專利名稱：：一種豬標(biāo)記輔助選擇的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記rnase6的克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于家畜基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：作為農(nóng)業(yè)大國(guó)，畜禽的養(yǎng)殖特別是豬的養(yǎng)殖在我國(guó)畜牧業(yè)中占有舉足輕重的地位。隨著人們對(duì)豬肉消費(fèi)的增加以及對(duì)豬肉品質(zhì)要求不斷的提高，促使人們對(duì)豬的遺傳育種改良主要集中于生產(chǎn)性狀。隨著生產(chǎn)集約化程度的不斷提高以及飼養(yǎng)條件的改變，近幾年不斷爆發(fā)的大范圍疾病流行，表明疾病已成為制約我國(guó)的畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素。疾病尤其是病毒性傳染病嚴(yán)重的影響著豬的健康和生產(chǎn)，導(dǎo)致豬的死亡、生產(chǎn)效率降低、醫(yī)藥費(fèi)用增加等一系列問(wèn)題，最終造成養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失；它甚至?xí)?yán)重影響和降低豬的遺傳育種進(jìn)程。隨著遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，人們已將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于畜禽抗病育種方面，旨在解決、提高動(dòng)物機(jī)體對(duì)病原的抗性，并且確定了一些與豬疾病抗性有關(guān)的候選基因及主效基因?？缭?號(hào)染色體著絲粒的豬淋巴細(xì)胞抗原(5ZJ)復(fù)合體(SmithTP等.Directedintegrationofthephysicalandgeneticlinkagemapsoftheswinechromosome7revealsthat5Z力spansthecentromere.GenomeResearch,1995，5:259-271)即豬主要組織相容性復(fù)合體(MajorHistocompatibilitycomplex,是一組與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的基因家族，在宿主的免疫反應(yīng)中，對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)的遺傳控制有重要作用。一些學(xué)者對(duì)5L4單倍型或等位基因與免疫應(yīng)答、抗病性的關(guān)系進(jìn)行了研究RothschildMF等(RothschildMF等.Thesetrogenreceptorlocusisassociatedwithamajorgeneinfluencinglittersizeinpigs[J].ProcNatlAcadSci,1996，93:201-205)發(fā)現(xiàn)微型豬單倍型"http://8對(duì)感染支氣管敗血性波氏桿菌高反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)；HrubanV等(HrubanV等.Presenceofspecifici^Chaplotypeinmelanoblstomabearingminipigs.AnimalGenetics,1994,25(suppl.2,CI))貝ij觀察至ljI等位基因與惡性黑色素瘤的出現(xiàn)存在關(guān)聯(lián)。位于豬15號(hào)染色體q2.3-2.6的基因(SunHS等.Mappingofthenaturalresistance-associatedmacrophageprotein1(AffiW尸/)genetopigchromosome15.AnimalGenetics,1998，29:138-140)屬于天然抗性相關(guān)的巨噬蛋白基因家族，GuolongZhang等(GuolongZhang等.CloningofPorcineyWiMJ/P/andItsInductionbyLipopolysaccharide,TumorNecrosisFactorAlphaandInterleukin-lP:RoleofCD14andMitogen-ActivatedProteinKinases[J].infectionandimmunity,2003,3:1086-1093)通過(guò)對(duì)豬順Mi/P/基因的mRNA表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞核特異性組織中都可表達(dá)，但在巨噬細(xì)胞中表達(dá)量最高，推測(cè)其可能通過(guò)消耗含有胞內(nèi)病原生物的吞噬體中二價(jià)金屬離子如鎂、亞鐵、鋅等離子使病原微生物缺乏增殖必需的離子而達(dá)到抵抗胞內(nèi)微生物的作用。KramerJ等(KramerJ等.AssociationoftwelvecandidategenepolymorphismsandresponsetochallengewithSalmonellaenteritidisinpoultry.AnimGenet,2003,34:339-348)發(fā)現(xiàn).MAJ/P/等位基因與雞沙門(mén)氏菌感染反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)。干擾素(interferon,//W)作為機(jī)體最重要的細(xì)胞因子之一，因其具有廣譜抗病毒、免疫調(diào)節(jié)與增強(qiáng)功能及其它生物活性而被人們廣泛研究。