例22:用TIC807轉(zhuǎn)化棉花，使用整林棉花植物進行毒素測試使用含有編碼TIC807蛋白的感興趣的基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化棉花細胞。在這種情況下，使用前述實施例中描述的TIC807轉(zhuǎn)化載體中的TIC807表達盒，在棉花細胞中表達編碼TIC807蛋白的、經(jīng)密碼子再設(shè)計的核酸序列。這些表達盒提供了TIC807蛋白向葉綠體的靶向(即，用pMON105863中發(fā)現(xiàn)的5，-e35S-Hsp17.9-CTP2-TIC807-T-35S-3'或pMON78892中發(fā)現(xiàn)的5，-P-ScBV-Hspl7.9-CTP2-TIC807-T—35S-3，表達盒)或TIC807的非靶向的(胞質(zhì))表達(即，用pMON105864中發(fā)現(xiàn)的5，-e35S-Hsp17.9-TIC807-T-35S-3，或pMON78893中發(fā)現(xiàn)的5，-P-ScBV-Hspl7.9-TIC807-T-35S-3，表達盒)。轉(zhuǎn)化載體提供了可選擇標志物，在這種情況下，用于選擇轉(zhuǎn)基因植物組織中的卡納霉素抗性?？墒褂胮MONl05863載體(圖2)、pMONl05864載體(圖3)或pMON78892載體(圖4)或pMON78893載體(圖5)或含有TIC807植物表達盒和可選擇標志物的其它等同TIC807植物表達載體。可使用封閉的棉花枝檢驗來在表達TIC807毒素分子的植物上進行生物檢驗。將棉花植物培養(yǎng)至早期開花階段，此時可獲得若干含有蕾(square)(即，未成熟的棉花的花)的結(jié)果枝。使用透氣性塑料膜(VilutisandCo.Inc.,Frankfort,IU制備套管。使用標準攝影或美術(shù)以及手工電燙器制造套管，以產(chǎn)生接縫，生產(chǎn)具有5英寸X5英寸X12英寸長的大致尺寸的口袋。將包括至少一個預(yù)開花的蕾和未巻曲的末端葉的末端枝插入進套管的開口端。備選地，如果需要的話，可用口袋裝棉桃或其它組織。使用扎帶(twisttie)在枝的周圍密封口袋。想要的被封起來的組織下面的葉和蕾可被除去，以協(xié)助確保更靠近扎帶。套管的另一端保持開放，以允許昆蟲侵害。用抽吸器收集Lygus蛹，將4只蛹放進2打蘭殼瓶(shellvial)中。針對含有蛹的每只瓶記錄蛹的初始質(zhì)量。輕柔蓋上管，以確保蛹處于管的底部，除去管的蓋子。將管放在套管內(nèi)，將蛹暴露給棉花植物組織。然后用扎帶封閉套管的開放端。令昆蟲留在套管內(nèi)，并在封閉的棉花植物材料上進食指定的天數(shù)。指定時間后，除去棉花枝。小心打開套管，對存活的蛹加以計數(shù)。收集所有的蛹并稱重。然后參考未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照植物，測定死亡率和發(fā)育遲緩的計分。將呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的棉花組織的AF^^蛹的經(jīng)修正計分與呈現(xiàn)給缺乏TIC807蛋白的對照棉花組織的Ar^^蛹的經(jīng)修正計分相比較。呈現(xiàn)給經(jīng)TIC807轉(zhuǎn)化的棉花組織的蛹的死亡率和/或發(fā)育遲緩計分較之呈現(xiàn)給對照棉花組織的A^7/s蛹的計分顯著增加。實施例23:組合TIC807毒素和無蜜腺棉花本實施例闡釋了使用無蜜腺棉花表型組合TIC807蛋白表達，以提供更好的對有害昆蟲的控制。蜜腺缺乏已被鑒定為是"^/p/咖"/ze/^os咖中兩個重復基因座的隱性突變的純合性導致的(MeyerandMeyer,1961，CropScience,1:167169)。在籠實驗中，用"鏡，.i/邁力/rswfu/H與Cc^s7pi"邁fo/se/^c^w/z7雜交展示出粉纟文夜蛾(cabbagelooper)和棉樹葉蟲(cottonleafworms)種群的顯著降低(相對于其中存在花蜜腺的普通棉花品種而言)(LukefahrandRhyne，1960,Econ.Entomol.53:242-244)。這假設(shè)是無蜜腺棉花品系對有害昆蟲來說較不美味以及缺乏蜜腺提供的食物的直接結(jié)果。在Gossypieae的物種中，多種抗性機制可能特別關(guān)鍵，因為花外蜜腺可直接吸引一些食草類的物種。培養(yǎng)的棉花中，花外蜜腺可增強若干作物害蟲(包括鱗翅目和盲墻)的豐度或損害(Trelease，1879,Nectar;whatitis，andsomeofitsuses.InJ.H.Comstock[ed.],Reportuponcottoninsects,319-343.U.S.DepartmentofAgriculturePublication,U.S.GovernmentPublicationOffice,Washington,D.C.，亂UkefahrandRhyne，1960;Lukefahretal.,1960，JournalofEconEntom53:516—518;BenschoterandLeal,1974，JournalofEconEntom67:217-218;Schusteretal.,1976，JournalofEconEntom69:400-402;WilsonandWilson,1976,JournalofEconEntom69:623-624;He麵berryetal.,1977，JournalofEconEntom70:797-799;Adjei-Maafoetal.,1983，EnvironEntom12:353358;Beachetal.