專利名稱：：凍干法穩(wěn)定疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物組合物，例如疫苗，以及制備和使用這樣的組合物的方法。
背景技術(shù)：
：接種疫苗是醫(yī)學(xué)最偉大的成就之一，使數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人免受毀滅性疾病的影響。在疫苗廣泛使用前，傳染病每年僅在美國(guó)就殺死了數(shù)以千計(jì)的兒童和成年人，同樣在世界各地殺死了更多得多的人。接種疫苗廣泛用于預(yù)防和治療細(xì)菌、病毒和其他病原體所致的感染，接種疫苗也是用于預(yù)防和治療癌癥的方法。疫苗接種中使用一些不同的方法，包括滅活病原體，活減毒病原體和滅活病原體亞單位給藥。就病毒感染而言，已發(fā)現(xiàn)活疫苗帶來(lái)最有效和持久的保護(hù)性免疫應(yīng)答。已經(jīng)開發(fā)出抗黃病毒的活減毒疫苗，黃病毒是通常通過感染的蚊子或壁虱傳播的小的包膜正鏈RNA病毒。黃病毒科家族的黃病毒屬包括大約70種病毒，其中許多如黃熱病(YF)、登革熱(DEN)、日本腦炎(JE)和森林腦炎(TBE)病毒是主要的人類病原體(綜述BurkeandMonath,FieldsVirology,4thEd.，1043-1126，2001)。不同的方法已用于開發(fā)抗黃病毒的疫苗。就黃熱病病毒而言，例如兩種疫苗(黃熱病17D和法國(guó)嗜神經(jīng)疫苗)已通過連續(xù)傳代進(jìn)行開發(fā)(Monath，“YellowFever,”InPlotkinandOrenstein,Vaccines,3rded.,Saunders,Philadelphia,pp.815-879,1999)。用于接種疫苗的黃病毒減毒的另一方法包括構(gòu)建包括兩種不同黃病毒組分的嵌合黃病毒。了解這種嵌合體如何構(gòu)建需要解釋黃病毒基因組的結(jié)構(gòu)。黃病毒蛋白是通過翻譯單個(gè)、長(zhǎng)開放閱讀框生成多蛋白，之后是一系列復(fù)雜的宿主以及病毒蛋白酶對(duì)多蛋白的翻譯后蛋白水解，生成成熟的病毒蛋白(Ambergetal.,J.Virol.73=8083-8094,1999；Rice,"Flaviviridae,”InVirology,Fields(ed.)，Raven-Lippincott,NewYork,1995,VolumeI，p.937)。病毒結(jié)構(gòu)蛋白以C-prM-E的順序在多蛋白中排列，其中“C”是衣殼，“prM”是病毒包膜結(jié)合M蛋白的前體，“E”是包膜蛋白。這些蛋白質(zhì)出現(xiàn)在多蛋白的N端區(qū)域，而非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)位于多蛋白的C端區(qū)域。已制備的嵌合黃病毒包括來(lái)自不同黃病毒的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。例如所謂的ChimeriVax技術(shù)采用黃熱病17D病毒衣殼蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，以遞送其他黃病毒的包膜蛋白(prM和E)(參見例如Chambersetal.，J.Virol.73:3095_3101，1999)。這項(xiàng)技術(shù)已用來(lái)開發(fā)針對(duì)登革熱、乙型腦炎(JE)、西尼羅(WN)和圣路易斯腦炎(SLE)病毒的候選疫苗(參見例如Pugachevetal.，NewGenerationVaccines,3rded.，Levineetal.，eds.,MarcelDekker,NewYork,Basel,pp.559-571,2004；Chambersetal.,J.Virol.733095-3101,1999；Guirakhooetal.,Virology257:363-372,1999；Monathetal.,Vaccine171869-1882,1999；Guirakhooetal.,J.Virol.74:5477-5485,2000；Arroyoetal.，TrendsMo1.Med.7:350_354，2001；Guirakhooetal.，J.Virol.78:4761_4775，2004；Guirakhooetal.,J.Virol.789998-10008,2004；Monathetal.,J.Infect.Dis.1881213-1230,2003；Arroyoetal.