專利名稱：：一種從丹參中提取多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多糖類化合物的制備，具體涉及中藥材丹參中多糖的提取。技術(shù)背景月參(SalviamiltiorrhizaBge.)是著名的活血化瘀藥，臨床廣泛用于冠心病、心絞痛、心肌梗塞和^f血管疾病的治療。人們?cè)趯?duì)丹參的化學(xué)成分進(jìn)行藥理篩選過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)丹參根中提取到的多糖用于氨基核苷誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腎病模型和四氯化碳引發(fā)的肝損傷模型，經(jīng)口服和肌注，能減少尿蛋白的排泄，抑制血清膽固醇和脂質(zhì)過(guò)氧化物濃度的提高，改善血清白蛋白與球蛋白的比值(A/G)，并能降低肝損傷引起的ALT升高。關(guān)于丹參多糖提取工藝的研究較少，大多停留于傳統(tǒng)的水提醇沉法?！蹲匣ǖ⒍嗵堑奶崛」に囇芯俊芬晃墓_(kāi)了一種提取丹參多糖的方法，該方法為水提醇沉法，具體步驟是取粉碎后的丹參10g，力n2040倍水并于95。C下浸提24h，然后5000r/min離心10min，取上清液，重復(fù)上述過(guò)程一次，合并上清液，在4(TC以下濃縮至原體積1/4，加入3倍體積80100%的乙醇，過(guò)夜；離心，取沉淀物，60'C烘千，即可。該方法的多糖得率較低，為1.7-2.1%。酶處理法相對(duì)于上述方法具有反應(yīng)溫和、得率高、成本低廉、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，己用到真菌多糖的提取中，如鄭靜等人發(fā)表的《超聲波法和超聲波酶法提取靈芝多糖的條件研究》公開(kāi)了利用超聲波結(jié)合纖維素酶提取靈芝多糖的方法1、將靈芝子實(shí)體粉用3倍體積濃度為80。/。乙醇85。C回流6小時(shí)脫低聚糖，濾出溶劑，將濾渣烘干2、按1:20(W:V)的料液比，2%酶量，在pH6.0，5(TC下酶解20分鐘；3、在55。C超聲提取15分鐘；4、將提取液經(jīng)過(guò)濾、離心、濃縮和乙醇沉淀得粗多糖。該方法提取靈芝多糖得率高、周期短，粗提取物中多糖含量高達(dá)57.62%。但靈芝為真菌，靈芝多糖多存于子實(shí)體細(xì)胞壁內(nèi)，其子實(shí)體的主要構(gòu)成成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，而丹參具有較強(qiáng)韌的硬壁組織，與靈芝有較大的不同，套用上述方法的工藝難以取得好的效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從丹參中提取多糖的方汰。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種從丹參中提取多糖的方法，該方法由以下歩驟組成(1)粉碎將丹參粉碎至粒徑為10100pm的微粉r(2)脫脂將丹參微粉用812倍體積的濃度大于或等于90%乙醇回流13小時(shí)'過(guò)濾，取濾渣揮干溶劑后備用；(3)酶處理將脫脂處理后的丹參微粉加到1015倍體積的水中，再加入酶，然后用堿將pH值調(diào)節(jié)至46，在408(TC下保溫0.5L5小時(shí)；所述的酶可以是纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶中的一種，用量為丹參重量0.5%1;5%，也可以纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶中的兩種以上，每種酶的用量為丹參重量0.5%1.5%，最好是纖維素酶和木瓜蛋白酶，每種酶的用量均為丹參重量的1.5%;(4)超聲提取在頻率為59kHz的超聲波下處理0.51.5小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液；(5)醇沉加入乙醇使其在濾液中的濃度至809U%，沉淀出丹參多糖固體，6080'C真空干燥。上述方法中，將脫脂處理后的丹參微粉浸泡于1015倍體積的酶溶液在pH5.5、6(TC下水解60分鐘，可以取得最佳的酶解效果。本發(fā)明方法，步驟(3)將脫脂處理后的丹參微粉加到1015倍體積的水中，再加入酶后，所得到的溶液為酸性，可采用熟知的方法營(yíng)造pH值為46的水解環(huán)境，如加入氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺等堿。本發(fā)明方法的原理是利用超微粉碎技術(shù)，將丹參超微粉碎后，可以提高丹參中有效成分的溶出率。利用酶處理丹參，反應(yīng)條件溫和，不會(huì)破壞丹參多糖結(jié)構(gòu)，然后利用超聲波的空化作用加速多糖的溶出，另外超聲波的次級(jí)效應(yīng)如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速多糖的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于提取；超聲波輔助提取具有提取時(shí)間短，溶劑用量少，提取率高，有利于進(jìn)一步的精制提純等優(yōu)點(diǎn)，且無(wú)需加熱，適合于提取熱敏物質(zhì)。雖然用酶處理和超聲波提取真菌多糖已是本領(lǐng)域常用的手段，但由于丹參組分和結(jié)構(gòu)與真菌有較大區(qū)別，采用與提取真菌多糖相同的工藝來(lái)提取丹參多糖，效果明顯欠佳。本發(fā)明選用了對(duì)丹參硬壁組織有較好降解作用的酶，并優(yōu)化了各種酶的搭配和用量，使其能充分降解丹參中的纖維素、木質(zhì)素和各種蛋白質(zhì)，同時(shí)還調(diào)整了超聲波提取的條件，加速多糖的溶出，丹參多糖的提取率可達(dá)511%。下面將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明本發(fā)明方法提取的丹參多糖的藥物活性及其效果。一、丹參多糖的保肝作用實(shí)驗(yàn)(一)四氯化碳模型l.實(shí)驗(yàn)材料(1)動(dòng)物昆明種小鼠70只，20士2g，雌雄各半，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼料顆粒由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。