專利名稱：香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記、其檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬香菇栽培菌種的檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記、其 檢測(cè)方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景我國香菇產(chǎn)量已從1983年的1.95萬噸迅速發(fā)展到2005年的242萬噸，占全球香菇總 產(chǎn)量的70%以上，改寫了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑薛產(chǎn) 量差距，有專家預(yù)測(cè)，由于中國香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn)量最 高的食用菌。中國香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界燕業(yè)人士矚 目，中國香菇己風(fēng)靡世界。優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了香燕菌種在香話產(chǎn)業(yè)中的 重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國家 的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國家自己的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品 種登記制度來真正保護(hù)我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登 記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月1日開始實(shí)行《種苗法修正案》，對(duì)我國食用菌尤其是 香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國內(nèi)而言，香菇栽培菌種"同種異名，異種同名"的現(xiàn) 象，不僅給菇農(nóng)帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香范 的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對(duì)香菇栽培菌株質(zhì)量的要求越 來越高，需要發(fā)展更為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無 誤。面對(duì)這種局勢(shì)，就需要我們進(jìn)一步加快菌種鑒定技術(shù)的研究，在香菇的研究中引進(jìn)更 為有效的菌種鑒定體系。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記、其檢測(cè)方法及應(yīng)用，通過 采用PCR技術(shù)，經(jīng)過篩選試驗(yàn)，獲得了香菇菌株241-4的特異DNA片斷，以此片段的DNA 序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物，通過對(duì)241-4菌株的特異片段檢測(cè)從而對(duì)香菊 241-4菌株進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。本發(fā)明的一種香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記，是基因SCAR的分子特異檢測(cè)標(biāo)記， 其PCR擴(kuò)增的專用引物是241-4F/R，241-4F是5，CTCTGGTCATTGTTACTGTG 3， ，241-4R 是5' CTCTGGCAAGGCTTAT 3' ， PCR產(chǎn)物大小為555bp。擴(kuò)增出的SCAR片段的基因序列如下-AATGGTGCCGCCTCCTC AA ATAGAGC ATAAGCCTTGCC AG AG-3'。本發(fā)明的香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括下列步驟(1) 菌絲培養(yǎng)將4。C保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，23。C 25。C避光培養(yǎng)，10 d 14d后接到 100mLPDY培養(yǎng)基中，100rpm 150rpm， 23。C 25。C搖瓶培養(yǎng)10d 14d后收集菌絲，放入 -201:冰箱保凍備用；(2) 基因組DNA的提取用改進(jìn)的CTAB (十六垸基三甲基溴化銨)法提取菌絲的基因組DNA:1) 將-2(TC冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65t:預(yù)熱的2XCTAB抽提液，65 °C保溫45min以上，間或輕搖混勻；2) 12000rpm， 4。C離心20min，取上清液；3) 加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合液(混合液的混合體積比為25: 24: 1)，輕 輕混勻10min， 12000rpm， 4'C離心10min，取上清液移入新離心管中；4) 加入等體積的氯仿和異戊醇混合液(混合液的混合體積比為24: 1)，輕輕混勻 10min， 12000rpm， 4。C離心10min，取上清液移入新離心管中；5) 加入2/3體積(相對(duì)于上一步驟中的上清液)的-2(TC預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5min， 8000rpm， 4'C離心10min，去上清；6) 沉淀用75% (體積百分?jǐn)?shù))乙醇、10mmol/L醋酸鉀(KAC)洗滌2 3次，每次 8000rpm，室溫離心5min;7) 加入預(yù)冷的95% (體積百分?jǐn)?shù))乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾千；8) 加入10(HiL10XTE (Tris/EDTA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；9) 加入lpL 10mg/mLRNaseA37。C水浴，lhr，去除RNA;紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致，冷藏 備用；(3) SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)擴(kuò)增體系(總體積25pL): 10XPCR buffer 2.5)iL， 25mmol/L MgCL22nL， 10mmol/L dNTP 0.25L， 2.5U/^L %《DNA酶0.5pL， 10pmol/L 241-4F/R引物各lpL，提取的模板 DNAlpL (濃度lng 10ng4iL)， ddH20 18.6[iL;PCR反應(yīng)條件94。C lmin; 94。C 15second， 58°C 15second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)； 72 。C 5miru(4) 電泳檢測(cè)取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8pL，與1^L加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于0.5 X TBE緩沖液(Tris-硼酸緩沖液)中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB (溴化乙錠)染色，然后在凝膠成像儀上照相，分析結(jié)果。本發(fā)明的一種香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記的應(yīng)用，是利用香菇菌種241-4的SCAR 的PCR擴(kuò)增專用檢測(cè)引物，進(jìn)行SCAR擴(kuò)增，存在SCAR標(biāo)記的即是香菇栽培菌種241-4。 本發(fā)明的有益效果該檢測(cè)方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出燕試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性 高的優(yōu)點(diǎn)。該檢測(cè)所需時(shí)間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間， 出菇試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間；該方法在所收集的我國30個(gè)香菇主栽菌種中具有241-4 菌株的專一性。