，J.Virol.78:12497_12507，2004；和Pugachevetal.，Am.J.Trop.Med.Hyg.71:639_645，2004)。對(duì)疫苗成功使用和商業(yè)化而言最重要的是以何種方式處理和配制疫苗，以確保在使用前疫苗運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定和療效的保持。冷凍干燥是一些疫苗產(chǎn)品處理中涉及的方法，本質(zhì)上是低壓下通過升華去除水，留下內(nèi)有少量水分的干餅產(chǎn)物的凍干過程。此過程可能對(duì)疫苗是有利的，包括如上所述的嵌合黃病毒疫苗，因?yàn)檫@樣的疫苗往往在低濕度環(huán)境中更穩(wěn)定。冷凍干燥還可以增加產(chǎn)物的存儲(chǔ)溫度，使其更易于運(yùn)輸。影響凍干過程有效性的關(guān)鍵因素是疫苗的制劑。例如可取的是通過除去水，所述制劑提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。通常疫苗制劑將包含任何或全部下列成分填充劑(如糖)、穩(wěn)定劑(如糖或蛋白質(zhì))以及緩沖劑。因此如上所討論的，開發(fā)有效和高效的加工方法和制劑對(duì)臨床上有用和商業(yè)上成功的疫苗，包括黃病毒疫苗的開發(fā)都是非常重要的。發(fā)明概述本發(fā)明提供包括一種或多種活減毒黃病毒疫苗、一種或多種穩(wěn)定劑，一種或多重填充劑以及一種或多種緩沖劑成分的組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，該穩(wěn)定劑是人血清白蛋白(HSA)(例如非重組人血清白蛋白(HSA)或重組人血清白蛋白(rHA))(例如約0.05-2.0%或0.1%)?？梢园ㄔ诒景l(fā)明組合物中的填充劑的例子是乳糖(例如約2-10%或4%)和/或甘露醇(例如約2-10%或5%)，而可以包括在組合物中的緩沖劑成分的例子是組氨酸(例如約l_20mM或IOmM)和/或谷氨酸鉀(例如約20_80mM或50mM)。組合物可以是凍干形式或凍干前的液體形式。此外，組合物的PH值可以是例如6-10、7-9、7.5-8.5或7.9-8.1。包括在本發(fā)明組合物中的活的減毒疫苗可以是例如嵌合黃病毒，如包括第一黃病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和第二不同黃病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的嵌合黃病毒。在一個(gè)實(shí)施例中，這樣的嵌合黃病毒包括第一黃病毒的前膜/膜和包膜蛋白，以及第二不同黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白。第一和第二黃病毒可以獨(dú)立地選自黃熱病(例如YF17D)、日本腦炎、登革熱-1、登革-2、登革熱-3、登革熱-4、墨萊溪谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、庫(kù)寧、羅西奧腦炎、Ilheus、中歐腦炎、西伯利亞腦炎、俄羅斯春夏腦炎、Kyasanur森林病、Alkhurma、鄂木斯克出血熱、跳躍病、Powassan、Negishi、Absettarov、Hansalova、Apoi禾口Hypr病毒。在具體實(shí)施例中，第一黃病毒為日本腦炎病毒或西尼羅病毒，第二黃病毒是黃熱病病毒(例如YF17D)。本發(fā)明還包括的是包括一種或多種基于蛋白和/或病毒的藥物、人血清白蛋白(例如非重組人血清白蛋白(HSA)或重組人血清白蛋白(rHA))(例如約0.05-2.0%或0.1%)、谷氨酸堿金屬鹽(如谷氨酸鉀)(例如約20-80mM或50mM)、一種或多種額外氨基酸(例如組氨酸)(例如約l_20mM或IOmM)，以及一種或多種糖或糖醇(如乳糖和/或甘露醇)(例如約2-10%、4%或5%)。組合物可以是冷凍干燥形式或凍干前的液體形式。此外組合物的PH值可以是例如6-10、7-9、7.5-8.5或7.9-8.1。在一個(gè)實(shí)施例中，基于病毒的藥品包括天花疫苗(如牛痘病毒或減毒痘苗病毒，例如ACAM1000、ACAM2000或改良安卡拉痘苗(MVA))。在另一實(shí)施例中，基于蛋白的藥品包括乙型肝炎病毒核心蛋白融合體(如乙型肝炎病毒核心蛋白融合體進(jìn)一步包括一種或多種流感M2e肽)。