(2)試劑四氯化碳(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠(批號(hào)98040258O;ALT、AST試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)20061223)。(3)藥品復(fù)方鱉甲軟肝片內(nèi)蒙古福瑞科技股份有限公司(批號(hào)20060303);聯(lián)苯雙酯廣州星群(藥業(yè))股份有限公司(批號(hào)DF40030);丹參多糖由實(shí)施例20方法制備。2.方法與結(jié)果:(1)分組小鼠隨機(jī)分7組正常組、模型組、丹參多糖高、中、低劑量組、聯(lián)苯雙酯組、復(fù)方鱉甲軟肝片組，各組給藥劑量如下丹參多糖高劑量組丹參多糖成人劑量4倍、丹參多糖中劑量組:，丹參多糖成人劑量2倍、丹參多糖低劑量組丹參多糖成人劑量、聯(lián)苯雙酯組成人每日劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片組成人每日劑量，正常組及模型組給予0.5ml/只生理鹽水。(2)方法各組連續(xù)灌胃給藥7天，于末次給藥后lh，除正常組外，其余各組均0.12%CCL4花生油溶液0.4mL/只。24h后，所有小鼠采用摘眼球法取血，分離血清，低溫保存，一次性同試劑同人操作進(jìn)行。并將肝組織置于10%的福爾馬林液中保存。病理切片取肝組織，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，觀察肝細(xì)胞變性、壞死情況。(3)結(jié)果從表1中可見(jiàn)，模型組小鼠血清ALT和AST兩種轉(zhuǎn)氨酶活性均明顯高于正常組(P〈0.01)，提示模型建立成功。與模型組比較，丹參多糖各劑量組血清ALT和AST顯著降低(P<0.05)。丹參多糖各劑量組與復(fù)方鱉甲軟肝片組相比，血清ALT和AST無(wú)顯著性差異(P〉0.05)。但丹參多糖各劑量組降低血清ALT和AST效果不如聯(lián)苯雙酯組(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參多糖能明顯降低CCl4引起的大鼠ALT、AST的增高。所致大鼠肝臟病變明顯減輕，說(shuō)明丹參多糖對(duì)四氯化碳性肝損害有一定的保護(hù)作用。表l丹參多糖對(duì)CCl4模型小鼠肝損傷的影響(x±s)組別例數(shù)ALT(U/L)AST(U/L)丹參多糖高劑量組10166.02±20.13**174.78±19.12**丹參多糖中劑量組10170.16±17.8(T198.87±19.78"丹參多糖低劑量組10213.92±26.42##225.24±17.61**復(fù)方鱉甲軟肝片組10161.21±16.13將177.83±19.3(T聯(lián)苯雙酯組10136.09±15.31s#156.27±20.15tf#模型組10271.44±39.37*321.35±28.69'正常組1058.10±12.6386.54±13.70PO.01與模型組比較/尸<0.01與正常組比較(二)D—半乳糖模型l.材料(l)動(dòng)物昆明種小鼠70只，20±2g，雌雄各半，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼料顆粒由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(2)試劑D-氨基半乳糖(D-GLAN)，廣州威佳科技有限公司；ALT、AST試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)20061223)。(3)藥品復(fù)方鱉甲軟肝片內(nèi)蒙古福瑞科技股份有限公司(批號(hào)20060303);聯(lián)苯雙酯廣州星群(藥業(yè))股份有限公司(批號(hào)DF40030);丹參多糖由實(shí)施例20方法制備。2.方法與結(jié)果(1)分組小鼠隨機(jī)分7組正常組、模型組、丹參多糖高、中、低劑量組、聯(lián)苯雙酯組、復(fù)方鱉甲軟肝片組，各組給藥劑量如下丹參多糖高劑量組丹參多糖成人劑量2倍、丹參多糖中劑量組丹參多糖成人劑量1.5倍、丹參多糖低劑量組丹參多糖成人劑量、聯(lián)苯雙酯組成人每日劑量、復(fù)方鱉甲軟肝片組成人每日劑量，正常組及模型組給予0.5ml/只生理鹽水。(2)方法各組連續(xù)灌胃給藥7天，于末次給藥后lh，除正常組外，其余各組均腹腔注射D-氨基半乳糖(800mg/kg)。禁食24h后，所有小鼠采用摘眼球法取血，分離血清，低溫保存，一次性同試劑同人操作進(jìn)行。并將肝組織置于10%的福爾馬林液中保存。病理切片取肝組織，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，觀察肝細(xì)胞變性、壞死情況。將肝組織損傷程度分為4級(jí)0級(jí)(-)，肝組織結(jié)構(gòu)正常,無(wú)明顯變性,壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；1級(jí)(+)，肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常,可見(jiàn)明顯的混濁腫脹,氣球樣變或脂肪變性,散在點(diǎn)狀壞死；2級(jí)(++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，可見(jiàn)明顯的灶狀壞死，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；3級(jí)(+++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不清、可見(jiàn)明顯的片狀壞死，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。(3)結(jié)果；從表2中可見(jiàn)，模型組小鼠血清ALT和AST兩種轉(zhuǎn)氨酶活性均明顯高于正常組(P<0.01)，提示模型建立成功。丹參多糖各劑量組與模型組比較，血清ALT和AST顯著降低(P<0.05)。