體外重組0-干擾素可顯著抑制豬流行性腹瀉病毒的感染(曹瑞兵等.豬P-干擾素的原核表達(dá)及其對(duì)豬流行性腹瀉病毒的抑制作用研究[J].中國(guó)病毒學(xué)，2004，19(4):364-368);體內(nèi)注射豬瘟疫苗和干擾素可增強(qiáng)對(duì)豬瘟病毒的防御能力(SuradhatS等.Thecorrelationofvirus-specificinterferon-gammaproductionandprotectionagainstclassicalswinefevervirusirrfecticm.VetImmunolImmunopathol,2001，83(3-4):177-189)。AWA5X^(Kibonuclease6)屬于核糖核酸酶A超家族，它們具有相似的初級(jí)結(jié)構(gòu)和酶活性。人y朋5S^多數(shù)體細(xì)胞組織中表達(dá)，且是單拷貝的基因(RosenbergHF等.Eosinophilcationicproteinandeosinophil-derivedneurotoxin:Evolutionofnovelfunctioninaprimateribonucleasegenefamily.JBiolChem,1995，270(50):30234)。HeleneF等(HeleneF等.Molecularcloningandcharacterizationofanovelhumanribonuclease(y&V;4S2^6):increasingdiversityintheenlargingribonucleasegenefamily.NucleicAcidsKes,1996，24(18):3507-3513)對(duì)人yWASS5進(jìn)行了分子鑒定，并揭示了其重組蛋白的免疫活性和核糖核酸酶活性。人^VA^碰人單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞有表達(dá)，但在嗜酸性粒細(xì)胞未檢測(cè)到其mRM的表達(dá)，推測(cè)其與宿主防御有關(guān)。KimberlyDD等(kiraberlyDD等.Isolation,Characterization,andEvolutionaryDivergenceofMouseRNASE6:EvidenceforUnusualEvolutioninRodents.JMolEvol,2004，59:657-665)將鼠^^SZ^定位于鼠14號(hào)染色體；并對(duì)嚙齒類iWA5a5基因的進(jìn)化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其在嚙齒類動(dòng)物中序列較為保守，也有可能有利-T宿主防御。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的S的在于從肌W5f6基因中克隆一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其在豬標(biāo)記輔助選擇關(guān)聯(lián)分析上的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人從報(bào)道基因/P朋5f《中克隆得到與豬免疫性狀相關(guān)基因的DM片段，它的cDNA序列如序列表SEQIDN0:l和附圖2所述(該序列包括全部CDS和部分5'-UTR、3'-UTR)。它的部分DNA序列如序列表SEQIDNO:3和附圖3所述。序列表SEQIDNO:3的第296bp處有一個(gè)C296-T296的堿基突變，導(dǎo)致ifepl-RFLP多態(tài)性。這個(gè)堿基突變位于必VA5"f《基因第2外顯子中，但不改變其翻譯的氨基酸序列。申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了一對(duì)克隆豬免疫性狀相關(guān)基因VWAS5^的引物，該引物的DNA序列如SEQIDNO:1所示。與此同時(shí)申請(qǐng)人克隆了擴(kuò)增^VAS^6基因第2外顯子所用的引物，該引物的DM序列如SEQIDN0:3所示。本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的制備方法是用人/SVA5^^基因mRNA(GenBank收錄號(hào)NM_005615.2)為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性70%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽然后拼接豬表達(dá)序列標(biāo)簽-重疊群；與人同源比對(duì)，根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽-重疊群設(shè)計(jì)引物；以成年通城豬胃組織提取總RNA為模板，作RT-PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測(cè)序，進(jìn)行序列分析，獲得如序列表SEQIDNO:l所述的cDNA序列(包括全部CDS和部分5'-UTR、3'-UTR);提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序，獲得如序列表SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。應(yīng)用常規(guī)的PCR-RFLP的方法對(duì)序列表SEQIDNO:3所示的第2恥位堿基突變進(jìn)行了檢測(cè)，并初步進(jìn)行其基因型與豬部分免疫性狀之間的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。更詳細(xì)的技術(shù)方案請(qǐng)參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)的《》及《具體實(shí)施方式》中的實(shí)施例。