專利名稱：：山茱萸核糖體dna的its片段及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法。二
背景技術(shù)：
：山茱萸，又名山萸肉、萸肉、藥棗、棗皮等，是山茱萸科植物山茱萸0#">wtoSieb.etZucc，除去果核的干燥成熟果肉，為我國名貴中藥材，具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫的功效，主治眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫，內(nèi)熱消渴等癥，現(xiàn)代研究證明山茱萸中含有多種成分，如有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜苷類、皂苷、鞣質(zhì)類、多糖、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等，具有較好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、降血糖、抗炎、抗衰老等作用，因此，中醫(yī)臨床用量較大，同時(shí)作為常用中成藥(如六味地黃丸等)原料，中藥生產(chǎn)用量也很大。山茱萸主產(chǎn)于我國的河南、浙江、陜西等省，四川、安徽、山東亦有栽培，但山茱萸在長期應(yīng)用和栽培的過程中，種內(nèi)產(chǎn)生很大變異，出現(xiàn)較多栽培品種，主要表現(xiàn)在這些品種的果實(shí)從形狀、大小、顏色、重量到產(chǎn)量、干果肉(藥材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有較大的差異，即它們的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥材質(zhì)量是明顯不同的。國內(nèi)學(xué)者根據(jù)山茱萸果實(shí)的不同形狀，對其進(jìn)行了初步分類，分為橢圓形果型、長梨形果型、短梨形果型、圓柱形果型、長圓柱形果型、短圓柱形果型和紡錘形果型。隨著近幾年來我國農(nóng)村種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，山茱萸的栽培面積正在逐漸擴(kuò)大，由于山茱萸果樹良莠不齊，產(chǎn)量高低不一，品質(zhì)差異較大，己嚴(yán)重影響了山茱萸的生產(chǎn)發(fā)展及臨床應(yīng)用。為此，國內(nèi)外學(xué)者對山茱萸做了大量的研究工作，國外學(xué)者對山茱萸的基因序列做了一定的研究工作，但主要是基于山茱萸科不同種之間的比較。國內(nèi)對山茱萸的研究主要集中對其化學(xué)成分及藥理作用的研究，并對各變異品種的品質(zhì)進(jìn)行綜合評價(jià)和分析，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對各品種進(jìn)行RAPD分析，建立了山茱萸各品種RAPD指紋數(shù)據(jù)庫及遺傳關(guān)系樹系圖，分析各品種之間的遺傳關(guān)系。其中測定山茱萸核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列，制備出山茱萸核糖體DNA的ITS片段，為山茱萸的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質(zhì)資源的開發(fā)利用和保護(hù)可提供科學(xué)依據(jù)和物質(zhì)條件，那么如何確定山茱萸核糖體DNA的ITS片段，并制備出山茱萸核糖體DNA的ITS片段呢？三
發(fā)明內(nèi)容針對上述情況，本發(fā)明之目的，就是提供山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法，可有效解決山茱萸的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質(zhì)資源的開發(fā)利用問題，根據(jù)分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生物類藥材所依賴的資源-"物種"的多樣性是由于其基因多態(tài)性的結(jié)果，最好是在DNA分子水平上進(jìn)行，據(jù)此，本發(fā)明山茱萸核糖體DNA的ITS片段有三部分組成，即ITS1、5.8S、ITS2，其中，ITS1為253bp，5.8S為156bp，ITS2為273bp，總共682bp，該ITS片段的制備方法是取山茱萸植物葉片研碎成細(xì)粉，將細(xì)粉置于提取緩沖液中，離心，棄去上清夜，再加入用Vc+2xCTAB制成的抽提液以及P-巰基乙醇，混勻，加入由等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)制成的溶液處理2次，除去雜質(zhì)，離心，取上清液，加入異丙醇，沉淀，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物質(zhì)，再利用設(shè)計(jì)的引物對DNA物質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化，對純化后的PCR產(chǎn)物測序得ITS片段。