丹參多糖各劑量組與聯(lián)苯雙酯組及復(fù)方鱉甲軟肝片組相比，血清ALT和AST降低無(wú)顯著性差異(P〉0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)丹參多糖對(duì)D-GLAN所致的急性肝細(xì)胞損傷具有降酶保肝作用。表2丹參多糖對(duì)D-Glan模型小鼠肝損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、丹參多糖對(duì)小鼠免疫功能和小鼠體液免疫功能實(shí)驗(yàn)(一)丹參多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響1實(shí)驗(yàn)材料昆明小鼠，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。丹參多糖由實(shí)施例20方法制備；復(fù)方鱉甲軟肝片、生脈口服液購(gòu)自南方大藥房。白細(xì)胞稀釋液按冰醋酸2ml蒸餾水98ml、1%亞甲藍(lán)2滴比例用前配制。2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果-〔1)分組及方法昆明小鼠，雌雄各半，每只(15土2)g，隨機(jī)分為6組，每組10只，即正常組、丹參多糖高、中、低劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、生脈口服液組。用蒸餾水溶解或稀釋藥物，每組小鼠灌胃0.5ml/只/天。丹參多糖高、中、低劑量組小鼠灌胃丹參多糖劑量分別為2.15、0.65、0.22mg/只；生脈口服液和復(fù)方鱉甲軟肝片的用量按成人用量的0.0026換算；正常組同時(shí)以蒸餾水灌胃0.5ml/只。每日1次，連續(xù)7d，于第8d處死動(dòng)物。動(dòng)物眼眶取血20yL加于380yL白細(xì)胞稀釋液中，鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞。摘取小鼠的胸腺和脾臟，用濾紙吸干殘血后，稱重(mg)，分別除以小鼠體重(g)，得到胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。上述各項(xiàng)指標(biāo)均計(jì)算均數(shù)(丁)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間比較用LSD法。結(jié)果見(jiàn)表3，表4。(2)結(jié)果與正常組相比，丹參多糖、復(fù)方鱉甲軟肝片組對(duì)外周白細(xì)胞的影響無(wú)顯著性差異；生脈口服液對(duì)小鼠外周白細(xì)胞增殖的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p〈0.05，見(jiàn)表3)。丹參多糖各劑量組和生脈組能夠有效抑制小鼠胸腺的萎縮(p<0.05見(jiàn)表4)，但無(wú)明顯量效關(guān)系；丹參多糖各劑量組和生脈口服液組對(duì)于小鼠脾臟有促進(jìn)增殖的作用(P〈0.05，見(jiàn)表4)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參多糖有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。表3丹參多糖對(duì)外周白細(xì)胞的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P〈0.05，"P<0.01與正常組比較:表4丹參多糖對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響組別胸腺指數(shù)(mg/g)脾臟指數(shù)'(mg/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(二)丹參多糖對(duì)小鼠體液免疫功能的影響(半數(shù)溶血值測(cè)定法)1、原理用SRBC免疫動(dòng)物后，產(chǎn)生抗SRBC抗體(溶血素)，與SRBC—起孵育，在補(bǔ)體參與下，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過(guò)測(cè)定血紅蛋白含量反映動(dòng)物血清中溶血素的含量。2、實(shí)驗(yàn)材料721分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴、SRBC、補(bǔ)體(豚鼠血清)、都氏試劑(碳酸氫鈉l.Og、高鐵氰化鉀0.2g、氰化鉀0.05g，加蒸餾水至lOOOmL)、生理鹽水；KM種小鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。丹參多糖由實(shí)施例20方法制備。復(fù)方鱉甲軟肝片、生脈口服液購(gòu)自南方大藥房。3、方法與結(jié)果方法M種小鼠60只，1822g，雌雄各半，隨機(jī)分6組，每組10只即正常對(duì)照組、丹參多糖高、中、低劑量組、復(fù)方鱉甲軟肝片組，生脈口服液組。用蒸餾水溶解或稀釋藥物，每組小鼠灌胃0.5ml/只/天。丹參多糖高、中、低劑量組小鼠灌胃丹參多糖劑量分別為2.15、0.65、0.22mg/只；生脈口服液和復(fù)方鱉甲軟肝片的用量按成人用量的0.0026換算；正常組同時(shí)以蒸餾水灌胃0.5ml/只。每日一次，連續(xù)7天。在實(shí)驗(yàn)第3天以20%SRBC0.2ml免疫小鼠，每只鼠腹腔注射0.2ml，繼續(xù)給藥至第7天。末次給藥后24h，摘眼球取血，室溫放置lh,將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，3000r/min離心10rain，收集血清。取血清用NS稀釋200倍。取稀釋血清lml置試管內(nèi)，加10%SRBC0.5ml，1:10補(bǔ)體lml。置37。C水浴中保溫30min，然后將管移入冰浴中終止反應(yīng)；2000r/min離心10min，取上清液lml加都氏劑3ml，混勻放置10min，540nm處檢測(cè)吸收度。另取10%SRBC0.25ml，加都氏劑3.75ml，同法測(cè)吸收度，作為SRBC半數(shù)溶血值。小鼠血清溶血素抗體含量以樣品半數(shù)溶血值(HCJ表示。