專利名稱：：從骨髓或臍帶血回收的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物；用于制備其的系統(tǒng)和方法從骨髓或臍帶血回收的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物；用于制備其的系統(tǒng)和方法P.H.科埃略、B.A.貝克、J.R.查普曼、李俊之、P.埃曼努埃爾和R.S.蔡爾德斯與相關(guān)串i青的奪叉參考根據(jù)35U.S.C.§120，本申請是于2002年4月8日提交的共同未決的美國專利申請系列號10/118，291的部分繼續(xù)申請，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述美國專利申請的完整公開內(nèi)容引入本文作為參考。根據(jù)35U.S.C.§120，本申請還是于2007年3月28日提交的共同未決的美國專利申請系列號11/664,212的部分繼續(xù)申請，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述美國專利申請是來自于2005年8月16日提交的國際申請系列號PCT/US2005/029288的35U.S.C.§371國家階段申請，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述國際申請指定美國并根據(jù)PCTArticle21(2)于2006年4月13日作為國際申請?zhí)朩O2006/038993A2以英文公開，并且其依次要求于2004年9月30日提交的美國專利申請系列號10/957,095的優(yōu)先權(quán)，所述美國專利申請于2007年5月1日作為美國專利號7，211，191授權(quán)，所述專利的所有公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明涉及用于從人骨髓或臍帶血回收特定細(xì)胞群體的方法和裝置。具體地，本發(fā)明包括用于高效回收(分離且分開)位于骨髓或臍帶血中的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，并且取出過量紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血小板和血漿的系統(tǒng)和方法，無需借助于通常用于改善干細(xì)胞回收效率的異生素添加劑。該系統(tǒng)包括無菌、功能上封閉的袋組(bagset)以及設(shè)計為在離心場中操作的微處理器控制的電機(jī)械和光學(xué)設(shè)備，所述設(shè)備基于其大小和密度使細(xì)胞群體分開，并且隨后將這些干細(xì)胞和祖細(xì)胞以預(yù)定最終體積轉(zhuǎn)移至干細(xì)胞袋。本發(fā)明還包括由人骨髓或臍帶血制備的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物，其可用于立即使用或用于貯存和隨后使用。2.相關(guān)技術(shù)描沭為了本說明書和權(quán)利要求的目的，使用下述定義"自體使用"意指人細(xì)胞或組織植入、移植、輸注或轉(zhuǎn)移回細(xì)胞或組織從其回收的個體內(nèi)。"類晶體"意指用于電解質(zhì)替換或增加血管內(nèi)體積的等滲鹽和/或葡萄糖溶液，例如鹽水溶液、林格氏(Ringer's)乳酸鹽溶液或5%葡萄糖水溶液。"造血干細(xì)胞"是產(chǎn)生許多類型的血細(xì)胞包括紅細(xì)胞(RBCs)、白血球、白細(xì)胞(WBCs)和血小板的多能干細(xì)胞。"白血球"或白細(xì)胞是造血譜系中的細(xì)胞，其主要包括單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，并且表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD45(CD45+細(xì)胞)。"淋巴細(xì)胞"是如通過SysmexXE-2100測量的淋巴樣譜系細(xì)胞，其可以包括成熟淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)以及發(fā)育中的淋巴細(xì)胞例如淋巴母細(xì)胞。"最低限度處理的骨髓或臍帶血"意指用于干細(xì)胞和祖細(xì)胞的抗凝(例如用肝素或檸檬酸鹽)骨髓或臍帶血處理，其不包括添加化學(xué)物質(zhì)(除水，類晶體，或滅菌、防腐或貯存試劑外)，并且不改變細(xì)胞或組織的相關(guān)生物特征。"單核細(xì)胞"是如通過SysmexXE-2100測量的髓樣譜系細(xì)胞，其可以包括成熟單核細(xì)胞和發(fā)育中的單核細(xì)胞例如成單核細(xì)胞。"單核的細(xì)胞"(麗C)是造血譜系中的細(xì)胞，其包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。"嗜中性粒細(xì)胞"是如通過SysmexXE-2100測量的髓樣譜系細(xì)胞，其可以包括多形核嗜中性粒細(xì)胞和發(fā)育中的嗜中性粒細(xì)胞，例如帶形、晚幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞和成粒細(xì)胞。"血小板"是如通過SysmexXE-2100測量的巨核細(xì)胞系細(xì)胞，其可以包括成熟血小板(凝血細(xì)胞)。"祖細(xì)胞"是通過一系列細(xì)胞分裂產(chǎn)生不同細(xì)胞譜系的干細(xì)胞直接后代。"紅細(xì)胞"如通過SysmexXE-2100測量的紅細(xì)胞系細(xì)胞，其包括成熟RBC而不是具核紅細(xì)胞。"干細(xì)胞"是具有3種一般性質(zhì)的多能細(xì)胞(1)它們能夠長期分裂且更新其自身；(2)它們是非特化的；和(3)它們可以產(chǎn)生不同的特化細(xì)胞類型。關(guān)于干細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記是CD34抗原，升高的胞內(nèi)酶醛脫氫酶(ALDH)濃度也是這樣。"斯托克斯定律(Stoke'sLaw)"是描述顆粒在重力加速度過程中在粘性液體中的沉降速度的數(shù)學(xué)公式(Vg=d2(Pl-P2)/18iixG)，其中Vg=沉降速度，d=顆粒直徑，PI=顆粒密度，P2=液體密度，*6=重力加速度，禾口ii=液體粘度。"SysmexXE-2100"是由SysmexCorp，Kobe，J即an制造的自動化血液學(xué)細(xì)胞分析儀，其通過流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分且定量造血細(xì)胞，發(fā)射半導(dǎo)體激光束，并且檢測3種光信號向前散射、側(cè)向散射和側(cè)向熒光。"總具核細(xì)胞"(TNC)是WBCs和具核RBCs。"異生素添加劑"和"異生素試劑"意指并非人體的天然組分的化學(xué)物質(zhì)，其有意加入收集的骨髓或臍帶血中用于達(dá)到細(xì)胞分離過程性能特征中的變化的目的，如果不添加其，所述變化將不發(fā)生。異生素添加劑的例子是1.沉降試劑(例如，羥乙基淀粉、葡聚糖或明膠)；2.密度梯度介質(zhì)(例如，F(xiàn)ico11⑧，Percoll);禾口3.用于細(xì)胞表面大分子細(xì)胞的親和分子(例如單克隆抗體、與順磁珠結(jié)合的單克隆抗體)。迄今，盡管干細(xì)胞的巨大臨床潛力，但無干細(xì)胞治療已收到FDA許可用于人使用。證實臨床功效和安全性且獲得干細(xì)胞治療的管理許可的主要障礙是，用于從骨髓或臍帶血分離干細(xì)胞群體的現(xiàn)有設(shè)備和方法具有一個或多個下述明顯局限性它們是冒微生物污染危險的開放系統(tǒng)；它們是時間和勞動力密集的；它們需要添加不希望有且昂貴的異生素試劑；它們以平均40-75%的非常低效率回收干細(xì)胞；并且它們與用于組織再生的臍帶血或骨髓量不相容。在干細(xì)胞治療嚴(yán)重和頻繁的人疾病的廣泛使用可以發(fā)生前，所述疾病例如心肌梗死、缺血、糖尿病和皮膚傷口，必須克服3個關(guān)鍵障礙1.臨床試驗必須證實干細(xì)胞治療的功效和安全性；2.必須獲得由健康管理機(jī)構(gòu)，特別是食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)細(xì)胞、組織和基因治療辦公室(OfficeofCell,TissueandGeneTher即y)(0CTGT)的管理許可；禾口3.必須開發(fā)用于從最低限度處理的骨髓或臍帶血快速和簡單回收活的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的實用方法，其不依賴于使用異生素添加劑以取出過量血漿、紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。除造血干細(xì)胞外，目前已知骨髓和臍帶血包含具有用于組織再生且增強(qiáng)傷口愈合的潛在治療價值的其他類型干細(xì)胞和祖細(xì)胞。先前命名為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞可以產(chǎn)生骨、軟骨、脂肪、肌肉和結(jié)締組織，并且是ALDHBr+。位于骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞是從造血干細(xì)胞傳下來的原始細(xì)胞，可以進(jìn)入血流并且到達(dá)血管損傷區(qū)域以幫助修復(fù)損害，可以產(chǎn)生新血管，并且是CD34+。干細(xì)胞通過各種細(xì)胞表面標(biāo)記進(jìn)行鑒定，包括CD34+和醛脫氫酶亮細(xì)胞(ALDHBr+)。CD34+細(xì)胞是表達(dá)命名為CD34的抗原的干細(xì)胞，所述抗原可以通過使用對于那種特定抗原具有特異性的生色團(tuán)綴合抗體進(jìn)行檢測。其他研究者基于其表達(dá)高水平的醛脫氫酶(ALDH)鑒定成體干細(xì)胞。一個公司Aldagen(Durham,NC)開發(fā)了利用基質(zhì)的技術(shù)，所述基質(zhì)通過產(chǎn)生強(qiáng)綠色熒光檢測表達(dá)高水平ALDH的細(xì)胞。這些所謂的ALDH亮細(xì)胞(ALDHBr+)可以使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。ALDHBr+細(xì)胞包含不同祖先，其可以產(chǎn)生多種重要細(xì)胞系，包括神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞。干細(xì)胞的生存力可以通過幾種方法加以證實，所述方法包括排斥活體染料例如錐蟲藍(lán)或7-氨基-放線菌素D(7-AAD)。使用商購可得的試劑盒，通過測量作為關(guān)于在骨髓或臍帶血中的干細(xì)胞替代物的白細(xì)胞(CD45+細(xì)胞)的生存力常規(guī)評估干細(xì)胞的生存力。大量骨髓或臍帶血是難處理的，特別是因為大量紅細(xì)胞的存在(對于骨髓中的每個CD34+細(xì)胞存在約25，000個紅細(xì)胞，并且對于臍帶血中的每個CD34+細(xì)胞存在約180，000個紅細(xì)胞)。這些過量紅細(xì)胞使得難以使用干細(xì)胞和祖細(xì)胞，因為它們的存在從根本上稀釋了在需要組織再生的傷口部位處的干細(xì)胞和祖細(xì)胞濃度，并且它們干擾用于干細(xì)胞的其他處理步驟，包括用于先體外后體內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)，基因治療、或細(xì)胞群體的親和純化。此外，此種大量紅細(xì)胞的存在產(chǎn)生其他安全性問題，例如在同種異體移植中的ABO不相容性。