專(zhuān)利名稱：檢測(cè)探針、通用寡核苷酸芯片及核酸檢測(cè)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)探針、通用寡核苷酸芯片及核酸檢測(cè)方法，特別是 涉及一種用于核酸檢測(cè)及序列分析的核酸檢測(cè)方法及其所使用的檢測(cè)探 針、通用寡核苷酸芯片。
背景技術(shù)：
基因突變是指基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生堿基對(duì)組成或排列順 序的改變，主要包括堿基的替換和小片段的缺失或插入，它是導(dǎo)致基因型疾 病的重要原因之一。而多態(tài)性是指在進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)在人群中積累起來(lái)的 DNA序列變化?；蛲蛔兗岸鄳B(tài)性分析在生物醫(yī)學(xué)研究中，尤其是在基因型 疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。隨著人類(lèi)基因組整體測(cè)序計(jì) 劃的發(fā)展，探索基因突變及多態(tài)性的任務(wù)變得十分迫切。
測(cè)定基因突變的方法很多，最經(jīng)典的基因突變檢測(cè)技術(shù)是核酸分子雜 交.傳統(tǒng)的核酸分子雜交方法有膜上印跡雜交(如Southern印跡、Northern 印跡)和細(xì)胞原位雜交等.由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)的高度靈 敏性，它的應(yīng)用對(duì)分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展起著重要的推動(dòng)作用.但由于傳統(tǒng) 的核酸分子雜交方法整個(gè)過(guò)程繁雜，操作步驟多，特別是探針往往用放射性 物質(zhì)標(biāo)記，容易對(duì)人體造成傷害。因此，迫切需要新的、快速、安全的檢測(cè) 分析技術(shù).
自19 8 5年P(guān)CR技術(shù)問(wèn)世以后，由于它具有強(qiáng)大的DNA體外擴(kuò)增能力，與 核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合,使其敏感性和特異性都大大增強(qiáng).因此基因突變 檢測(cè)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，不斷衍生出許多新的檢測(cè)手段和技術(shù).它們中 的許多方法適合于點(diǎn)突變的枱二測(cè)，亦應(yīng)用于檢測(cè)SNPs.目前常用于基于PCR 技術(shù)的檢測(cè)方法包括:檢測(cè)已知突變和SNPs的方法有等位基因特異性寡核 苦酸雜交(AS0)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、 TaqMan技術(shù)，多聚酶鏈限制性長(zhǎng)度 多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、短串聯(lián)重復(fù)長(zhǎng)度多態(tài)性(STR)等；檢測(cè)未知突變的 方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、異源雙鏈多態(tài)性分析(HPA)、 MALDI-T0F質(zhì) 譜分析(matrix assisted laser desorptionion Ization time of flight mass spectrometry),變性梯度凝膠電泳(DGGE)、酶促切割錯(cuò)配(EMC)、雙 脫氧指紋圖鐠法(ddF)以及DNA測(cè)序法等.這些方法的特點(diǎn)、原理及應(yīng)用已 有許多報(bào)道.雖然這些方法能夠檢測(cè)突變是否存在，但大多數(shù)方法不能確定 突變的類(lèi)型并且只能檢測(cè)到SNP的一部分；同時(shí)大多數(shù)方法如瓊脂糖凝膠電 泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細(xì)管電泳，高效液相色譜等需要PCR后處理等檢測(cè)手段才能分析判斷結(jié)果，而且結(jié)果判斷比較復(fù)雜.此外，上述大多數(shù)檢測(cè) 技術(shù)處理過(guò)程復(fù)雜， 一次只能檢測(cè)少量樣品，很難滿足自動(dòng)化的需要.
DNA測(cè)序法是最根本的一種檢測(cè)突變的方法，其雖然能準(zhǔn)確確定突變的
部位及性質(zhì)，但目前以凝膠電泳為基礎(chǔ)的測(cè)序技術(shù)費(fèi)時(shí)，自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序費(fèi) 用高，限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。
生物微陣列(或稱生物芯片)技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的快速、高通量的檢
測(cè)工具，它利用^f鼓點(diǎn)陣技術(shù)，將成千上萬(wàn)的生物組分(細(xì)胞、蛋白質(zhì)和DNA 等)排列在固相基質(zhì)上，生物樣品中被檢測(cè)組分與基質(zhì)上特定物質(zhì)反應(yīng)， 然后引入相應(yīng)的信號(hào)(如熒光)達(dá)到對(duì)生物樣品分析的目的。生物微陣列 技術(shù)使一些傳統(tǒng)的生物學(xué)分析手段能夠在盡量小的空間范圍內(nèi)，以盡量快 的速度完成。目前，生物芯片技術(shù)飛速發(fā)展，包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、 組織芯片、細(xì)胞芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室等多種芯片技術(shù)已經(jīng)被研究者用于大規(guī) 模突變檢測(cè)和多態(tài)性篩選.
目前，有多種基于DM芯片的方法及專(zhuān)利技術(shù)用于基因突變檢測(cè)(如 SNPs檢測(cè))及核酸測(cè)序分析，如在以基于核酸雜交反應(yīng)，單i成基延伸反應(yīng) (Nikiforov et al.， 1994; Bell et al. ， 2002),等位基因特異性引物延 伸和連接反應(yīng)(Gunderson et al. ， 2005; Landegren et al. ， 1988)，引 物連接反應(yīng)(Weiguo Cao, Clinical and Applied Immunology Reviews 2 2001: 33 - 43 ),限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，鎖式探針?lè)磻?yīng)(xiaoquan Qi， Nucleic Acids Research, 2001， Vol. 29， No. 22 e116)等原理的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了諸如 貝克曼公司的 SNP通量分析系統(tǒng)(SNPStream assay (Orchid Cellmark/Beckman Coulter)),伊3各明納7>司的GoldenGate多重位點(diǎn)特異 性延伸擴(kuò)增分型系統(tǒng)(GoldenGate genotyping assay (Illumina)), 昂 飛7>司的人全基因纟且圖"i普分;f斤系統(tǒng)(GeneChip Human Mapping assays (Affymetrix))，伊3各明納7^司的Infinium基因分型系統(tǒng)(Infinium genotyping assay (Illumina))，昂飛公司的藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體目標(biāo)基 因分型系統(tǒng)(Targeted Genotyping System for drug metabol izing enzymes and transports (廳Ts) analysis (Affymetrix))等突變(如SNPs )檢 測(cè)平臺(tái)，另外在相關(guān)的專(zhuān)利技術(shù)如US 5427930， US 6479242， WO9300447, US 5871921, US 6858412， US 5866337等中對(duì)相關(guān)的基因突變檢測(cè)(如 SNPs檢測(cè))及核酸測(cè)序分析也有所介紹。