本發(fā)明方法簡單、科學(xué)，為山茱萸的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質(zhì)資源的開發(fā)利用和保護(hù)提供了科學(xué)依據(jù)，有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。四具體實(shí)施例方式根據(jù)上述技術(shù)方案，本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，是由以下方式實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明所說的山茱萸核糖體DNA(rDNA)的ITS片段是有三部分組成，即ITS1、5.8S、ITS2，其中，ITS1為253bp，5.8S為156bp，ITS2為273bp，總共682bp，具體是1tcgaaacctgcacagcagaacgacccgcgaacgtgttttttacgacggcggcggggcgct、61ctcgcgggtgccccggcgccatcagggtgagcgcgtgccgatcccttcgcggggggaggc、1之1gggcgctttcccctgca^iaataacgaaccccggcgcgaaccgcgcca汪ggeiacacg2iac、181ga犯gagcgagcccgcg肌gccccgtccgcgggcgcgatcgcgggccggcatcttccttt、241atcgaaatcgaacgactctcgacaacggatatctcggctctcgcatcgatgaagaacgta、301gtgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgc、361aagttgcgcccgaagccgtcaggccgagggcacgtctgcctgggcgtctcacatcgcgtc、421gcccccctcaccaccccaccacacacttcggtgacggtgggcggggggcggac敏ggcc、481ccccgtgcgctcgctcacagcacagtgtgcggtcggccgaaaaaacgagtcgccggcgac、541ggacgtcacgacaagtggtggttgagacggaaccttaagcgtcctgtcgtgcgtgccgca、601gtcgccsgcgcg3tgctcgcgcgacccttaacgcgccgtcaccgscggtgcctcgaccgc、661gaccccaggtcaggcgggacta。其制備方法是(一)、DNA提取方法(1)取山茱萸植物葉片0.2g放入研缽，加入葉片重量的10。/。PVP粉末，在液氮中研磨成細(xì)粉；(2)將細(xì)粉裝到1.5ml離心管，加入冷藏的提取緩沖液1200pi(該緩沖液為25mMTris-HCl，pH=8.00)，冰上放置10min，8000r/min離心5min，棄去上清液，加入用Vc+2xCTAB制成的抽提液600^il(該抽提液為0.25gVc/mlCTAB，pH=6.06.5;2xCTAB的組成2%CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA,1.4MNaCl，pH=8.0)，再加入50[ilP-巰基乙醇，混勻后成混合液，65°C，保溫4h，其間不時(shí)搖動(dòng)；(3)將上述裝有混合液的離心管取出，4°C，12000r/min，離心15min;取上層溶液，加入等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇(25:241)混勻，4°C，U000r/min離心10min，取上層溶液，然后加入等體積的氯仿-異戊醇混合制成的液體，其氯仿異戊醇=24:1，在4。C，12000r/min離心10min，重復(fù)抽提2次，去其雜質(zhì)成抽提液；(4)將上述抽提液，加入0.61.0倍體積的異丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液(可放在-2(TC冰箱30min12h，冷凍條件有利于沉淀物的生成)；(5)將上述含有沉淀物的溶液，于4。C，12000r/min離心15min;收集沉淀物，加入300^175°/。乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄上清液，棄上清液后的沉淀物，再加入300(il75。/。乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，重復(fù)洗漆1次，得到沉淀物；(6)將裝有沉淀物的試管置于真空干燥器中510min，抽干乙醇(不能太干燥，否則DNA不易水溶)；用50去離子水溶解DNA沉淀物，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?