在一些情況下，還可能希望使來自體積減少的干細(xì)胞濃縮物的嗜中性粒細(xì)胞降到最低，這是由于這些細(xì)胞與炎癥反應(yīng)的潛在關(guān)聯(lián)，以及在其細(xì)胞質(zhì)中存在可能影響生存力或可塑性或以其他方式改變干細(xì)胞功能性的生物學(xué)活性酶和細(xì)胞因子。在固定離心時間段后細(xì)胞的運動速率和最終位置隨其大小和密度而變，其中它的運動根據(jù)斯托克斯定律進(jìn)行限定。干細(xì)胞在其密度方面低于RBCs，并且在密度方面高于血小板，具有更接近于WBCs的那種的密度。因此，通過密度和大小回收干細(xì)胞的常規(guī)方法一般涉及通過離心使細(xì)胞群體分層，且然后在從離心機(jī)取出后，嘗試從臍帶血或骨髓的剩余部分中捕獲干細(xì)胞。7從骨髓或臍帶血分離WBCs和干細(xì)胞的一種手工方法是將全部骨髓或臍帶血插入離心機(jī)管內(nèi)，并且使它們在1500-2000xg下在室溫下旋轉(zhuǎn)10-15分鐘。這使骨髓或臍帶血分離成上部血漿層、下部紅細(xì)胞(RBC)層、和在RBC和血漿之間的界面處的薄WBCs和干細(xì)胞和祖細(xì)胞層。在分層完成后，一次性塑料轉(zhuǎn)移移液管可以用于下至距離RBCs約lmm抽吸掉血漿(上層)。當(dāng)取出血漿時，必須非常小心，以免攪亂必須通過相同的移液技術(shù)取出的WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層，同時嘗試提防干細(xì)胞和祖細(xì)胞丟失到RBCs內(nèi)或干細(xì)胞被RBCs過度污染。這種在試管中的手工方法的缺點是它是開放系統(tǒng)，這冒著骨髓單位的微生物污染危險；它是勞動力和時間密集的；WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層的紅細(xì)胞污染量是高度可變的；并且干細(xì)胞的丟失是顯著且可變的。重要的是避免微生物污染——關(guān)于這種方法的主要關(guān)注，因為它可以負(fù)面影響培養(yǎng)干細(xì)胞的能力或冒感染傳播給干細(xì)胞受體身體的危險。從臍帶血或骨髓回收WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞群體的另一種方法利用細(xì)胞處理設(shè)備，例如CompomatG4設(shè)備(FreseniusKabiAG，F(xiàn)riedberg，德國)和C0BE2991血細(xì)胞處理器(BloodCellProcessor)(COBELaboratories，Lakewood，CO)。這禾中類型的方法的例子呈現(xiàn)于Tsubaki，等人"ConcentrationofProgenitorCellsCollectedfromBoneMarrowFluidUsingaContinuousFlowCellSeparatorSystem，，，ApheresisandDialysis5(1)，46_48，2001中。對于干細(xì)胞收獲的骨髓或臍帶血量依賴于所提議的臨床用途。對于組織再生或修復(fù)中基于細(xì)胞的治療，一般收集50-150mL骨髓或臍帶血。這些血庫儀器需要大量骨髓或臍帶血(超過200mL)以正確發(fā)揮作用，并且完全不適合于一般對于組織再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用收集的低體積(小于200mL)。此外，這些機(jī)械化方法的細(xì)胞產(chǎn)物的最終體積(50-100mL)基本上大于優(yōu)選的3-20mL最終體積，這提供對于臨床用途合適的干細(xì)胞和祖細(xì)胞濃度。這些儀器還需要泵以將血液或骨髓從一個容器移動到另一個，并且這些泵可能潛在引起對于細(xì)胞的機(jī)械損害。用于骨髓或臍帶血的體積減少和純化的另一種方法利用梯度介質(zhì)例如Fico11⑧或Percoll⑧,以與骨髓或臍帶血組合，并且在離心過程中，使其自身介入細(xì)胞群體之間，以減少在回收干細(xì)胞的嘗試過程中細(xì)胞群體的混合。？&011.是中性、高分支、高質(zhì)量、親水的多糖。Ficoll(例如密度1.077)可以用于將血液或骨髓分離成其組分(紅細(xì)胞、白細(xì)胞等)。Ficoll⑧正常放置在管的底部，并且用鹽水稀釋的骨髓或臍帶血隨后在Ficoll⑧上緩慢成層。在離心后，較重的RBCs(密度1.09-1.10)取代在管底部的FlCOll㊣,并且下述層從頂部到底部在柱中可見(1)血漿和血小板；(2)單核的細(xì)胞(MNC)(密度1.06-1.07);(3)Ficoll⑧;和(4)在底部以沉淀形式存在的紅細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞(密度1.08-1.09)。這種分離允許以MNCs與RBCs共混合的更少機(jī)會收獲MNCs。一些紅細(xì)胞俘獲(紅細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的存在)仍在麗C層中發(fā)生。用Ficoll⑧處理骨髓或臍帶血的明顯缺點是在將Ficoll⑧加入骨髓或臍帶血的步驟時它是開放系統(tǒng)，從而意味著微生物可以直接進(jìn)入骨髓或臍帶血內(nèi)，并且從而增加微生物污染的危險。為了減少這種危險，必須使用生物學(xué)安全工作櫥執(zhí)行這個步驟，這可能不總是可得到的，并且是為了可接受的性能必須連續(xù)維持且監(jiān)控的實驗室設(shè)備的昂貴部分。此外，F(xiàn)icoll⑧是異生素，并且在細(xì)胞可以安全地施用于人體前必須通過洗滌取出。這個洗滌步驟需要時間和努力，并且進(jìn)一步增加關(guān)于微生物污染和細(xì)胞丟失的可能性。干細(xì)胞的回收是低的且高度可變的，為20-70%。Percoll⑧,用聚乙烯吡咯烷酮包被的膠態(tài)二氧化硅，是類似于Ficoll⑧的具有其伴隨缺點的另一種密度梯度介質(zhì)。關(guān)于使用羥乙基淀粉(HES)沉降試劑分離骨髓白細(xì)胞的技術(shù)已由A.Montuoro等人，"Atechniqueforisolationofbonemarrowcellsusinghydroxyethylstarch(HES)sedimentationagent,，，跑迎幽Mgi.e終76S聊ll:7-9，1991公開。HES在臨床上用作血漿擴(kuò)張劑并且特征在于它的分子量及其取代程度。一般以0.5-2%HES重量與骨髓或臍帶血體積的終濃度的HES添加引起紅細(xì)胞凝集，并且從而基于斯托克斯定律的原理改變其沉降速度。然而，HES是異生素，并且已與靜脈內(nèi)施用時一些患者中的不利事件相關(guān)。此外，HES的使用增加成本和對于細(xì)胞處理的另外復(fù)雜性。葡聚糖聚合物制劑和明膠溶液也已用于相同目的，并且具有與HES相同的缺點。最后，還已知可以通過使用免疫方法從骨髓或臍帶血分離干細(xì)胞和祖細(xì)胞，所述免疫方法包括流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分選(BecktonDickinson或Coulter)和通過抗體包被的順磁顆粒細(xì)胞分選例如MiltenyiCIiniMacs或BaxterIsolex系統(tǒng)。對干細(xì)胞抗原例如CD34具有特異性的抗體用作這些分離技術(shù)的部分。這些方法具有需要昂貴的異生素試劑、設(shè)備和一次性處理用具，并且執(zhí)行是費時的缺點。雖然最終產(chǎn)物是具有少的紅細(xì)胞或白細(xì)胞污染的更純的干細(xì)胞群體，但這個純度水平代表相當(dāng)大的產(chǎn)生的費用，并且可能不是達(dá)到預(yù)期細(xì)胞治療效果所需要的。此外，抗體和珠對骨髓或臍帶血的添加意味著產(chǎn)物在方法過程中不是"最低限度處理的"，因為這些試劑可能引起非故意的不利生物后果，例如干細(xì)胞不可逆的分化成譜系定型途徑。由Minguell，等人"Preparativeseparationofnucleatedcellsfromhumanbonemarrow",Experentia35:548-549，1978的研究比較了由于用葡聚糖、葡聚糖加Ficoll、Ficoll⑧和血沉棕黃層法處理的體積減少、細(xì)胞回收和細(xì)胞生存力。該論文證實缺乏用于骨髓的理想制備方法，因為一些方法引起細(xì)胞生存力的喪失，并且全部具有68%或更少淋巴樣細(xì)胞(單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞或MNC)的相對低的細(xì)胞回收。為了達(dá)到所觀察到的2.7:l紅細(xì)胞(RBC)/具核細(xì)胞比，命名為血沉棕黃層法的無需沉降輔助的離心法具有低且高度可變的(36-68%)最初存在的這些細(xì)胞的淋巴樣細(xì)胞回收范圍。發(fā)明才既述需要用于從骨髓或臍帶血制備干細(xì)胞組合物的系統(tǒng)和方法，其選擇性回收高百分比的干細(xì)胞和非常低百分比的RBCs;快速，非勞動力密集，且易于以一致方式執(zhí)行；可以在手術(shù)室中使用；在無菌、功能上封閉的系統(tǒng)中執(zhí)行；不需要異生素添加劑；減少骨髓或臍帶血樣品的原始體積；能夠處理一系列骨髓體積；并且允許用戶預(yù)先選擇最終產(chǎn)物的體積。還需要這樣的干細(xì)胞組合物，其包括來自原始樣品的高百分比干細(xì)胞且使那些干細(xì)胞維持在存活條件下，包含來自原始樣品的非常低百分比的RBCs，不包括任何異生素添加劑，并且具有可以由用戶選擇的最終體積。公開了衍生自人骨髓或臍帶血的干細(xì)胞組合物以及用于其制備的系統(tǒng)和方法。公開的發(fā)明具有整合到單一系統(tǒng)內(nèi)的下述10個屬性1.它回收高百分比的干細(xì)胞；2.它通過取出過量血槳、RBCs、血小板和嗜中性粒細(xì)胞而減少骨髓或臍帶血樣品的原始體積；3.它不需要異生素添加劑以完成干細(xì)胞回收，同時增強(qiáng)產(chǎn)物的安全性概況，從而消除關(guān)于細(xì)胞洗滌的需要，且使成本降到最低；4.它使干細(xì)胞維持在存活條件下；[OOSO]5.它快速完成(少于90分鐘)；6.由于干細(xì)胞分離和捕獲步驟的自動化，它并非勞動力密集的；7.它易于以一致方式執(zhí)行，從而需要最低限度的操作員訓(xùn)練和專業(yè)知識；8.它可以在手術(shù)室中或鄰近手術(shù)室使用用于自體或同種異體用途，或在細(xì)胞處理實驗室中使用。9.它在無菌、功能上封閉的系統(tǒng)中分開且分離干細(xì)胞和祖細(xì)胞，以減少產(chǎn)物的微生物污染危險；禾口10.它能夠處理用于組織再生的全范圍的骨髓和臍帶血。在一個方面，本發(fā)明包括了包括處理袋組和處理設(shè)備的系統(tǒng)。無菌且優(yōu)選一次性的袋組包括處理袋、RBC濃縮袋、干細(xì)胞袋、計量閥和使計量閥與每個袋連接的管路。一旦臍帶血或骨髓已轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)，就將袋組放置到安裝到離心桶(bucket)內(nèi)的處理設(shè)備內(nèi)。處理設(shè)備與袋組相互作用，以在單次離心運行過程中將WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層從骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。處理設(shè)備包括光學(xué)傳感器、微控制器、伺服電動機(jī)、一個或多個加速計、測壓儀(loadcell)和電池。微控制器接受且分析來自光學(xué)傳感器、加速計和測壓儀的輸入，并且指導(dǎo)伺服電動機(jī)以精確的閥運動打開且關(guān)閉計量閥，這允許在離心過程中通過密度和大小分層的不同細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到不同袋內(nèi)。在另一個方面，本發(fā)明還包括用于從骨髓或臍帶血分離且濃縮干細(xì)胞的方法。該方法包括下述步驟。將骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)。