圖1是241-4的SCAR擴(kuò)增圖譜，其中M是100bpDN A ladder, NC是對(duì)照，箭頭所指是241-4特異性標(biāo)記。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。實(shí)施例11、 菌絲培養(yǎng)將4。C保藏的香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，25X:避光培養(yǎng)。14d后接到100mL PDY 培養(yǎng)基中，150rpm， 25。C搖瓶培養(yǎng)。待菌絲生長(zhǎng)達(dá)到一定量時(shí)，收集菌絲，放入-20。C冰 箱保凍備用。2、 基因組DNA的提取用改進(jìn)的CTAB法提取基因組DNA。紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度和純度， 調(diào)整樣品DNA的濃度一致，冷藏備用。3、 SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)擴(kuò)增體系(總體積25pL): 10XPCRbuffer2.5nL， 25mmol/LMgCL22pL， 1O讓ol/L dNTP0.25L， 2.5U4iL DNA酶0.5^L， 1Opmol/L 241-4F/R各lpL，模板DNAlpL(濃 度lng 10ng/jiL)， ddH20 18.6pL。 PCR反應(yīng)條件94°C lmin; 94°C 15second， 58°C 15second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min。4、 電泳檢測(cè)取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8pL，與lnL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成 像儀上照相。采用專用241-4檢測(cè)引物對(duì)香菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，香菇241-4菌株能擴(kuò)增出分子量 為555bp的特殊DNA條帶。如圖1中箭頭標(biāo)注所示。實(shí)施例2利用241-4的特異性引物對(duì)114個(gè)收集自全國各地的香薛生產(chǎn)用菌種及少數(shù)野生種進(jìn) 行SCAR擴(kuò)增。114個(gè)菌種中有6個(gè)菌種擴(kuò)增出了 241-4的SCAR標(biāo)記，其中四個(gè)是不同 地方收集來的241-4菌株，另外兩個(gè)分別是浙江省慶元縣振州食用菌研究所的王優(yōu)12和河 南省信陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站的師豐1號(hào)。
權(quán)利要求
1. 一種香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記是基因SCAR的分子特異檢測(cè)標(biāo)記，其PCR擴(kuò)增的專用引物是241-4F/R，241-4F是5’CTCTGGTCATTGTTACTGTG3’，241-4R是5’CTCTGGCAAGGCTTAT3’，PCR產(chǎn)物大小為555bp。
2. 香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括下列步驟 (1) 菌絲培養(yǎng)將香菇菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，23。C 25。C避光培養(yǎng)，10 d ~14d后接到lOOmL PDY 培養(yǎng)基中，100rpm 150rpm、 23。C 25。C搖瓶培養(yǎng)10d 14d后收集菌絲； (2) 基因組DNA的提取用改進(jìn)的CTAB法提取菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測(cè)總基因組DNA濃度 和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致； (3) SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)將提取的DNA進(jìn)行基因SCAR的PCR擴(kuò)增； (4) 電泳檢測(cè)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠上，電泳，用EB染色， 在凝膠成像儀上照相，分析結(jié)果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所 述步驟(2)中的改進(jìn)的CTAB法 1) 將-20。C冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65'C預(yù)熱的2XCTAB抽提液，65'C保溫45min以上，間或輕搖混勻； 2) 12000rpm， 4。C離心20min，取上清液； 3) 加入等體積的酚、氯仿和異戊醇的混合液，其混合液的混合體積比為25: 24: 1， 輕輕混勻10min， 12000rpm， 4。C離心10min，取上清液移入新離心管中； 4) 加入等體積的氯仿和異戊醇的混合液，其混合液的混合體積比為24: 1，輕輕混 勻10min， 12000rpm， 4。C離心10min，取上清液移入新離心管中； 5) 加入2/3體積的-2(TC預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5min， 8000rpm， 4'C離心10min， 去上清； 6) 沉淀用體積百分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、1Ommol/L醋酸鉀KAC洗滌2 3次，每次 8000rpm，室溫離心5min; 7) 加入預(yù)冷的體積百分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；8) 加入100pL10XTE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；9) 加入l^L 10mg/mLRNaseA37。C水浴，lhr，去除RNA;10) DNA提取物于-2(TC冰箱貯藏備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所 述步驟(3)中的PCR擴(kuò)增的總體積為25pL，包括10XPCRbuffer 2.5^L， 25mmol/L MgCl2 2nL， 1Ommol/L dNTP 0.25L， 2.5U4iL 71^ DNA酶0,5^L， lOpmol/L 241-4菌株檢測(cè)專用 引物對(duì)各lpL，濃度lng 10ng4iL的模板DNA1^L， ddH20 18.6^L;PCR反應(yīng)條件94°C lmin; 94°C 15second， 58°C 15second， 72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)； 72 。C 5mirti
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于所 述步驟(4)中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是8pL,加樣緩沖液為lpL，瓊脂糖凝膠為1.5%，電泳是 在0.5 X TBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳。
6. —種香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記的應(yīng)用，是將香菇菌種進(jìn)行基因SCAR擴(kuò)增，存在 SCAR標(biāo)記的即是香菇栽培菌種241-4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇栽培菌種241-4的分子標(biāo)記、其檢測(cè)方法及應(yīng)用，該分子標(biāo)記是基因SCAR的分子特異檢測(cè)標(biāo)記，其PCR專用引物對(duì)序列為241-4F5’CTCTGGTCATTGTTACTGTG 3’與241-4R5’CTCTGGCAAGGCTTAT 3’；檢測(cè)方法，包括1)菌絲培養(yǎng)；2)基因組DNA的提取；3)SCAR分子標(biāo)記的檢測(cè)；4)電泳檢測(cè)；應(yīng)用是將香菇菌種進(jìn)行基因SCAR擴(kuò)增，存在SCAR標(biāo)記的即是香菇栽培菌種241-4。本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，該方法在所收集的我國30個(gè)香菇主栽菌種中具有241-4菌株的專一性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101265493SQ200810037260
公開日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2008年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日
發(fā)明者宋春艷, 尚曉冬, 琦 譚, 陳明杰 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院