此外，在另一實(shí)施例中，基于蛋白的藥物包括艱難梭菌的毒素或類毒素。本發(fā)明還包括制備藥物組合物的方法，其包括將如上所述的那些組合物凍干處理。此過程可包括冷凍、一次干燥和二次干燥。在實(shí)施例中，冷凍步驟包括約-50°C下冷凍約120分鐘。一次干燥步驟可以包括溫度遞變(ramp)步驟，其包括溫度遞變約+0.1°C/分鐘至擱板溫度約-40°C，保持約500分鐘；溫度遞變約+0.1°C/分鐘至擱板溫度約-35°C，保持約500分鐘；溫度遞變約+0.I0C/分鐘至擱板溫度約-30°C，保持約500分鐘；溫度遞變約+0.rc/分鐘至擱板溫度約-25°c，保持約800分鐘。在此實(shí)施例中，二次干燥步驟可包括溫度遞變步驟，其包括溫度遞變約+0.rc/分鐘至擱板溫度約+20°C，保持約800分鐘。在另一實(shí)施例中，冷凍步驟可以包括在約-40°c冷凍約60分鐘。一次干燥步驟可包括溫度遞變步驟，其包括溫度遞變約+0.5°c/分鐘至擱板溫度約-5°c，保持約300分鐘；以及溫度遞變約-0.5°C/分鐘至擱板溫度約-0°C，保持約300分鐘。二次干燥步驟可包括溫度遞變步驟，其包括溫度遞變約+0.2V/分鐘至擱板溫度約+30°C，保持約600分鐘；以及溫度遞變約-1.O0C/分鐘至擱板溫度約+5°C，保持約9999分鐘。本發(fā)明還包括預(yù)防或治療受試者一種或多種疾病的方法，其包括如上所述或本文其他地方所述，施用一種或多種本發(fā)明的組合物。在這些方法的某些實(shí)施例中，受試者有黃病毒(例如日本腦炎病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒或黃熱病病毒感染)、天花、流感或艱難梭菌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，或有以上病毒。此外，本發(fā)明包括在如本文所述的疾病的預(yù)防和治療中本文所述的組合物和制劑的用途，以及用于這些目的的藥品的制備。一般而言，如果本發(fā)明的物質(zhì)或組合物給藥前，受試者沒有所述疾病或感染，則執(zhí)行所述方法以“預(yù)防”受試者的疾病或感染。如果受試者有這樣的疾病或感染，則執(zhí)行該方法以“治療”疾病或感染?？梢赃M(jìn)行預(yù)防和/或治療以減少如不給藥則出現(xiàn)的所述影響，或消除這種影響。本發(fā)明提供若干好處。例如如上所述，對(duì)包括蛋白和/或病毒成分的藥物組合物，如疫苗的有效使用而言，關(guān)鍵是在不同的運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件下保持組合物穩(wěn)定。如下文進(jìn)一步討論的，本發(fā)明提供制劑和加工步驟，制備具有提高的穩(wěn)定性的組合物。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)從以下詳細(xì)說明、附圖和權(quán)利要求是顯而易見的。圖1為實(shí)驗(yàn)JEPD-018中，37°C儲(chǔ)存時(shí)效價(jià)損失圖。圖2為實(shí)驗(yàn)WNPD-033中，有和沒有組氨酸的穩(wěn)定性圖。圖3為實(shí)驗(yàn)WNPD-045中，37°C下有和沒有谷氨酸鉀的穩(wěn)定性圖。圖4為實(shí)驗(yàn)JEPD-145中，37°C下不同濃度乳糖的穩(wěn)定性圖。圖5為與37°C下甘露醇/乳糖組合比較單一糖制劑的穩(wěn)定性圖。圖6為退火樣品中，37°C儲(chǔ)存的效價(jià)損失圖。圖7為4%乳糖溶液的熱分析圖，其玻璃化溫度為-32.6°C。圖8為當(dāng)5%甘露醇加到制劑中時(shí)，玻璃轉(zhuǎn)化溫度降低約6°C至_38°C的熱分析圖。圖9為-80°C時(shí)，最終制劑的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性圖。圖10是使用調(diào)制式DSC分析以提高分辨率的WNPD-045樣品的熱分析圖。圖11是無(wú)需使用調(diào)制式掃描即表現(xiàn)足夠分辨率的JEPD-172樣品的熱分析圖。圖12是所示實(shí)驗(yàn)中凍干的ChimeriVax殘留水分的穩(wěn)定性的相互關(guān)系。圖13是實(shí)驗(yàn)JEPD-151的熱電偶溫度圖。詳細(xì)說明本發(fā)明提供可用于制備基于病毒和/或蛋白的藥品，包括活病毒疫苗的制備的組合物和方法，進(jìn)一步介紹如下。