將裝載的袋組放置到處理設(shè)備內(nèi)。袋組在處理設(shè)備中以足夠的g力和時間離心，以使處理袋中的骨髓或臍帶血的細(xì)胞基于其密度和大小分為數(shù)層。袋組在處理設(shè)備中以較低的g力離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)。袋組可以任選在處理設(shè)備中以足夠的g力和時間離心，以使處理袋中的細(xì)胞基于細(xì)胞密度和大小再次分為數(shù)層。袋組在處理設(shè)備中離心，同時計量閥連續(xù)快速打開且關(guān)閉多次，以使剩余RBCs部分從處理袋分離到RBC濃縮袋內(nèi)，而不同時轉(zhuǎn)移WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層。當(dāng)袋組在離心時，處理設(shè)備使空干細(xì)胞袋的重量校準(zhǔn)為零。袋組在處理設(shè)備中離心，同時計量閥連續(xù)快速打開且關(guān)閉多次，以使小量剩余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些血漿從處理袋中分離且轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。在另一個方面，本發(fā)明包括通過本發(fā)明方法的實施方案制備的衍生自骨髓或臍帶血的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物。來自骨髓的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物具有約l個CD34+細(xì)胞與約500個RBCs的比，并且來自臍帶血的具有1個CD34+細(xì)胞與5，000個RBCs的比。這些干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物不包含任何異生素添加劑。本發(fā)明的干細(xì)胞組合物解決了無需異生素添加劑的、關(guān)于在功能上封閉的袋組中快速制備的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物的目前未滿足的臨床需要，以達(dá)到先前難以達(dá)到的紅細(xì)胞與干細(xì)胞比。骨髓組合物是有利的，因為它回收高比例的CD34+細(xì)胞(約97%)和ALDHBr+細(xì)胞(約92X)，同時消耗約98X的RBCs，并且不包含異生素添加劑。臍帶血組合物也是有利的，因為它回收高比例的CD34+細(xì)胞(約95%)，同時消耗約98%的RBCs，并且不包含異生素添加劑。附圖簡述10圖1是本發(fā)明袋組的實施方案的二維布置圖。圖2是圖1袋組的透視圖。圖3A是顯示圖1袋組的計量閥的一個流體通道的示意圖。圖3B是顯示圖3A中所示計量閥的第二個流體通道的示意圖。圖3C是顯示圖3B中所示計量閥的第三個流體通道的示意圖。圖4A是顯示與圖3A-3C實施方案不同的計量閥的實施方案的一個流體通道的示意圖。圖4B顯示圖4A中所示計量閥的第二個流體通道的示意圖。圖5是本發(fā)明處理設(shè)備的實施方案的透視圖。圖6是圖5處理設(shè)備的透視圖。圖7是圖5處理設(shè)備的透視圖。圖8是圖5處理設(shè)備的透視圖。圖9是圖5處理設(shè)備的側(cè)視圖。圖10是本發(fā)明處理設(shè)備的基板的實施方案的透視圖，顯示組分。圖11是圖5處理設(shè)備的分解圖。圖12是圖5處理設(shè)備中放置的圖1袋組的透視圖。圖13是圖12袋組和處理設(shè)備的透視圖。圖14是圖12袋組和處理設(shè)備的透視圖。圖15是圖12袋組和處理設(shè)備的透視圖。圖16是圖12袋組和處理設(shè)備在離心桶中的透視圖。圖17是顯示圖16裝載的離心桶和離心機(jī)的部分分解圖。圖18是圖5處理設(shè)備的微控制器的輸入和輸出的方框圖。圖19是顯示在分層步驟后的細(xì)胞層的圖1處理袋的部分橫截面?zhèn)纫晥D。圖20是顯示在方法的離心步驟過程中隨時間而變的在透光率中的變化的曲線圖。發(fā)明詳述用于從骨髓或臍帶血回收干細(xì)胞和祖細(xì)胞飽合物的系統(tǒng)該系統(tǒng)包括袋組100和處理設(shè)備200。圖1和2顯示袋組100的實施方案。袋組100是功能上封閉且優(yōu)選一次性的。袋組100包括通過管路或管道系統(tǒng)與計量閥連接的3個或更多個袋，具有入口管路、夾、濾器和取樣位點。袋組100優(yōu)選包括3個袋處理袋102、紅細(xì)胞(RBC)濃縮袋104和干細(xì)胞袋106。處理袋102可以由乙烯乙酸乙烯酯(EVA)制成，但還可以由PVC或其他塑料制成。RBC濃縮袋可以由PVC或其他塑料制成。干細(xì)胞袋106可以由EVA制成，盡管也可以使用其他塑料。袋102和106可以是吹塑的。RBC濃縮袋可以是RF熔接的，盡管它可以是吹塑的。處理袋102是三維袋，其可以具有不對稱形狀，包括頂部邊緣108、彎曲側(cè)面110、垂直側(cè)面112、錐形底部113和底部出口114。頂部邊緣108包括入口115和2個洞116?？商娲兀幚泶?02可以是對稱形狀的，從而使得它的側(cè)面錐形對稱地朝向底部出口114。處理袋102的總體積可以是約240mL，盡管在使用中，它一般充滿約50_150mL骨髓或臍帶血。處理袋102通過與入口115連接的入口管路118供應(yīng)。入口管路118包括凹形luer口(femaleluer)120，其允許袋組100與包含待轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)的骨髓或臍帶血的注射器連接。凹形luer口120與凸形luer頭(maleluer)122連接，所述凸形luer頭122與釘124連接，所述釘124由帽126覆蓋，所述帽126允許袋組100與包含待轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)的骨髓或臍帶血的收集袋連接。入口管路118包括凝塊和骨碎片濾器128(約200-300y網(wǎng)孔)。管路或管道系統(tǒng)夾130位于凝塊和骨碎片濾器128與凹形luer口120之間。入口管路118可以任選還包括取樣位點132、取樣枕134和取樣位點136，全部位于凝塊和骨碎片濾器128下。取樣位點132和136各自包括無針凹形luer口和非放氣luer口帽。底部出口114將輸出從處理袋102導(dǎo)向計量閥138。RBC濃縮袋104可以是扁平袋，具有頂部邊緣105、底部邊緣107和2個側(cè)面邊緣109，并且包括蝶形釘孔(spikeport)140，其用于在過程結(jié)束時取出RBCs的等分試樣，如果需要這樣的話。底部邊緣107在一個角落處包括入口111。RBC濃縮袋104的體積是約lOOmL，盡管在使用中，它一般充滿約30-80mL。RBC濃縮袋104在入口111處與供應(yīng)管路142連接，所述供應(yīng)管路142在計量閥138的連接頭139之一處與計量閥138連接。干細(xì)胞袋106是形狀為矩形的三維袋。干細(xì)胞袋106包括頂部邊緣117、底部邊緣119、大區(qū)室144和小區(qū)室146，其中區(qū)室144和146通過2個通道148連接。頂部邊緣117包括入口121和2個釘孔150，其用于在過程結(jié)束時取出干細(xì)胞。干細(xì)胞袋106的體積是約30mL，盡管在使用中，它一般充滿約25mL，其中約20mL在大區(qū)室144中，并且約5mL在小區(qū)室146中。干細(xì)胞袋106在入口121處與干細(xì)胞袋入口管路152連接，所述干細(xì)胞袋入口管路152通過F連接頭154與供應(yīng)管路156連接。供應(yīng)管路156在計量閥138的連接頭139之一處與計量閥138連接。F連接頭154使供應(yīng)管路156和干細(xì)胞袋入口管路152與分支管路158連接。分支管路158通過T連接頭160與取樣管路162和冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路164連接。取樣管路162包括管路夾164和取樣位點166，并且在取樣枕168中終止。冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路164包括取樣位點170和管路夾172，并且在無菌濾器174(優(yōu)選約0.2y網(wǎng)孔)中終止。取樣位點166和170各自包括無針凹形luer口和非放氣luer口帽。管路H8、142、156和162是可以由PVC、EVA或其他材料制成的管道系統(tǒng)。管路152和158是由EVA制成的管道系統(tǒng)。冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路164是在外部用PVC和在內(nèi)部用EVA制備的共擠壓管道系統(tǒng)。因為與冷凍保護(hù)劑接觸的塑料材料(如果它們浸出到冷凍保護(hù)劑內(nèi))可以進(jìn)入干細(xì)胞袋106且污染最終產(chǎn)物，所以使用不包含可以浸出到冷凍保護(hù)劑內(nèi)的增塑劑的材料例如EVA用于將與冷凍保護(hù)劑接觸的管路是有利的。計量閥138可以是旋塞閥。在一個實施方案中，計量閥138是三通旋塞閥，因為它具有3個連接頭139，從而使得它可以與3個袋連接處理袋102、RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106。其他類型的計量閥或旋塞閥也將發(fā)揮作用，例如具有4個連接頭的四通旋塞閥。計量閥138包括具有3個連接頭139的外部部分141和內(nèi)部部分143。外部部分141可以由聚碳酸酯制成。內(nèi)部部分143包括整體模塑的柄145和桶147，其可以由聚乙烯(polyethelene)制成。桶147在幾個位置之間移動，包括定義為不允許任何流體流過計量閥138的位置的封閉位置，以及定義為允許流體流過計量閥138的位置的2個開放位置。2個開放位置包括允許流體從處理袋102流過計量閥138到RBC濃縮袋104的一個位置，和12允許流體從處理袋102流過計量閥138到干細(xì)胞袋106的一個位置。在圖3A-3C中所示的一個實施方案中，計量閥138的桶147可以配置為包含3個開口，從而允許流體沿著3個可能流體通道流動如圖3A中所示從處理袋102到RBC濃縮袋104的預(yù)期通道；如圖3B中所示從處理袋102到干細(xì)胞袋106的預(yù)期通道；和如圖3C中所示在RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106之間的非計劃暫時通道，這可能在計量閥138在其2個預(yù)期位置之間移動時出現(xiàn)。此種暫時流體流動是不希望的，因為它可以允許一些另外的RBCs流入干細(xì)胞袋106內(nèi)，從而減少所得到的干細(xì)胞組合物的純度。為了解決這個擔(dān)心，在圖4A-4B中所示的另一個實施方案中，計量閥138的桶147可以可替代地配置為僅包含2個開口，從而允許流體僅沿著2個可能的流體通道流動；如圖4A中所示從處理袋102到RBC濃縮袋104的預(yù)期通道；和如圖4B中所示從處理袋102到干細(xì)胞袋106的預(yù)期通道。這種配置將排除在RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106之間任何可能的暫時流體流動。計量閥138應(yīng)能夠經(jīng)得住在離心過程中發(fā)生的高壓；例如，評定為約500磅/英寸2(psi)的閥是令人滿意的。供應(yīng)管路142從計量閥138導(dǎo)向RBC濃縮袋104。供應(yīng)管路156從計量閥138導(dǎo)向F連接頭154，所述F連接頭154經(jīng)由干細(xì)胞袋入口管路152導(dǎo)向干細(xì)胞袋106。管路142、152和156可以各自是熱封的且與袋組100分開。如果需要更多的袋以使來自骨髓或臍帶血的另外組分分開，那么袋組100可以包括另外的袋。