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離體快速繁殖地烏的方法

文檔序號:566731閱讀:550來源:國知局
專利名稱:離體快速繁殖地烏的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種離體快速繁殖地烏的方法。
背景技術(shù)
地烏,其學(xué)名是林蔭銀蓮花(Anemone Flaccida Fr. Schmidt)為多年生草本,屬于毛茛科銀蓮花屬植 物,其干燥根莖稱為地烏,俗稱地烏。每年3 5月為地烏地上部生長發(fā)育時期。基生葉1一2片,長葉柄, 五角形,長2 7cm,寬3 10cm。根狀莖近圓柱形,最大直徑為lcm, 3 5年方能采收入藥。地烏野生 資源主耍分布丁長江中下游各省海拔1500 3000m的山坡林下陰濕處,鄂西山地分布相對集中。由此看來, 野生地烏分布面積有限,生長期短,生長緩慢,生物量小,屬于珍稀植物。
地烏性味溫、辛、微苦,由地烏提取物制成的銀蓮花膠囊具有祛風(fēng)濕、強筋骨、消腫止痛之功效,地 烏對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有良好的治療作用.而且毒副作用很小。由于野生地烏珍稀,對地烏進行中成藥開發(fā); 不能僅僅依靠野生資源,必須規(guī)模化人工栽培,否則,將導(dǎo)致地烏野生資源枯竭,自然生態(tài)環(huán)境遭到破壞。
通過檢驗,地烏種子活力很低,目前,在實驗室條件下很難用其種子直接發(fā)芽生產(chǎn)地烏種苗。因此, 現(xiàn)階段地烏規(guī)?;斯ぴ耘嗟姆N苗只嫩那個通過地烏的離體繁殖(組織培養(yǎng))來獲取,關(guān)于地烏的離體快 速繁殖目前國內(nèi)外文獻中尚未見報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,提出一種離體快速繁殖地烏的方法,以縮短常規(guī)育苗時間, 提高育苗效率,實現(xiàn)地烏的快速繁殖。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn) 一種離體繁殖地烏的方法,包括以下步驟 (1)外植體的選擇與消毒
1) 選擇地烏根莖帶老組織的長度為l-2cm的休眠芽和剛萌發(fā)未展開的葉片作外植體;
2) 將該外植體用如下方法進行消毒
a. 外植體為休眠芽的消毒先在自來水下將地烏根莖芽體表面的泥沙沖洗干凈,并用軟毛刷將烏根莖 芽體表面的老死組織刷洗干凈,至芽體呈現(xiàn)白色,用1.5。/。的多菌靈水溶液浸泡2h,在用自來水沖洗0.5h, 轉(zhuǎn)移至超凈工作臺,用75%酒精消毒30-60 s,無菌水沖洗l-2遍,再用0.2%升汞溶液消毒8-12 min,無菌 水沖洗4-5遍,使該外植體在每次無菌水中的沖洗時間至少保持為min,備用;
b. 外植體為剛萌發(fā)未展開的葉片的消毒將剛萌發(fā)未展開的葉片用自來水沖洗干凈,轉(zhuǎn)移至超凈T.作 臺上,用75。/。酒精消毒30s, 0.2%升汞消毒5 min,無菌水沖洗2-3遍,備用;
(2)接種與培養(yǎng)用無菌濾紙吸去所述外植體表面水分,將所述葉片切成lcmXlcm小塊;或?qū)⑿?眠芽表面的老組織切除,然后從該芽中間剖開;將所述的休眠芽或葉片的外植體接種到不定芽或擬球莖誘 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽或擬球莖;或者將所述的芽或剛萌發(fā)未展開的葉片外植體接種到胚性愈傷 組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,使其誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織;外植體培養(yǎng)條件為每天光照12h,培養(yǎng)溫度17-20。C;
光照強度3000Lux,得到地烏不定芽或擬球莖或胚性愈傷組織;
(3) 繼代、增殖與分化培養(yǎng)將步驟(2)得到的擬球莖或不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽或擬球莖增殖培養(yǎng)基 上進行增殖培養(yǎng);或?qū)⒉襟E(2)得到的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng),
進而再轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到叢生芽;繼代、增殖和分化的條件每天光照12h,培養(yǎng)溫度17-20 'C,光照強度為3000Lux;
(4) 生根培養(yǎng)將步驟(3)的擬球莖或不定芽或叢生芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)40-50d,使其生根; 培養(yǎng)條件為5'C,暗培養(yǎng);