本發(fā)明的組合物包括如下所述已發(fā)現(xiàn)在疫苗制備中有利的成分(例如尤其是穩(wěn)定劑、填充劑和緩沖劑)，而所述方法包括涉及也是有利的凍干的步驟。本發(fā)明還提供了采用本文所述組合物的預(yù)防和治療方法。本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)一步說明如下。本發(fā)明的組合物包括一種或多種基于蛋白和/或病毒的治療藥物，以及一種或多種穩(wěn)定劑、填充劑，和/或緩沖成分。本發(fā)明的組合物的具體實(shí)施例以下進(jìn)一步詳述，包括嵌合黃病毒疫苗、作為穩(wěn)定劑的人血清白蛋白(0.1%)、作為填充劑的甘露醇(5%)和乳糖(4%),以及作為緩沖組分的組氨酸(IOmM)和谷氨酸鉀(50mM)。如下所述，除了此具體實(shí)施例，本發(fā)明還包括其中這些類型成分的特性和/或數(shù)量改變的組合物。本發(fā)明的組合物中可出現(xiàn)的穩(wěn)定劑包括血清白蛋白蛋白。優(yōu)選血清白蛋白蛋白人血清白蛋白(HSA)，無(wú)論重組或非重組形式?？砂ㄔ诒景l(fā)明所述組合物中的血清白蛋白蛋白的另外的例子是牛血清白蛋白。除了血清白蛋白，可包括在本發(fā)明組合物中的其他穩(wěn)定劑是明膠，如人明膠(如可以是野生型或基因工程的重組人明膠)和豬明膠、酪蛋白、PVP，及本文提及的任何穩(wěn)定劑(或本領(lǐng)域已知的其他)的組合。就人血清白蛋白而言，此成分的量可以是例如約0.05-2.0%,0.075-1.0%或0.可存在于本發(fā)明組合物中的填充劑包括糖，如乳糖、蔗糖和果糖，和/或糖醇，如甘露醇和山梨醇。正如下文進(jìn)一步討論的，在包括甘露醇的本發(fā)明組合物中，對(duì)此組分而言優(yōu)選無(wú)定形，而非結(jié)晶形式。此外，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物可優(yōu)選包括糖和/或糖醇的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，下文進(jìn)一步闡述的，本發(fā)明的組合物可以包括乳糖和甘露醇的組合，后者優(yōu)選無(wú)定形形式。在一個(gè)實(shí)施例中，乳糖為約1-10%、2-8%或4-6%(例如4%)，而甘露醇為約1-10%、2-8%或4-6%(如5%)。正如以上所指出的，除了穩(wěn)定劑和填充劑，本發(fā)明的組合物可包括緩沖組分，如氨基酸，這可能有助于保持例如某一特定PH水平或范圍，和/或產(chǎn)物穩(wěn)定性?？砂ㄔ诒景l(fā)明組合物中的緩沖組分的一個(gè)例子是組氨酸，可能出現(xiàn)在組合物中的濃度為約例如1-20、5-15或10mM。緩沖組分的另一個(gè)例子是谷氨酸堿金屬鹽，如谷氨酸鈉或鉀，組合物中存在的濃度為約10-100、25-75或50mM。此外，所述組合物一般pH值為例如6_10、7_9、7.5-8.5或7.9-8.1。本發(fā)明的組合物還包括一種或多種活性治療成分，其可為基于肽或蛋白的治療藥物，以及病毒，如活的減毒病毒疫苗。后一組治療藥物(活減毒病毒疫苗)類型的例子是黃病毒疫苗，如黃熱病病毒疫苗。這樣的黃熱病病毒疫苗的例子是YF17D疫苗株(Smithburnetal·,"YellowFeverVaccination,"WorldHealthOrg.,p.238,1956；Freestone,inPlotkinetal.(eds.),Vaccines,2ndedition,W.B.Saunders,Philadelphia,1995)。其他黃熱病病毒株，如YF17DD(GenBank檢索號(hào)U17066)和YF17D-213(GenBank檢索號(hào)U17067)(dosSantosetal.，VirusRes.35:35_41，1995)，YF17D-204France(X15067,X15062),YF17D-204,234US(Riceetal.，Science229726-733,1985；Riceetal.,NewBiologist1:285_296，1989;C03700，K02749)，和Galleretal.，Vaccine16(9/10):1024_1028，1998所描述的黃熱病病毒株，也可以存在于本發(fā)明的組合物中?？