如果包括另外的袋，那么計量閥138將具有另外的連接頭以供給每個袋，并且袋組將包括另外的供應(yīng)管路以使計量閥與每個袋連接。例如，如果希望使處理袋102中最后部分的RBCs與轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)的那些RBCs分開，那么需要第四個袋。第四個袋通過分開的供應(yīng)管路與計量閥138連接。在那種情況下，計量閥138將是具有4個連接頭的四通旋塞閥，并且將包括允許從處理袋102到其他3個袋中每個的流體流動的桶。圖5-15顯示處理設(shè)備200的實施方案。處理設(shè)備200是略微圓柱狀的，具有頂部202、底部204、前部206、背部208、側(cè)面210和側(cè)面212。前部206包括前門214以及前壁216和217。處理設(shè)備200具有機(jī)體218、干細(xì)胞袋區(qū)室220、基板222、支持托架224和處理袋吊架226。機(jī)體218和干細(xì)胞袋區(qū)室220優(yōu)選由模塑的氨基甲酸乙酯制成，盡管還可以使用其他熱塑材料?；?22優(yōu)選由不銹鋼制成。支持托架224優(yōu)選由鋁制成。處理袋吊架226優(yōu)選由不銹鋼制成。依一定尺寸制造處理設(shè)備200以配合具有1L最低限度容積的離心桶內(nèi)，所述離心桶在橫截面中可以是圓形或卵圓形的。圖16顯示處理設(shè)備200，包含在離心桶228內(nèi)部的袋組IOO。圖17顯示裝載的離心桶228如何安裝到在合適位置中已具有另外5個裝載的離心桶的離心機(jī)內(nèi)。處理設(shè)備200的機(jī)體218包括主區(qū)室230，所述主區(qū)室230具有加工為接受處理袋102的尺寸的延長卵圓形形狀。主區(qū)室230在頂部是開放的，并且由開放前門214接近，所述前門214通過鉸鏈232與處理設(shè)備200的前部206附著。主區(qū)室230具有符合且支持處理袋102的側(cè)壁234和236以及后壁238，且朝向通道240漸小，所述通道加工為接受處理袋102的錐形底部113的尺寸。側(cè)壁234和236在中部附近寬松地用架支撐處理袋102，并且在錐形底部113處更緊密地用架支撐處理袋102。接近處理袋102錐形底部113的更緊密容限是有利的，以提供關(guān)于處理袋102及其內(nèi)容物在離心的高壓過程中的支持，并且使對袋內(nèi)容物的干擾降到最低。前門214包括在其內(nèi)部表面上的凹入內(nèi)部凹進(jìn)242，所述凹入內(nèi)部凹進(jìn)242對應(yīng)于主區(qū)室230的側(cè)壁234和236以及通道240，并且提供連續(xù)表面，從而13使得當(dāng)前門214閉合時，它符合且支持處理袋102。凹進(jìn)244位于處理設(shè)備200的前部206上，在前壁216和217下，并且配置為支持計量閥138的連接頭139。閥門致動器套箍246位于凹進(jìn)244內(nèi)，并且按一定尺寸制造且配置為接受計量閥138柄145。閥門致動器套箍246通過螺絲250與伺服電動機(jī)248的軸附著。相應(yīng)凹進(jìn)252位于前門214內(nèi)部上，并且按一定尺寸制造且配置為接受計量閥138的伸出末端和連接頭139?！獋€或多個光學(xué)傳感器254通過主區(qū)室230的前壁217裝配，它們的小孔位于側(cè)壁236上，其中相等數(shù)目的LEDs256位于相對側(cè)壁234上。LED256包括紅色LED燈，盡管還可以使用其他類型的LEDs。一個光學(xué)傳感器254和一個LED256優(yōu)選位于通道240之上約2cm，從而使得在光學(xué)傳感器254和LED256水平以及計量閥138水平之間的處理袋102中的體積是約2mL，盡管還可以使用其他距離和相應(yīng)體積。如果包括另外的光學(xué)傳感器和LEDs，那么它們可以位于光學(xué)傳感器254和LED256之上或之下，這依賴于待分離的RBCs所需體積。處理設(shè)備200的側(cè)面212包括槽口258、貯存腔260、通道262、RBC濃縮袋凹進(jìn)264、支持架266和鉤268。槽口258按一定尺寸制造且配置為接受RBC濃縮袋104的釘孔140。RBC濃縮袋凹進(jìn)264從槽口258向下延伸至支持架266，并且按一定尺寸制造且配置為接受RBC濃縮袋104。貯存腔260位于槽口258下，并且在RBC濃縮袋凹進(jìn)264后且與RBC濃縮袋凹進(jìn)264連續(xù)。通道262沿著RBC濃縮袋凹進(jìn)264的內(nèi)部邊緣延伸，與前門214、頂部202和背部208鄰近。支持架266是形成RBC濃縮袋凹進(jìn)264的底面的水平架。干細(xì)胞袋區(qū)室220是水平、中空的矩形區(qū)室，其具有位于前門214的鉸鏈232下的較大側(cè)面270。干細(xì)胞袋區(qū)室268位于基板232下，并且與測壓儀272附著。干細(xì)胞袋區(qū)室220通過向下打開的鉸接門274接近，并且經(jīng)由在其頂部邊緣處位于干細(xì)胞袋區(qū)室220內(nèi)部的閂276合到應(yīng)有位置。鉸接門274的內(nèi)部包含凹進(jìn)278，所述凹進(jìn)278按一定尺寸制造且配置為容納干細(xì)胞袋106的釘孔150和入口121。鉸接門274的外部包含按一定尺寸制造以容納干細(xì)胞袋入口管路152的槽280和通道282。底部通道284向上延伸并且與基板222平行，從在鉸鏈232下的前部206經(jīng)過側(cè)面210和背部208到側(cè)面212。底部通道284按一定尺寸制造以容納管路142。處理設(shè)備200包括在側(cè)面210處延伸超過頂部202的處理袋吊架226。處理袋吊架226具有銜接在處理袋102上的洞116的接片227，使處理袋102維持在處理設(shè)備200內(nèi)部適當(dāng)位置中。LED窗口229位于側(cè)面210處的頂部202上。支持托架224是U型托架，其通過螺絲225與基板222附著，并且定向與處理設(shè)備200的側(cè)面210和212平行。如圖10中所示，基板222優(yōu)選具有安裝到其上的下述組分印刷電路板286、伺服電動機(jī)248、測壓儀272和界面接觸印刷電路板288。印刷電路板286包含可編程只讀存儲器憶微控制器290。由于在離心過程中的熱產(chǎn)生，微控制器290可能需要溫度補償。測壓儀272是補償溫度的應(yīng)變計測壓儀。伺服電動機(jī)248是齒輪減速電動機(jī)。一個或多個加速計292安裝到印刷電路板286上；如果使用2個加速計292，那么一個可以安裝到另一個之上。優(yōu)選地，加速計292包括測量約0-200xg的低g加速計291，和測量約1000-1700xg的高g加速計293。印刷電路板286還包括通過LED窗口229可見的狀態(tài)LEDs294。一個或多個狀態(tài)LEDs294可以指示電池296的充電狀態(tài)以及在方法中正執(zhí)行的當(dāng)前步驟，以及其他信息。提供界面接觸印刷電路板288以與外部電池充電器連接，并且提供與個人計算機(jī)的通訊連接?；?22通過螺絲298與機(jī)體218附著。圖18是顯示微控制器290的輸入和輸出的方框圖。光學(xué)傳感器254、電池電壓302、測壓儀272以及加速計291和293，產(chǎn)生轉(zhuǎn)變成由微控制器290接受的數(shù)字輸入的模擬輸出。微控制器290以預(yù)定時間間隔記錄、貯存且分析那些輸入。微控制器控制伺服電動機(jī)248、關(guān)于光學(xué)傳感器254的LED256和狀態(tài)LEDs294。當(dāng)包括計量閥138的袋組100正確放置到處理設(shè)備200內(nèi)時，伺服電動機(jī)248通過其傳動軸與閥門致動器套箍246連接，并且響應(yīng)來自微控制器290的信號，伺服電動機(jī)248引起計量閥138移動至不同位置，以打開或關(guān)閉至袋組100的袋的流體流動。電池296位于處理設(shè)備200的側(cè)面210處在頂部202上的電池腔300中。電池296是可再充電的鎳金屬氫化物電池，包括具有總共約3.8-4伏的3個電池，所述電壓進(jìn)行調(diào)節(jié)以提供5伏的恒定電壓。電池296給微控制器290、光學(xué)傳感器254、加速計291和293、測壓儀272、光學(xué)傳感器LED256、狀態(tài)LEDs294、伺服電動機(jī)248、以及處理設(shè)備200中的所有電路包括與個人計算機(jī)的通訊連接提供動力。處理單元200可以放置在分開的擴(kuò)展塢(dockingstation)中，所述擴(kuò)展塢包括電池充電器并且可以與個人計算機(jī)連接。來自微控制器290的數(shù)據(jù)可以轉(zhuǎn)移給個人計算機(jī)，并且經(jīng)由擴(kuò)展塢通過界面接觸印刷電路板288，可以接受來自個人計算機(jī)的命令。如圖12-15中所示，袋組100如下插入處理設(shè)備200內(nèi)。將干細(xì)胞袋106放置到干細(xì)胞袋區(qū)室220內(nèi)，從而使得底部邊緣119首先配合，并且小區(qū)室146折疊并且放置在較大側(cè)面270中。入口121和釘孔150放置在鉸接門274的凹進(jìn)278內(nèi)部。干細(xì)胞袋入口管路152放置在鉸接門274的槽280中。鉸接門274隨后關(guān)閉并且用閂276閂上。干細(xì)胞袋入口管路152放置在通道282中。計量閥138的柄145放置到閥門致動器套箍246內(nèi)。處理袋102在主區(qū)室230中這樣定向，從而使得前門214在處理袋102的垂直側(cè)面112上關(guān)閉。F連接頭154放置在RBC濃縮袋凹進(jìn)264內(nèi)。管路夾165關(guān)閉且連同取樣管路162—起放置在通道262內(nèi)部。冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路165、管路夾172(關(guān)閉的)和取樣位點170放置到貯存腔260內(nèi)，其中無菌濾器174放置到貯存腔260的右側(cè)壁插座內(nèi)。取樣位點166錨定在鉤268處。取樣枕168安裝到直接在RBC濃縮袋凹進(jìn)264的右側(cè)中的濾器插座下的凹進(jìn)內(nèi)。隨后，將供應(yīng)管路142放置到底部通道284內(nèi)，并且將RBC濃縮袋104放置到RBC濃縮袋凹進(jìn)264內(nèi)。入口管路118和取樣位點136向下并且朝向在側(cè)面210處的處理袋吊架226折疊。處理袋102的洞116與吊架226的接片227附著。前門214關(guān)閉。釘孔140安裝到槽口258內(nèi)，其中底部邊緣107在支持架266上，從而使得RBC濃縮袋104安裝在貯存腔260上。分支管路158沿著貯存腔260的左側(cè)垂直放置。從骨髓或臍帶血回收干細(xì)胞和祖細(xì)胞飽合物的方法該方法包括使骨髓或臍帶血細(xì)胞通過細(xì)胞密度和大小分層且分離的離心。待處理的骨髓或臍帶血包含血漿、RBCs、WBCs和干細(xì)胞，如由CD34+和ALDHBr+干細(xì)胞標(biāo)記的存在指示的。所得到的干細(xì)胞產(chǎn)物是干細(xì)胞和祖細(xì)胞的組合物，其包括一些WBCs、以及顯著減少的RBCs和血漿。使用上文描述的系統(tǒng)的該方法在能夠處理一系列骨髓或臍帶血體積的無菌、功能上封閉的系統(tǒng)中執(zhí)行，并且產(chǎn)生其體積可以預(yù)先由用戶選擇的最終產(chǎn)物。該方法15通過取出過量RBCs和血漿，并且如果臨床上有利的，則取出嗜中性粒細(xì)胞和血小板，來顯著減少骨髓體積，從而使最終干細(xì)胞組合物中的干細(xì)胞濃縮。對于這種方法不需要異生素添加劑，所述方法從骨髓或臍帶血回收高百分比的干細(xì)胞和祖細(xì)胞。如本說明書中使用的，術(shù)語"g力"指相對離心力，并且所有對特定g力的參考均在處理設(shè)備200中的光學(xué)傳感器254位置處測定。