所述培養(yǎng)基成分如下
不定芽或擬球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
不定芽或擬球莖增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8°/^1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
分化培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8%~1%瓊脂, 3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/LNAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8°/<^1°/。瓊脂,3%蔗糖,補 充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0。
為了敘述方便,在本說明書的后面部分,申請人將"休眠芽",稱之為"芽或地烏芽",將"剛萌發(fā)未 展開的葉片"稱之為"葉片或地烏葉片",其含義同上述的定義是一個意思。
本發(fā)明的效果是
(1) 本發(fā)明采用的外植體來源不受季節(jié)限制,可以周年進行地烏的組織培養(yǎng);
(2) 離體培養(yǎng)下的地烏體細(xì)胞胚可通過次生胚不斷增殖;具有良好的增殖效果;
(3) 本發(fā)明的方法對提高不定芽、擬球莖誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚分化率顯著。 更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實施方式
》。


圖la和圖lb:是以地烏剛萌發(fā)未展開的葉片為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽。 圖2a和圖2b:是以地烏休眠芽為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽。 圖3a和圖3b:是以地烏剛萌發(fā)未展開的葉片為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的擬球莖。 圖4a和圖4b:是以地烏休眠芽為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的擬球莖。 圖5:是以地烏休眠芽為外植體,經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的不同階段外植體形態(tài)
具體實施例方式
實施例1 (通用培養(yǎng)程序) 一種離體快速繁殖地烏的方法,其步驟如下(1) 外植體的選擇與消毒
1) 選擇地烏根莖帶老組織的長度為l-2cm的休眠芽和剛萌發(fā)未展開的葉片作外植體;
2) 將該外植體用如下方法進行消毒
a. 外植體為休眠芽的消毒先在自來水下將地烏根莖芽體表面的泥沙沖洗干凈,并用軟毛刷將烏根莖 芽體表面的老死組織刷洗干凈,至芽體呈現(xiàn)白色,用1.5。/。的多菌靈水溶液浸泡2h,在用自來水沖洗.Q.5h, 轉(zhuǎn)移至超凈工作臺,用75%酒精消毒30-60 s,無菌水沖洗l-2遍,再用0.2%升汞溶液消毒8-12111111,無菌 水沖洗4-5遍,使該外植體在每次無菌水中的沖洗時間至少保持為lmin,備用;
b. 外植體為剛萌發(fā)未展開的葉片的消毒將剛萌發(fā)未展開的葉片用自來水沖洗干凈,轉(zhuǎn)移至超凈工作 臺上,用75°/。酒精消毒30s, 0.2。/。升汞消毒5min,無菌水沖洗2-3遍,備用;
(2) 接種與培養(yǎng)用無菌濾紙吸去所述外植體表面水分,將所述葉片切成lcmXlcm小塊;或?qū)⑿?眠芽表面的老組織切除,然后從該芽中間剖開;將所述的休眠芽或葉片的外植體接種到不定芽或擬球莖誘 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽或擬球莖;或者將所述的芽或剛萌發(fā)未展開的葉片外植體接種到胚性愈傷 組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,使其誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織;外植體培養(yǎng)條件為每天光照12h,培養(yǎng)溫度17-2(TC, 光照強度3000Lux,得到地烏不定芽或擬球莖或胚性愈傷組織;