，1985，JournalofEntomologicalScience20:233-236;Smith,1992，AdvancesinAgronomy48:251-296;SummyandKing,1992，CropProtection11:307-319)，主要是因為這些分類的成年害蟲能消耗花外蜜腺。針對無蜜腺表型和有好處的農(nóng)業(yè)性狀的存在，對通過《.力/"Wz/范與f咖eWo;咖雜交生產(chǎn)的品系加以選擇。在其它一些實施方式中，從商業(yè)種質(zhì)Stoneville825獲得的品系可用作為包含無蜜腺表型的種質(zhì)的來源。在該方法的一種實施方式中，用編碼TIC807蛋白、TIC809/TIC810蛋白、TIC128蛋白或其組合或針對棉花害蟲(其中，蜜腺的存在該有害昆蟲作用為引誘劑)的任何其它毒素分子的表達盒，來轉(zhuǎn)化選用的無蜜腺品系。在該方法的另一實施方式中，在任何合適的棉花種質(zhì)中，獲得包含編碼TIC807蛋白、TIC809/TIC810蛋白、TIC128蛋白或其組合或針對棉花害蟲(其中，蜜腺的存在該有害昆蟲作用為引誘劑)的任何其它毒素分子的表達盒的轉(zhuǎn)基因插入，并將該種質(zhì)滲入進通過".力/rsWwz7與&M邁e"雜交產(chǎn)生的品系(已針對無蜜腺表型和有好處的農(nóng)業(yè)性狀的存在選擇過)。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的育種方法，選擇表達無蜜腺表型的轉(zhuǎn)化子品系，并將其保持于含有無蜜腺表型和昆蟲毒素分子兩者的后續(xù)世代中。實施例24:對TIC807和Cry51Aa蛋白加以比較為鑒定TIC807(SEQIDNO:5)和Cry51Aa(SEQIDNO:59)的保守和非保守區(qū)域，使用ClustalW對兩種蛋白進行比對。從Bt菌林F14-l分離Cry51Aa蛋白，其具報道稱與cryl5Aa具有22%的同一性，并且還報道稱，其具有針對/poW(鱗翅目昆蟲)的活性(H磁getal.，J.Invertebr.Pathol.95(3)，175-180，2007)。cry51Aal基因(SEQIDNO:58)和編碼的Cry51Aal蛋白(SEQIDNO:59)的序列作為NCBIGenBank檢錄號DQ836184一皮才艮道。對TIC807(SEQIDNO:5)和Cry51Aal進行的ClustalW比較顯示，兩種蛋白在301個氨基酸的長度上具有大約97.4%的序列同一性(見圖6和表端，其對應(yīng)于可^的^TG起始密碼子的使用，這將產(chǎn)生309個氨基酸的一級翻譯產(chǎn)物。而相反，基于通過Edman降解測定的經(jīng)分離TIC807蛋白的N-末端肽序列，TIC807蛋白具有截然不同的氨基末端(見實施例2和SEQIDNO:1)。顯然地，SEQIDNO:4的TTG起始曱疏氨酸密碼子被用于產(chǎn)生SEQIDNO:5的TIC807蛋白。由此，報道的Cry51Aal蛋白在其N-末端包含額外的三個氨基酸，而這是TIC807(SEQIDNO:5)中沒有出現(xiàn)的。在Cry51Aal中，對應(yīng)于TIC807的苯丙氨酸46的氨基酸殘基被取代為絲氨酸殘基，對應(yīng)于TIC807的酪氨酸54的氨基酸殘基被取代為組氨酸殘基，對應(yīng)于TIC807的絲氨酸167的氨基酸殘基被取代為精氨酸殘基，對應(yīng)于TIC807的組氨酸199至絲氨酸201的三(3)個氨基酸殘基缺失，對應(yīng)于TIC807的絲氨酸217的氨基酸殘基被取代為天冬酰胺殘基。圖6顯示了對TIC807和Cry51Aal蛋白的這種比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>雖然TIC807蛋白與Cry51Aal蛋白共享顯著的序列同一性，但是當喂銅給某些鱗翅目昆蟲時，TIC807蛋白令人吃驚地沒有展示出顯著的活性水平。4十對歐洲玉米螟(ECB;^y"/力j'a"z^/7ahY)和煙音蟲(TBW:#e//o^ysr/resce/"對經(jīng)純化TIC807蛋白進行了測試，它們對這些鱗翅目昆蟲沒有活性。而同樣的TIC807樣品展示出對馬鈴薯曱蟲CPB的活性，卻對玉米根蟲(CRW;"/a6ro〃cM)沒有活性。因此，經(jīng)純化的TIC807對ECB和TBW不存在活性并非是由于經(jīng)純化TIC807蛋白失活。本發(fā)明因此包括對半翅目和鞘翅目昆蟲有活性而對鱗翅目昆蟲沒有活性的TIC807蛋白。在某些實施方式中，本發(fā)明的TIC807蛋白可包含這樣的TIC807蛋白，其中，TIC807蛋白的相應(yīng)的笫54位殘基并非組氨酸，其中，TIC807蛋白的相應(yīng)的第167位殘基并非精氨酸，其中，對應(yīng)于TIC807的組氨酸199至絲氨酸201的三(3)個氨基酸殘基存在，和/或TIC807的相應(yīng)的殘基217并非天冬酰胺殘基。在又一些實施方式中，本發(fā)明的TIC807蛋白可包含這樣的蛋白，所述蛋白在301個氨基酸的長度上，與SEQIDNO:5的第2至309位氨基酸殘基對應(yīng)，具有至少98%或至少99%的同一性。本文提到了若干專利和非專利公開文本，其中每篇的公開內(nèi)容都通過引用整體以必要的程度并入本文。