專利名稱：一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，特別是涉及一種連接有ssDNA探針 的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法。
技術(shù)背景雙層類脂膜(BLM)是雙分子層超薄度(厚度小于10nm)和兩個有各向異性又相互聯(lián) 結(jié)的脂質(zhì)界面。它具有與生物膜相似的厚度、電化學(xué)性質(zhì)、滲透性和可激發(fā)性。在分子結(jié) 構(gòu)上具有親水部分或極性頭(polar head)和疏水部分或稱非極性尾(no叩olar tail)。 兩親化合物在水介質(zhì)中的定向分布，導(dǎo)致膜脂裝配成表面是親水部分，內(nèi)部是疏水部分的 脂質(zhì)雙分子層。從生物相容性來看，BLM有很大優(yōu)越性。在其它反應(yīng)體系中的活性物質(zhì)多 被固定在剛性的類似固體體系中，在BLM中活性物質(zhì)是被鑲嵌于其中的，鑲嵌意味著BLM中 感興趣的物質(zhì)(即膜修飾物，如多肽、蛋白質(zhì)、電子受體、供體、組織或整個細(xì)胞)是相對 自由地順應(yīng)它的周圍環(huán)境，同時BLM的存在極大地降低了界面的背景噪音。目前報道的雙層類脂膜主要有平板雙層類脂膜(P-BLM)，金屬支撐的雙層類脂膜 (s-BLM)，鹽橋支撐的雙層類脂膜(sb-BLM)及微濾膜支撐的雙層類脂膜(filter-BLM)。其 中平板雙層類脂膜的通透性最好，存在狀態(tài)也最接近真實(shí)的生物膜，但機(jī)械穩(wěn)定性差，許 多研究難以進(jìn)行。金屬支撐的雙層類脂膜的穩(wěn)定性雖然很好，但由于膜的一側(cè)為金屬材料， 使得膜的通透性很差，不能用于膜通道等方面的研究。sb-BLM和filter-BLM穩(wěn)定性和通 透性介于兩者之間，彌補(bǔ)了這方面的缺陷。將具有電子傳遞功能的化合物嵌入sb-BLM中， 修飾后的sb-BLM可以作為電極使用，與其它電極組合，形成一個固體支撐的雙層脂膜研究 體系，該體系既能保持雙層脂膜的自組裝、超薄、易于形成等優(yōu)點(diǎn)，又具有較好的穩(wěn)定性， 應(yīng)用電化學(xué)手段，可以獲取有關(guān)電子跨膜傳遞的重要信息?；贐LMs表面核酸探針的固定化已有很多報道，目前國內(nèi)外采用的方法均是BLM形 成后，將ssDNA進(jìn)行修飾，利用修飾物與膜之間的疏水作用或靜電作用將ssDNA分子固定 到BLMs上。Nikolelis等終端帶有一個(:16烷烴鏈的ssDNA(dT20)可嵌入s-BLM中作為核酸 探針，由于d6垸烴鏈與成膜的磷脂分子的脂肪烴鏈之間的疏水作用和靜電作用，dT20-C16 與BLM有較高的結(jié)合常數(shù)，核酸探針的吸附使BLM與溶液界面的負(fù)表面電位增加，進(jìn)而使 膜表面的陽離子數(shù)量增加，跨膜電流增加。本研究室也在文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上進(jìn)行了相關(guān)的研究，利用C,2對設(shè)計的ssDNA進(jìn)行修 飾，研究結(jié)果表明在BLMs表面固定C,2修飾的ssDNA探針后，可使膜電流從十幾PA增加 到幾百PA。雖然將ssDNA進(jìn)行修飾在一定程度上能夠提高固定化效果，但經(jīng)過d2修飾的 ssDNA價格較高，固定化效果也不十分理想，由于成膜與修飾分步進(jìn)行，很難保證方法的重復(fù)性，這也限制了 BLM在DNA檢測領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成 膜溶液的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，包括下述步驟(1) 按體積比3: 1的比例將正癸烷與N， N—二乙基苯胺混合配成溶液；(2) 將卵磷脂和膽固醇加入到步驟(1)制成的溶液中，使卵磷脂的終濃度為0. 016mg/L, 使膽固醇的終濃度為0. 004mg/L; '(3) 將ssDNA溶解于O. lmol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽咪唑溶液中， 使ssDNA的終濃度為1-5. 0 OD;(4) 按體積比為1: 1的比例將步驟(2)制成的溶液與步驟(3)制成的溶液混合，充分 震蕩5分鐘后靜止分層，上層溶液即一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液。優(yōu)選的是所述ssDNA的終濃度為2. 5 0D。本發(fā)明的方法通過對成膜溶液的修飾，采用共價結(jié)合的方法，在雙層類脂膜形成之前 先將ssDNA探針引入成膜液中，ssDNA的探針與雙層類脂膜的形成一步完成，不僅保證了 雙層類脂膜的穩(wěn)定性，而且ssDNA探針每次的固定化量相同，保證了方法的重復(fù)性與穩(wěn)定 性。


圖1為本發(fā)明方法制備的一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液固定化效果時 間-電流曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例1一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，包括下述步驟(1) 按體積比3: 1的比例將正癸烷與N， N—二乙基苯胺混合配成溶液；(2) 將卵磷脂和膽固醇加入到步驟(1)制成的溶液中，使卵磷脂的終濃度為0. 016mg/L， 使膽固醇的終濃度為0. 004mg/L;(3) 將ssDNA溶解于O. lmol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽咪唑溶液中， 使ssDNA的終濃度為5. 0 0D;(4) 按體積比為1: 1的比例將步驟(2)制成的溶液與步驟(3)制成的溶液按混合，充 分震蕩5分鐘后靜止分層，上層溶液即一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液。 