半數(shù)溶血值(HCJ-[樣品吸收度值/SRBC半數(shù)溶血值]X稀釋倍數(shù)(200)上述指標(biāo)計(jì)算均數(shù)(x)與標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間比較用LSD法。結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果與正常組相比，丹參多糖高、中、低劑量組，復(fù)方鱉甲軟肝片組對(duì)小鼠體液免疫均有增強(qiáng)作用，差異有顯著性(p<0.05,見(jiàn)表)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參多糖有增強(qiáng)小鼠體液免疫的作用。表5丹參多糖對(duì)小鼠半數(shù)溶血值(HCs。)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>'P〈0.05與正常組比較三、丹參多糖抗免疫性肝損傷實(shí)驗(yàn)(一)Cs7小鼠免疫性肝損傷模型1.實(shí)驗(yàn)材料(1)動(dòng)物Cw小鼠，70只，4一6周齡，體重14一16g，雌雄各半(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，實(shí)驗(yàn)期間的顆粒飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SD大鼠肝臟由別人贈(zèng)送，均為正常老鼠肝臟。實(shí)驗(yàn)環(huán)境:動(dòng)物房保持通風(fēng)、干燥、室溫22-25°C,濕度50-70%，自由飲水、鼠料定量飼養(yǎng)。(2)試劑弗式完全佐劑，購(gòu)于sigma公司，規(guī)格:F5881-10ml、ALT試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)20061016、AST試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào):20061016、NO試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)20061205、TNF-od式劑盒購(gòu)于RD公司批號(hào)EIA05897、丹參多糖由實(shí)施例20方法制備，用時(shí)蒸餾水溶解稀釋、復(fù)方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司)批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991011、聯(lián)苯雙酯滴丸(廣州星群藥業(yè)股份有限公司)批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字:H44023176主要儀器721B型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠生產(chǎn))、酶標(biāo)儀(sigma公司)、DK-8AD型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)、離心機(jī)(Thermo)2.方法與結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)方法取SD大鼠肝組織，用4。C預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗，洗去浮血，用濾紙擦干稱重。再用生理鹽水配成10%肝組織勻漿，按照l(shuí):1比例將10%肝組織勻漿與弗式完全佐劑混合制成乳化劑。除正常組外(:57小鼠皮下注射，每次O.lral，每周兩次，共8次，一月左右形成免疫性肝損傷模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為7組正常組、模型組、丹參多糖高、中、低劑量,組、聯(lián)苯雙酯組、復(fù)方鱉甲軟肝片組，每組10只。造模同時(shí)開(kāi)始按既定方案灌胃直到動(dòng)物處死前一天，正常組給予同等劑量生理鹽水。造模結(jié)束后所有小鼠禁食12h，稱重后采血，脫椎處死取肝臟、脾臟、胸腺稱重計(jì)算臟器系數(shù)，肝左葉標(biāo)本常規(guī)固定包埋切片HE染色，剩余肝臟超低溫冰箱凍存以做肝組織勻漿。血液3000轉(zhuǎn)10分鐘離心取血清超低溫冰箱凍存以備下一步檢測(cè)所需。指標(biāo)測(cè)定(l)光鏡標(biāo)本:石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色。(2)ALT、AST、NO用小鼠血清(1:5稀釋)按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。(3)凍存肝臟化凍后生理鹽水洗去浮血，用生理鹽水配成10%肝組織勻漿，3500轉(zhuǎn)10分鐘離心取上清液，IO倍稀釋。ELISA法按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)TNF-a。(2)統(tǒng)計(jì)處理方法上述各項(xiàng)指標(biāo)均計(jì)算均數(shù)(r)與標(biāo)準(zhǔn)差(S),用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSll.O進(jìn)行方差分析。(3)結(jié)果:①肝功(血清中ALT、AST)的變化及比較由表6可見(jiàn)，模型組明顯高于正常組(P<0.01),說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與模型組比較可顯著降血清中的ALT和AST含量(P〈0.01)，以丹參多糖中、低劑量組效果較為明顯。②NO、TNF-a的變化及比較由表7可見(jiàn)，模型組明顯高于正常組(P〈0.01)，說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與模型組比較可顯著降血清中的NO及組織中TNF-a含量(P〈0.01)，以丹參多糖中劑量組效果較為明顯。