本文提到的從某些網(wǎng)址來自互聯(lián)網(wǎng)的文獻也通過引用整體并入本文。本文通過其"NCBI檢錄號"引用的某些生物序列可由ncbi.nlm.nih.gov從互聯(lián)網(wǎng)上的NationalCenterofBiotechnologyInformation獲得。在本文描述和闡釋的構(gòu)造和方法中，可進行多種改變，而不偏離本發(fā)明的范圍，前述說明書和所附附圖中含有的所有內(nèi)容都應(yīng)當被解釋為闡釋性的而非限制性的。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)受到任何前述示例性實施方式的限制，而僅應(yīng)按照所附權(quán)利要求及其等同體來界定。200880020577.1關(guān)于保藏的微生物的說明(PCT實施細則第13條之二)A.以下所作的說明涉及說明書第1頁第21-25行所指的微生物。B.保藏物標識更多的保藏物標識見附頁口保藏單位名稱農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(NR:RI,)保藏單位地址(包括郵政編碼和國家)::1815N.UniversityStreetPeoria,U!inois61604U.S.A(美國)保藏日期2007年3月16閂保藏編號NRRLB-50030C.其它說明(如果不適用則留空)該信息續(xù)在附頁上口D.本說明所適用的指定國(如果本說明不用于所有指定國)E.單獨提交的說明(如果不適用則留空)以下說明將在以后提交給國際局(指明說明的一般性質(zhì)，如"保藏編號")本欄由受理局填寫口本頁和國際申請--起收到授權(quán)官員PCT/RO/134表本欄由國際局填寫口國際局于以下n期收到本頁:年月Fl授權(quán)官員國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約國際表格孟山都技術(shù)有限責任公司700ChesterfieldParkwayNorthChesterfield,MO63017美國<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>當適用第6.4(d)款時，該日期是取得國際保藏單位資格的日期在原始保藏情況下的收條，由本頁下面所示的國際保藏單位根據(jù)第7.1款發(fā)給國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約國際表格孟山都技術(shù)有限責任公司存活報告書，由本頁下面所示的國際保藏單位根據(jù)第10.2款發(fā)給700ChesterfieldParkwayNorthChesterfield,MO63017美國I.保藏人II.微生物的鑒別名稱孟山都技術(shù)有限責任公司由國際保藏單位給予的登錄號NRRLB-50030地址700ChesterfieldParkwayNorthChesterfield,MO63017(美國)原始保藏或轉(zhuǎn)移的日期、2007-03-17III.存活報告書在上面II中鑒別的微生物的存活性于2004-02-092進行測試。在這一天，所述微生物(x)3存活()3不再存活I(lǐng)V.進行存活性測試的條件4V.國際保藏單位名稱農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(NRRL)有權(quán)代表本國際保藏單位的人員或者經(jīng)授權(quán)的官員的簽字地址1815N.UniversityStreetPeoriaIllinois61604U.S.A.日期2009-09-3指原始保藏日期；或者當進行重新保藏或移轉(zhuǎn)時，指最近的相關(guān)日期(重新保藏日期或移轉(zhuǎn)日期)。在第10.2(a)款第(ii)和(iii)項中所涉及的情況下，指最近的存活性測試。在合適的項目上打x號。如果要求這些信息和如果測試結(jié)果為陰性，請?zhí)顚懘隧棥?quán)利要求1.經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70％序列同一性的多肽序列。2.權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多肽序列與SEQIDNO:5中含有的所述相應(yīng)多肽序列具有至少大約80%的序列同一性。3.權(quán)利要求2的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多肽序列與SEQIDNO:5中含有的所述相應(yīng)多肽序列具有至少大約90%的序列同一性。4.權(quán)利要求3的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多肽序列與SEQIDNO:5中含有的所述相應(yīng)多肽序列具有至少大約95°/。的序列同一性。5.權(quán)利要求4的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多肽序列與SEQIDNO:5中含有的所述相應(yīng)多肽序列具有100%的序列同一性。6.權(quán)利要求5的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多肽序列是SEQIDNO:5。7.