應(yīng)當(dāng)理解本文提及的特定g力和時間段舉例說明該方法的實施方案，并且除所提及的那些外的g力和時間段是有用的并且包括在該方法的其他實施方案中。在該方法的一個實施方案中，包括下述步驟1.將骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)。將骨髓或臍帶血收獲或收集到收集容器例如袋、注射器或其他容器內(nèi)，與抗凝劑例如肝素或CPD—起保存，并且轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)。轉(zhuǎn)移可以這樣完成通過將釘124插入收集袋內(nèi)，使凹形旋鎖luer口(luerlock)120與注射器附著，或使用無菌連接設(shè)備無菌對接收集袋和處理袋的管道系統(tǒng)。管路夾130是打開的。骨髓或臍帶血隨后經(jīng)由重力流動通過入口管路118從收集容器轉(zhuǎn)移到處理袋102。骨髓或臍帶血經(jīng)過凝塊和骨碎片濾器128，在它到達(dá)處理袋102前，所述凝塊和骨碎片濾器128從骨髓或臍帶血取出聚集物(例如血凝塊、脂肪球和骨碎片)。在骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移后，入口管路118在取樣位點132之上進(jìn)行熱封，并且取出收集容器、凝塊和骨碎片濾器128以及管路118的其余部分。約25-200mL體積的骨髓或臍帶血可以放置到處理袋102內(nèi)，其中約50_170mL是優(yōu)選的。如果收集的骨髓或臍帶血的原始體積是約100mL，并且骨髓或臍帶血具有約30X的血細(xì)胞比容，那么RBC體積將是約30mL，WBC以及干細(xì)胞和祖細(xì)胞體積將是約lmL，并且剩余體積將是血槳。出乎意料地，不必需沉降試劑或其他異生素添加劑，以執(zhí)行這個方法并且達(dá)到干細(xì)胞和祖細(xì)胞從骨髓或臍帶血的有效回收，如本文所描述的。如果需要沉降試劑例如HES，那么它任選加入處理袋102中的骨髓中。如果需要，在取樣位點132之上的入口管路118熱封后，待處理的骨髓或臍帶血樣品可以從處理袋102中獲取。對取樣枕134進(jìn)行擠壓并且釋放以將樣品抽取到枕內(nèi)。入口管路118隨后在取樣位點136之上進(jìn)行熱封，并且連同取樣位點132取出取樣枕134。取樣枕134中的骨髓或臍帶血隨后可以通過取樣位點132接近用于分開的測定，例如用于細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞生存力、微生物污染和HLA分析。如果未從處理袋102中獲取樣品，那么入口管路118在取樣位點136之上進(jìn)行熱封，并且取出在取樣位點136之上的所有組分。2.將裝載的袋組放置到處理設(shè)備內(nèi)。將袋組100包括袋、管路和計量閥放置到如上所述的處理設(shè)備200內(nèi)。如圖16和17中所示，將處理設(shè)備200與袋組100—起放置到離心機(jī)的離心桶228內(nèi)，所述離心桶228可以進(jìn)行冷凍。離心機(jī)需要用另一個處理設(shè)備200或用合適的砝碼進(jìn)行平衡。3.使袋組以足夠的g力和經(jīng)過時間在處理設(shè)備中離心，以使處理袋中的骨髓或臍帶血細(xì)胞基于其密度和大小分為數(shù)層。處理設(shè)備200中的袋組100以足夠的預(yù)定g力和預(yù)定時間進(jìn)行離心，以使處理袋102中的骨髓或臍帶血細(xì)胞群體通過細(xì)胞密度和大小分為數(shù)層。例如，離心可以在約1400xg下執(zhí)行約20-約40分鐘。在這個分層步驟過程中，計量閥138處于其關(guān)閉位置，從而使得不允許流體流動通過計量閥138。加速計293測量在離心過程中的g力。離心優(yōu)選繼續(xù)直至細(xì)胞已分為3層。參見顯示在這個分層步驟已執(zhí)行后的處理袋102的圖19。下面、最濃的層400主要是RBCs;中間密度的中間層402是WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及一些血小板的層；并且上面、最不濃的層404主要是血漿伴隨一些另外的血小板。與干細(xì)胞和祖細(xì)胞一起存在的血小板百分比將隨著離心持續(xù)時間增加而變大。1400g力和20-40分鐘的離心時間足以引起超過70%的干細(xì)胞遷移至WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層，盡管優(yōu)選至少約80%_90%的干細(xì)胞位于這個層中。4.袋組在處理設(shè)備中以較低g力離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)。細(xì)胞已在先前步驟中在處理袋102中分層后，處理設(shè)備200中的袋組100以足夠的預(yù)定較低g力和預(yù)定時間進(jìn)行離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋102分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。g力低于步驟3中使用的g力，以依具有細(xì)胞損傷的最低危險的受控方式，允許RBC層從處理袋102通過計量閥138通過供應(yīng)管路142流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。例如，離心可以在約80xg下執(zhí)行約3-約10分鐘。這個離心步驟可以通過使先前步驟的g力自動減少至預(yù)定較低g力與先前分層步驟的離心連續(xù)，或它可以在先前離心步驟已完成且停下來后起始且執(zhí)行。加速計291測量在離心過程中的g力。微控制器290—接受預(yù)定g力穩(wěn)定例如約30秒的來自加速計291的輸入，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動機(jī)248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138打開至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過供應(yīng)管路142且到RBC濃縮袋104內(nèi)的流體通道。在計量閥138打開時，處理袋102中由壓緊的RBCs組成的大部分下層流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。同時在計量閥138打開時，微控制器290在流體流過LED256時指導(dǎo)光學(xué)傳感器254從LED256獲取通過在處理袋102中的骨髓或臍帶血的透光率讀數(shù)。微控制器290連續(xù)記錄且分析透光率，它接受所述透光率作為隨時間而變的來自光學(xué)傳感器254的輸入。圖20顯示隨著細(xì)胞層流經(jīng)LED256和光學(xué)傳感器254在離心過程中隨時間而變的相對透光率，在步驟4中計量閥138打開后開始并且持續(xù)經(jīng)過步驟8，排除任選步驟5。線近似S形曲線，具有其中存在很少的透光率或無透光率并且線幾乎水平的區(qū)域A;其中存在透光率量中的快速增加并且線的斜率陡的區(qū)域B;和其中存在大量透光率并且線幾乎水平的區(qū)域C。在這個步驟過程中，RBC層流經(jīng)光學(xué)傳感器254。因為RBC層具有最大的細(xì)胞濃度，所以它阻斷光透射至光學(xué)傳感器254。因此，在這個步驟過程中，光學(xué)傳感器254檢測出來自LED256的很少光或未檢測出光，如圖20上的區(qū)域A所示。在RBC層已流經(jīng)光學(xué)傳感器254后，RBC層和WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層之間的界面開始流過光學(xué)傳感器254。因為這個層具有比RBC層更低的細(xì)胞濃度，所以更多的光通過光學(xué)傳感器254從LED256檢測出。微控制器290—由光學(xué)傳感器254通知，預(yù)定量的透光率已達(dá)到，這指示W(wǎng)BC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物層的經(jīng)過的開始，微控制器就指導(dǎo)伺服電動機(jī)248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138關(guān)閉，從而使得通過計量閥138的流體流17動停止。這由圖20上的點D顯示。因此，WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層的最低部分一開始達(dá)到光學(xué)傳感器254，計量閥138就關(guān)閉。在這個分離步驟后，約2mL壓緊的RBC體積保留在處理袋102中，大部分RBC體積已轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。例如，在具有30%血細(xì)胞比容的100mL收集的骨髓的原始體積中，約28mLRBC體積(約93%)目前將在RBC濃縮袋104中，并且約2mL(7%)RBC體積將保留在處理袋102中。5.袋組可以任選在處理設(shè)備中以足夠的g力和經(jīng)過時間離心，以使處理袋中的細(xì)胞基于細(xì)胞密度和大小再次分為數(shù)層。這是個任選步驟。如果這個步驟不執(zhí)行，那么該方法前進(jìn)到下一個步驟。由于先前分離步驟和當(dāng)細(xì)胞溶液通過計量閥138取出時發(fā)展的科里奧利(Coriolis)力，處理袋102中的細(xì)胞層(這包括RBC層的剩余部分、所有WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層、和所有血漿層)可以在其界面處變得略微更少確定且更多混合。在這個任選步驟中，處理設(shè)備200中的袋組100可以以足夠的預(yù)定g力和時間離心，以使剩余細(xì)胞通過細(xì)胞密度和大小再次分為更確定的層。例如，離心可以在約1400xg下執(zhí)行約5-約15分鐘。這個離心步驟可以通過給離心機(jī)編程以自動增加g力與先前分離步驟的離心連續(xù)，或它可以在先前離心步驟已完成且停下來后起始且執(zhí)行。在這個離心步驟過程中，計量閥138處于其關(guān)閉位置，從而使得不允許流體流動通過計量閥138。離心優(yōu)選持續(xù)直至細(xì)胞已再次分為在層之間的界面處具有減少的混合的3層剩余RBCs的下層、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞的中間層、和血槳上層。離心力和時間是足夠的，從而使得超過70X的干細(xì)胞位于WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層中，盡管優(yōu)選至少約80%_90%的干細(xì)胞位于這個層中。6.袋組在處理設(shè)備中離心，同時計量閥接連快速打開且關(guān)閉多次，以使剩余RBCs的相當(dāng)大部分從處理袋更精確地轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)，而不同時轉(zhuǎn)移WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層。先前任選再分層步驟后，或如果未執(zhí)行再分層步驟，那么在先前分離步驟后，處理設(shè)備200中的袋組100以足夠的預(yù)定g力和預(yù)定時間段離心，以完成這個步驟以及步驟7和8。例如，離心可以在約80xg(與步驟4中使用的相同的g力)下執(zhí)行約5-約15分鐘。在這個步驟中，在處理袋102中剩余RBCs的相當(dāng)大部分精確地轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。較低g力的目的是以具有細(xì)胞損傷的最低危險的受控方式，允許RBCs從處理袋102流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。