序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明克隆的豬免疫性狀相關(guān)基因7WASf6的部分cDNA序列；序列表SEQIDNO:2是本發(fā)明克隆的豬免疫性狀相關(guān)基因朋i^^6編碼的蛋白質(zhì)序列；序列表SEQIDNO:3是本發(fā)明克隆的豬免疫性狀相關(guān)基因iWA5^《的部分DNA序列；圖l:是本發(fā)明技術(shù)流程圖；圖2:是本發(fā)明中豬i5W5^6基因cDNA序列(包括全部CDS和部分5'-UTR、3'-UTR)，圖中起始密碼子和終止密碼子用標(biāo)有下劃線的斜體顯述，引物序列用斜體加粗及陰影顯述；圖3:是本發(fā)明中豬忠W5^ff基因DNA序列，圖中突變位點(diǎn)用標(biāo)有下劃線的4號(hào)加粗斜體顯述，引物序列用斜體加粗及陰影顯述；圖4:是本發(fā)明中豬必W5^5基因基因組擴(kuò)增電泳結(jié)果，圖中M:DL2000;圖5:是本發(fā)明中豬忠VAS^基因第2外顯子的/)&pI-RFLP的三種基因型(TTTCCC)電泳結(jié)果，圖中M:DL2000;圖6:是本發(fā)明中豬^VASXS基因反向測(cè)序發(fā)現(xiàn)的C-T突變。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:(一)豬/P朋6S基因的CDS克隆及部分DNA序列擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì)以報(bào)道的人yyVASX"堪因mRNA(GenBank收錄號(hào)NM_005615.2)為信息探針，利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具掃描GenBank豬表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)，將同源性大于70%、片段長(zhǎng)度大于100bp的豬的表達(dá)序列標(biāo)簽全部下載到電腦上，然后用生物學(xué)軟件DNAStar中的SeqMan程序?qū)⒇i/P/VA5^堪因的表達(dá)序列標(biāo)簽拼接成表達(dá)序列標(biāo)簽-重疊群。根據(jù)與人yRV力5ff堪因niRNA的同源比對(duì)初步確定起始及終止密碼子位置，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0，以拼接的表達(dá)序列標(biāo)簽-重疊群作為引物設(shè)計(jì)的模板序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下/yVASK5CDS:正向5'CCAGGACTAACTGCTGCTTC3'，反向5'CTCCAGTCCAACCTCCTCAT3'。該引物的D他序列擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為665bp。(2)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增反應(yīng)利用TRIzoL試劑盒(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)從成年"通城豬"(一種具有中國(guó)地方豬血緣的地方豬種)胃組織中提取總RNA，具體操作方法參照TRIzoL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。cDNA第一鏈的的合成反應(yīng)總體積為50n1，首先將總RNA2ug與oligod(T)u4u1，隨機(jī)引物1u1,DEPC水9ii1混合于一離心管中，70'C變性5min以解除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，立即置于冰上冷卻以避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的重新生成，經(jīng)短暫離心后加入M-MLV1.5y1,5Xbuffer10u1，dNTP2.5ul，KNASE抑制劑lul和DEPC水20ul，于42'C溫育1h后將溫度升至95'C滅活反轉(zhuǎn)錄酶，置于-20'C保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)反應(yīng)總體積為lOiil,其中豬cDNA模板0.5u1,雙蒸水6.9ul,bufferlnl，Mg2'0.6u,10mM正向引物和反向引物各O.3nl，dNTP0.2ul，Taq酶0.2ylOU/ul)。PCI反應(yīng)條件為:94'C預(yù)變性5min后，循環(huán)35次94。C變性30s、62'C退火30s、72'C延伸25s,最后72'C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(3)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5ml離心管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(新長(zhǎng)江)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟是按照100rag膠塊加入400u1GSBuffer的比例加入GSBuffer,置50'C溫育10min，使瓊脂糖膠塊完全溶化，每?jī)煞昼婎嵉够靹蛞淮危粚⑷芑哪z液轉(zhuǎn)入到離心吸附柱，并將離心吸附柱置于廢液收集管中，10000rpm離心30s,棄去廢液；將離心吸附柱置回廢液收集管中，加入500iUWashBuffer于離心吸附柱中，10000rpm離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用500;UWashBuffer溶液洗滌一次；將離心吸附柱置會(huì)廢液收集管中，最高速度離心lmin;小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)無(wú)齒的1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30"l雙蒸水，室溫靜置2-10min后，最高速度離心lmin;取山離心吸附柱，將l.5ml離心管(DNA溶液)置于-20'C保存?zhèn)溆?。