權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段抑制半翅目昆蟲、異翅目昆蟲、丄ep〃/20&"a57.昆蟲或同翅目昆蟲。8.權(quán)利要求7的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述半翅目昆蟲是9.權(quán)利要求7的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述同翅目昆蟲是蟲牙蟲、跳蟲或粉虱。10.權(quán)利要求8的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段在Z/^Ay膳食中以至少大約5ppm的所述TIC807蛋白或蛋白片段的A^m膳食濃度抑制Zj^m。11.權(quán)利要求10的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段在AFgM膳食中以至少大約50ppffl的所述TIC807蛋白或蛋白片段的ij^^膳食濃度抑制Zj^m。12.權(quán)利要求11的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段在丄/g^膳食中以至少大約250ppm的所述TIC807蛋白或蛋白片段的A7^aj膳食濃度抑制丄/^a。13.權(quán)利要求12的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段在膳食中以至少大約500ppm的所述TIC807蛋白或蛋白片段的A^^膳食濃度抑制A^m。14.權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述蛋白片段包含至少250個氨基酸殘基的肽序列。15.權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸在高度嚴緊條件下與SEQIDNO:4或SEQIDNO:6雜交。16.權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述核苷酸序列選自SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52和SEQIDNO:53構(gòu)成的組。17.權(quán)利要求1的經(jīng)分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列被設(shè)計以在植物中表達。18.轉(zhuǎn)基因植物或源于其的植物部分，其中包含TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列。19.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其中所述植物或植物部分以下述濃度包含所述TIC807蛋白或蛋白片段，所述濃度為每克鮮重植物組織至少大約5iug所述TIC807蛋白或蛋白片段。20.權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其中所述植物或植物部分以下述濃度包含所述TIC807蛋白或蛋白片段，所述濃度為每克鮮重植物組織至少大約50]ng所述TIC807蛋白或蛋白片段。21.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其中所述植物或植物部分以下述濃度包含所述TIC807蛋白或蛋白片段，所述濃度為每克鮮重植物組織至少大約250pg所述TIC807蛋白或蛋白片段。22.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其中所述植物部分是細胞、葉、莖、花、萼片、果、根或種子。23.包含下述多核苷酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中所述多核苷酸編碼TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70°/。序列同一性的多肽序列。24.權(quán)利要求23的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌細胞或植物細力包。25.權(quán)利要求24的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中所述植物細胞選自大麥、玉米、燕麥、水稻、黑麥、高粱、草皮草、甘蔗、小麥、紫花苜蓿、香蕉、花椰菜、豆、，巻心菜、油菜、胡蘿卜、木薯、花椰菜、芽菜、柑橘類、棉花、葫蘆、桉樹、亞麻、蒜、葡萄、洋蔥、萵苣、豌豆、花生、胡椒、馬鈴薯、楊樹、松樹、向日葵、紅花、大豆、草莓、甜菜、甘薯、煙草、番茄、裝飾植物、灌木、堅果、鷹嘴豆、木豆、稷、啤酒花和牧場草植物細胞構(gòu)成的組。26.權(quán)利要求25的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其中所述植物細胞是棉花才直物細胞。27.源于權(quán)利要求24的所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物宿主細胞的植物。28.從權(quán)利要求27所述的植物產(chǎn)生的種子。29.來自權(quán)利要求28所述的種子的后代植物。30.