這個離心步驟可以與先前步驟的離心連續(xù)，如果先前步驟是再分層，那么通過給離心機(jī)編程以自動減少g力來實現(xiàn)，或如果先前步驟是分離，那么通過以相同g力繼續(xù)離心來實現(xiàn)，或它可以在先前離心步驟完成且停下來后起始且執(zhí)行。加速計291測量在離心過程中的g力。微控制器290—接受預(yù)定g力穩(wěn)定例如約30秒的來自加速計291的輸入，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動機(jī)248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138打開至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過供應(yīng)管路142且到RBC濃縮袋104內(nèi)的流體通道，并且隨后關(guān)閉，經(jīng)過預(yù)定時間間隔的預(yù)定持續(xù)時間連續(xù)重復(fù)打開和關(guān)閉多次達(dá)預(yù)定數(shù)目的循環(huán)，允許從處理袋102到RBC濃縮袋104訪問足夠的重復(fù)的、不連續(xù)時間量，以允許血漿層接近光學(xué)傳感器254水平。例如，計量閥138可以設(shè)定為打開約O.l-約0.2秒的持續(xù)時間，并且關(guān)閉約IO秒，這個循環(huán)重復(fù)約10-約30次，盡管持續(xù)時間、時間間隔和重復(fù)的其他組合也將良好工作。隨著計量閥138打開且關(guān)閉，處理袋102中剩余RBCs部分流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。這個精確的紅細(xì)胞取出步驟引起在先前步驟后保留在處理袋102中的2mLRBC體積中約5mL從處理袋102流動到RBC濃縮袋104內(nèi)，甚至進(jìn)一步減少處理袋102中留下的RBC體積，并且由于伴隨計量閥138每次短暫打開和關(guān)閉的微小體積的RBC轉(zhuǎn)移，RBCs不與干細(xì)胞和祖細(xì)胞混合，并且由于科里奧利力，干細(xì)胞和祖細(xì)胞不吸入到轉(zhuǎn)移的紅細(xì)胞內(nèi)。如果需要，甚至更大比例的剩余RBCs也可以通過這種方式轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋102內(nèi)。這個最終精確計量活性由微控制器290指導(dǎo)，所述微控制器290隨著處理袋102中的細(xì)胞層流過LED256，從光學(xué)傳感器254接受來自LED256的透光率讀數(shù)。微控制器290連續(xù)記錄且分析隨時間而變的透光率，并且使當(dāng)前值與先前值比較。在這個步驟過程中，WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層流經(jīng)光學(xué)傳感器254。因為這個層在其與RBC層的界面處具有較高的細(xì)胞濃度，并且在其與血漿層的界面處具有較低的細(xì)胞濃度，所以隨著WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層流經(jīng)光學(xué)傳感器254和與血漿層的界面接近，透光率穩(wěn)定增加。因此，在這個步驟過程中，光學(xué)傳感器254檢測出在來自LED256的透光率中的穩(wěn)定增加。這由圖20上區(qū)域B中線的斜率顯示。WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層已流經(jīng)光學(xué)傳感器254后，WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層和血漿層之間的界面開始流過光學(xué)傳感器254。因為血漿層具有比WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層更少的細(xì)胞，所以通過光學(xué)傳感器254從LED256檢測出更多的光。微控制器290—接受來自光學(xué)傳感器254的輸入，所述輸入為透光率的^iiim中的預(yù)定減少已發(fā)生，這基于光學(xué)傳感器254檢測預(yù)定速率值，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動機(jī)248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138關(guān)閉，從而使得RBCs通過計量閥138的轉(zhuǎn)移終止。這由圖20上的點E顯示，在從區(qū)域B中線的陡斜率到區(qū)域C中幾乎水平的線的轉(zhuǎn)換處，這是在其下WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物層已流過光學(xué)傳感器254之下并且血漿層已開始流經(jīng)光學(xué)傳感器254的點。因此，血漿層的最低部分一開始達(dá)到光學(xué)傳感器254，計量閥138就關(guān)閉。在這個分離步驟后，約O.5-1.0mLRBC體積保留在處理袋102中，另外5mLRBC體積已轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。7.當(dāng)袋組在離心時，處理設(shè)備使空干細(xì)胞袋的重量校準(zhǔn)為零。計量閥138在先前步驟中已關(guān)閉后，離心以步驟6中設(shè)定的g力和時間繼續(xù)。加速計291證實設(shè)定的g力，在這個點下測壓儀272和微控制器290組合以使空干細(xì)胞袋106的重量校準(zhǔn)為零。8.袋組在處理設(shè)備中離心，同時計量閥接連快速打開且關(guān)閉多次，以使小量剩余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些血漿從處理袋中分離且轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。袋組106在處理設(shè)備200中的離心以步驟6中設(shè)定的g力和時間繼續(xù)。當(dāng)微控制器290接受來自測壓儀272的輸入，所述輸入為空干細(xì)胞袋106的重量已校準(zhǔn)為零，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動機(jī)248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138打開至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過供應(yīng)管路156和干細(xì)胞袋入口管路152到干細(xì)胞袋106內(nèi)的流體通道，并且隨后關(guān)閉，經(jīng)過預(yù)定時間間隔的預(yù)定持續(xù)時間連續(xù)重復(fù)打開和關(guān)閉多次達(dá)預(yù)定數(shù)目的循環(huán)，允許從處理袋102到干細(xì)胞袋106訪問足夠的重復(fù)的、不連續(xù)時間量，以允許干細(xì)胞袋106填充直至達(dá)到它的預(yù)定重量。例如，計量閥138可以設(shè)定為打開約190.l-約0.2秒的持續(xù)時間，并且關(guān)閉約IO秒，這個循環(huán)重復(fù)多次。隨著計量閥138打開且關(guān)閉，處理袋102中的剩余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些血槳流動到干細(xì)胞袋106內(nèi)。這個步驟過程中較低g力的目的是以具有細(xì)胞損傷(其在較高g力下將發(fā)生)的最低危險的受控方式，允許這些細(xì)胞從處理袋102流動到干細(xì)胞袋106內(nèi)。在這個分離步驟過程中，測壓儀272測量干細(xì)胞袋106的重量，并且微控制器290接受來自測壓儀272的輸入。預(yù)設(shè)WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層的所需重量，并且可以設(shè)定為約3克-約30克。例如，如果干細(xì)胞袋106中最終干細(xì)胞產(chǎn)物的所需體積是10mL，那么可以使用10克的重量。微控制器290—接受來自測壓儀272的輸入，所述輸入為干細(xì)胞袋106已達(dá)到其預(yù)設(shè)重量，微控制器290就指導(dǎo)伺服電動機(jī)248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138關(guān)閉，從而使得通過計量閥138的流體流動停止。計量閥138關(guān)閉后，離心以相同的g力繼續(xù)直至已達(dá)到步驟6中的預(yù)設(shè)時間段設(shè)置。9.離心結(jié)束并且從處理設(shè)備中取出袋組。在預(yù)設(shè)離心時間段結(jié)束時，離心終止并且從離心機(jī)中取出處理設(shè)備200。從處理單元200中取出袋組100，包括所有袋、計量閥138和管路。干細(xì)胞袋106包含剩余RBCs、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞、以及一些血槳。干細(xì)胞袋106的內(nèi)容物在本文中稱為"干細(xì)胞組合物"或"干細(xì)胞的組合物"。RBC濃縮袋104包含RBCs。處理袋102包含在干細(xì)胞袋106中不包含的血槳的剩余部分。若需要，可以獲取來自RBC濃縮袋104和干細(xì)胞袋106的樣品。取樣管路162、取樣枕168、取樣位點166和管路夾164用于取樣干細(xì)胞袋106。如果干細(xì)胞組合物立即使用，例如在自體背景中，那么干細(xì)胞袋106隨后使用Sebra密封器(SebraCorp.，Tucson,AZ.)與袋組100的其余部分分離。如果干細(xì)胞組合物待冷凍，那么冷凍保護(hù)劑溶液例如匿SO溶液應(yīng)通過無菌濾器174和冷凍保護(hù)劑供應(yīng)管路165加入干細(xì)胞袋106中。使用骨髓和臍帶血作力干細(xì)胞來源的方法的例子從授權(quán)供應(yīng)商收集5單位人骨髓和6單位臍帶血，并且在收集1-3天內(nèi)進(jìn)行處理。下表顯示對于通過本文所述方法處理的骨髓和臍帶血獲得的數(shù)據(jù)。骨髓用肝素進(jìn)行抗凝，并且臍帶血用CPD進(jìn)行抗凝。依一定尺寸制造以包含處理設(shè)備的臺式離心機(jī)提供離心場。在這些實驗中不使用異生素添加劑作為沉降助劑。下表1提供用于骨髓和臍帶血實驗的方法步驟概括。表1:用于骨髓和臍帶血實驗的方法概括<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>~~在處理前獲取骨髓和臍帶血樣品，并且在處理后獲取最終產(chǎn)物(干細(xì)胞組合物)樣品。使用SysmexXE-2100執(zhí)行RBCs、WBCs、血小板、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞計數(shù)。使用商業(yè)Stem-Count試劑盒(BeckmanCoulter,Inc，Miami，F(xiàn)L)根據(jù)制造商的說明書，對處理前和后的樣品執(zhí)行CD34+細(xì)胞和CD45+細(xì)胞(在所有白細(xì)胞上和在大多數(shù)CD34+細(xì)胞上表達(dá)的抗原)的計算。試劑盒允許通過流式細(xì)胞術(shù)同時鑒定且計算在生物樣品中的CD45+和雙陽性CD45+，CD34+細(xì)胞群體百分比和絕對細(xì)胞計數(shù)。CD45+細(xì)胞的生存力基于活體染料7-AAD的染料排除進(jìn)行測定。通過流式細(xì)胞術(shù)用在適當(dāng)配置的BeckmanCoulterFC-500流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter,Inc.