連接反應(yīng)將純化PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(購(gòu)自takara公司)連接，連接反應(yīng)總體積是5y1，其中包括SolutionI2.5ul，pMD18-T0.5ul，純化PCR產(chǎn)物2ul'4"C過(guò)夜。感受態(tài)細(xì)胞的制備從37'C培養(yǎng)了16-20h的新鮮平板上挑取一個(gè)DH5ci單菌落接種于2mlLB中，丁-37'C振蕩培養(yǎng)3h,轉(zhuǎn)接菌液于含有30mlLB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37'C振蕩培養(yǎng)約4h,待OD秘。達(dá)到0.3-0.4時(shí)將鹽水瓶從搖床取出，冰浴冷卻10-15min,然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4'C4000rpm離心10min,棄去培養(yǎng)液，用10ral冰預(yù)冷的0.1mo1/1的CaCh重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4'C4000rpm離心lOmin，用4ral冰預(yù)冷的0.lmo1/1的CaCl2重懸沉淀，置4'C保存?zhèn)溆谩＾D(zhuǎn)化無(wú)菌狀態(tài)下取100-120ul感受態(tài)細(xì)胞于1.5inl離心管中，將5u1的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42。C熱激90s，其間不要搖動(dòng)離心管，取出后冰浴3-4rain，加入400u1無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)45min。取100"l涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-P-D-galactoside，異丙基硫代-P-D-半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37'C平放1h后倒置培養(yǎng)。序列測(cè)定策略是采用克隆測(cè)序方法。克隆測(cè)序是挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆子用于測(cè)序，序列測(cè)定由北京奧科公司完成，每個(gè)基因片段至少測(cè)兩個(gè)克隆子。(4)DNA序列同源性檢索鑒定通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:Mvww.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件，將測(cè)序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。(二)PCR-RFLP診斷方法建立(1)引物序列vW15^6SNP:正向5'TATTGCTGCTGGGACTGT3'，反向5'GGGAACAAACGGATAAGG3'。該引物擴(kuò)增片段K度404bp。(2)PCK擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體積10n1，其中豬基因組DNA模板1u1,雙蒸水7.12n1，10Xbuffer1u1，10mM正向引物和反向引物各O.3n1，dNTP0.2u1'Taq酶0.08w1(5U/u1)。PCR反應(yīng)條件為:94'C預(yù)變性5min后，循環(huán)4次94'C變性30s、58'C退火30s、72'C延伸30s:循環(huán)4次94。C變性30s、56'C退火30s、72。C延伸30s;循環(huán)28次94。C變性30s、54。C退火30s、72'C延伸30s，最后72'C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(3)RFLP檢測(cè)PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10u1，其中PCR產(chǎn)物3yl，雙蒸水5.85u1,1XbufferTango1y1，限制性內(nèi)切酶#胡1為0.15wl(lOU/tU)，將樣品混勻后離心，37'C培養(yǎng)箱放置4h，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了404bp特異性擴(kuò)增片段，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段在第2恥位發(fā)現(xiàn)一個(gè)C-T轉(zhuǎn)換，位于外顯子2中(如圖6所示)，造成一個(gè)#印1酶切位點(diǎn)(C"CGG)，其中第295bp處為多態(tài)性酶切位點(diǎn)。酶切產(chǎn)生三種基因型，TT基因型只有404bp—條帶，CC基因型有295bp和109bp兩條帶，雜合子TC基因型有404bp，295bp和109bp的三條帶，如圖5所述。