權(quán)利要求24的細菌細胞，其中所述細菌細胞選自i^To6acter/w/h、Jac/Ziw^^fsc力er2.c力/a、5^//zo/2e/7a、戶sewcfo/zo/2ss和W力Wwz7細菌細胞構(gòu)成的組。31.權(quán)利要求30的細菌細胞，其中所述細菌細胞是勘c/7/mf力wr/刀《ye/^/51纟田l包。32.控制A^^的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供m抑制量的TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段，其中，所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中舍有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70°/。序列同一性的多肽序列；以及(b)使所述與所述抑制量的所述多肽序列接觸，由此控制Zj^ws昆蟲。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述多肽序列與SEQIDN0:5中含有的所述相應(yīng)多肽序列具有至少大約90°/。的序列同一性。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述多肽序列與SEQIDN0:5中含有的所述相應(yīng)多肽序列具有100%的序列同一性。35.權(quán)利要求32的方法，其中在步驟(a)中于A^m膳食中提供所述Z/^Ay抑制量的所述多肽序列，并且在步驟(b)中可通過令所述丄j^M進食所述膳食來接觸所述Af《"s。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述A^M膳食是轉(zhuǎn)基因植物。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述多肽序列的所迷丄7^^抑制量為每克所述轉(zhuǎn)基因植物鮮重組織至少大約5,g。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述多肽序列的所述Z;^^抑制量為每克所述轉(zhuǎn)基因植物鮮重組織至少大約50^g。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述多肽序列的所述Zj^^抑制量為每克所述轉(zhuǎn)基因植物鮮重組織至少大約250jig。40.權(quán)利要求32的方法，其中在步驟(a)中通過將包含所述多肽的組合物噴霧到植物上，提供所述AF^^抑制量的所述多肽序列。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述組合物包含表達所述多肽的細菌細胞或細菌芽孢。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述細菌細胞或細菌芽孢是^2C27/m細胞或^cy77zA芽孢。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述組合物包含含有所述多肽的伴胞晶體。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述植物被Z/^/s侵害。45.經(jīng)分離的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:4中含有的或SEQIDNO:4的互補序列中含有的序列的至少12個連續(xù)核苷酸。46.經(jīng)分離的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53中含有的或SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的互補序列中含有的序列的至少12個連續(xù)核苷酸。47.試劑盒，用于檢測樣品中的多核苷酸序列，所述試劑盒包含與SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SBQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53的多核普酸序列或其互補序列特異性雜交的寡核苷酸和與所述寡核普酸雜交的對照多核苷酸。48.組合物，所述組合物包含至少兩條至少12個核苷酸的簡并寡核苷酸引物，其中，所述筒并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的多肽序列。49.在樣品中檢測或分離編碼TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟(a)選擇能產(chǎn)生擴增子的簡并寡核苷酸引物對，其中，所述簡并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的TIC807多肽序列；(b)從所述樣品中的所述多核苷酸序列產(chǎn)生擴增子；以及(c)檢測或分離所述擴增子，由此檢測或分離樣品中編碼TIC807蛋白或TIC807相關(guān)蛋白的多核苷酸。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述被檢測或分離的擴增子編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%的序列同一性的TIC807相關(guān)蛋白。