這些方法雖然都有自身的一些優(yōu)勢(shì)，但是也都存在各自的缺陷，如基 于直接核酸雜交反應(yīng)的芯片技術(shù)，其非特異性雜交導(dǎo)致分辨率不高，易產(chǎn) 生假陽(yáng)性結(jié)果；基于單堿基延伸反應(yīng)和等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯 片技術(shù)均需要多色熒光系統(tǒng)及需要對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增、制備和純化等步驟， 從而使大規(guī)模的突變檢測(cè)工作費(fèi)時(shí)耗力等。有鑒于上述現(xiàn)有的基因突變檢測(cè)(如SNPS檢測(cè))及核酸測(cè)序分析方法 存在的缺陷，本發(fā)明人基于從事此類(lèi)產(chǎn)品設(shè)計(jì)制造多年豐富的實(shí)務(wù)經(jīng)驗(yàn)及
專(zhuān)業(yè)知識(shí)，并配合學(xué)理的運(yùn)用，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種新的抬r 測(cè)探針、通用寡核苦酸芯片及核酸檢測(cè)方法，能夠改進(jìn)一般現(xiàn)有的基因突 變檢測(cè)及核酸測(cè)序分析方法，使其更具有實(shí)用性。經(jīng)過(guò)不斷的研究、設(shè)計(jì)， 并經(jīng)過(guò)反復(fù)試作樣品及改進(jìn)后，終于創(chuàng)設(shè)出確具實(shí)用價(jià)值的本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于，克服現(xiàn)有的基因突變檢測(cè)及核酸測(cè)序分析方 法存在的缺陷，而提供一種新的檢測(cè)探針、通用寡核苦酸芯片及核酸檢測(cè) 方法，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是使其能夠達(dá)到低成本、高特異性、高靈敏度 的目的，非常適于實(shí)用。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。依據(jù) 本發(fā)明提出的一種檢測(cè)探針，其特征在于其是由針對(duì)各個(gè)待測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè) 探針對(duì)Pl， P2組成的，Pl和P2分別含有與待測(cè)堿基位點(diǎn)兩側(cè)的序列互補(bǔ) 的序列Hl和H2, 并各含有一條相關(guān)的通用寡核苷酸序列H3和H4，且在 Pl或P2上至少還含有某個(gè)特定的Tag序列，所述的檢測(cè)探針對(duì)Pl和P2通 過(guò)下述方法連接成為一條探針將檢測(cè)探針對(duì)Pl和P2與待測(cè)核酸樣本退 火雜交，通過(guò)H1和H2與待測(cè)堿基位點(diǎn)兩側(cè)的序列互補(bǔ)，在4冢針P1和P2 間形成與待測(cè)堿基位點(diǎn)處的石咸基相對(duì)應(yīng)的缺口 ，將退火后的反應(yīng)體系均分 成A、 、 T、 G、 C四個(gè)反應(yīng)體系，在A體系中加入dATP，在T體系中加入 dTTP,在G體系中加入dGTP，在C體系中加入dCTP,與待測(cè)石威基位點(diǎn)處的 堿基互補(bǔ)的堿基在DM聚合酶和連接酶的作用下就會(huì)填充上述缺口 ，將檢 測(cè)探針對(duì)Pl和P2連接成為一條探針。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。
前述的檢測(cè)探針，其中所述的檢測(cè)探針對(duì)還包括另一條探針P2，，且該 探針含有與待測(cè)堿基位點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)的序列Hl或H2， 一條相關(guān)的通用 寡核苷酸序列H3或H4,某個(gè)特定的Tag序列及與待測(cè)樣本插入型位點(diǎn)的插 入序列互補(bǔ)的序列H5。
前述的檢測(cè)探針，在探針Pl或P2上至少還含有生物素標(biāo)記分子，且 該生物素標(biāo)記分子與探針的核苷S臾序列之間還包含有一段連接臂。
前述的檢測(cè)探針，其中所述的連接臂為碳連接臂，或非碳類(lèi)型的連接臂。
前述的檢測(cè)探針，其中所述的非碳類(lèi)型的連接臂為聚乙二醇、polyA、 polyT。前述的檢測(cè)探針，其可應(yīng)用于對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測(cè)序分析、對(duì)已 知核酸序列中的突變位點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行沖企測(cè)分析及病原微生物的
分型^r測(cè)領(lǐng)i或。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題還可以采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 依據(jù)本發(fā)明提出的一種通用寡核苷酸芯片，其包含分成A, T， G, C四個(gè)相 同的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)的各個(gè)位點(diǎn)上分別點(diǎn)制與對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針上的Tag 序列相同的寡核苷酸序列。
前述的通用寡核普酸芯片，其可以應(yīng)用于對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測(cè)序 分析、對(duì)已知核酸序列中的突變位點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析及病原 微生物的分型檢測(cè)領(lǐng)域。
本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題另外還采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。為 達(dá)到上述目的，依據(jù)本發(fā)明提出的一種基于通用寡核苷酸微陣列的核酸檢 測(cè)方法，其包括以下步驟①待測(cè)核酸樣本的制備；②檢測(cè)探針的制備， 所述探針是由針對(duì)各個(gè)待測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)探針對(duì)Pl和P2組成的，Pl和P2分 別含有與待測(cè)堿基位點(diǎn)兩側(cè)的序列互補(bǔ)的序列Hl和H2,并各含有一條相關(guān) 的通用寡核苷酸序列H3和H4，且在Pl或P2上至少還含有某個(gè)特定的Tag 序列；③將各探針對(duì)Pl和P2與核酸樣本退火雜交，在探針間形成與待測(cè) 堿基位點(diǎn)處的堿基相對(duì)應(yīng)的缺口；④將退火后的反應(yīng)體系均分成A、 G、 T、 C四個(gè)反應(yīng)體系，在A體系中加入dATP，在T體系中加入dTTP，在G體系 中加入dGTP,在C體系中加入dCTP,在DNA聚合酶和連接酶的作用下，與 待測(cè)堿基位點(diǎn)處的堿基互補(bǔ)的堿基就會(huì)填充上述缺口，將檢測(cè)探針對(duì)P1和 P2連接成為一條探針；⑤純化上述連接的探針； 擴(kuò)增純化出的探針；⑦ 通用寡核苷酸芯片的制備，將每張芯片分成A， T， G, C四個(gè)雜交區(qū)域，每 個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)的各個(gè)位點(diǎn)上分別點(diǎn)制與對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針Pl或P2上的Tag序 列相同的寡核苷酸序列；⑧將上述寡核苷酸芯片的A, T， G， C四個(gè)雜交區(qū) 域用來(lái)分別和擴(kuò)增后的四個(gè)反應(yīng)體系中的探針進(jìn)行雜交；⑨對(duì)芯片進(jìn)行結(jié) 果檢測(cè)分析。