稍诒景l(fā)明的組合物中存在的其他黃病毒包括其他蚊子傳播的黃病毒，如日本腦炎(例如SA14-14-2)，登革熱(血清型1-4)、墨萊溪谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、庫(kù)寧、Rocio腦炎，Ilheus病毒；蜱傳黃病毒，如中歐腦炎、西伯利亞腦炎、俄羅斯春夏腦炎，Kyasanur*#_、Powassan>Negishi、Absettarov>Hansalova.Apoi和Hypr病毒，以及丙型肝炎病毒屬病毒(如丙型肝炎病毒)。除了上面列出的病毒以及其他黃病毒，嵌合黃病毒也可以包括在本發(fā)明的組合物中。這些嵌合體可以由黃病毒(即骨架黃病毒)組成，其中結(jié)構(gòu)蛋白(或多種結(jié)構(gòu)蛋白)已經(jīng)被第二病毒(即待測(cè)或預(yù)定的病毒，例如黃病毒；參見例如美國(guó)專利號(hào)6，696，281；美國(guó)專利號(hào)6，184，024；美國(guó)專利號(hào)6，676，936和美國(guó)專利號(hào)6，497，884)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)蛋白(或多種結(jié)構(gòu)蛋白)取代。例如，所述嵌合體可由骨架黃病毒(如黃熱病病毒)組成，其中所述黃病毒的膜和包膜蛋白已被第二待測(cè)病毒(例如西尼羅病毒、登革熱病毒(血清型1、2、3或4)、日本腦炎病毒，或其他病毒，如任何本文提及的那些)的膜和包膜取代。嵌合病毒可以從任意組合的病毒制備，但通常需要針對(duì)哪種病毒的免疫力，則所述病毒就是插入的結(jié)構(gòu)蛋白的來(lái)源?？砂ㄔ诒景l(fā)明組合物的嵌合病毒類型的具體例子是黃熱病人疫苗株YF17D，其中膜蛋白和包膜蛋白已被另一黃病毒，如西尼羅病毒、登革熱病毒(血清型1、2、3或4)、日本腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒，墨萊溪谷腦炎病毒，或任何其他黃病毒，如以上所列那些之一的膜蛋白和包膜蛋白取代。使用此方法制備的嵌合黃病毒已被指定為所謂的“ChimeriVax”病毒。使用ChimeriVax技術(shù)制備，保藏在布達(dá)佩斯條約確認(rèn)的美國(guó)弗吉尼亞馬納薩斯的美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，保藏日期1998年1月6日的以下嵌合黃病毒可用于制備本發(fā)明的病毒嵌合黃熱病17D/登革熱2型病毒(YF/DEN-2；ATCC檢索號(hào)ATCCVR-2593)和嵌合黃熱病17D/日本腦炎SA14-14-2病毒(YF/JEA1.3；ATCC檢索號(hào)ATCCVR-2594)?？捎糜诒景l(fā)明的嵌合病毒的詳細(xì)信息在例如下列出版物中提供W098/37911；W001/39802；Chambersetal.,J.Virol.733095-3101,1999；W003/103571；W02004/045529；U.S.專利號(hào)6，696，281；U.S.專利號(hào)6，184，024；U.S.專利號(hào)6，676，936；和U.S.專利號(hào)6，497，884。能在本發(fā)明的組合物中出現(xiàn)，并可以包括特定減毒突變的嵌合黃病毒的另外具體例子例如在W002/072835、W002/102828、W003/10357UW02004/045529、W02005/082020、W02006/044857、W02006/116182和U.S.專利號(hào)6，589，531中描述?？沙霈F(xiàn)在本發(fā)明組合物中的另外的病毒疫苗包括天花疫苗(例如基于牛痘病毒的疫苗，包括ACAM1000、ACAM2000、改良安卡拉痘苗(MVA)，和Lister，以及基于猴痘的疫苗)以及皰疹病毒和疫苗(如HSV-1及其重組體，以及HSV-2及其重組體)(參見例如美國(guó)專利號(hào)7，115，270)。除了病毒，本發(fā)明的組合物還可以包括治療或疫苗肽或蛋白，例如乙型肝炎核心蛋白融合體構(gòu)建物(如與一種或多種流感肽例如M2e融合的乙型肝炎核心蛋白；參見例如W02005/055957)和艱難梭菌類毒素疫苗(包括例如類毒素A和/或B)。上述及本文其他地方所述的組合物可以是凍干形式，或液體形式，如凍干過程之前或之后的形式。正如本文其他地方進(jìn)一步詳細(xì)討論的，由于活性組分的穩(wěn)定性，本發(fā)明的組合物尤其有利，活性組分的穩(wěn)定性主要是由于制劑以及包括凍干的產(chǎn)物制備過程。