實(shí)施例2:利用PCR-i&;7l-RFLP檢測(cè)了7個(gè)不同中外豬品種其中具有國(guó)外豬血緣的豬種分別是長(zhǎng)白豬、大白豬和杜洛克豬，具有中國(guó)地方豬血緣的豬種分別是清平豬、一花臉豬、大花白豬和玉山黑豬。該突變位點(diǎn)在不同豬種中的基因型和基因頻率如表1所示，結(jié)果顯示《W5f(5基因各基因型在長(zhǎng)白豬、大白豬和二花臉豬都有分布，杜洛克豬和清平豬中沒(méi)有檢測(cè)到TT基因型，大花白豬和玉山黑豬沒(méi)有檢測(cè)到CC基因型。x2檢驗(yàn)7個(gè)不同中外豬品種間基因型頻率差異如表2所示，結(jié)果顯示7個(gè)不同品種間基因頻率分布存在著一定的差異。表1不同豬品種中iBW5fff基因多態(tài)性的基因型和基因頻率品種個(gè)體數(shù)基因型等位基因頻率TTTCCCTC長(zhǎng)白豬1811520.750.25大白豬33210110.2120.788杜洛克豬31014170.2260.774清平豬29012170.2070.793二花臉豬192890.3160.684大花白豬2116500.8810.119玉山黑豬127500.7920.208表2不同豬品種中yWA^6基因#砂1多態(tài)性基因頻率的x2檢驗(yàn)結(jié)果品種大白豬杜洛克豬清平豬二花臉豬大花白豬玉山黑豬長(zhǎng)白豬13.722525.4475'24.4915*11.35892.71121.75926大白豬2.829292.812670.041647623.5132*13,3011杜洛克豬0.08727653.4145836.6972"24.6879'清平豬3.3224135.5114**23.9513'二花臉豬20.532511.4745大花白豬1.15295注"表示P〈0.01，'表示P〈0.05。x20.05(12)=21.02607，x20.0,(12)=26.21697。實(shí)施例3:利用PCR-,印I-RFLP檢測(cè)了廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺(tái)原種豬場(chǎng)的"長(zhǎng)白豬"群(一種具有國(guó)外豬血緣的豬種)，豬群的基因型頻率、基因頻率、香農(nóng)指數(shù)和x2檢驗(yàn)P值如表3所示，結(jié)果顯示^VASS基因各基因型在長(zhǎng)白豬種均有分布，CC基因型數(shù)最少，TT基閔型數(shù)最多，長(zhǎng)白豬是T等位基因占優(yōu)勢(shì)；^VAS^5基因的香農(nóng)指數(shù)較高，該廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺(tái)原種豬場(chǎng)的長(zhǎng)白豬群的多樣性較大；對(duì)該基因進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡定律適合性檢驗(yàn)，結(jié)果表明在長(zhǎng)白豬群中^WSW基因的基因型和基因頻率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P〉0.05)。表3本發(fā)明的PCR-ifepI-RFLP多態(tài)性在長(zhǎng)白豬中的分布基因型基因頻率x2檢驗(yàn)P值個(gè)體數(shù)香農(nóng)指數(shù)TTTCCCTC29517498230.7560.2440.55830.145808實(shí)施例4:本實(shí)驗(yàn)豬群來(lái)自廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺(tái)原種豬場(chǎng)的長(zhǎng)白豬群，父母代及子一代全部進(jìn)行了基因型檢測(cè)，子代在0、17、32日齡采集抗凝血和非抗凝血，用于血常規(guī)和抗體水平檢測(cè)。所分析的性狀主要是免疫性狀，包括子一代豬分別在0、17、32三個(gè)日齡的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平、豬瘟病毒抗體水平、偽狂犬抗體水平及血常規(guī)18項(xiàng)指標(biāo)。根據(jù)采集樣品的群體結(jié)構(gòu)，申請(qǐng)人運(yùn)用混合模型來(lái)統(tǒng)計(jì)分析ySVAS^《基因SNP位點(diǎn)的基因型效應(yīng)及其與免疫指標(biāo)的關(guān)系Y=XP+Zy+e其中Y為免疫性狀測(cè)定值向量；X為固定效應(yīng)關(guān)聯(lián)矩陣；e為固定效應(yīng)參數(shù)向量，包括性別效應(yīng)、胎次效應(yīng)、線別效應(yīng)、候選基因的基因型效應(yīng)；Z為混合模型中的隨機(jī)效應(yīng)的關(guān)聯(lián)矩陣；Y為所有隨機(jī)效應(yīng)參數(shù)向量，包括公畜效應(yīng)、公畜內(nèi)母畜效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)；采用SAS(Version8.0)軟件中MIXEDMODELS程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)豬朋iiS^5基因第2外顯子#s;I-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)與部分免疫性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，由表7可知在295個(gè)個(gè)體中TT基因型有174個(gè)，TC基因型有98個(gè)，CC基因型有23個(gè)。