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的檢測(cè)探針的制備步驟中，還包括另 一條探針P2，， 該探針含有與待測(cè)堿基位點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)的序列Hl或 H2, —條相關(guān)的通用寡核苷酸序列H3或H4，某個(gè)特定的Tag序列及與待測(cè) 樣本插入型位點(diǎn)的插入序列互補(bǔ)的序列H5。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的待測(cè)核酸樣本為動(dòng)植物染色體DNA、 目標(biāo)核酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、線粒體DNA、 cDNA、細(xì)菌或者病毒DNA或RNA。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的檢測(cè)探針Pl或P2的不發(fā)生連接反 應(yīng)的一端至少還含有生物素標(biāo)記分子，且該生物素標(biāo)記分子與探針的核苷 酸序列之間還含有一段連接臂，有利于后續(xù)的探針純化和擴(kuò)增。前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的連接臂為碳連接臂、聚乙二醇、polyA 或者polyT。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的探針的純化步驟是采用鏈親和素包 被載體介質(zhì)來(lái)完成的。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的載體介質(zhì)為磁性微?；蛘呔郾揭蚁?微球。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的探針的擴(kuò)增步驟是利用通用引物進(jìn) 行的對(duì)稱或不對(duì)稱PCR擴(kuò)增。
前述的核酸檢測(cè)方法，如果利用通用引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，則在其 中至少在一條通用引物的5，端還含有分子標(biāo)記。如果利用通用引物進(jìn)行不 對(duì)稱PCR擴(kuò)增，則通用引物中至少有一個(gè)為限制性引物，另一個(gè)為非限制 性引物，且在非限制性引物的5，端至少還含有分子標(biāo)記。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的分子標(biāo)記為非同位素標(biāo)記或放射性 同4立素才示"i己。
前述的核酸;f企測(cè)方法，其中所述的非同位素標(biāo)記為焚光物質(zhì)標(biāo)記如焚 光素分子(cy3，cy5，F(xiàn)ITC)，金屬標(biāo)記如Hg，半抗原標(biāo)記如地高辛，酶類(lèi)如 辣根過(guò)氧化物酶(HRP),半乳糖苷酶，堿性磷酸酶等。
前述的核酸沖企測(cè)方法，其中所述的放射性同位素標(biāo)記為32p或35s 。
前述的核酸檢測(cè)方法，其中所述的對(duì)芯片進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)分析的步驟是 對(duì)芯片進(jìn)行單色熒光掃描并根據(jù)芯片上四個(gè)分區(qū)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上的熒光信號(hào)出 現(xiàn)情況確定檢測(cè)結(jié)果，或者對(duì)芯片進(jìn)行酶顯色的方法確定檢測(cè)結(jié)果。
前述的核酸^r測(cè)方法，其可應(yīng)用于對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測(cè)序分析、 對(duì)已知核酸序列中的突變位點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析及病原微生 物的分型^r測(cè)領(lǐng)域。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益效果。本發(fā)明所提出的 基于通用寡核苷酸4鼓陣列的核酸檢測(cè)方法，使用4企測(cè)探針對(duì)Pl和P2對(duì)核 酸序列中的某個(gè)堿基位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，此兩條探針的5，端和3，端的一段序 列分別與待測(cè)堿基位點(diǎn)左右兩側(cè)的核酸序列互補(bǔ)，當(dāng)探針和模板退火雜交 后，就在待測(cè)堿基位點(diǎn)處形成一個(gè)堿基的缺口，并且因?yàn)闄z測(cè)是在四個(gè)反 應(yīng)管中進(jìn)行的，所以只有當(dāng)在每個(gè)反應(yīng)管中加入的 一種脫氧核糖核苷酸與 在此反應(yīng)管中待測(cè)堿基位點(diǎn)處的堿基互補(bǔ)時(shí)，才能夠在DNA聚合酶的作用 下被引入從而補(bǔ)平缺口，然后，再在DM連接酶的作用下把兩條探針P1和 P2連接成為一條探針，從而才能夠進(jìn)行下一步探針的純化和擴(kuò)增步驟。此 外，本發(fā)明以通用芯片技術(shù)為基礎(chǔ)，將芯片分為四個(gè)區(qū)，點(diǎn)制在芯片上每 個(gè)區(qū)特定位點(diǎn)上的Tag序列都是一樣的。在雜交時(shí)，四個(gè)反應(yīng)管中的擴(kuò)增 體系分別與芯片上的四個(gè)區(qū)進(jìn)行獨(dú)立雜交，最后用單色熒光掃描儀來(lái)完成芯片的掃描，根據(jù)芯片上四個(gè)區(qū)的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上熒光信號(hào)的有無(wú)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)
結(jié)果的分析，非常簡(jiǎn)單。同時(shí)在微陣列上選用通用Tag序列能夠排除對(duì)序
列特異性探針和微陣列雜交的條件選擇和優(yōu)化。
借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明一種新的檢測(cè)探針、通用寡核苷酸芯片及
核酸;險(xiǎn)測(cè)方法，具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果
1. 成本低。在本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法中，從以下幾方面都降低了核酸 檢測(cè)的成本首先，采用一對(duì)通用引物能夠?qū)λ械臋z測(cè)探針進(jìn)行擴(kuò)增， 節(jié)省了進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增時(shí)要根據(jù)靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)和優(yōu)化大量擴(kuò)增引物的費(fèi) 用；其次，本方法以通用寡核苷酸芯片技術(shù)為基礎(chǔ)，采用存在于檢測(cè)探針 上和點(diǎn)制在芯片特定位點(diǎn)上的Tag序列用來(lái)對(duì)待測(cè)位點(diǎn)進(jìn)行定位分析，避 免了對(duì)序列特異性探針和微陣列雜交的條件的選擇和優(yōu)化費(fèi)用；再次，本 方法在通用引物P3或P4的5，端進(jìn)行熒光素cy3、 cy5或FITC標(biāo)記從而在
探針擴(kuò)增時(shí)引入單色熒光標(biāo)記對(duì)待測(cè)堿基位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，使得檢測(cè)所需的 掃描及結(jié)果分析設(shè)備的成本進(jìn)一 步降低。
2. 特異性強(qiáng)。在本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法中，檢測(cè)探針對(duì)P1和P2特異 性的識(shí)別待測(cè)核酸樣本模板，在分離的四個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)Pl和P2探針形 成的缺口進(jìn)行填充和連接，通過(guò)磁粒純化經(jīng)連接的探針，這些步驟都使得 該方法具有很高的特異性。