一般來(lái)說，這個(gè)過程包括以下步驟冷凍、一次干燥、二次干燥和加塞。這個(gè)過程在以下實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)說明，但所述過程的例子如下。冷凍步驟中凍干機(jī)擱板預(yù)冷至_50°C。一旦所有托盤放上樣品，擱板保持在_50°C120分鐘。在一次干燥步驟中，真空設(shè)置為25mT，并進(jìn)行以下溫度遞變步驟溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-40°C，保持500分鐘；溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-35°C，保持500分鐘；溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-30°C，保持500分鐘；溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-25X，保持800分鐘。在二次干燥步驟中，真空保持為25mT，并進(jìn)行溫度遞變步驟溫度遞變+0.I0C/分鐘至擱板溫度+20°C，保持800分鐘。如有必要，產(chǎn)品可在20°C、25mT最多再保持24小時(shí)，然后加塞。在加塞步驟中，用0.22μm過濾的干燥氮?dú)鈱?duì)室內(nèi)脫氣，真空設(shè)為SOOmbar(略有真空)，并將塞子擠到小瓶中?？捎糜诒景l(fā)明的另一凍干循環(huán)總結(jié)在下表中。表1-另一凍干循環(huán)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>因此，本發(fā)明的所述方法可以包括在或至約例如-70°C至-30°C(例如-60°C至-40°C，或-50°C)冷凍。冷凍可以進(jìn)行約30至240分鐘(例如60至120分鐘)或更長(zhǎng)的時(shí)間。如本文所述，所述材料可隨后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)干燥步驟。在這些步驟中，可使用真空(例如25mT)，溫度可以經(jīng)一段時(shí)間(如100-1000分鐘，例如200-600或300-500分鐘)，逐步改變(例如0.1至1.O0C/分鐘，或0.5°C/分鐘)。在一次干燥中，溫度可提高到或約例如-30°C至+10°C，例如-20°C至+5°C或-15°C至0°C，而在二次干燥中，溫度可改變至例如+5°C至+35°C，例如10°C至30°C，或15°C至20°C。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，這些參數(shù)(如溫度、保持時(shí)間，溫度遞變速率和真空水平)可以基于例如得到的結(jié)果改變。配制前，可包括在本發(fā)明組合物中的病毒(包括嵌合體)可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，病毒基因組相應(yīng)的RNA分子可引入原代細(xì)胞、雞胚或二倍體細(xì)胞系，則子代病毒就可從中(或其上清)純化。可用于制備所述病毒的另一方法采用異倍體細(xì)胞，如Vero細(xì)胞(Yasumuraetal.，NihonRinsho211201-1215，1963)。在此方法中，病毒基因組相應(yīng)的核酸分子(例如RNA分子)引入異倍體細(xì)胞，從其中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基收集病毒，收集的病毒用核酸酶(例如降解DNA和RNA的核酸內(nèi)切酶，如Benzonase；美國(guó)專利號(hào)5，173,418)處理，核酸酶處理的病毒濃縮(例如通過使用截留分子量例如500kDa的濾器超濾)，為接種疫苗之目的配制濃縮的病毒。這種方法的詳細(xì)資料在WO03/060088A2中提供，其全部在此引作參考。本發(fā)明的疫苗組合物可以作為一線預(yù)防性藥物施用于那些有感染風(fēng)險(xiǎn)的人，或可用作為二線藥物治療患者。由于這些組合物的一些中病毒是減毒的，它們尤其適合施用于“有風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體”，如老年人、兒童，或艾滋病毒感染者。