，Miami，F(xiàn)L)上的合適門控和分析獲得細(xì)胞群體測量。使用商購可得的具有BeckmanCoulterFC-500流式細(xì)胞儀的Aldecount試劑盒(Aldagen，Durham,NC)根據(jù)制造商的說明書，對來自骨髓單位1、2和3的樣品在處理前和后執(zhí)行ALDHBr+細(xì)胞的鑒定和計算。試劑盒中提供的試劑促使干細(xì)胞染為亮熒光綠色。這些細(xì)胞命名為Aldagen亮(ALDHBr+)細(xì)胞。[OWO]A.骨髓數(shù)據(jù)表2顯示在處理前關(guān)于5次實驗的骨髓體積和細(xì)胞計數(shù)。顯示了每個單位中RBCs、血小板、TNCs、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、MNCs、CD34+細(xì)胞和ALDHBr+細(xì)胞的總數(shù)目。ND的條目指示數(shù)據(jù)"未測定"。表2:擺處鍾(船只艦麵遷/擺靴)實驗單位體積(mL)RBC血小板TNC嗜中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞顧C(jī)CD34+細(xì)胞ALDHBr+106/單位106/單位106/單位106/單位106/單位106/單位106陣位106/單位106/單位183329,0005,39016368434121245368.1813.092154427,0006,1402229115742918361119.5017.613149467,0005,970簡歸34611946617.2323.41478189,0005,280172311801091322418.96ND578170，0006,720172812351331492819.50ND平均值簡317，,S，卯O■109528614142712.718.04SD3913S，0005卯23615515426161S.3S.18表3顯示來自在表2中提及的5單位骨髓關(guān)于在5次實驗中獲得的干細(xì)胞組合物的體積和細(xì)胞計數(shù)。顯示了每個單位中RBCs、血小板、TNCs、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、MNCs、CD34+細(xì)胞和ALDHBr+細(xì)胞的總數(shù)目。表3:骨髓干細(xì)胞飽合物(體積和總細(xì)胞i十?dāng)?shù)/骨髓單位)22實驗單位體積(mL)RBC血小板TNC嗜中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞畫CCD34+細(xì)胞ALDHBr+106/單位106/單位106/單位106/單位106/單位106/單位106/單位106/單位106/單位120.96,7005,710127153137498.24728.611.4220.76,2106，0901482600339161.550119.720.2321.36,3906,01013255522649836213.717.44216,0904，530140788017079.82509.7ND520.84,1606,010107564796106.12029,5ND平均值20.95910.0S670.01312.0642.0248.6風(fēng)7357.412.216.3SD0.21004.9653.6154.9140.4115.831.0131.84.64.5表4呈現(xiàn)了基于表2和3中呈現(xiàn)的5次實驗結(jié)果，每個細(xì)胞類型的百分比回收。通過將干細(xì)胞組合物中的細(xì)胞計數(shù)(表3)除以骨髓處理前樣品中的相應(yīng)值(表2)，并且將這個商乘以IOO，計算百分比回收。例如，在實驗l中，通過將(6，700X106)除以(329，000X106)，并且將商乘以100，以得到2.0%的回收(表4)，計算RBCs的百分比回收。可以通過從100%中減去百分比回收簡單地計算百分比消耗。例如，在實驗1中，紅細(xì)胞的百分比消耗是100%-2.0%=98.0%。表4:躺釘麵會目^腫齡麵,船營細(xì)險實驗RBC血小板TNC嗜中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞MNCCD34+細(xì)胞ALDHBr+12.0105.977.763.090.879.288.1105.187.121.599.266.551.979.088.382.0101.0114.731.4100.769.652.176.382.477.779.574.343.285.881.774.6156.060.5103.7108.3ND52.489.462.252.472.271.271.9100.0ND平均值2.196.271.558.894.876.384.798.892.0SD0.88.38.010.034.910.812.211.320.6表4中的數(shù)據(jù)出乎意料地證實可能達(dá)到平均97.9X的RBCs消耗(2.1%回收)，23同時回收超過90%的干細(xì)胞，如通過CD34+細(xì)胞和ALDHBr+細(xì)胞測量的(分別為98.9%和92.0%的平均回收)。更加出乎意料地，表4證實甚至可以回收超過90%的干細(xì)胞，同時回收平均僅59%的嗜中性粒細(xì)胞。骨髓的這個選擇性細(xì)胞分離水平將預(yù)期需要使用異生素沉降試劑。表5和6顯示在處理前骨髓中和在干細(xì)胞組合物中RBCs與具核細(xì)胞類型比，其基于表2和3的數(shù)據(jù)。這些細(xì)胞彼此的比限定在自然界中未發(fā)現(xiàn)也未由任何其他細(xì)胞處理系統(tǒng)產(chǎn)生的獨特干細(xì)胞組合物。具有非常低數(shù)目RBCs的干細(xì)胞組合物的開發(fā)通過產(chǎn)生更安全的細(xì)胞產(chǎn)物代表干細(xì)胞治療的重要進(jìn)展，這是由于與關(guān)于干細(xì)胞輸液的過量紅細(xì)胞相關(guān)的不利作用和有助于用免疫親和或流式細(xì)胞術(shù)方法的進(jìn)一步純化過程的細(xì)胞產(chǎn)物。具體地，表5和6中的數(shù)據(jù)顯示在處理前的骨髓中，RBCs與CD34+細(xì)胞的平均比最初是25，642:1，并且在處理后，干細(xì)胞組合物中的比是539:1。RBCs與干細(xì)胞比中的這種急劇減少反映該方法選擇性消除RBCs而不損失CD34+細(xì)胞的成功。觀察到紅細(xì)胞與ALDHBr+細(xì)胞比中的相似減少。表5:骨髓單位(處理前)中RBCs與具核細(xì)胞比實驗RBC:TNCRBC:嗜中性粒細(xì)胞RBC:淋巴細(xì)胞RBC:單核細(xì)胞RBC:MNCRBC:CD34+RBC:ALDHBr+1201390799265361440220251342192369995233369921897242483245441135039241002271041994941101601734143278421094ND5981381278114160517895ND平均值169300123122977412564223110SD63140358110216387952773表6:骨髓干細(xì)胞組合物中RBCs與具核細(xì)胞比24<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>這些細(xì)胞群體的效用是其包含活細(xì)胞固有的。表7包含關(guān)于骨髓中CD45+細(xì)胞的細(xì)胞生存力的分析結(jié)果，如使用商業(yè)試劑盒(Stem-Kit,BeckmanCoulter,Fullerton，CA)測量的。不存在處理后CD45+細(xì)胞生存力中的顯著變化，這證實該過程的生物相容性。表7:在骨髓處理前中和在干細(xì)朐纟目合物中活CD45+細(xì)朐百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>B.臍帶血數(shù)據(jù)表8顯示在處理前6個臍帶血單位的體積和細(xì)胞計數(shù)。顯示了處理前每個單位中RBCs、血小板、TNCs、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、麗Cs和CD34+細(xì)胞的總數(shù)目。表8盡血處雄(船只禾口迪朐遷/,血靴)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*Plt.二血小板，Neut.=嗜中性粒細(xì)胞，Lymph.二淋巴細(xì)胞，Mono.=單核細(xì)胞表9顯示關(guān)于來自表8中提及的臍帶血相應(yīng)單位的6次實驗中獲得的干細(xì)胞組合物的體積和細(xì)胞計數(shù)。顯示了處理后每個單位中RBCs、血小板、TNCs、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、麗Cs和CD34+細(xì)胞的總數(shù)目。表9盡血f麵。(船只禾口迪朐遷/,血靴)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*Plt.二血小板，Neut.=嗜中性粒細(xì)胞，Lymph.二淋巴細(xì)胞，Mono.=單核細(xì)胞表10呈現(xiàn)了基于表8和9中呈現(xiàn)的6次實驗結(jié)果，每個細(xì)胞類型的百分比回收。通過將干細(xì)胞組合物中的細(xì)胞計數(shù)(表9)除以臍帶血處理前樣品中的相應(yīng)值(表8)，并且將這個商乘以ioo，計算百分比回收。表io:軒麵會目，帳鋪帶血麵,白勺麵g營扁<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*Plt.二血小板，Neut.=嗜中性粒細(xì)胞，Lymph.二淋巴細(xì)胞，Mono.=單核細(xì)胞表10中的數(shù)據(jù)證實可能達(dá)到98.0%的平均RBCs消耗(2.0%回收)，同時回收平均95%的干細(xì)胞，如通過CD34+標(biāo)記測量的。此外，表10證實甚至回收平均95%的干細(xì)胞，同時僅回收平均55%的嗜中性粒細(xì)胞。與骨髓的情況一樣，將預(yù)期需要使用異生素沉降助劑以達(dá)到這個選擇性細(xì)胞分離水平。下表11和12顯示在處理前臍帶血中和在臍帶血干細(xì)胞組合物中RBCs與各種其他細(xì)胞類型比，這基于表8和9的數(shù)據(jù)。不存在異生素添加劑，這些細(xì)胞彼此的比限定在自然界中未發(fā)現(xiàn)也未由任何其他細(xì)胞處理系統(tǒng)產(chǎn)生的獨特干細(xì)胞組合物。這些干細(xì)胞組合物的效用要求干細(xì)胞是活的，具有紅細(xì)胞的顯著消耗且無異生素添加劑。包含位于來源骨髓或臍帶血中的大多數(shù)干細(xì)胞和祖細(xì)胞且具有非常低RBC與CD34+細(xì)胞比的干細(xì)胞組合物的可用性通過產(chǎn)生更安全的細(xì)胞產(chǎn)物代表干細(xì)胞治療的重要進(jìn)展，這是由于與關(guān)于干細(xì)胞輸液的過量紅細(xì)胞相關(guān)的潛在不利作用。RBCs與CD34+細(xì)胞的平均比最初是201，834:1，并且在處理后，它減少至5，007:1。RBCs與干細(xì)胞比中的這種急劇減少反映該方法選擇性消除RBCs而不顯著損失CD34+細(xì)胞的成功。表11:在臍帶血單位(處理前)中RBCs與具核細(xì)胞比<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>干細(xì)胞組合物如上所述的方法產(chǎn)生了衍生自骨髓或臍帶血的干細(xì)胞組合物，其包括干細(xì)胞、血漿、RBCs和WBCs，并且不具有異生素添加劑。衍生自骨髓的干細(xì)胞組合物具有對于每個TNC約5個RBCs，對于每個嗜中性粒細(xì)胞約10個RBCs，對于每個MNC約18個RBCs，和對于每個干細(xì)胞約400-500個RBCs的比，如通過CD34+細(xì)胞或ALDHBr+細(xì)胞測量的(表6)。