3. 靈敏度高。在本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法中，不是采用直接對(duì)靶標(biāo)序列 進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增來(lái)放大檢測(cè)信號(hào)，而是在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)時(shí)將一對(duì)通用引 物P3和P4的相關(guān)序列引入了所有檢測(cè)探針對(duì)Pl和P2序列之中，并且， 在擴(kuò)增時(shí)，以P3和P4為通用引物，進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，不但形成便于 和芯片雜交的單鏈，而且克服了基于多重PCR方法的隨著目標(biāo)序列的增加 導(dǎo)致的不可控的交叉反應(yīng)性，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。
4. 高通量的檢測(cè)能力?；诒景l(fā)明的核酸檢測(cè)方法特有的檢測(cè)探針的 設(shè)計(jì)方法、擴(kuò)增體系和芯片設(shè)計(jì)法，使其具有高通量的檢測(cè)能力，且由于 獨(dú)特的芯片設(shè)計(jì)體系，有利于新的待檢測(cè)位點(diǎn)還可以很容易的加入到芯片 陣列中。
綜上所述，本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)線性檢測(cè)探針對(duì)Pl和P2對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)堿 基或突變位點(diǎn)的高通量檢測(cè)。在探針和模板退火雜交后，將其平均分成A、 G、 T、 C四個(gè)反應(yīng)體系，分別加入一種對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸一dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP，之后在DNA聚合酶和連4妻酶的作用下，在四個(gè)反應(yīng)體系中將 相應(yīng)的檢測(cè)探針對(duì)Pl和P2連接成為一條探針，再經(jīng)鏈親和素磁性微粒將 連接后的探針純化出來(lái)，再經(jīng)單色熒光標(biāo)記的一對(duì)通用核酸序列進(jìn)行不對(duì) 稱PCR擴(kuò)增使信號(hào)放大用于和芯片進(jìn)行雜交。本發(fā)明中芯片的設(shè)計(jì)為分別 對(duì)應(yīng)于A、 G、 T、 C四個(gè)反應(yīng)體系而"i殳定A、 G、 T、 C四個(gè)分區(qū)與四個(gè)反應(yīng)體系中的最后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行獨(dú)立雜交，經(jīng)清洗，用單色熒光掃描儀掃描 并根據(jù)芯片上四個(gè)分區(qū)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上信號(hào)的有無(wú)進(jìn)行信號(hào)分析確定待測(cè)位點(diǎn) 堿基類(lèi)型或突變位點(diǎn)基因型。
本發(fā)明具有上述諸多優(yōu)點(diǎn)及實(shí)用價(jià)值，其不論在方法或功能上皆有較 大的改進(jìn)，在技術(shù)上有顯著的進(jìn)步，并產(chǎn)生了好用及實(shí)用的效果，且較現(xiàn) 有的基因突變檢測(cè)及核酸測(cè)序分析方法具有增進(jìn)的突出多項(xiàng)功效，從而更 加適于實(shí)用，誠(chéng)為一新穎、進(jìn)步、實(shí)用的新設(shè)計(jì)。
上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的 技術(shù)手段，而可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述和 其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實(shí)施例，并配合附 圖，詳細(xì)說(shuō)明如下。


圖U-圖1B為本發(fā)明通用寡核香S吏微陣列的核酸檢測(cè)方法一實(shí)施例的 檢測(cè)探針的示意圖。
圖2A-圖2F為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸檢測(cè)方法的流程示意圖。
圖3為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸4企測(cè)方法的芯片示意圖。
圖4為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸檢測(cè)方法用于核酸序列重測(cè) 序的芯片結(jié)果分析示意圖。
圖5為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸檢測(cè)方法用于SNP位點(diǎn)檢測(cè) 的芯片結(jié)果分析示意圖。
圖6A-圖6C為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸檢測(cè)方法另一實(shí)施例 的檢測(cè)探針的示意圖。
圖7A-圖7D為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核S吏;險(xiǎn)測(cè)方法另一實(shí)施例 的核酸檢測(cè)方法的流程示意圖。
圖8為本發(fā)明通用寡核苦酸微陣列的核酸檢測(cè)方法用于插入/缺失位點(diǎn) 檢測(cè)的芯片結(jié)果分析示意圖。
圖9A -圖9C為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸檢測(cè)方法對(duì)存在于克 隆人基因組P4 5 0藥物代謝酶基因片段上的突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證電泳 圖。
圖10是本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸-險(xiǎn)測(cè)方法對(duì)存在于克隆人基 因組P450藥物代謝酶基因片段上的突變位點(diǎn)進(jìn)行芯片雜交后的結(jié)果掃描 圖。
具體實(shí)施例方式
為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的檢測(cè)探針、通用寡核 普酸芯片及核酸檢測(cè)方法及其用途其具體實(shí)施方式
、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，
"^細(xì)"i兌明長(zhǎng)口后。
本發(fā)明的原理在于，以通用寡核苷酸基因芯片為基礎(chǔ)，通過(guò)設(shè)計(jì)線性 檢測(cè)探針對(duì)Pl和P2對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)堿基或突變位點(diǎn)的高通量檢測(cè)。在探針 和模板退火雜交后將反應(yīng)分成A、 G、 T、 C四個(gè)體系，在DNA聚合酶和連接 酶的作用下完成探針Pl和P2的連接，經(jīng)過(guò)純化和擴(kuò)增及熒光信號(hào)的引入 后，與芯片上對(duì)應(yīng)的A、 G、 T、 C四個(gè)雜交區(qū)域雜交。而芯片上的四個(gè)區(qū)域 不同的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)都點(diǎn)制有和探針上相應(yīng)的Tag序列。雜交后清洗芯片，用 單色熒光掃描儀掃描并根據(jù)芯片上四個(gè)分區(qū)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上信號(hào)的有無(wú)進(jìn)行信 號(hào)分析確定待測(cè)位點(diǎn)堿基類(lèi)型或突變位點(diǎn)基因型。