這樣的疫苗還可以用于獸醫(yī)的情況，例如給馬接種疫苗抗西尼羅病毒感染，或給鳥(例如有價(jià)值的、瀕危的或馴養(yǎng)的鳥類，分別例如火烈鳥、禿頭鷹和鵝)接種疫苗。此外，本發(fā)明的所述疫苗可以包括病毒，如與缺乏這樣突變的病毒混合的混合物中的包括特定突變的嵌合病毒。本發(fā)明的疫苗可采用本領(lǐng)域熟知的方法給藥，施用的疫苗的適當(dāng)量可由本領(lǐng)域計(jì)數(shù)人員容易地確定。確定施用的病毒的適當(dāng)量可通過考慮以下因素確定，例如待施用所述病毒的受試者的體型和一般健康狀況。例如，本發(fā)明的病毒可以配制成0.1至1.Oml劑量體積中含有IO2和IO8之間，例如IO3至IO7感染單位(例如噬斑形成單位或組織培養(yǎng)感染劑量)的無(wú)菌水溶液，以例如肌肉內(nèi)、皮下或皮內(nèi)途徑給藥。另外，由于黃病毒可能通過粘膜途徑，例如口腔途徑感染人宿主(Gresikovaetal.，“Tick-borneEncephalitis,"InTheArboviruses,EcologyandEpidemiology,Monath(ed·),CRCPress,BocaRaton,Florida,1988,VolumeIV，177-203)，所以本發(fā)明的基于黃病毒的疫苗還可通過粘膜途徑給藥。此外，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員確定合適的，本發(fā)明的疫苗可以單劑量給藥，或可選地給藥可包括使用首劑量，然后例如2-6個(gè)月后給予加強(qiáng)劑量。實(shí)施例在配制和凍干兩種疫苗ChimeriVaXTM-WN(包括黃熱病病毒衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白以及西尼羅病毒前膜/膜和包膜蛋白的嵌合黃病毒)和ChimeriVaXTM-JE(包括黃熱病病毒衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白以及日本腦炎病毒前膜/膜和包膜蛋白的嵌合病毒)的開發(fā)計(jì)劃中，進(jìn)行下文所述的實(shí)驗(yàn)，但就其他蛋白/肽和/或含有病毒的治療產(chǎn)物的配制和加工而言，這些方法也包括在本發(fā)明中，如上所討論。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的制劑包括IOmM組氨酸(氨基酸)、50mM谷氨酸鉀(氨基酸)、0.HSA(人血清白蛋白，USP)、5%甘露醇以及4%乳糖，pH7.9-8.1。在本發(fā)明方法的實(shí)施例中，凍干如下進(jìn)行。凍干機(jī)擱板預(yù)冷至-50°C，一旦所有托盤都放置樣品，擱板-50°C保持120分鐘。一次干燥步驟過程中，真空設(shè)為25mT，步驟包括溫度遞變+0.I0C/分鐘至擱板溫度約-40°C，保持約500分鐘；溫度遞變+0.I0C/分鐘至擱板溫度約_35°C，保持約500分鐘；溫度遞變約+0.I0C/分鐘至擱板溫度約-30°C，保持約500分鐘；溫度遞變+0.I0C/分鐘至擱板溫度約_25°C，保持約800分鐘。在二次干燥步驟中，真空設(shè)為25mT，溫度遞變+0.I0C/分鐘至擱板溫度+20°C，保持約800分鐘。如有必要，產(chǎn)物可在20°C、25mT，再保持最多24小時(shí)，然后加塞。在加塞步驟中，用0.22μm過濾的干燥氮?dú)馐覂?nèi)脫氣，真空設(shè)為SOOmbar(略有真空)，將塞子擠到小瓶中。以下提供部分此實(shí)施例的基礎(chǔ)，以及包括在本發(fā)明中的其他制劑和方法。實(shí)施例ι-m^rmm/%mmm(WNPD-045)講行西原羅凍干研究在此實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)中，研究了以5%甘露醇、4%乳糖和IOmM組氨酸為基礎(chǔ)的西尼羅制劑。完整的制劑以及相關(guān)玻璃體轉(zhuǎn)化溫度見表2。表2:ffNPD-045制劑和玻璃轉(zhuǎn)化溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>病毒是將WNPD-001澄清原液(ClarifiedBulk)以1100稀釋在配制緩沖液中制備的。配制在BSC中進(jìn)行。