所分析的免疫性狀主要是子一代豬分別在0、17、32三個(gè)日齡的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平、豬瘟病毒抗體水平、偽狂犬抗體水平及血常規(guī)18項(xiàng)指標(biāo)，不同基因型之間性狀差異顯著性的結(jié)果如表4-6所示，所得到相關(guān)的性狀是0曰齡平均紅細(xì)胞體積、0日齡平均血紅蛋白量和0日齡中性粒細(xì)胞如表4所示。表4i0W52^基因第2外顯子多態(tài)性位點(diǎn)基因型與0日齡部分免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)免疫性狀鵬娜免疫性狀環(huán)娜免疫性狀細(xì)腳(0日齡)6xon2(0日齡)exon2(0日齡)6xon2豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平0.7851平均紅細(xì)胞體積<.OOO廣淋巴細(xì)胞絕對(duì)值0.7679豬瘟病毒抗體水平0.1210平均血紅蛋白量0.0016**中間白細(xì)胞絕對(duì)值0.4157偽狂犬抗體水平0.3765平均血紅蛋白濃度0.0746中性粒細(xì)胞絕對(duì)值0.9906白細(xì)胞0.9633血小板0.7724紅細(xì)胞分布寬度0.7084紅細(xì)胞0.3657淋巴細(xì)胞0.6621血小板分布寬度0.3449血紅蛋白0.1319中間白細(xì)胞0.8018血小板體積0.1523紅細(xì)胞壓積0.1310中性粒細(xì)胞0.0240'大血小板比率0.0568注"表示P〈0.01，'表示P〈0.05。表5^BVASS^基因第2外顯子多態(tài)性位點(diǎn)基因型與17日齡部分免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)免疫性狀(0日齡)■5M6xon2免疫性狀(0日齡)卿鄉(xiāng)6xon2免疫性狀(0日齡)側(cè)鄉(xiāng)exon2豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平0.7233平均紅細(xì)胞體積0.1158淋巴細(xì)胞絕對(duì)值0.9028豬瘟病毒抗體水平0.7404平均血紅蛋白量0.1033中間白細(xì)胞絕對(duì)值偽狂犬抗體水平0.4608平均血紅蛋白濃度0.5163中性粒細(xì)胞絕對(duì)值白細(xì)胞0.4527血小板0.9942紅細(xì)胞分布寬度0.6443紅細(xì)胞0.5472淋巴細(xì)胞0.3279血小板分布寬度0.8142血紅蛋白0.7438中間白細(xì)胞血小板體積0.2193紅細(xì)胞壓積0.5690中性粒細(xì)胞大血小板比率0.3920注"表示P〈0.01，'表示P〈0.05。表6^VAS^6基因第2外顯子多態(tài)性位點(diǎn)基因型與32日齡部分免疫性狀的關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)免疫性狀卿娜免疫性狀鵬鄉(xiāng)免疫性狀細(xì)娜(0日齡)exon2(0日齡)exon2(0曰齡)exon2豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體水平0.7653平均紅細(xì)胞體積0.0722淋巴細(xì)胞絕對(duì)值0,9829豬瘟病毒抗體水平0.2026平均血紅蛋白量0.1784中間白細(xì)胞絕對(duì)值偽狂犬抗體水平0.8400平均血紅蛋白濃度0.6412中性粒細(xì)胞絕對(duì)值白細(xì)胞0.8204血小板0.8730紅細(xì)胞分布寬度0.5823紅細(xì)胞0.7659淋巴細(xì)胞0.9369血小板分布寬度0.7655血紅蛋白0.5347中間白細(xì)胞血小板體積0.6889紅細(xì)胞壓積0.8937中性粒細(xì)胞大血小板比率0.7614注"表示P〈0.01,'表示P〈0.05。由表4-6可知，y&VASS基因第2外顯子的SNP位點(diǎn)對(duì)0日齡平均紅細(xì)胞體積和0日齡平均血紅蛋白量有極顯著影響(P<0.01),對(duì)0日齡中性粒細(xì)胞有顯著影響(P<0.05)，此位點(diǎn)對(duì)其它免疫性狀沒(méi)有顯著影響。對(duì)0日齡平均紅細(xì)胞體積和0日齡平均血紅蛋白量有極顯著影響(P<0.01)，對(duì)0日齡中性粒細(xì)胞有顯著影響(P<0.05)的y/VA5^《基因第2外顯子的SNP位點(diǎn)基因型的最小二乘均數(shù)如表7所示。表7SNP位點(diǎn)(y0W5S)基因型0日齡平均紅細(xì)胞體積、0曰齡平均血紅蛋白量和0日齡中性粒細(xì)胞的最小二乘均數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注"表示P〈0.01，'表示P〈0.05。由表7可知，TC基因型個(gè)體的O日齡平均紅細(xì)胞體積顯著高于TT基因型(P<0.05);CC基因型個(gè)體的0日齡平均紅細(xì)胞體積、0日齡平均血紅蛋白量和O日齡中性粒細(xì)胞極顯著高于TT基因型(P<0.01);CC基因型個(gè)體的O日齡平均紅細(xì)胞體積極顯著高于TC基因型(P<0.01),而CC基因型個(gè)體的O日齡平均血紅蛋白量和O日齡中性粒細(xì)胞顯著高于TC基因型(P<0.05)。因此，C等位基因是O日齡平均紅細(xì)胞體積、0日齡平均血紅蛋白量和0日齡中性粒細(xì)胞的有利等位基因。血常規(guī)的檢測(cè)不僅有利于動(dòng)物正常生長(zhǎng)和生存，而且有助T改進(jìn)飼養(yǎng)與管理和預(yù)防疾病的發(fā)生。平均血紅蛋白量即平均單個(gè)紅細(xì)胞血紅蛋白量，與每升血液中血紅蛋白量呈正比。平均血紅蛋白量越高，那么血紅蛋白量也越高，機(jī)體的循環(huán)和免疫系統(tǒng)的功能越強(qiáng)，對(duì)疾病的抵抗能力越大(程澤信等.家豬與家野雜交豬血液中八項(xiàng)指標(biāo)的比較分析.