圖1A-圖1B為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸檢測(cè)方法一實(shí)施例的 檢測(cè)探針的示意圖，對(duì)于某個(gè)待測(cè)堿基位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，檢測(cè)所需探針的設(shè)計(jì)方 法為用兩條線性探針Pl和P2對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，所設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列詳 細(xì)i兌明3o下。
請(qǐng)參閱圖1A所示，為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的探針P1的寡核苷酸序列，該序 列由Hl， H3和連接臂(spacer)三部分組成，其中在探針Pl的5，端的 H3為一段20nt左右的通用寡核苷酸序列，用來(lái)對(duì)用于對(duì)探針進(jìn)行對(duì)稱或不 對(duì)稱PCR擴(kuò)增；探針Pl的3，端的Hl為一段20nt左右的與模板上待測(cè)石威 基位點(diǎn)一側(cè)的核酸序列互補(bǔ)的序列；此外，為了對(duì)探針進(jìn)行純化以便于后 續(xù)操作，在探針P1的5，端還有生物素標(biāo)記分子；為了利于對(duì)探針進(jìn)行純 化和PCR擴(kuò)增，在生物素標(biāo)記分子和探針Pl的5，端核苷酸之間設(shè)計(jì)有一 段連接臂，此連接臂可以為碳連接臂，也可以是其它類(lèi)型的連接臂。
請(qǐng)參閱圖1B所示，為本發(fā)明所設(shè)計(jì)的探針P2的寡核苷酸序列由H2， H4 和tag三部分組成，其中在探針P2的5，端的20 nt左右的序列為與待測(cè) 堿基位點(diǎn)另一側(cè)的核酸序列互補(bǔ)的序列H2;在探針P2的3，端的20 nt左 右的序列為與另一條通用引物P4互補(bǔ)的序列H4，并且對(duì)此條通用引物P4 序列的5，端進(jìn)行焚光素分子cy3標(biāo)記；此外，探針P2中所含有某個(gè)特定 的Tag序列，用于和芯片上特定位點(diǎn)進(jìn)行雜交和識(shí)別。
圖2A-圖2F為本發(fā)明通用寡核苷酸微陣列的核酸檢測(cè)方法的流程示意 圖。請(qǐng)參閱圖2A所示，為將檢測(cè)所需的探針和核酸樣本在適合的溫度條件 下進(jìn)行退火雜交的過(guò)程，探針和模板退火雜交后，在探針P1的3'端和P2 的5，端形成一個(gè)堿基的缺口，使此缺口處的堿基剛好與待測(cè)堿基位點(diǎn)處堿 基相對(duì)應(yīng)。
圖2B所示在探針和模板退火雜交后，如果加入到反應(yīng)體系中的堿基和 模板上待測(cè)堿基位點(diǎn)處堿基互補(bǔ)時(shí)，則在DNA聚合酶和連接酶的作用下將探針Pl和P2連接成一條探針。該缺口的填充以及探針的連接的詳細(xì)過(guò)程
為，將檢測(cè)所需探針、DNA模板、核酸樣本及反應(yīng)緩沖液混合后，等量分成 四個(gè)反應(yīng)管，標(biāo)記為A， T， G, C,經(jīng)過(guò)退火和雜交后，在每對(duì)探針P1的3， 端和P2的5'端形成一個(gè)堿基的缺口，使此缺口和待測(cè)堿基位點(diǎn)處的堿基 相對(duì)應(yīng)，然后在A， T， G， C四個(gè)反應(yīng)管中分別加入一種對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核 苦酸一dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP及反應(yīng)所需的DNA聚合酶，連接酶。只有 當(dāng)在四個(gè)反應(yīng)管中加入的脫氧核糖核苷酸堿基和沖莫板上待測(cè)堿基位點(diǎn)處的 堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，其才能夠在DNA聚合酶的作用下被引入由探針和模板退 火后形成的缺口從而完成缺口填充(gap-填充)的過(guò)程，而在這一過(guò)程完 成后，在DNA連接酶的作用下，探針Pl和P2就完成連接(連接)過(guò)程從 而連接成為一條完整的探針。
圖2C-圖2D所示為用鏈親和素》茲粒對(duì)完成連接后的探針進(jìn)行純化的過(guò) 程，具體過(guò)程如下在檢測(cè)所需的各對(duì)探針Pl和P2完成gap-填充和連接 過(guò)程而成為一條完整的探針后，需要用鏈親和素包被的磁性微球?qū)ζ溥M(jìn)行 純化。即在四個(gè)反應(yīng)管中分別加入2x反應(yīng)緩沖液，在37°C, 180 rpm恒 溫?fù)u床中反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)完畢后，磁性分離，棄上清，用清洗緩沖液清 洗磁粒三次。之后超純水中保存。經(jīng)純化后，在每個(gè)反應(yīng)體系中完成連接 的探針就被鏈親和素磁粒所捕獲。
為了放大檢測(cè)信號(hào)，需要分別對(duì)四個(gè)反應(yīng)體系中的探針進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增后用于和芯片上的對(duì)應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雜交。圖2E-2F所示為探針的擴(kuò)增過(guò) 程，以經(jīng)過(guò)缺口填充和連接過(guò)程而完成連接并纟皮《連親和素包被一磁粒純化的 探針為模板，以序列H3和P4作為一對(duì)通用引物進(jìn)行對(duì)稱或不對(duì)稱PCR擴(kuò) 增。加入DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖液，以序列H3為限制性引物，P4為非限制 性引物進(jìn)行不對(duì)稱擴(kuò)增，且P4的5，端有熒光分子標(biāo)記cy3。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增， 形成大量的cy3標(biāo)記的單鏈探針，之后經(jīng)磁性分離，移取上清用于和芯片 對(duì)應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雜交。由于探針P2含有的特定Tag序列，使得在完成PCR擴(kuò) 增后焚光素分子cy3標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物序列中含有一條與其互補(bǔ)的Anti-Tag 序列，用四個(gè)體系中的擴(kuò)增產(chǎn)物與點(diǎn)制有Ta g序列的芯片上的對(duì)應(yīng)的各個(gè) 區(qū)域進(jìn)行雜交，經(jīng)清洗和掃描分析來(lái)確定檢測(cè)結(jié)果。
圖3為本發(fā)明通用寡核苷酸^(:陣列的核酸;險(xiǎn)測(cè)方法的芯片示意圖。在 一張芯片上，分為A，T，G，C四個(gè)區(qū)，用來(lái)分別和對(duì)稱或不對(duì)稱PCR擴(kuò)增后 的四個(gè)反應(yīng)體系中的探針進(jìn)行雜交，每個(gè)區(qū)的對(duì)應(yīng)位置上都分別點(diǎn)制一種 和探針P2上的Tag序列相同的序列，用來(lái)對(duì)這一特定待測(cè)堿基位點(diǎn)進(jìn)行識(shí) 別和定位，此四個(gè)區(qū)分別用來(lái)與加入對(duì)應(yīng)堿基的體系的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交。 如圖3所示，其以點(diǎn)制15個(gè)Tag序列為例說(shuō)明芯片的分區(qū)情況，而此15 個(gè)Tag序列對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)可以對(duì)15個(gè)待測(cè)石威基位點(diǎn)進(jìn)行纟全測(cè)，并且隨著每區(qū)點(diǎn)制的Tag序列的數(shù)目的增加，本技術(shù)的檢測(cè)通量也隨著增大，因此，本 技術(shù)可達(dá)到相當(dāng)大的檢測(cè)通量。