(D臟器系數(shù)的變化及比較由表8可見(jiàn)，模型組肝臟、脾臟系數(shù)明顯高于正常組(P〈0.01)，胸腺系數(shù)明顯低于正常組(P〈0.01)，說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與模型組比較可顯著改變肝臟、脾臟、胸腺系數(shù)(P〈0.05)。④肝組織病理變化模型組肝細(xì)胞損害，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和局灶性肝細(xì)胞壞死，甚至匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴廣泛的肝細(xì)胞壞死。正常組肝細(xì)胞、匯管區(qū)、膽管區(qū)未見(jiàn)異常，說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與正常組比較有不同程度肝細(xì)胞腫大、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等肝損傷病變，但與模型組比較損傷程度明顯減輕。綜上所述，丹參多糖高、中、低劑量組對(duì)CK小鼠免疫性肝損傷均有明顯保護(hù)作用。表6丹參多糖f對(duì)免疫性肝技!傷Cs7小鼠肝功能(;c±S)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>ipO.Ol與模型組比較，PO.01與正常組比較表7丹參多糖對(duì)免疫性肝損傷Cs7小鼠NO、TNF-a(;c±S)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>VO.01與模型組比較，與正常組比較表8丹參多糖對(duì)免疫性肝損傷(:57小鼠臟器系數(shù)(x±S)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>#尸<0.05與模型組t:匕較，#V<0.01與模型組比較，'尸O.Ol與正常組比較(二)NIH小鼠免疫性肝損傷模型1.實(shí)驗(yàn)材料(1)動(dòng)物NIH小鼠，體重1822g，70只，雌雄各半(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，實(shí)驗(yàn)期間的顆粒詞料由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。'實(shí)驗(yàn)環(huán)境:動(dòng)物房保持通風(fēng)、干燥、室溫22-25。C，濕度50-70%'自由飲水、鼠料定量飼養(yǎng)。(2)試劑與儀器試劑脂多糖，購(gòu)于sigma公司、卡介苗凍干粉，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所、ALT試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)20061016、AST試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)20061016、NO試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，批號(hào)20061205、IL-1P試劑盒購(gòu)于RD公司批號(hào)EIA05935、丹參多糖由實(shí)施例20方法制備，用時(shí)蒸餾水溶解稀釋、復(fù)方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司)批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字:Z19991011、聯(lián)苯雙酯滴丸(廣州星群藥業(yè)股份有限公司)批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H44023176。主要儀器721B型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠生產(chǎn))、酶標(biāo)儀(sigma公司)、DK-8AD型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)、離心機(jī)(Thermo).2.方法與結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)方法采用卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷。小鼠尾靜脈注射BCG漿液0.2ml/只(含菌量2.5X106單位)，致敏后10d，尾靜脈注射LPSO.2ml/只(8.5Pg)以誘導(dǎo)肝損傷，正常組小鼠尾靜脈注射同等劑量生理鹽水。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為7組正常組、模型組、丹參多糖高、中、低劑量組、聯(lián)苯雙酯組、復(fù)方鱉甲軟肝片組，每組10只。造模同時(shí)開(kāi)始按既定方案灌胃直到動(dòng)物處死前一天，正常組給予同等劑量生理鹽水。造模結(jié)束后小鼠禁食12h左右，稱重后采血，脫椎處死取肝臟、脾臟、胸腺稱重計(jì)算臟器系數(shù)，肝左葉標(biāo)本常規(guī)固定包埋切片HE染色，剩余肝臟超低溫冰箱凍存以做肝組織勻漿。血液3000轉(zhuǎn)10分鐘離心取血清超低溫冰箱凍存以備下一步檢測(cè)所需。指標(biāo)測(cè)定(l)光鏡標(biāo)本石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色。(2)ALT、AST、NO用小鼠血清(l:2稀釋)按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。(3)凍存肝臟化凍后生理鹽水洗去浮血，用生理鹽水配成10%肝組織勻漿，3500轉(zhuǎn)10分鐘離心取上清液，IO倍稀釋。ELISA法按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)IL-1P。(2)統(tǒng)計(jì)處理方法上述各項(xiàng)指標(biāo)均計(jì)算均數(shù)(r)與標(biāo)準(zhǔn)差(S)，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSll.O進(jìn)行方差分析。