實(shí)施例2一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，包括下述步驟(1) 按體積比3: 1的比例將正癸烷與N， N—二乙基苯胺混合配成溶液；(2) 將卵磷脂和膽固醇加入到步驟(1)制成的溶液中，使卵磷脂的終濃度為0. 016mg/L，使膽固醇的終濃度為0. 004mg/L;(3) 將ssDNA溶解于O. lmol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽咪唑溶液中， 使ssDNA的終濃度為1. 0 0D;(4) 按體積比為1: 1的比例將步驟(2)制成的溶液與步驟(3)制成的溶液按混合，充 分震蕩5分鐘后靜止分層，上層溶液即一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液。 實(shí)施例3一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，包括下述步驟(1) 按體積比3: 1的比例將正癸烷與N， N—二乙基苯胺混合配成溶液；(2) 將卵磷脂和膽固醇加入到步驟(1)制成的溶液中，使卵磷脂的終濃度為0. 016mg/L， 使膽固醇的終濃度為0. 004mg/L;(3) 將ssDNA溶解于O. lmol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽咪唑溶液中， 使ssDNA的終濃度為4. 0 0D;(4) 按體積比為1: 1的比例將步驟(2)制成的溶液與步驟(3)制成的溶液按混合，充 分震蕩5分鐘后靜止分層，上層溶液即一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液。 實(shí)施例4一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，包括下述步驟(1) 按體積比3: 1的比例將正癸烷與N， N—二乙基苯胺混合配成溶液；(2) 將卵磷脂和膽固醇加入到步驟(1)制成的溶液中，使卵磷脂的終濃度為0. 016mg/L， 使膽固醇的終濃度為0. 004mg/L;(3) 將ssDNA溶解于O. lmol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽咪唑溶液中， 使ssDNA的終濃度為2. 5 0D;(4) 按體積比為1: 1的比例將步驟(2)制成的溶液與步驟(3)制成的溶液按混合，充 分震蕩5分鐘后靜止分層，上層溶液即一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液。 實(shí)施例51瓊脂支撐(Sb) - BLMs的制備過程第一步將8 10cm長、直徑為0. 3醒的銀絲和6cm長、直徑為0. 8mm的聚四氟乙烯管分 別用洗滌劑，水和去離子水洗凈，干燥，并將銀絲的一部分繞成螺旋狀，其直徑和長度分 別略小于0. 8mm和4cm;第二步將銀絲的螺旋狀部分插入聚四氟乙烯管中；第三步將瓊脂溶液煮沸融化，然后，用注射器將熱的瓊脂溶液灌入包括有銀絲的聚四氟乙烯管中，冷卻，浸泡在O. lmol/L KC1溶液中，得到sb電極備用；第四步:將sb電極的瓊脂端切出一個新鮮表面，立即將其放入實(shí)施例1制備的連接有ssDNA 探針的雙層類脂膜成膜溶液中5分鐘，然后移入電解液中，將該電極的金屬絲一端和參比 電極與測試儀器連接，測定膜電流和膜電位-電流關(guān)系，大約10分鐘，雙層類脂膜形成后， 即可用于反應(yīng)體系的測定。觀察ssDNA探針的固定化效果，如圖1所示，圖1中采樣間隔0. 1S， a為實(shí)施例4制得成膜溶液的電流-時間曲線;b為乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)咪 唑溶液與含有N， N—二乙基苯胺(NNA)的溶液充分反應(yīng)后制得成膜溶液的電流-時間曲 線。從圖l可以看出，在相同條件下，引入了 ssDNA之后的成膜溶液其膜電流大大增加， 這與文獻(xiàn)報道相一致，由于ssDNA在BLM上的鑲嵌，使膜電阻降低，膜電流增加。
權(quán)利要求
1. 一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，其特征是包括下述步驟(1)按體積比3∶1的比例將正癸烷與N，N-二乙基苯胺混合配成溶液；(2)將卵磷脂和膽固醇加入到步驟(1)制成的溶液中，使卵磷脂的終濃度為0.016mg/L，使膽固醇的終濃度為0.004mg/L；(3)將ssDNA溶解于0.1mol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽咪唑溶液中，使ssDNA的終濃度為1-5.0OD；(4)按體積比為1∶1的比例將步驟(2)制成的溶液與步驟(3)制成的溶液混合，充分震蕩5分鐘后靜止分層，上層溶液即一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求所述的一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，其特征 是所述ssDNA的終濃度為2. 5 0D。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液的制備方法，包括下述步驟(1)將正癸烷與N，N-二乙基苯胺混合；(2)將卵磷脂和膽固醇加入到步驟(1)制成的溶液中；(3)將ssDNA溶解于乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽咪唑溶液中；(4)將步驟(2)制成的溶液與步驟(3)制成的溶液混合，充分震蕩5分鐘后靜止分層，上層溶液即一種連接有ssDNA探針的雙層類脂膜成膜溶液。本發(fā)明在雙層類脂膜形成之前先將ssDNA探針引入成膜液中，ssDNA的探針與雙層類脂膜的形成一步完成，不僅保證了雙層類脂膜的穩(wěn)定性，而且ssDNA探針每次的固定化量相同，保證了方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性。
文檔編號C12Q1/68GK101260436SQ20081005284
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者周煥英, 高志賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所