本發(fā)明所提出的通用寡核苷酸微陣列，可以用于對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行 重測(cè)序分析。所述的核酸序列重測(cè)序的芯片結(jié)果分析示意圖如圖4所示。 若在芯片上的A區(qū)1位點(diǎn)有熒光信號(hào)出現(xiàn)，則說(shuō)明與1位點(diǎn)Tag序列對(duì)應(yīng) 的檢測(cè)探針的HI和H2序列存在于目標(biāo)核酸序列中，并且目標(biāo)核酸序列中 所測(cè)位點(diǎn)處i威基為T(mén)。若在芯片上的G區(qū)2位點(diǎn)有焚光信號(hào)出現(xiàn)，則說(shuō)明與 2位點(diǎn)Tag序列對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針的HI和H2序列存在于目標(biāo)核酸序列中，并 且目標(biāo)核酸序列中所測(cè)位點(diǎn)處i咸基為C。若在芯片上的T區(qū)3位點(diǎn)有焚光信 號(hào)出現(xiàn)，則說(shuō)明與3位點(diǎn)Tag序列對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針的HI和H2序列存在于 目標(biāo)核S^列中，并且目標(biāo)核酸序列中所測(cè)位點(diǎn)處堿基為A。
本發(fā)明所提出的通用寡核苷酸微陣列，還可以用于對(duì)已知核酸序列的 突變進(jìn)行檢測(cè)，如對(duì)SNPs突變位點(diǎn)4企測(cè)。所述的SNP位點(diǎn)檢測(cè)的芯片結(jié)果 分析示意圖如圖5所示。用l位點(diǎn)，2位點(diǎn)和3位點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)于SNP1, SNP2 和SNP3三個(gè)突變位點(diǎn)，如果芯片掃描后的結(jié)果如圖所示，即1位點(diǎn)的A區(qū) 和G區(qū)有熒光信號(hào)出現(xiàn)，2位點(diǎn)的C區(qū)有熒光信號(hào)出現(xiàn)，3位點(diǎn)的C區(qū)和T 區(qū)有熒光信號(hào)出現(xiàn)，那么SNP1位點(diǎn)的基因型為T(mén)/C雜合型，SNP2位點(diǎn)的基 因型為G/G純合型，SNP3位點(diǎn)的基因型為G/A雜合型。
此外，本發(fā)明所提出的通用寡核苷酸微陣列還可用于插入/缺失位點(diǎn)進(jìn) 行檢測(cè)分析。對(duì)于某個(gè)短片段的(一個(gè)或幾個(gè)堿基的)插入/缺失型多態(tài)性 位點(diǎn)的分型，采用三條探針Pl, P2，和P2對(duì)其進(jìn)行分型，探針的序列設(shè)計(jì) 請(qǐng)參見(jiàn)圖6A -圖6C所示。圖6A所示探針Pl的寡核苷酸序列，由Hl， H3 和連接臂三部分組成，另外在其5，端為生物素標(biāo)記。圖6B所示探針P2， 的寡核苷酸序列，由H2， H4， H5和tag四部分組成。圖6C所示探針P2的 寡核苷酸序列，由H2， H4和tag，三部分組成。其中H1為與模板上插入/ 缺失突變位點(diǎn)一側(cè)序列互補(bǔ)的序列，H5為探針P2，上5，端與插入型多態(tài) 性位點(diǎn)的序列互補(bǔ)的序列，H2為與模板上插入/缺失突變位點(diǎn)另一側(cè)的序列 互補(bǔ)的序列，H5為與插入型多態(tài)性位點(diǎn)一個(gè)或幾個(gè)堿基的序列互補(bǔ)的序列， 它只存在于探針P2，上5，端，而在探針P2的5，端卻沒(méi)有，這樣，由探 針Pl和P2，對(duì)插入型模板進(jìn)行分型檢測(cè)，由探針Pl和P2對(duì)缺失型模板 進(jìn)行分型檢測(cè)。另外，H3和H4是用來(lái)對(duì)探針進(jìn)行擴(kuò)增的一對(duì)相關(guān)的通用寡 核苷酸序列。在探針P2，和P2中還各含有某個(gè)特定的Tag序列用于和芯片 上特定位點(diǎn)進(jìn)行雜交和識(shí)別。
圖7A-圖7D為此實(shí)施例的核酸^r測(cè)方法的流程示意圖。圖7A和7B所 示為將檢測(cè)所需的探針和模板在適合的溫度下進(jìn)行退火雜交的過(guò)程，以與 模板上插入/缺失突變位點(diǎn)相鄰的一個(gè)堿基做為探針和模板退火后形成的缺口處對(duì)應(yīng)的堿基。在探針和模板退火雜交后，在探針P1的3，端和P2或 P2，的5'端形成一個(gè)堿基的缺口。
圖7C和7D所示為在探針和模板退火雜交后，如果加入到反應(yīng)體系中 的堿基和探針與模板退火后形成缺口處的堿基互補(bǔ)時(shí)，則在DNA聚合酶和 連接酶的作用下將探針Pl和P2或P2，連接成一條探針。之后探針的純化， 擴(kuò)增及雜交過(guò)程與以上所述的檢測(cè)過(guò)程相同。
所述的插入/缺失位點(diǎn)檢測(cè)的芯片結(jié)果分析示意圖如圖8所示。對(duì)插入 /缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，用芯片上各區(qū)的兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)一個(gè)插入/缺失位點(diǎn)進(jìn) 行枱r測(cè)。即若用芯片上的4位點(diǎn)和5位點(diǎn)對(duì)一個(gè)插入/缺失位點(diǎn)X進(jìn)行4企測(cè)， 并且4位點(diǎn)所點(diǎn)制的Ug序列對(duì)應(yīng)于對(duì)插入型位點(diǎn)檢測(cè)的探針P2，上的tag 序列，5位點(diǎn)所點(diǎn)制的tag，序列對(duì)應(yīng)于對(duì)缺失型位點(diǎn)檢測(cè)的探針P2上的 tag，序列；探針和模板退火后形成的缺口處對(duì)應(yīng)的i咸基為G;而用6位點(diǎn) 和7位點(diǎn)對(duì)另 一個(gè)插入/缺失位點(diǎn)Y進(jìn)行檢測(cè)，并且6位點(diǎn)所點(diǎn)制的tag序 列對(duì)應(yīng)于對(duì)插入型位點(diǎn)檢測(cè)的探針P2'上的tag序列，7位點(diǎn)所點(diǎn)制的tag' 序列對(duì)應(yīng)于對(duì)缺失型位點(diǎn)檢測(cè)的探針P2上的tag序列；探針和模板退火后 形成的缺口處對(duì)應(yīng)的堿基為T(mén)時(shí)，如圖8所示，若4位點(diǎn)和5位點(diǎn)在C區(qū) 都有熒光信號(hào)出現(xiàn)，那么位點(diǎn)X的基因型為插入/缺失雜合基因型，若只有 7位點(diǎn)在A區(qū)有熒光信號(hào)而6位點(diǎn)無(wú)焚光信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，那么位點(diǎn)Y的基因型 為缺失/缺失純合基因型。
以下是采用本發(fā)明所提出的通用寡核苷酸孩史陣列對(duì)存在于克隆人基因 組P450藥物代謝酶基因片段上的CYP3A4*17, c. 566T〉C (F189S)突變進(jìn)行
檢測(cè)的實(shí)施例，其具體步驟如下
(1 )檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)及合成所需檢測(cè)探針對(duì)序列如下。 Pl (53nt): 5，
Spacer H3 HI
P2(71nt):
5，
H2 Tag H4
P3(24nt):
5， cy3 -CCAGA CGACA CCGAG ATAGC AGCC-3' P4(24nt):
5 ， -GGG丁TCGTGGTAGAGCGTCGGAGT-3 ， tag sequence (24nt):5， -GCCGTGTCTGCCGCTGGGTTATCA-3， (2 )檢測(cè)探針Pl和P2的連接通過(guò)填充和連接過(guò)程填補(bǔ)探針Pl和 P2之間的缺口 ，反應(yīng)體系配制如下探針Pl和P2各取10 fmol,模板取1 ~ 5 ng。各力口入0. 1 |u 1的DNA polymerase和DNA Ligase，再力口入10 x 反 應(yīng)緩沖液，平均分成四個(gè)反應(yīng)管，每個(gè)反應(yīng)管中分別加入0. 1 ja 1的dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP,超純水補(bǔ)足20 |a 1 。在以下反應(yīng)條件下反應(yīng)94°C, 5 min; 94°C， 1 min， 57。C， 2 min; 30個(gè)循環(huán)，57°C， 5 min.