(3)結(jié)果①肝功(血清中ALT、AST)的變化及比較由表9可見(jiàn)，模型組明顯高于正常組(P<0.01),說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與模型組比較可顯著降血清中的ALT和AST含量(P〈0.01)，以丹參多糖中劑量組效果較為明顯。②N0、IL-1P的變化及比較由表10可見(jiàn)，模型組明顯高于正常組(P〈0.01)，說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與模型組比較可顯著降血清中的No及組織中iL-ie含量(P〈0.01)，以丹參多糖低劑量組效果較為明顯。③臟器系數(shù)的變化及比較由表11可見(jiàn)，模型組肝臟、脾臟系數(shù)明顯高于正常組(P〈0.01)，胸腺系數(shù)明顯低于正常組(P〈0.01)，說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與模型組比較可顯著改變肝臟、脾臟、胸腺系數(shù)(P〈0.05)。④肝組織病理變化模型組肝細(xì)胞損害，伴炎性細(xì)啤浸潤(rùn)和局灶性肝細(xì)胞壞死，甚至匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴廣泛的肝細(xì)胞壞死。正常組肝細(xì)胞、匯管區(qū)、膽管區(qū)未見(jiàn)異常，說(shuō)明模型建立成功。丹參多糖高、中、低劑量組與正常組比較有不同程度肝細(xì)胞腫大、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等肝損傷病變，但與模型組比較損傷程度明顯減輕。綜上所述，丹參多糖高、中、低劑量組對(duì)BCG加LPS誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷均有明顯保護(hù)作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表ll丹參多糖對(duì)免疫性肝損傷NIH小鼠臟器系數(shù)(jc±S)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>"尸<0.05與模型鄉(xiāng)」a比較，"尸<0.01與模型組比較，><0.01與正常組比較具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方法的效果。實(shí)施例1將丹參粗粉1Kg，粉碎至粒徑為10tim的微粉，加入8升純乙醇，回流提取1小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入10倍水，加入纖維素酶15克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到5.5，與濾渣混勻，60。C保溫60分鐘，超聲處理60分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為90%，放置過(guò)夜，將沉淀60'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品71g。實(shí)施例2將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為100lim的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入纖維素酶5克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到4.0，與濾渣混勻，80°C保溫30分鐘，超聲處理90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品70g。實(shí)施例3將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為50^m的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入纖維素酶10克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，40°C保溫90分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品54g。實(shí)施例4將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為50um的微粉，粉碎至粒徑為50um的微粉，加入10升乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入果膠酶10克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到4.5，與濾渣混勻，60。C保溫60分鐘，超聲處理60分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70。C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品63g。實(shí)施例5將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為80um的微粉，加入10升95%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入果膠酶5克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到4.0，與濾渣混勻，40°C保溫80分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70。C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品71g。實(shí)施例6將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為40um的微粉，加入10升95%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入果膠酶1.5克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，50°C保溫40分鐘，超聲處理90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品55g。