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述被檢測或分離的擴增子編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少70%的序列同一性的多肽。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述被檢測或分離的擴增子編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少90%的序列同一性的多肽。53.在樣品中檢測或分離編碼TIC807蛋白的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟(a)選擇簡并寡核苷酸或簡并寡核苷酸集，其中，所述簡并寡核苷酸引物的核苷酸序列源于SEQIDNO:5的ITC807多肽序列；(b)將所述簡并寡核苷酸或簡并寡核苷酸集與所述樣品雜交；(c)檢測所述樣品中與多核苷酸的雜交，由此檢測樣品中編碼TIC807的多核普酸，以及(d)分離在步驟(c)中通過雜交檢測到的多核苷酸。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述被檢測或分離的多核苷酸編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少45%的序列同一性的多肽。55.權(quán)利要求54的方法，其中所述被檢測或分離的多核苷酸編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少70%的序列同一性的多肽。56.權(quán)利要求55的方法，其中所述被檢測或分離的多核苷酸編碼與TIC807(SEQIDNO:5)具有至少90%的序列同一性的多肽。57.在植物中表達TIC8(H蛋白的方法，所述方法包括下述步驟(a)向植物細胞基因組中插入以5，至3，的方向包含可操作相連的、重組雙鏈DNA分子的核酸序列，其中，所述重組雙鏈MA分子包含i.在所述植物細胞中發(fā)揮功能的啟動子；ii.編碼包含TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻譯核苷酸序列，其在所述植物的細胞中發(fā)揮功能以導致轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷化，其中，所述啟動子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻譯核苷酸序列可操作地相連；(b)獲得含有步驟(a)的所述核酸序列的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞，以及(c)從所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞再生表達所述TIC807蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，由此在植物中表達TIC807蛋白。58.權(quán)利要求57的方法，其中步驟(a)的所述多核苷酸序列編碼與SEQIDNO:5具有至少90%的序列同一性的TIC807蛋白。59.權(quán)利要求58的方法，其中步驟(a)的所述多核苷酸序列編碼SEQIDNO:5。60.權(quán)利要求59的方法，其中編碼TIC807蛋白的、步驟(a)的所述多核苷酸序列與編碼質(zhì)體靶向多肽的多核苷酸序列可操作地相連。61.權(quán)利要求60的方法，其中步驟(a)的所述多核苷酸序列編碼SEQIDNO:8的多肽。62.重組DNA載體，用于在植物中表達TIC807蛋白，所述載體以5，至3，的方向包含i.在植物細胞中發(fā)揮功能的啟動子；ii.編碼包含TIC807昆蟲抑制性蛋白或源于其的昆蟲抑制性蛋白片段的多肽的多核苷酸序列，其中所述昆蟲抑制性蛋白或蛋白片段包含與SEQIDNO:5中含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約70%序列同一性的多肽序列；以及iii.3，非翻譯核苷酸序列，其在所述植物的細胞中發(fā)揮功能以導致聚腺普化，其中，所述啟動子、所述多核苷酸序列和所述3，非翻譯核苦酸序列可操作地相連。63.權(quán)利要求62的載體，其中所述多核苷酸序列編碼與SEQIDNO:5具有至少90°/。的序列同一性的TIC8(H蛋白。64.權(quán)利要求63的載體，其中所述多核苷酸序列編碼SEQIDNO:5的TIC807蛋白。65.權(quán)利要求64的載體，其中所述多核苷酸序列包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52或SEQIDNO:53。66.權(quán)利要求62的載體，其中編碼TIC807蛋白的所述多核苷酸序列與編碼質(zhì)體乾向多肽的多核苷酸序列可操作地相連。67.權(quán)利要求66的載體，其中所述多核苷酸序列編碼SEQIDNO:`8的多肽。68.權(quán)利要求67的載體，其中所述多核苷酸序列是SEQIDN0:7。69.權(quán)利要求68的載體，所述載體還包含編碼可選擇標志物基因的多核苷酸。70.權(quán)利要求69的載體，其中所述可選擇標志物基因賦予對AMPA、莠去津、溴苯腈、茅草枯、麥草畏、草甘膦、潮霉素、甲氨蝶呤、新霉素、草銨膦、磺酰脲或2，4-D和其組合的抗性。71.