(3) 探針連接后的純化
a. 連接反應(yīng)完畢，將四個(gè)反應(yīng)體系94。C， 1G min,冰上驟冷。
b. 在四個(gè)反應(yīng)體系中分別加入2 x純化緩沖液和5 ial的鏈親和素 磁粒。恒溫?fù)u床中37°C, 180 rpm， 20min.反應(yīng)完畢，磁性分離，棄上清。 加入80 ju 1清洗緩沖液清洗兩次。/磁性分離，棄上清。
c. 5 m 1超純水重懸》茲粒。
(4) 純化探針的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增體系如下，取l ial重懸的磁粒做為 模板，各取O. 1 n 1的通用引物P3和P4,加入7.5 jal的2 x Taq PCR mastermix和6. 5 p 1的dH20使反應(yīng)體系為15 以下列條件做PCR擴(kuò) 增94°C， 5 min; 94°C， 1 min, 55°C, 1 min， 72°C, 1 min; 20個(gè)循 環(huán)，72°C， 5 min， 4。C保存。反應(yīng)完畢，四個(gè)體系分別磁性分離，移取上 清備用。
(5 ) 7 ja 1的PCR產(chǎn)物做1.5%瓊脂糖凝膠電泳或12 % PAGE凝膠電泳驗(yàn) 證反應(yīng)體系的正確性。預(yù)測(cè)結(jié)果為當(dāng)對(duì)野生型(T)模板進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，只有 在A反應(yīng)體系中才能完成探針Pl和P2的連接及后續(xù)的以連接產(chǎn)物為模板 的PCR的擴(kuò)增，因此也只應(yīng)在A反應(yīng)體系產(chǎn)物所在泳道出現(xiàn)PCR產(chǎn)物。當(dāng) 對(duì)野生型(T)和突變型(G)模板的混合檢測(cè)時(shí)，只有在A和G反應(yīng)體系中 才能完成探針Pl和P2的連接及后續(xù)的以連接產(chǎn)物為模板的PCR的擴(kuò)增， 因此也只應(yīng)在A和G反應(yīng)體系產(chǎn)物所在泳道出現(xiàn)PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖9A-圖9C所示。
(6 )寡核苷酸芯片的制備制備醛基化的片基，并按照權(quán)利要求書(shū)中 要求分為四個(gè)雜交區(qū)域，并在各個(gè)區(qū)域點(diǎn)制相應(yīng)的Tag序列。烘千備用。
(7 )探針的雜交將步驟(5 )的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交緩沖液混合，與 對(duì)應(yīng)的芯片區(qū)域在60。C雜交4 h.雜交完畢，經(jīng)清洗后甩干。
(8)芯片掃描及結(jié)果分析用單色熒光掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，結(jié)果 如圖5D所示。根據(jù)掃描圖進(jìn)行結(jié)果分析。
圖9A -圖9C為利用本發(fā)明通用寡核苦酸微陣列的核酸檢測(cè)方法對(duì)存在 于克隆人基因組P450藥物代謝酶基因片段上的突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證 電泳圖。圖9A為對(duì)存在于克隆人基因組P450藥物代謝酶基因片段上的 CYP3A4*17， c.566T〉C (F189S)突變的野生型(T )沖莫板的4企測(cè)結(jié)果。四個(gè) 反應(yīng)體系在經(jīng)過(guò)探針純化和PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物做1. 5 %瓊脂糖凝膠電 泳。泳道M為DNAMarker2000.泳道A，C，G，T分別為四個(gè)反應(yīng)體系所在的泳 道。從圖上可以看出，只有在A泳道中出現(xiàn)了一條長(zhǎng)度為lOOnt以上的條 帶，而在其余三個(gè)泳道中都沒(méi)有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)。這與實(shí)驗(yàn)的預(yù)期是相同 的。為了驗(yàn)證在A泳道中出現(xiàn)的條帶是否就是理論上應(yīng)該出現(xiàn)的條帶，因 此，對(duì)出現(xiàn)的條帶進(jìn)行了膠回收，并將回收產(chǎn)物用通用引物P3和P4做PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物做l. 5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖9B所示。由如圖9B可 以看出，在和圖9A泳道A相同位置也出現(xiàn)了一條條帶，這也證明了圖9A 泳道A中出現(xiàn)的條帶確實(shí)是探針Pl和P2完成連接后，以其為模板，以通 用引物P3和P4為引物做PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物。
圖9C為對(duì)存在于克隆人基因組P450藥物代謝酶基因片段上的 CYP3A4*17， c.566T〉C (F189S)突變的野生型(T )和突變型(G)模板的混合 檢測(cè)結(jié)果。四個(gè)反應(yīng)體系在經(jīng)過(guò)探針純化和PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物做12 %PAGE凝膠電泳。泳道M為DNA Marker2000.泳道A， C， G， T分別為四個(gè)反 應(yīng)體系所在的泳道。從圖上可以看出，同時(shí)在A泳道和G泳道中出現(xiàn)了一 條長(zhǎng)度為100nt以上的條帶，而在其余兩個(gè)泳道中都沒(méi)有相應(yīng)的條帶出現(xiàn)。 這與實(shí)驗(yàn)中對(duì)野生型(T)和突變型(G)混合模板的檢測(cè)的預(yù)期結(jié)果是相同。
圖10是對(duì)存在于克隆人基因組P450藥物代謝酶基因片段上的 CYP3A4*17， c.566T〉C (F189S)突變的野生型(T )模板進(jìn)行檢測(cè)的芯片雜 交后的結(jié)果掃描圖。
在圖10中，芯片上各區(qū)分別點(diǎn)制6個(gè)點(diǎn)，其中兩個(gè)空白對(duì)照點(diǎn)，四個(gè) Tag序列所在點(diǎn)。圖上A區(qū)和T區(qū)分別是A和T反應(yīng)體系在經(jīng)過(guò)探針純化后， 做PCR擴(kuò)增，取6pl擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交掃描結(jié)果。從掃描結(jié)果可以看出，只 有在A區(qū)的四個(gè)Tag序列所在點(diǎn)均有較強(qiáng)熒光信號(hào)出現(xiàn)，而在T區(qū)對(duì)應(yīng)各 點(diǎn)僅有非常微弱的熒光信號(hào)出現(xiàn)。A區(qū)和T區(qū)Tag序列所在點(diǎn)的熒光信號(hào)比 ii可達(dá)10以上。
從圖9A-圖9C及圖IO表明此方法可以作為對(duì)SNP進(jìn)行分析的新方法。 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式 上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā) 明，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利 用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但 凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例 所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種檢測(cè)探針，其特征在于其主要由針對(duì)各個(gè)待測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)探針對(duì)(P1，P2)組成，且所述探針對(duì)(P1，P2)分別含有一條與待測(cè)堿基位點(diǎn)兩側(cè)的序列互補(bǔ)的序列(H1，H2)，并各含有一條相關(guān)的通用寡核苷酸序列(H3，H4)，且在該探針對(duì)(P1，P2)上至少還含有某個(gè)特定的Tag序列，所述的檢測(cè)探針對(duì)(P1，P2)通過(guò)下述方法連接成為一條探針將檢測(cè)探針對(duì)與待測(cè)核酸樣本退火雜交，通過(guò)所述與待測(cè)堿基位點(diǎn)兩側(cè)的序列互補(bǔ)的序列(H1，H2)與待測(cè)堿基位點(diǎn)兩側(cè)的序列互補(bǔ)，在探針對(duì)(P1，P2)間形成與待測(cè)堿基位點(diǎn)處的堿基相對(duì)應(yīng)的缺口，將退火后的反應(yīng)體系均分成A、T、G、C四個(gè)反應(yīng)體系，在A體系中加入dATP，在T體系中加入dTTP，在G體系中加入dGTP，在C體系中加入dCTP，與待測(cè)堿基位點(diǎn)處的堿基互補(bǔ)的堿基在DNA聚合酶和連接酶的作用下就會(huì)填充上述缺口，將檢測(cè)探針對(duì)連接成為一條探針。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1述的檢測(cè)探針，其特征在于其中所述的檢測(cè)探針還 包括另一條探針(P2，)，且該探針含有與待測(cè)堿基位點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)的 序列(H1或H2)， 一條相關(guān)的通用寡核苷S吏序列(H3或H4)，某個(gè)特定的 Tag序列及與待測(cè)樣本插入型位點(diǎn)的插入序列互補(bǔ)的序列(H5 )。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)探針，其特征在于在其中所述的檢 測(cè)探針對(duì)中探針的不發(fā)生連接反應(yīng)的一端至少還含有生物素標(biāo)記分子，且 該生物素標(biāo)記分子與探針的核苷酸序列之間還包含有 一段連接臂。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)探針，其特征在于其中所述的連接臂為 碳連接臂，或非碳類(lèi)型的連接臂。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)探針，其特征在于其中所述的非碳類(lèi)型 的連接臂為聚乙二醇、polyA、 polyT。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的檢測(cè)探針，其特征在于其應(yīng)用于對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測(cè)序分析、對(duì)已知核酸序列中的突變位 點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析及病原微生物的分型檢測(cè)領(lǐng)域。