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007,46(3):419-421)。有關(guān)報(bào)道中平均血紅蛋白量與平均紅細(xì)胞體積呈極顯著正相關(guān)，而平均紅細(xì)胞體積與白細(xì)胞數(shù)呈顯著正相關(guān)(劉榜等.通城豬及其雜種豬若千免疫性狀的研究.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,22(5):469-473)。中性粒細(xì)胞亦屬于白細(xì)胞。在血液、淋巴組織、脾等組織中均存在有白細(xì)胞，其通過(guò)吞噬作用對(duì)機(jī)體損傷治愈、抗御病原入侵和疾病免疫方面起著重要的作用。當(dāng)血常規(guī)中的平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白量和中性粒細(xì)胞越高，那么白細(xì)胞數(shù)也越高表明機(jī)體對(duì)于疾病的抵抗力越強(qiáng)。_序列表_<110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>—種豬標(biāo)記輔助選擇的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記7WASS的克隆及應(yīng)用<130><141〉2008-01-14〈歸3<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211>665<212〉腿<213〉豬(Susscrofa)<220>〈221>gene<222>(1)..(665)<223><220><221〉3'腿<222>(522)..(665)<223〉<220><221〉5'脂<222>(1)..(59)<223><220>《221>primer—bind<222>(646)..(665)<223><220><221〉primer_bind<222>(l)..咖〈223><220>〈221〉CDS〈222〉(60)..(521)〈223〉〈400〉1ccaggactaactgctgcttctcttctcagcgggaaccccaatggggccagatctgagatgctttcctetcetcMetGlyProAspLeuArgCysPheProLeu1510ctgtggtggteagtgcgtccactttgtgccLeuTrpTrpSerValArgProLeuCysAlagcgtggagacctgagaaaacteittgctgctgggaLeuLeuLeuLeu鄉(xiāng)getArgAlatgc犯cCysAsn50cctcaaProGin65tgtaatCysAsncagagtGinSeraactatAsnTyrattgttlieVal130gttcccGin35犯gLys犯cAsnttaLeugesAlaccgPro115gccAlateaSer20tggTrpgcaAlaaccThrcccPro犯gLys100肌cAsntgtCysmPheatgMetutPheaacAsn85cctProtgcCysgatAspThr犯cAsnctgLeu70ateliegttValcgcArgcccProgtacacttagatElttlie敏Ser55cax;HisThrSertacTyrccgPro135犯gcagGin40gtcValgacAsptgtCysctgLeuaaaLys120cagGintgtCys25catHis犯cAsntecSer卿LysactThr105gatAsp犯gLysatalielie犯tAsnttcPheaacAsn90csgGingccAlaggcGlyGintatTyrC￡lgGin75ggcGlytgcCysgccAlaLeu15etcLeuetcLeutgtCysactThrtgcCys95gggGlyttcPhe203251299ateatttaacccaagaatProLysAsn30ccaagecctProSerPro45acttggc￡icThrTrpHis60gatgtggccAspValAlacagaac犯cGinAsnAsnagtttcactSerPheThr110caatac幼gGinTyrLys125gaccctccttatccgttt491AspProProTyrProPhe140agtttccatcactttccctc541GlyaccThrca_aGin卿LysgccAla80ca_cHisgggGlytttPhe5910715534739544313ValProValHisLeuAspLyslielie145150tcactcagctcgcgttctcttatgatctcttctgatttttcttttgttgattttcctggt601tccc3tgg肪gsaaaaaaaggsgggtgttggaasaatcsgagcgatgsggsggttggact661ggsg665〈210〉2<211〉153<212>PRT<213>豬(Susscrofa)<400>2Met1LeuGlyProAspLeuArgCysPheProLeuLeuLeuLeuLeuLeuGlyTrpTrpArgAlaCysPro65CysAsn50GinGin35LysSer20Trp5ValArgProLeuPheThrlieAlaMetAsnAsnThrPheAsnLeuProGinSerAlaAsnTyrlieVal145Val130ProPro115AlaLys100AsnAsn85ProLeu70lieSer55HisGin40ValCys25His10AlalieProLyslieGinProAsnAsnTyrAspSerPheThrCysLysValSerLeuCysArgTyrCysAspProValHisLeuAsp150Pro135LysLys120GinThr105AspAsn90GinGin75GlyThr60AspSer45TrpAsn30Pro15LeuThrLeuGinHisCysLysValAlaThrGinAsnAsnCysSerPheAlaAlaGinLysGlyAspPro140Tyr125ProThr110LysCys95GlyAla80HisGlyPhePheTyrProPhelielie〈210〉3<211>404<212〉腿<213>豬(Susscrofa)〈220〉〈221〉gene<222〉(1)..