從植物或種子生產(chǎn)的商品，其中，所述商品含有可檢測到的量的TIC807蛋白或編碼TIC807蛋白的多核苷酸。72.權(quán)利要求71的商品，其中所述植物或種子是棉花植物或棉花植物種子。73.權(quán)利要求72的商品，其中商品是棉絨、油、粗粉或外殼。74.控制至少一種有害昆蟲的方法，所述方法包括下述步驟(a)在組合物中提供至少兩種不同的有害昆蟲抑制性試劑，所述組合物包含i.昆蟲抑制量的TIC807蛋白，和ii.昆蟲抑制量的、被下述有害昆蟲攝入后發(fā)揮功能以抑制所述有害昆蟲內(nèi)的生物學功能的至少一種核糖核苷酸序列，和/或iii.昆蟲抑制量的并非TIC807蛋白的至少一種昆蟲抑制性蛋白；和(b)令所述至少一種有害昆蟲與抑制量的所述組合物接觸，由此控制所述至少一種有害昆蟲。75.權(quán)利要求74的方法，其中所述至少一種有害昆蟲是半翅目昆蟲、異翅目昆蟲、Ze;〃/o"r^昆蟲或同翅目昆蟲。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述半翅目昆蟲是Z/^/s昆蟲。77.權(quán)利要求75的方法，其中所述同翅目昆蟲是奸蟲、跳蟲或粉虱。78.權(quán)利要求74的方法，其中(a)ii.中所述有害昆蟲內(nèi)的所述生物學功能是必要生物學功能。79.權(quán)利要求78的方法，其中所述必要生物學功能是所述有害昆蟲的必要蛋白或核糖核酸提供的，其預(yù)測功能選自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)控，離子調(diào)控和運輸，消化酶的合成，細胞膜勢能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，細胞分裂，能量代it,呼吸和凋亡構(gòu)成的組。80.權(quán)利要求78的方法，其中所述必要生物學功能被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出與選自SBQIDNO:24至SEQIDNO:39樹成的組的核苷酸編碼序列大約80至大約100%序列同一性的大約21至大約5000個連續(xù)的核苷酸。81.權(quán)利要求74的方法，其中所述并非TIC807蛋白的一種昆蟲抑制性蛋白源于5ac/7/z/s^i/i"2-"^7e/^/s。82.權(quán)利要求81的方法，其中所述昆蟲抑制性蛋白選自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI—009、AXMI-014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI-028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128構(gòu)成的組。83.權(quán)利要求74的方法，其中所述組合物包含并非TIC807的兩種昆蟲抑制性蛋白，并且，其中，所述兩種昆蟲抑制性蛋白是TIC809和TIC810。84.權(quán)利要求74的方法，其中通過所述組合物控制第二有害昆蟲。85.權(quán)利要求84的方法，其中所述第二有害昆蟲被ii.中的所述核糖核苷酸序列或被iii.中的所述并非TIC807的蛋白抑制。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述第二有害昆蟲是鱗翅目有害昆蟲。87.權(quán)利要求86的方法，其中所述第二有害昆蟲被選自CrylA蛋白、CrylB蛋白、CrylC、CrylA/CrylF嵌合蛋白和Cry2Ab蛋白構(gòu)成的組的蛋白抑制。88.權(quán)利要求74的方法，其中所述組合物提供了協(xié)同性的昆蟲抑制效果。89.權(quán)利要求74的方法，其中所述組合物提供了加合性的昆蟲抑制效果。90.權(quán)利要求74的方法，其中所述組合物是轉(zhuǎn)基因植物。91.保護植物抵擋A^m侵害的方法，所述方法包括下述步驟在所述植物中表達Zj^m抑制量的至少兩種不同的Z7《m抑制性試劑，其中，所述ArgM抑制性試劑包含(i)Ar^/s抑制量的TIC807蛋白；(ii)Z7^^抑制量的、并非TIC807蛋白的至少一種Ar^/s抑制性蛋白，和/或(iii)抑制量的至少一種核苷酸序列，其被所述Af^/s攝入后發(fā)揮功能以抑制所述AF^/s內(nèi)的生物學功能，由此保護所述植物抵擋力j^m侵害。92.權(quán)利要求91的方法，其中ii.中所述內(nèi)的所述生物學功能是必要生物學功能。93.權(quán)利要求92的方法，其中所述必要生物學功能是所述Ar^/s的必要蛋白或核糖核酸提供的，其預(yù)測功能選自肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素調(diào)控，離子調(diào)控和運輸，消化酶的合成，細胞膜勢能保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素傳感，觸角形成，翅膀形成，腿形成、發(fā)育和分化，卵形成，幼蟲成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神經(jīng)傳遞，細胞分裂，能量代謝，呼吸和凋亡構(gòu)成的組。94.權(quán)利要求93的方法，其中所述必要生物學功能被下述核糖核苷酸序列抑制，所述核糖核苷酸序列包含展示出與選自SEQIDNO:24至SEQIDNO:39構(gòu)成的組的核香酸編碼序列大約80至大約100%序列同一性的大約21至大約5000個連續(xù)的核苷酸。