7、 一種通用寡核苷酸芯片，其特征在于其包含分成A， T， G, C四個(gè) 相同的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)的各個(gè)位點(diǎn)上分別點(diǎn)制與對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針上的 T a g序列相同的寡核苷酸序列。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的通用寡核苷酸芯片，其特征在于其應(yīng)用于對(duì) 目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測(cè)序分析、對(duì)已知核酸序列中的突變位點(diǎn)和插入/缺失 位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析及病原微生物的分型檢測(cè)領(lǐng)域。
9、 一種核S臾;險(xiǎn)測(cè)方法，其特征在于其包括以下步驟 ①待測(cè)核酸樣本的制備；② 檢測(cè)探針的制備，所述探針主要是由針對(duì)各個(gè)待測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)探針對(duì)(Pl， P2)組成，且所述探針對(duì)(Pl， P2)分別含有與待測(cè)堿基位點(diǎn)兩 側(cè)的序列互補(bǔ)的序列(H1， H2),并各含有一條相關(guān)的通用寡核苦酸序列(H3， H4 ),且在該探針對(duì)上至少還含有某個(gè)特定的Tag序列；③ 將各探針對(duì)與核酸樣本退火雜交，在各探針對(duì)間形成與待測(cè)堿基位 點(diǎn)處的;咸基相對(duì)應(yīng)的缺口 ；④ 將退火后的反應(yīng)體系均分成A、 T、 G、 C四個(gè)反應(yīng)體系，在A體系 中加入dATP，在T體系中加入dTTP，在G體系中加入dGTP，在C體系中加 入dCTP，在DM聚合酶和連接酶的作用下，與待測(cè)堿基位點(diǎn)處的堿基互補(bǔ) 的堿基就會(huì)填充上述缺口 ，將各檢測(cè)探針對(duì)連接成為一條探針； 純化上述連接的探針； 擴(kuò)增純化出的探針；⑦通用寡核苦酸芯片的制備，將每張芯片分成A， T， G， C四個(gè)雜交 區(qū)域，每個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)的各個(gè)位點(diǎn)上分別點(diǎn)制與對(duì)應(yīng)的檢測(cè)探針上的Tag序 列相同的寡核苷酸序列； 將上述寡核苦酸芯片的A， T， G, C四個(gè)雜交區(qū)域用來(lái)分別和擴(kuò)增 后對(duì)應(yīng)的四個(gè)反應(yīng)體系中的^:針進(jìn)行雜交； 對(duì)芯片進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)分析。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的各 檢測(cè)探針對(duì)的制備步驟中，還包括另一條探針(P2，)，且該探針含有一條 與待測(cè)石威基位點(diǎn)一側(cè)的序列互補(bǔ)的序列(HI或H2)， 一條相關(guān)的通用寡核 苷酸序列(H3或H4),某個(gè)特定的Tag序列及與待測(cè)樣本插入型多態(tài)性位 點(diǎn)的插入序列互補(bǔ)的序列(H5)。
11、 根據(jù)權(quán)利要求9或IO所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述 的待測(cè)核酸樣本為動(dòng)植物染色體DNA、目標(biāo)核酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、線粒體DNA、 cDNA、細(xì)菌或者病毒DNA或RNA。
12、 根據(jù)權(quán)利要求9或IO所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述 的檢測(cè)探針對(duì)中探針的的不發(fā)生連接反應(yīng)的一端至少還含有生物素標(biāo)記分 子，且該生物素標(biāo)記分子與探針的核苷酸序列之間還含有一段連接臂，有 利于后續(xù)的探針純化和擴(kuò)增。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的連 接臂為碳連接臂、聚乙二醇、polyA或polyT。
14、 根據(jù)權(quán)利要求9或IO所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述 的探針的純化步驟是采用鏈親和素包被載體介質(zhì)來(lái)完成的。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的載 體介質(zhì)為磁性微?；蚓郾揭蚁┪⑶?。
16、 根據(jù)權(quán)利要求9或IO所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述 的探針的擴(kuò)增步驟是利用與所述各探針對(duì)上的通用寡核苷酸序列(H3， H4) 對(duì)應(yīng)的通用引物進(jìn)行的對(duì)稱或不對(duì)稱PCR擴(kuò)增。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的對(duì) 稱PCR擴(kuò)增，至少在一條通用引物的5，端還含有分子標(biāo)記；其中所述的不 對(duì)稱PCR擴(kuò)增，至少有一條為限制性通用引物，另一條為非限制性通用引 物，且在非限制性通用引物的5，端至少還含有分子標(biāo)記。
18、 根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的分 子標(biāo)記為非同位素標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的非 同位素標(biāo)記為熒光素分子，金屬標(biāo)記，半抗原標(biāo)記或酶類(lèi)。
20、 根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的焚 光素分子為cy3，cy5，F(xiàn)ITC,金屬標(biāo)記為Hg，半抗原標(biāo)記為地高辛，酶類(lèi)為 辣才艮過(guò)氧化物酶HRP，半乳糖苷酶，^喊性磷酸酶。
21、 根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的核g吏檢測(cè)方法，其特征在于其中所片上四個(gè)分區(qū)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上的熒光信^出現(xiàn)情況確定檢測(cè)結(jié)果，或者對(duì)芯片 進(jìn)行酶顯色的方法確定檢測(cè)結(jié)果。
22、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸檢測(cè)方法，其特征在于其中所述的放 射性同位素標(biāo)記為32p或35s 。
23、 權(quán)利要求9至21中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸檢測(cè)方法，其特征 在于其應(yīng)用于對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測(cè)序分析、對(duì)已知核酸序列中的突變 位點(diǎn)和插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析及病原微生物的分型檢測(cè)領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種檢測(cè)探針、通用寡核苷酸芯片及核酸檢測(cè)方法及其用途。通過(guò)設(shè)計(jì)線性檢測(cè)探針對(duì)P1和P2實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸樣本上待測(cè)堿基或突變位點(diǎn)的高通量檢測(cè)。將檢測(cè)探針與核酸樣本退火雜交，之后將其均分成四個(gè)反應(yīng)體系，在每個(gè)體系中分別加入A，T，G，C，在DNA聚合酶和連接酶的作用下，將相應(yīng)的檢測(cè)探針對(duì)P1和P2連接成為一條探針，將此探針進(jìn)行純化和擴(kuò)增后，與通用寡核苷酸微陣列上的對(duì)應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雜交，最后對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)和分析，確定核酸樣本上待測(cè)位點(diǎn)堿基類(lèi)型或突變位點(diǎn)基因型。本發(fā)明可應(yīng)用于對(duì)目標(biāo)核酸序列進(jìn)行重測(cè)序分析、對(duì)已知核酸序列中的突變位點(diǎn)，插入/缺失位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析及病原微生物的分型檢測(cè)領(lǐng)域，具有低成本、高特異性、高靈敏度的效果。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101586150SQ200810097700
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者余龍林, 唐一通, 崔亞麗, 朱娟莉, 錚 李, 超 陳, 高怡文 申請(qǐng)人:陜西北美基因股份有限公司