二)、對沉淀物進(jìn)行PCR擴(kuò)增1、引物設(shè)計(jì)在美國的國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,簡稱NCBI)網(wǎng)頁搜索，查找到山茱萸科、五加科和傘形科有關(guān)的核基因組序列的相關(guān)信息。通過Primerpremier5.0軟件自動(dòng)搜索和編輯功能，分別設(shè)計(jì)上游引物和下游引物2對，其中上游引物位于18SrDNA3，端靠近ITS1的邊界，下游引物位于26SrDNA5，端靠近ITS2的邊界；另參考通用引物l對(P3/P4)作對比，序列如下PI/P25，-GTCGCTCCTACCGATTGAA-3，/5，-GGACGCTTCTCCAGACTACAA-3，；P3/P45，-TCCTCCGCTTATTGATATGCC-3，/5'-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAG-3';P5/P65，-TTGACTACGTCCCTGCCCTTTG_3，/5，-GGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3';3對引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。用提取量大且擴(kuò)增效果好的模板來篩選引物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，引物P1/P2連續(xù)擴(kuò)增三次均有單一明亮清晰的條帶，擴(kuò)增效果比較理想。確定引物P1/P2為山茱萸ITS序列的PCR擴(kuò)增引物，引物P1為上游引物，引物P2為下游引物。2、利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增50yl反應(yīng)體系，見表1。表lPCR反應(yīng)體系的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>所說的模板DNA是由PCR擴(kuò)增物制成的DNA模板；循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)94。C預(yù)變性8min，變性94°C，1min;退火55°C，1min;延伸72°C，1.5min;72。C放置10min，94。C降溫到55'C的時(shí)間及從55°。升溫72°C的時(shí)間設(shè)置均為快速升降溫。擴(kuò)增產(chǎn)物在lxTAE電泳緩沖液中用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢用0.5嗎/ml的0.5ng/ml溴化乙錠溶液染色1h，保存。利用設(shè)計(jì)引物P1/P2對山茱萸所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得單一條帶，所說的lxTAE龜泳緩沖液為Tris-HCl0.04mol/L，EDTA-Na20.02mol/L，醋酸57.lml/L制成，PH8.0。(三)、擴(kuò)增產(chǎn)物的提取純化把擴(kuò)增好的瓊脂糖凝膠板，置紫外光燈下，用潔凈的刀片將目標(biāo)條帶挖出，稱重。按照上海百賽生物技術(shù)有限公司提供的DNAGdExtractionKit操作程序的要求，嚴(yán)格操作，將擴(kuò)增產(chǎn)物DNA提取純化，最后加入35Pl(65。C預(yù)熱)的洗脫液(Eluent)，離心后用濾液重復(fù)洗滌一次，再次離心即為純化的DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(四)、測序?qū)⒓兓蟮腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司，采用3730型測序儀測序。各樣品均采用正反向測序，以保證測序的準(zhǔn)確性和完整性。得到較為完整的ITS序列。將所得序列用DNAssistVersion2.0軟件分析，先驗(yàn)證所有樣品序列正反向，然后分別與山茱萸其它種及傘形科和五加科其它種的序列比對，確定的ITS區(qū)的位置。(1)5.8S區(qū)和ITS1的確定將樣品序列與在GenBank中所查到山茱萸科狹葉四照花(AY530911)、燈臺(tái)樹(AY530918)、株木(AY530916>及山茱萸(AY530921)的ITS區(qū)的部分序列一起輸入VectorNTISuite7軟件中進(jìn)行比對，確定山茱萸的5.8S及ITS1的5，與3，端的位置，5.8S為254-409即156bp，ITS1為1-253，艮卩253bp。(2)ITS2的確定在GenBank中山茱萸科的ITS2報(bào)道均不完整，都只有部分序列。選擇山茱萸科狹葉四照花(AF297533)、毛株(AF297540)、燈臺(tái)樹(AF297541)及山茱萸(AF479163)的編碼區(qū)26S基因序列，輸入VectorNTISuite7軟件中進(jìn)行比對。從山茱萸確定26S的5'端截取10bp左右的堿基，然后到樣品的序列中去査找，即可確定ITS2的3，端，為273bp。