實(shí)施例7將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為10um的微粉，加入12升90%乙醇，回流提取3小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入15倍水，加入木瓜蛋白酶10克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到4.5，與濾渣混勻，60'C保溫60分鐘，超聲處理60分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為卯％，放置過(guò)夜，將沉淀8(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品72g。實(shí)施例8'將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為100um的微粉，加入10升95%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶5克，用氫氧化鈉調(diào)pH值到4.0，與濾渣混勻，40°C保溫80分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品66g。實(shí)施例9將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為20um的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶1.5克，用氫氧化鉀調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，50°C保溫40分鐘，超聲處理90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70r真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品73g。實(shí)施例10將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為100nm的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入纖維素酶15克，果膠酶10克，用氫氧化鉀調(diào)pH值到5.5，與濾渣混勻，60'C保溫60分鐘，超聲處理60分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品80g。實(shí)施例11將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為30um的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入纖維素酶15克，果膠酶15克，用氫氧化鉀調(diào)pH值到4.0，與濾渣混勻，60°C保溫60分鐘，超聲處理90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品78g。實(shí)施例12將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為20um的微粉，加入10升卯％乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入纖維素酶10克，果膠酶15克，用氫氧化鉀調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，60°C保溫60分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品89g。實(shí)施例13將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為10um的微粉，加入10升卯％乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，果膠酶15克，用氫氧化鉀調(diào)pH值到5.5，與濾渣混勻，60°C保溫60分鐘，超聲處理60分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品69g。實(shí)施例14將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為50um的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，果膠酶10克，用氫氧化鉀調(diào)pH值到4.0，與濾渣混勻，80°C保溫30分鐘，超聲處理90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7trc真空千燥，粉碎得丹參多糖粗品73g。實(shí)施例15將丹參粗粉lKg,粉碎至粒徑為50Pm的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶10克，果膠酶15克，用三乙醇胺調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，40°C保溫90分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品74g。實(shí)施例16將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為10um的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纖維素酶15克，用三乙醇胺調(diào)pH值到5.5，與濾渣混勻，60。C保溫60分鐘，超聲處理60分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品108g。實(shí)施例17將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為20Pm的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纖維素酶10克，用三乙醇胺調(diào)pH值到4.0，與濾渣混勻，80°C保溫30分鐘，超聲處理90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品87g。