(404)<223>〈220〉<221〉exon<222>(1)…(404)<223><220〉<221>primer_bind<222>(387)…(404)<223><220〉<221>primer—bind<222>(1)..(18)<223>〈220〉<221>mutation<222>(296)..(296)<223〉<400>3ccatac48ProTyr15ttcage96PheSerattata144lielietattgctgctggTyrCysCysTrp1ccaagaateteaProArglieSer20caagccetctecGinAlaLeuSer35gactgtggtggtcagAspCysGlyGlyGin5ccagggetcaatggtProGlyLeuAsnGly25aatgcaacaaggcaaAsnAlaThrArgGin40tgcgtccactttgtgCysValHisPheVal10tt&caattcageataLeuGinPheSerlie30tgaacggtgteaacaThrValSerThr45cttggcactgtaageetcaaaacacctttctgcacgactccttecagg192LeuGlyThrValSerLeuLysThrProPheCysThrThrProSerArg505560atgtggccactgcctgtaatttacccaacateacctgtaagaacggcc240MetT卬ProLeuProVallieTyrProThrSerProValArgThrAla657075agaacaactgccaccagagtgcaaagectgttagcctgaetcagtgca288ArgThrThrAlaThrArgValGinSerLeuLeuAlaLeuSerAla808590gttteacyggggggaactateeggiactgccgetaca肌g3tgccgccc336ValSerXaaGlyGlyThrlieArgThrAlaAlaThrLysMetProPro95100105110犯tacaagttctttattgttgcctgtgateccccgcaga￡igggcgacc384AsnThrSerSerLeuLeuLeuProVallieProArgArgArgAlaThr115120125etccttatecgtttgttccc404LeuLeulieArgLeuPhe130權(quán)利要求1、一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO3所述。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記，其特征在于序列表SEQIDNO:3的第296bp處有一個(gè)C296-T296的堿基突變，導(dǎo)致RFLP多態(tài)性。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記，其中擴(kuò)增y;VA5^^基因第2外顯子所用的引物序列如SEQIDN0:3所示。4、權(quán)利要求1或2所述的分子標(biāo)記在豬輔助選擇育種中的應(yīng)用。5、一種權(quán)利要求1或2所述的分子標(biāo)記的制備方法，其特征在于按照以下步驟-用人^VA5^6基因mRNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性70%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽；然后拼接豬表達(dá)序列標(biāo)簽-重疊群；根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽-重疊群設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到目的片段；從豬耳組織中提取基因組DNA，以豬朋^5S5基因cDNA序列為模板設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和克隆測(cè)序，獲得如序列表SEQIDNO:3所述的核苷酸序列，應(yīng)用PCR-RFLP方法檢測(cè)豬yWA5^6基因的多態(tài)性。全文摘要本發(fā)明屬于家畜基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由RNASE6基因克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQIDNO2所述。在序列表SEQIDNO2的第296bp處有一個(gè)C296-T296的堿基突變，導(dǎo)致MspI-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開(kāi)了擴(kuò)增RNASE6基因第2外顯子所用的引物以及用于多態(tài)性檢測(cè)方法，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。文檔編號(hào)C12N15/12GK101235419SQ20081004676公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2008年1月25日優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日發(fā)明者梅余,朱猛進(jìn),李新云,李長(zhǎng)春,雪白,趙書(shū)紅申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)