衍生自臍帶血的干細(xì)胞組合物具有對于每個TNC約11個RBCs，對于每個嗜中性粒細(xì)胞約24個RBCs，對于每個MNC約23個RBCs，和對于每個干細(xì)胞約5，000個RBCs的比，如通過CD34+細(xì)胞測量的(表12)。衍生自骨髓的干細(xì)胞組合物回收約79%-約100%CD34+細(xì)胞，和約74%-約100%ALDHBr+細(xì)胞，同時消耗約97X-約99XRBCs。衍生自臍帶血的干細(xì)胞組合物回收超過約77%-約100%CD34+細(xì)胞，同時消耗約96%-約99%RBCs。結(jié)果證實出乎意料的發(fā)現(xiàn)在RBCs從處理袋分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)的過程自始至終，骨髓或臍帶血中的干細(xì)胞可以維持其在WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層中相對較高的位置(比紅細(xì)胞層更接近于血漿層)，并且嗜中性粒細(xì)胞維持其在WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層中相對較低的位置(更接近于紅細(xì)胞層)。將預(yù)期流出處理袋的RBCs將引起干細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞以及其他細(xì)胞類型的顯著混合，這是由于隨著RBCs向下朝著計量閥流動的科里奧利效應(yīng)和非層流。此種混合將預(yù)期阻礙觀察到的相對于嗜中性粒細(xì)胞低回收的干細(xì)胞高回收，以及相對于RBCs高效消耗的干細(xì)胞高回收。本發(fā)明在上文已參考特定實施方案進(jìn)行描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)想包含在權(quán)利要求范圍內(nèi)的本發(fā)明的其他實施方案和變化。權(quán)利要求一種由抗凝骨髓制備的干細(xì)胞的組合物，其包括血漿；RBCs；WBCs；和活的干細(xì)胞；其中所述組合物不包括異生素添加劑；其中所述干細(xì)胞包括CD34+細(xì)胞；和進(jìn)一步地其中在所述組合物中所述RBCs與所述CD34+細(xì)胞比小于約2000∶1。2.—種由抗凝骨髓制備的干細(xì)胞的組合物，其包括血漿RBCsWBCs和活的干細(xì)胞；其中所述組合物不包括異生素添加劑；其中所述干細(xì)胞包括ALDHBr+細(xì)胞；禾口其中在所述組合物中所述RBCs與所述ALDHBr+細(xì)胞比小于約20003.—種由抗凝臍帶血制備的干細(xì)胞的組合物，其包括血漿1。RBCsWBCs和活的干細(xì)胞；其中所述組合物不包括異生素添加劑；其中所述干細(xì)胞包括CD34+細(xì)胞；禾口其中在所述組合物中所述RBCs與所述CD34+細(xì)胞比小于約15，000:1,4.一種由抗凝骨髓制備的干細(xì)胞的組合物，其包括血漿RBCsWBCs和活的干細(xì)胞；其中所述組合物由收集的、抗凝骨髓制備，其包括血漿、RBCs、WBCs和干細(xì)胞，包括活的CD34+細(xì)胞；其中所述組合物包括所述收集骨髓的至少約80%CD34+細(xì)胞和所述收集骨髓的不超過約10%RBCs;禾口其中所述組合物不包括異生素添加劑。5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述組合物的體積不超過所述收集骨髓體積的約25%。6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述組合物的體積預(yù)先進(jìn)行選擇。7.權(quán)利要求4的組合物，其中所述收集骨髓中超過90%的所述活的CD34+細(xì)胞在所述組合物中保持存活。8.—種由抗凝臍帶血制備的干細(xì)胞的組合物，其包括血漿RBCsWBCs;禾口活的干細(xì)胞；其中所述組合物由收集的、抗凝臍帶血制備，其包括血漿、RBCs、WBCs和干細(xì)胞，包括活的CD34+細(xì)胞；其中所述組合物包括所述收集臍帶血的至少約80%CD34+細(xì)胞和所述收集臍帶血的不超過約10%RBCs;禾口其中所述組合物不包括異生素添加劑。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述組合物的體積不超過所述收集臍帶血體積的約25%。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物的體積預(yù)先進(jìn)行選擇。11.權(quán)利要求8的組合物，其中所述收集臍帶血中超過90X的所述活的CD34+細(xì)胞在所述組合物中保持存活。12.—種由骨髓制備的干細(xì)胞的組合物，其包括血漿RBCsWBCs;禾口活的干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞包括CD34+細(xì)胞；其中RBCs與CD34+細(xì)胞比是約500:約1;其中所述組合物不包括異生素添加劑；禾口其中所述組合物在對于環(huán)境功能上封閉的容器中制備-13.—種由臍帶血制備的干細(xì)胞的組合物，其包括血漿RBCsWBCs;禾口活的干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞包括CD34+細(xì)胞；其中RBCs與CD34+細(xì)胞比是約5000:約1;其中所述組合物不包括異生素添加劑；禾口其中所述組合物在對于環(huán)境功能上封閉的容器中制備。14.一種從骨髓或臍帶血制備干細(xì)胞組合物的方法，其包括a.將收集的骨髓或臍帶血放置到處理袋內(nèi)，其中所述處理袋是袋組的部分，所述袋組還包括紅細(xì)胞濃縮袋、干細(xì)胞袋和計量閥，并且進(jìn)一步地，其中所述計量閥與所述處理袋、所述紅細(xì)胞濃縮袋和所述干細(xì)胞袋連接；b.將所述袋組放置到處理設(shè)備內(nèi)，其中所述處理設(shè)備包括微控制器、伺服電動機(jī)、光學(xué)傳感器、LED、測壓儀和加速計，其中當(dāng)所述袋組包含在所述處理設(shè)備中時，所述伺服電動機(jī)與所述計量閥可操作地偶聯(lián)；c.使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時間離心，以使所述處理袋中的所述骨髓或臍帶血細(xì)胞分為紅細(xì)胞層、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及血漿層，其中所述計量閥關(guān)閉；d.使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以低于所述分層步驟中使用的g力的g力和足夠的時間離心，以使大多數(shù)所述紅細(xì)胞從所述處理袋分離到所述紅細(xì)胞濃縮袋內(nèi)，其中所述計量閥從所述處理袋打開到所述紅細(xì)胞濃縮袋；e.促使所述計量閥響應(yīng)所述光學(xué)傳感器檢測來自所述LED的預(yù)定量透光率而關(guān)閉；f.使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時間離心，以使更多所述紅細(xì)胞從所述處理袋分離到所述紅細(xì)胞濃縮袋內(nèi)，其中所述計量閥接連打開且關(guān)閉多次；g.促使所述計量閥響應(yīng)所述光學(xué)傳感器檢測透光率的預(yù)設(shè)變化速率而關(guān)閉；h.使所述干細(xì)胞袋校準(zhǔn)為零，其中所述校準(zhǔn)使用來自所述測壓儀的數(shù)據(jù)來執(zhí)行；i.使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時間離心，以使剩余紅細(xì)胞、所述WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及一些所述血槳從所述處理袋分離到所述干細(xì)胞袋內(nèi)，其中所述計量閥接連打開且關(guān)閉多次；j.促使所述計量閥響應(yīng)所述測壓儀測量所述干細(xì)胞袋的預(yù)設(shè)重量而關(guān)閉；k.從所述處理單元中取出所述袋組；禾口1.從所述袋組中取出包含所述干細(xì)胞組合物的所述干細(xì)胞袋。15.權(quán)利要求14的方法，其在步驟(e)和(f)之間進(jìn)一步包括，使包含所述袋組的所述處理設(shè)備以足夠的g力和時間離心，以使所述處理袋中的所述骨髓或臍帶血細(xì)胞再次分為紅細(xì)胞層、WBC/干細(xì)胞和祖細(xì)胞層以及血漿層，其中所述計量閥關(guān)閉。16.權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括預(yù)先選擇所述干細(xì)胞組合物的體積。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述選擇的體積通過選擇所述干細(xì)胞袋中所述干細(xì)胞組合物的重量進(jìn)行測定。18.權(quán)利要求14的方法，其中所述收集骨髓的體積是約40mL-約240mL。19.一種用于從骨髓或臍帶血制備干細(xì)胞產(chǎn)物的系統(tǒng)，其包括a.袋組，包括容納收集的骨髓或臍帶血的處理袋、紅細(xì)胞濃縮袋、干細(xì)胞袋和計量閥，其中所述計量閥與所述處理袋、所述紅細(xì)胞濃縮袋和所述干細(xì)胞袋連接；禾口b.處理設(shè)備，所述袋組安裝到其內(nèi)，并且包括微控制器、伺服電動機(jī)、光學(xué)傳感器、LED、測壓儀和加速計，其中當(dāng)所述袋組包含在所述處理設(shè)備中時，所述伺服電動機(jī)與所述計量閥可操作地偶聯(lián)；禾口c.其中所述袋組和所述處理設(shè)備可以經(jīng)得住在足夠的g力和時間下的離心，以使來自所述收集骨髓或臍帶血的干細(xì)胞產(chǎn)物分離且濃縮。20.權(quán)利要求19的系統(tǒng)，其中所述微控制器接受且分析來自所述加速計、所述光學(xué)傳感器和所述測壓儀的輸入，并且引起所述伺服電動機(jī)使所述計量閥響應(yīng)所述輸入而打開或關(guān)閉。21.權(quán)利要求19的系統(tǒng)，其中所述光學(xué)傳感器位于所述處理設(shè)備中，從而使得在所述光學(xué)傳感器水平和所述計量閥水平之間的所述處理袋中的體積是約2mL。全文摘要本發(fā)明包括從骨髓或臍帶血回收的干細(xì)胞和祖細(xì)胞組合物，其包含大多數(shù)活的CD34+細(xì)胞以及基本上消耗的位于原始樣品中的紅細(xì)胞，無需任何異生素添加劑以幫助細(xì)胞分離。本發(fā)明還包括用于制備組合物的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)包括袋組和處理設(shè)備，所述處理設(shè)備利用光學(xué)傳感器、微控制器、伺服電動機(jī)、加速計、測壓儀和電池。該系統(tǒng)和方法利用離心，以使細(xì)胞分為數(shù)層并且隨后將干細(xì)胞分離且轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞袋內(nèi)。處理設(shè)備的微控制器接受來自設(shè)備的加速計、測壓儀和光學(xué)傳感器的輸入，以指導(dǎo)袋組中的計量閥打開且關(guān)閉，以允許轉(zhuǎn)移盡可能多的干細(xì)胞與盡可能少的紅細(xì)胞。文檔編號C12N5/00GK101707891SQ200780053147公開日2010年5月12日申請日期2007年7月6日優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日發(fā)明者B·A·貝克,J·R·查普曼,P·H·科埃略,P·埃曼努埃爾,R·S·蔡爾德斯,李俊之申請人:熱起源公司