最后確定山茱萸的ITS序列ITS1為253bp，5.8S為156bp，ITS2為273bp，總共682bp。本發(fā)明其積極效果是(1)、可用于中藥山茱萸品種的鑒定及與其混偽品的鑒別就現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，ITS區(qū)序列種間及種以上類群間的分辨率是比較好的，所以選用此片段作為中藥材的分子標(biāo)記是適宜的?？筛鶕?jù)完整的相關(guān)序列，選用適當(dāng)?shù)姆肿予b定技術(shù)，并摸索出有效的方法，進(jìn)行中藥材的真?zhèn)舞b定甚至品質(zhì)上的評價(jià)。目前植物總DNA的提取方法己比較完善，可從長期貯存的標(biāo)本中進(jìn)行提取、擴(kuò)增與測序，使中藥材的分子鑒別在方法學(xué)上得到保證。山茱萸藥材的混偽品有山茱萸科植物川鄂山茱萸cM/7e/7w'sWanger.的干燥成熟果肉、鼠李科植物酸棗j力'WeMill.、滇刺棗Zz力77力iAS/7awrj'"a/aLam.的干燥成熟果皮、小檗科植物小檗萬e2^e/^saM/re/sisRupr.的干燥成熟果實(shí)、葡萄科植物葡萄pa'w'/ersL.的干燥成熟果皮、薔薇科植物山荊子Z^"a^(L.)Barkh.的干燥成熟果實(shí)、薔薇禾斗H物山里紅Cra&e^us/j'/2;a^z'/j'ofeBge.「ar./agjarN.E.Br.、山楂Craz^se卵s"/!VsBge.、野山楂Craz^e卵5"c〃/朋tsSieb.etZucc.的干燥成熟果皮。(2)可用于被子植物系統(tǒng)發(fā)育研究ITS序列(ITS1和ITS2)由于進(jìn)化速率較快，可以提供較為豐富的信息位點(diǎn)，從而成為系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)研究中的重要分子標(biāo)記，目前已被廣泛用于研究被子植物種及種下水平、屬內(nèi)、近緣屬間乃至科內(nèi)的多樣性、系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)問題。(3)可用于中藥山茱萸的品種改良及新品種選育山茱萸栽培品種的劃分主要指標(biāo)是果實(shí)的形狀和果形指數(shù)(果實(shí)直徑/果實(shí)長度)，但是山茱萸是木本植物，從幼苗到開始掛果需要6-8年的時(shí)間，故以果實(shí)的性狀對山茱萸的品種進(jìn)行鑒別、篩選與純化是非常困難的。而利用ITS序列可作為分子標(biāo)記的特點(diǎn)可以對山茱萸幼苗進(jìn)行鑒定，可以大大縮短山茱萸品種改良及新品種選育的周期，節(jié)省成本。另外，ITS序列中間的5.8S序列帶有大量的遺傳信息，并且是rDNA的編碼區(qū)，因此，可以用于山茱萸的品種改良和育種。用現(xiàn)有DNA技術(shù)，采用本發(fā)明，對市場山茱萸產(chǎn)品190例進(jìn)行測定，準(zhǔn)確率為99.89%，效果非常之好，是未曾預(yù)料到的，而且方法簡單，節(jié)省成本，是藥品鑒定，品種培育、改良上的一大創(chuàng)造，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。序列表<110>河南中醫(yī)學(xué)院〈120〉山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法〈130〉山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法〈140〉200810049407.8<141>2008-03-25<160>1〈170〉Patentlnversion3.2〈210〉1〈211〉682<212>腿〈213>山茱萸科的山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)<400>1tcgaaacctgcacagcagaacgacccgcgaacgtgttttttacgacggcggcggggcgct60ctcgcgggtgccccggcgccatcagggtgagcgcgtgccgatcccttcgcggggggaggc120gggcgctttcccctgcaaaa3t36lCg3￡lCCccggcgcgaaccgcgccaaggaacacgsac180gcccgcgaagccccgtccgcgggcgcgatcgcgggccggcatcttccttt240atcgaaatcgaacgactctcgac幼cggatatctcggctctcgcatcgatgaagaacgta300gtg認(rèn)tgcgatacttggtgtggiattgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgc360aagttgcgcccgaagccgtcaggccgagggcacgtctgcctgggcgtctcacatcgcgtc420gcccccctcaCCEICCCC3CCacacacttcggtgacggtgggcggggggcggacag1:ggcc480ccccgtgcgctcgctcacagcacagtgtgcggtcggccgaa肪aBcg3gtcgccggcgac540ggacgtcacgacaagtggtggttgagacggsaccttaagcgtcctgtcgtgcgtgccgca600gtcgccagcgcgatgctcgcgcgacccttaacgcgccgtcaccgacggtgcctcgaccgc660gacccctcaggcgggac68權(quán)利要求1、一種山茱萸核糖體DNA的ITS片段，其特征在于，該ITS片段是由ITS1、5.8S、ITS2山苵萸核糖體DNA的三部分組成，其中，ITS1為253bp，5.8S為156bp，ITS2為273bp，總共682bp，具體是1tcgaaacctgcacagcagaacgacccgcgaacgtgttttttacgacggcggcggggcgct、61ctcgcgggtgccccggcgccatcagggtgagcgcgtgccgatcccttcgcggggggaggc、121gggcgctttcccctgcaaaaataacgaaccccggcgcgaaccgcgccaaggaacacgaac、181gaaagagcgagcccgcgaagccccgtccgcgggcgcgatcgcgggccggcatcttccttt、241atcgaaatcgaacgactctcgacaacggatatctcggctctcgcatcgatgaagaacgta、301gtgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgc、361aagttgcgcccgaagccgtcaggccgagggcacgtctgcctgggcgtctcacatcgcgtc、421gcccccctcaccaccccaccacacacttcggtgacggtgggcggggggcggacagtggcc、481ccccgtgcgctcgctcacagcacagtgtgcggtcggccgaaaaaacgagtcgccggcgac、541ggacgtcacgacaagtggtggttgagacggaaccttaagcgtcctgtcgtgcgtgccgca、6o1gtcgccagcgcgatgctcgcgcgacccttaacgcgccgtcaccgacggtgcctcgaccgc、661gaccccaggtcaggcgggacta。2、權(quán)利要求1所述的山茱萸核糖體DNA的ITS片段的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn)A、提取DNA，方法是(1)取山茱萸植物葉片0.2g放入研缽，加入葉片重量的10%PVP粉末，在液氮中研磨成細(xì)粉；(2)將細(xì)粉裝到1.5ml離心管，加入冷藏的提取緩沖液1200^d，該緩沖液為25mMTris-HCl，pH=8.00，冰上放置10min，8000r/min離心5min，棄去上清液，加入用Vc+2xCTAB制成的抽提液600ial，該抽提液為0.25gVc/mlCTAB，pH=6.06.5;2xCTAB的組成2%CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA，1.4MNaCl,pH=8.0，再加入50jalP-巰基乙醇，混勻后成混合液，65°C，保溫4h，其間不時(shí)搖動(dòng)；(3)將上述裝有混合液的離心管取出，4。C，12000r/min，離心15min;取上層溶液，加入等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇，飽和酚氯仿異戊醇=25:24:1混勻，4。C，12000r/min離心10min，取上層溶液，然后加入等體積的氯仿-異戊醇混合制成的液體，其氯仿異戊醇=24:1，在4C，12000r/min離心10min，重復(fù)抽提2次，去其雜質(zhì)成抽提液；(4)將上述抽提液，加入0.61.0倍體積的異丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液，放在-20'C冰箱冷凍30min12h;(5)將上述含有沉淀物的溶液，于4°C，12000r/min離心15min;收集沉淀物，加入300^175%乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄上清液，棄上清液后的沉淀物，再加入300^75%乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，重復(fù)洗滌1次，得到沉淀物；(6)將裝有沉淀物的試管置于真空干燥器中510min，不能太干燥，否則DNA不易水溶；用50pl去離子水溶解DNA沉淀物，-20"C冰箱保存?zhèn)溆?