專利名稱：一種提高l-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法
一種提高L-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高L-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的 方法，屬于發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的常用 菌株。在谷氨酸生產(chǎn)菌生物合成的代謝途徑已經(jīng)清楚的前提下，理論上通過
計算可以得出L-谷氨酸生產(chǎn)的得率在0.817gL-谷氨酸/g葡萄糖，而目前實際得 率僅有約0.50-0.58gL-谷氨酸/g葡萄糖，較理論值有較大的差距，所以仍具有 很大的研究空間。但是，提高糖酸轉(zhuǎn)化率相對于提高產(chǎn)率而言卻有相當(dāng)大的 難度。
近年來，代謝工程領(lǐng)域的研究結(jié)果表明，在谷氨酸生產(chǎn)菌中，糖酵解途 徑(EMP)相對于三羧酸循環(huán)(TCA)過量，即EMP通量超出了TCA代謝的 能力，造成碳"溢流"以及過量ATP的合成。那么，連接EMP和TCA的丙酮 酸會發(fā)生積累，并且會通過其他途徑進(jìn)行代謝以緩解持續(xù)的"溢流"。因此， 過量碳的溢流會導(dǎo)致有機(jī)酸和其他物質(zhì)的生成。在谷氨酸棒桿菌中，分析葡 萄糖在胞內(nèi)的代謝途徑，明顯可以看到產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸的生物合成過程中，HMP 途徑所提供的能量是十分重要的，這樣代謝流在EMP、 TCA和HMP之間的合 理分配就成為提高L-谷氨酸產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的前提。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明采用在培養(yǎng)基中添加一定量的擰檬酸或其鹽、蘋果酸或 其鹽的方法來提高谷氨酸生產(chǎn)菌L-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。
檸檬酸或檸檬酸鹽可以抑制丙酮酸激酶的活性，減少丙酮酸的積累，造 成磷酸烯醇式丙酮酸的積累。磷酸烯醇式丙酮酸是EMP途徑限速酶磷酸果糖 激酶的抑制劑，所以磷酸烯醇式丙酮酸的積累降低了磷酸果糖激酶的活性，從而降低了EMP途徑的通量，緩解了EMP和TCA之間的代謝溢流。同時，葡 萄糖總通量沒有變化，所以更多的葡萄糖進(jìn)入HMP途徑生成了L-谷氨酸合成 所必需的能量，相應(yīng)的提高了L-谷氨酸的糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。
蘋果酸作為乙醛酸循環(huán)的終產(chǎn)物，對催化乙醛酸循環(huán)第一步反應(yīng)的異擰 檬酸裂解酶有一定的反饋抑制作用，故其適量添加可使一部分乙醛酸循環(huán)的 代謝流向著繼續(xù)TCA循環(huán)的方向發(fā)生遷移，使異檸檬酸更多的生成a -KG, 進(jìn)而更多的生成L-谷氨酸，而非合成乙醛酸和琥珀酸。同時，添加蘋果酸可 以增加HMP途徑代謝流量，減弱EMP途徑代謝流量。而EMP途徑向HMP途徑 發(fā)生的代謝流遷移，使HMP途徑的流量增加，從而增加了作為L-谷氨酸合成 中心代謝途徑中關(guān)鍵反應(yīng)所需還原力的NADPH的量，進(jìn)而使更多的代謝流流 向L-谷氨酸。此外，蘋果酸作為TCA循環(huán)的主要產(chǎn)物之一，其添加會對作為 TCA循環(huán)限速酶的檸檬酸合成酶的活性產(chǎn)生一定抑制作用，從而限制TCA循 環(huán)代謝流量過多，減少C02的生成，進(jìn)而避免了碳架的大量浪費。
此方法在不增加額外設(shè)備和人力投入的情況下，實現(xiàn)了整個發(fā)酵周期的 縮短和L-谷氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的大幅提高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
本發(fā)明提供的一種提高L-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法，其 特征是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽、蘋果酸或其鹽，使其在培養(yǎng)基 中的濃度均為0.01 10g/L，優(yōu)選0.05-5 g/L，更優(yōu)選0.1~3 g/L。其中所說的 擰檬酸鹽為擰檬酸鈉或檸檬酸鉀，蘋果酸鹽為蘋果酸鈉或蘋果酸鉀。
本發(fā)明根據(jù)調(diào)整代謝流分配的原理提出了適用于提高谷氨酸生產(chǎn)菌L-谷 氨酸發(fā)酵過程中糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法，它通過降低丙酮酸激酶和磷酸果 糖激酶的活力，減弱糖酵解途徑通量，降低有機(jī)酸的合成，緩解EMP和TCA之間的代謝溢流，使更多的葡萄糖進(jìn)入HMP途徑生成了 L-谷氨酸合成所必 需的能量，從而在糖耗相同的基礎(chǔ)上，合成較多的L-谷氨酸，即提高了糖酸
轉(zhuǎn)化率。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，所舉之例并不限制本發(fā)明的 保護(hù)范圍 實施例l:
采用的菌株為谷氨酸棒桿菌或鈍齒棒桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的 發(fā)酵培養(yǎng)基[葡萄糖8%、甘蔗糖蜜0.1%、玉米漿0.4%、 MgS04.7H20 0.15%、 Na2HP(V12H20 0.2%、 KC1 0.1%、 MnS04 0細(xì)1%、 FeS04 0.0001%、 VB1
0.0000ln/。]中添加0.1g/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法將菌種接入種子培養(yǎng)基[葡萄糖