95.權(quán)利要求91的方法，其中所述并非TIC807蛋白的Z/^/s抑制(性蛋白源、于Asei/ii^f力y/i"g/e刀51/^。96.權(quán)利要求95的方法，其中所述抑制性蛋白選自AXMI-027、AXMI-036、AXMI-038、AXMI-018、AXMI-020、AXMI-021、AXMI-010、AXMI-003、AXMI-008、AXMI-006、AXMI-007、AXMI-009、AXMI-014、ET29、ET37、AXMI-004、AXMI-028、AXMI-029、AXMI-007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127和TIC128構(gòu)成的組。97.權(quán)利要求91的方法，其中在所述植物中表達并非TIC807蛋白的兩種A^m抑制性蛋白，所述兩種Ar^/s抑制性蛋白包含TIC809和TIC810。98.權(quán)利要求91的方法，其中A^^抑制性試劑的所述表達提供了協(xié)同性的抑制效果。99.權(quán)利要求91的方法，其中A^^抑制性試劑的所述表達提供了加合性的A^m抑制效果。100.斗又利要>，91的方、法，其中戶斤述Z7《w^是A^"ws力es/ei7/s或101.經(jīng)分離的蛋白，其中所述蛋白包含SEQIDNO:5中含有的、長度為至少9個氨基酸的多肽序列。102.權(quán)利要求101的經(jīng)分離的蛋白，其中所述多肽序列長度為至少12個氨基酸。103.權(quán)利要求102的經(jīng)分離的蛋白，其中所述多肽序列長度為至少16個氨基酸。104.權(quán)利要求103的經(jīng)分離的蛋白，其中所述多肽序列長度為至少32個氨基酸。105.權(quán)利要求104的經(jīng)分離的蛋白，其中所述多肽序列與SEQIDNO:5內(nèi)含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約80%的序列同一性。106.權(quán)利要求105的經(jīng)分離的蛋白，其中所述多肽序列與SEQIDNO:5內(nèi)含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約90%的序列同一性。107.權(quán)利要求106的經(jīng)分離的蛋白，其中所述多肽序列與SEQIDNO:5內(nèi)含有的相應(yīng)多肽序列具有至少大約95%的序列同一性。108.權(quán)利要求107的經(jīng)分離的蛋白，其中所述蛋白是SEQIDNO:109.權(quán)利要求101的經(jīng)分離的蛋白，其中所述蛋白還包含載劑蛋白。110.權(quán)利要求109的經(jīng)分離的蛋白，其中所述載劑蛋白是清蛋白或KLH蛋白。111.權(quán)利要求101的經(jīng)分離的蛋白，其中所述蛋白還包含選自指示劑、氨基酸間隔、氨基酸接頭、信號序列、葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列、液泡靶向序列、停止轉(zhuǎn)移序列、跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白純化配體或其組合構(gòu)成的組的共價修飾。112.與TIC807蛋白或源于其的肽表位特異性結(jié)合的抗體，其中，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9個連續(xù)氨基酸。113.在樣品中檢測TIC807蛋白的試劑盒，所述試劑盒包含a)與TIC807蛋白或源于其的肽表位特異性結(jié)合的抗體，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9個連續(xù)氨基酸；和b)對照TIC807蛋白或源于其的肽表位，所述蛋白或表位包含SEQIDNO:5的至少9個連續(xù)氨基酸。114.經(jīng)分離的A"力er2'c力hcoh'菌4朱SIC8088，其帶有載體pIC17040，并且包含編碼TIC807的殺昆蟲片段的核苷酸序列，所述菌林于2007年3月16日被保藏于AgriculturalResearchCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL),保藏號為No.NRRLB-50030。全文摘要本發(fā)明公開了展示出昆蟲抑制活性的新穎的Bacillusthuringiensis晶體蛋白。通過在Lygus昆蟲膳食中提供新穎的晶體蛋白，顯著抑制了Lygus昆蟲的生長。本發(fā)明還提供了編碼晶體蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物和微生物、源于所述晶體蛋白的經(jīng)分離的肽以及針對所述晶體蛋白的抗體。本發(fā)明還公開了使用所述晶體蛋白和編碼所述晶體蛋白的多核苷酸以控制半翅目昆蟲的方法。文檔編號A23J1/00GK101686705SQ200880020577公開日2010年3月31日申請日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者G·R·海克,J·鮑姆,S·R·佩恩,S·弗拉辛斯基,U·R·蘇庫魯,石曉紅申請人:孟山都技術(shù)有限責任公司