；B、對沉淀物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法是(1)、引物設(shè)計(jì)該引物為PI/P25，—GTCGCTCCTACCGATTGAA—3，/5，—GGACGCTTCTCCAGACTACM-3，，引物Pl/P2為山茱萸ITS序列的PCR擴(kuò)增引物，引物P1為上游引物，弓I物P2為下游引物；(2)、利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法是用PCR反應(yīng)體系進(jìn)行，該反應(yīng)體系為用水稀釋10倍的上述DNA沉淀物6.0ul，25mM的Mg^6.0y1、10xPCRbuffer5.0|il、2.5mM的dNTP6.0|il、上下游引物各5.0|il、5U/pl的Taq酶2.5pi和ddH2014.5^組成，反應(yīng)參數(shù)是94。C預(yù)變性8min，變性94°C，1min;退火55°C，1min;延伸72°C，1,5min;72°C再保持10min;擴(kuò)增產(chǎn)物在lxTAE電泳緩沖液中用1.5°/。瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢用0.5嗎/ml的溴化乙錠染色1h，保存，利用引物P1/P2對山茱萸所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得單一條帶，所說的lxTAE電泳緩沖液為Tris-HC10.04mol/L，EDTA-Na20.02mol/L，醋酸57.lml/L制成，PH8,0;C、擴(kuò)增產(chǎn)物的提取純化把擴(kuò)增好的瓊脂糖凝膠板，置紫外光燈下，用潔凈的刀片將目標(biāo)條帶挖出，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物DNA提取純化，最后加入35ul的洗脫液，離心后用洗脫液重復(fù)洗滌一次，再次離心即為純化的DNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物；D、測序?qū)⒓兓蟮腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用正反向測序，得ITS序列，將所得序列用DNAssistVersion2.0軟件分析，然后分別與山茱萸其它種及傘形科和五加科其它種的序列比對，確定ITS區(qū)的位置，得ITS1、5.8S、ITS2三部分片段。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的山茱萸核糖體DNA的ITS片段的制備方法，其特征在于，所說的ITS區(qū)位置的確定是(1)5.8S區(qū)和ITS1的確定將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列與在GenBank中所査到山茱萸科狹葉四照花、燈臺(tái)樹、楝木及山茱萸的ITS區(qū)的部分序列一起輸入VectorNTISuite7軟件中進(jìn)行比對，確定山茱萸的5.8S及ITSl的5'與3'端的位置，5.8S為254-409即156bp，ITSl為1-253，即253bp;(2)ITS2的確定選擇山茱萸科狹葉四照花、毛株、燈臺(tái)樹及山茱萸的編碼區(qū)26S基因序列，輸入VectorNTISuite7軟件中進(jìn)行比對，從山茱萸確定26S的5'端截取10bp左右的堿基，然后到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列中去查找，即可確定ITS2的3，端，為273bp;最后山茱萸的ITS序列為ITSl為253bp，5.8S為156bp，ITS2為273bp，總共682bp。全文摘要本發(fā)明涉及山茱萸核糖體DNA的ITS片段及其制備方法，可有效解決山茱萸的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質(zhì)資源的開發(fā)利用問題，ITS片段由三部分組成，即ITS1，5.8S，ITS2，制備方法是取山茱萸植物葉片研碎，加入PVP粉末研成細(xì)粉，將細(xì)粉置于提取緩沖液中，離心，棄去上清夜，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巰基乙醇，混勻，加入由等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇制成的溶液處理2次，除去雜質(zhì)，離心，取上清液，加入異丙醇，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物質(zhì)，再利用設(shè)計(jì)的引物對DNA物質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化，對純化后的PCR產(chǎn)物測序得ITS片段，方法簡單、科學(xué)，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。文檔編號C12N15/29GK101285067SQ20081004940公開日2008年10月15日申請日期2008年3月25日優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日公開號200810049407.8發(fā)明者潘成學(xué),陳隨清申請人:河南中醫(yī)學(xué)院