(3) 繼代、增殖與分化培養(yǎng)將步驟(2)得到的擬球莖或不定芽轉(zhuǎn)移到不定芽或擬球莖增殖培養(yǎng)基 上進行增殖培養(yǎng);或?qū)⒉襟E(2)得到的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng),, 進而再轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng),得到叢生芽;繼代、增殖和分化的條件每天光照12h,培養(yǎng)溫度17-20 'C,光照強度為3000Lux;
(4) 生根培養(yǎng)將步驟(3)的擬球莖或不定芽或叢生芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)40-50d,使其生根; 培養(yǎng)條件為5'C,暗培養(yǎng);
所述培養(yǎng)基成分如下
不定芽或擬球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.80/。~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
不定芽或擬球莖增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,頭孢噻訴鈉300 mg/L' 0.8%~1%瓊脂,3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
分化培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L, 0.8%~1%瓊脂, 3%蔗糖,補充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0;
生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/LNAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L' 0.8°/<^1%瓊脂'3%蔗糖'補 充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0。
生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基+0.2mg/LNAA,頭孢噻肟鈉300 mg/L' 0.8%~1%瓊脂'3%蔗糖'補 充蒸餾水至1L,調(diào)pH至5.8-6.0。
具體步驟
外植體的選擇與消毒
本發(fā)明的核心之一是對地烏外植體進行消毒,以建立地烏的無菌(消毒)培養(yǎng)體系,而該體系是本發(fā) 明之前從未見報道。
由于地烏是多年生地下根莖,共生真菌、內(nèi)生細(xì)菌多,其作為培養(yǎng)材料來源,首先要解決外植體污染 問題。在保證外植體成活的前提下,通過外植體的預(yù)處理,篩選消毒劑種類、濃度,優(yōu)化消毒方案,以及 在培養(yǎng)基中添加不同抗生素等方法,來消除組織培養(yǎng)中污染,以期建立起地烏組織培養(yǎng)無菌體系。
在選用帶有老組織材料為外植體時,不同消毒劑種類、濃度和消毒時間進行組合,用0.2%升汞消毒 9min,在保證一定成活率的同時能夠有效控制污染;為了有效控制外植體中出現(xiàn)的真菌污染,操作中對外 植體用殺菌劑進行預(yù)處理,用不同濃度的多菌靈、84消毒液(購自武漢東湖星科技公司商品)、不同處理 時間對比試驗發(fā)現(xiàn),以1.5。/。多菌靈浸泡外植體2h,能夠有效控制外植體中的真菌污染,保證操作高效進 行。
為了控制培養(yǎng)初期和培養(yǎng)后期外植體中內(nèi)生菌造成的污染,本發(fā)明進行了不同種類、濃度抗生素的組 合試驗,以頭孢噻肟鈉(華北制藥股份有限公司)300mg/L的濃度最佳,能夠控制外植體內(nèi)生菌造成的污 染,同時也不會對外植體的生長造成抑制作用,所以在本實施例的全過程的培養(yǎng)基中均添加有該抗生素。
以葉片、葉柄、根莖和帶老組織的芽為外植體,進行對比試驗,葉片和芽均能誘導(dǎo)出芽和愈傷組織, 且以芽為外植體的誘導(dǎo)率為最高。
具體操作步驟以帶部分老組織的地烏根莖芽(l-2cm)為外植體,在自來水下,將外植體表面的泥 沙清洗干凈,于1.5。/。的多菌靈水溶液中浸泡2h,將芽放入小燒杯中,將其用自來水下沖洗0.511,轉(zhuǎn)至超 凈丄作臺,置于已滅菌的100 mL三角瓶中,加入75%酒精,不停振蕩,30 s后用無菌水沖洗一遍,再將 外植體轉(zhuǎn)入另一己滅菌的100mL三角瓶中,加入0.2%的升汞,滴加2滴吐溫-20,不停振蕩,消毒7min, 棄去升汞溶液,外植體用無菌水沖洗5遍,每次沖洗時間不少于1 min,直至無菌水中無泡沫止。
葉片為外植體,將葉片用自來水沖洗干凈,轉(zhuǎn)移至超凈工作臺,用75%酒精消毒時間少于15 s, 0.2% 升汞消毒5 min。其他步驟均與芽處理相同。
2、 接種
芽接種時,按不同的接種方式進行對比試驗,接種方式有完整的芽、1/2芽(4mm)、縱切薄片(2mm) 和橫切薄片(2mm)。其中以1/2芽成活率和誘導(dǎo)率為最高。