2.5%、玉米漿3%、 K2HP04.3H20 0.2%、 MgS04'7H20 0,1%、尿素0.025%] 中，接種量為5%;在32t:、 pH為7.0和溶氧為20y。條件下于5L自動控制發(fā)酵 罐中培養(yǎng)6h至對數(shù)期，按10。/。的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動控制發(fā) 酵罐中，控制發(fā)酵液溫度采用順序提溫模式0 5h為34"C， 5 10h為35。C, 10 18h為36。C， 18 26h為37X:，26 32h為38T:，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌 轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式控制溶氧0~1011為20%， 10 32h為5。/Q，通過自 動流加氨水控制pH在7.0 7.2,通過流加適量泡敵消泡，并通過流加濃度為 800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?.0M，發(fā)酵至32h停止。放罐時，L-谷氨酸 的產(chǎn)量為150.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為60.0%，分別比對照實驗(L-谷氨酸產(chǎn)量為 130.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為50.0%)提高了15.4%和20.0%。
實施例2:
采用的菌株為谷氨酸棒桿菌或鈍齒棒桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例l)中添加3.0g/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法同實施例l。放
罐時，L-谷氨酸的產(chǎn)量為156.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為62.0%，分別比對照實驗(L-谷氨酸產(chǎn)量為130.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為50.0°/。)提高了20.0°/0和24.0°/0。
實施例3:
采用的菌株為黃色短桿菌或天津短桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā) 酵培養(yǎng)基(同實施例l)中添加0.10g/L蘋果酸；培養(yǎng)方法同實施例l。放罐時， L-谷氨酸的產(chǎn)量為152.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61.0%，分別比對照實驗(L-谷氨 酸產(chǎn)量為130.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為50.0%)提高了16.9%和22.0%。 實施例4:
采用的菌株為黃色短桿菌或天津短桿菌；培養(yǎng)基為在現(xiàn)有普遍采用的發(fā) 酵培養(yǎng)基(同實施例l)中添加3.0g/L蘋果酸；培養(yǎng)方法同實施例l。放罐時， L-谷氨酸的產(chǎn)量為155.0g^，糖酸轉(zhuǎn)化率為64.0%，分別比對照實驗(L-谷氨 酸產(chǎn)量為130.0g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為50.0%)提高了19.2°/。和28.0%。
權(quán)利要求
1. 一種提高L-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法，其主要步驟為采用谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等谷氨酸生產(chǎn)菌經(jīng)發(fā)酵獲得L-谷氨酸，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽、蘋果酸或其鹽，使其在培養(yǎng)基中的濃度均為0.01～10g/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸或其鹽的濃度為0.05 5g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸或其鹽的濃度為0.1 3g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的蘋果酸或其鹽的 濃度為0.05 5 g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是其中所說的蘋果酸或其鹽的 濃度為0.1~3 g/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5所述的任意一種方法，其特征是其中所說的檸檬 酸鹽為檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1~5所述的任意一種方法，其特征是其中所說的蘋果酸鹽為蘋果酸鈉或蘋果酸鉀。
全文摘要
一種提高L-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率的方法。本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法制備L-谷氨酸的改進(jìn)方法。本發(fā)明根據(jù)調(diào)整細(xì)胞代謝流分配的原理，采用在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽、蘋果酸或其鹽的方法，來有效提高L-谷氨酸發(fā)酵過程糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。
文檔編號C12P13/14GK101445817SQ20081015445
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日 公開號200810154451.發(fā)明者劉淑云, 翔 宋, 徐慶陽, 謝希賢, 寧 陳 申請人:天津科技大學(xué)