實(shí)施例18將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為30ixm的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶10克，纖維素酶15克，用三乙醇胺調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，40°C保溫90分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品87g。實(shí)施例19將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為30um的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纖維素酶15克，果膠酶15克，用三乙醇胺調(diào)pH值到5.5,與濾渣混勻，60°C保溫60分鐘，超聲處理60分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品84g。實(shí)施例20將丹參粗粉lKg，粉碎至粒徑為10nm的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶15克，纖維素酶10克，果膠酶10克，用三乙醇胺調(diào)pH值到4.0，與濾渣混勻，80°C保溫30分鐘，超聲處理90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品102g。實(shí)施例21將丹參粗粉1Kg，粉碎至粒徑為10"m的微粉，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，加入木瓜蛋白酶10克，纖維素酶15克，果膠酶15克，用三乙醇胺調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，40°C保溫90分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品99g。實(shí)施例22(比較例)將丹參粗粉lKg，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，用三乙醇胺調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，40。C保溫90分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀7(TC真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品35g。實(shí)施例23(比較例)將丹參粗粉lKg，加入10升90%乙醇，回流提取2小時(shí)，過(guò)濾收集濾渣。加入12倍水，用三乙醇胺調(diào)pH值到6.0，與濾渣混勻，40°C保溫90分鐘，超聲處理30分鐘，過(guò)濾，濾液為多糖提取液，提取液濃縮后加乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為85%，放置過(guò)夜，將沉淀70'C真空干燥，粉碎得丹參多糖粗品42g。權(quán)利要求1、一種從丹參中提取多糖的方法，該方法由以下步驟組成(1)粉碎將丹參粉碎至粒徑為10～100μm的微粉；(2)脫脂將丹參微粉用8～12倍體積的濃度大于或等于90％的乙醇回流1～3小時(shí)，過(guò)濾，取濾渣揮干溶劑后備用；(3)酶處理將脫脂處理后的丹參微粉加到10～15倍體積的水中，再加入酶，然后用堿將pH值調(diào)節(jié)至4～6，在40～80℃下保溫0.5～1.5小時(shí)；所述的酶是纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶中的一種，用量為丹參重量的0.5％～1.5％，或者是纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶中的兩種以上，每種酶的用量為丹參重量的0.5％～1.5％；(4)超聲提取在頻率為59kHz的超聲波下處理0.5～1.5小時(shí)，過(guò)濾，收集濾液；(5)醇沉加入乙醇使其在濾液中的濃度至80～90％，沉淀出丹參多糖，60～80℃真空干燥。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酶是纖維素酶和木瓜蛋白酶，每一種酶的用量均為丹參重量的1.5%。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶處理步驟是將脫脂處理后的丹參微粉浸泡于1015倍體積的酶溶液在pH5.5、60'C下水解60分鐘。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的超聲提取的時(shí)間為60分鐘。5、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的方法，其特征在于步驟(3)所述的堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀或三乙醇胺。全文摘要本發(fā)明提供了一種從丹參中提取多糖的方法，該方法是將丹參經(jīng)超微粉碎脫脂處理后，用纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶中的一種或多種在pH4～6、40～80℃下水解0.5～1.5小時(shí)，然后在頻率為59KHz的超聲波下處理0.5～1.5小時(shí)，過(guò)濾，最后用乙醇沉淀濾液中的多糖。本發(fā)明方法在提取真菌多糖的工藝的基礎(chǔ)上調(diào)整了酶的種類和用量，以及酶處理和超聲波提取的工藝條件，實(shí)現(xiàn)了低耗能、高效地提取丹參多糖的目的。文檔編號(hào)C12P19/00GK101225422SQ200810026249公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年2月2日優(yōu)先權(quán)日2008年2月2日發(fā)明者強(qiáng)劉,呂志平申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)