具體操作將消毒好的外植體,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中的濾紙上,吸去表面的水分,將芽體外層老組織切除 后,從芽體中間將芽剖開,側(cè)放于培養(yǎng)基表面即可,于15-20 'C光照條件下培養(yǎng),光照強度3000 lux,光 照時間為12h/d。
以葉為外植體,接種時,進行了不同接種方式的對比,接種方式有完整未展開葉、完整展開葉背面接 觸培養(yǎng)基、完整展開葉腹面接觸培養(yǎng)基、葉片0.5cm方塊背面接觸培養(yǎng)基和葉片0.5cm方塊腹面接觸培養(yǎng) 基。其中以完整未展開葉誘導(dǎo)率和成活率為最高。
具體操作將消毒好的外植體,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中的濾紙上,吸去表面的水分'將葉柄切除,接種至培 養(yǎng)基表面即可,于15-20。C光照條件下培養(yǎng),光照強度3000 lux,光照時間為12h/d。
3、 誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)
本發(fā)明在外植體芽和葉片接種成活后,對其進行誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng),這一過程中進行了一系列的激素配
比試驗。其中不定芽或擬球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳配方為MS基本培養(yǎng)基+2.0 mg/L6-節(jié)氨基嘌呤(6-BA) +0.2 mg/L萘乙酸(NAA),同時此培養(yǎng)基也是不定芽和擬球莖增殖培養(yǎng)基。胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配 方為MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L6-BA十1.0mg/LNAA,胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。
步驟是外植體(地烏芽或葉片)接種于不定芽或擬球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每30d用同樣的培養(yǎng)基繼代 一次,培養(yǎng)初代芽體開始膨大,表面輕微愈傷化,形成瘤狀的小突起,50d左右,開始產(chǎn)生嫩綠色新芽。 外植體在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)45d左右,在外植體傷口處,產(chǎn)生胚性愈傷組織,將胚性愈傷組 織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng),使其迅速增殖。
4、生根培養(yǎng)
本發(fā)明在根的誘導(dǎo)試驗過程中,進行了激素種類、濃度和培養(yǎng)條件的試驗,以1/2MS基本培養(yǎng)基+0.2 mg/LNAA (成分參見生根培養(yǎng)基),5'C,暗培養(yǎng)為最佳組合。
步驟是將離體培養(yǎng)的不定芽和擬球莖,轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)(1/2MS基本培養(yǎng)基+0.2 mg/LNAA),在5'C下暗培養(yǎng)40d后長出根,煉苗后移栽。
本發(fā)明可以快速繁殖地烏組培苗。本發(fā)明操作簡便,分化指數(shù)高。通過組織培養(yǎng)可快速生產(chǎn)地烏繁殖 體,是一種投資少、見效快的組培苗生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明可以保持地烏自身優(yōu)良的生藥學(xué)特性,以用于地烏 中成藥的開發(fā),具有可觀的經(jīng)濟效益。同時,應(yīng)用本發(fā)明可有效保護野生地烏資源,具有良好的生態(tài)效益;
實施例2
試驗材料選擇、培養(yǎng)基設(shè)計與接種培養(yǎng) 1、實驗材料來源及其處理
選用來自湖北省長陽土家族自治縣麻池銅鼓包海拔1800米左右山區(qū)野生地烏根狀莖作為試驗材料。 使用前,將地烏根狀莖用申請人在先的發(fā)明專利中請(專利申請?zhí)?200810047075.X,
發(fā)明者張忠池, 方賢東, 朱端衛(wèi), 李宏飛, 楊特武, 俊 王, 耿明建, 龍 辛, 黃漫翔 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
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