凍干在下列條件下進(jìn)行0.5°C/分鐘溫度遞變至擱板溫度為_55°C，保持120分鐘；當(dāng)產(chǎn)物溫度達(dá)到-50°C時(shí)，保持15分鐘；室內(nèi)設(shè)為150mT，前級(jí)管道(foreline)設(shè)為IOOmT時(shí)干燥；50mT下0.2°C/分鐘溫度遞變至擱板溫度為_20°C，保持1034分鐘；50mT下，0.53°C/分鐘溫度遞變至擱板溫度為20°C，保持大約862分鐘。此凍干周期在約38小時(shí)內(nèi)完成。對(duì)凍干材料進(jìn)行加速穩(wěn)定性研究。一些凍干瓶37°C培養(yǎng)。第7日和14日時(shí)，取出小瓶，標(biāo)記，置于-80°C儲(chǔ)存。37°C下7天后，所有有谷氨酸鉀的制劑已有明顯的餅收縮。無(wú)谷氨酸鉀的制劑沒有此收縮。實(shí)驗(yàn)WNPD-049和WNPD-051為確定這些制劑中病毒穩(wěn)定性的PFU分析。所有樣品用WFI復(fù)溶。結(jié)果凍干后所有制劑看起來(lái)非常相似。餅是完整的，沒有出現(xiàn)明顯體積損失。一些餅已從小瓶壁分離，但在制劑中似乎是隨機(jī)的。表3顯示了冷凍得率，以及與制劑中使用的澄清原液(ClarifiedBulk)物質(zhì)比較的經(jīng)凍干的得率。表4顯示37°C加速穩(wěn)定性研究的結(jié)表3:ffNPD-045凍干和冷凍得率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表437°C下WNPD-045穩(wěn)定件<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)論有HSA的制劑表現(xiàn)非常好，有迄今為止一些最好的結(jié)果。-80°C保存沒有明顯損失。這些制劑也顯示非常好的凍干得率，平均得率為73%。應(yīng)當(dāng)指出的是，這些樣品的餅的外觀比起迄今為止任何其他制劑更一致得多。HSA制劑的穩(wěn)定性非常令人鼓舞。這兩種制劑37°C下14天后顯示<0.5的對(duì)數(shù)損失?？雌饋?lái)有谷氨酸鉀對(duì)制劑是有利的。有重組人明膠rHG-272的制劑得到的結(jié)果不及有HSA的那些好，但如果增加0.1%濃度，則結(jié)果可能改善。這些制劑當(dāng)-80°C下冷凍時(shí)，顯示低得率。此支持?jǐn)?shù)據(jù)見WNPD-033(見下文)，當(dāng)在rHG-272制劑中冷凍后回收率低。37°C下14天后，穩(wěn)定性研究中有重組明膠的制劑還顯示損失(>llog)。實(shí)施例II-ChimeriVaxlg-WN和ChimeriVaxa-TE產(chǎn)物凍干疫苗的開發(fā)此實(shí)施例描述了適合ChimeriVaXTM-WN和ChimeriVaXTM-JE疫苗的制劑的開發(fā)和表征，以及這些疫苗凍干周期的開發(fā)和最優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果步驟配制為配制大量樣品(bulk)用于凍干實(shí)驗(yàn)，將濃的ChimeriVaXTM-WN或ChimeriVax-JEl100稀釋于配制緩沖液中。配制緩沖液組合物根據(jù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行變動(dòng)。凍干前得到配制的大量樣品(bulk)，-80°C儲(chǔ)存作為“凍干前樣品”。凍干對(duì)于直至WNPD-070和直至JEPD-144的實(shí)驗(yàn)，使用FTSDuraStopMP系統(tǒng)凍干。以JEPD-145開始，使用動(dòng)力學(xué)LyoStarII系統(tǒng)。凍干參數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行變動(dòng)。所有實(shí)驗(yàn)都使用3mL小瓶。通常使用0.5mL填充體積，但是實(shí)驗(yàn)使用0.3mL填充體積，適當(dāng)時(shí)會(huì)指出οChimeriVax-WN噬斑分析噬斑分析用于評(píng)估凍干過程的小瓶回收率和穩(wěn)定性研究。凍干的ChimeriVaXTM-WN樣品用注射用水(WFI)或0.9%注射用氯化鈉復(fù)溶。復(fù)溶的樣品用WNPFU培養(yǎng)基稀釋。稀釋液置于O-Vero板，每孔100μ1，接種每孔2χ105細(xì)胞。板37°C和5%CO2下孵育1小時(shí)，然后覆蓋甲基纖維素膜。板于37°C、5%C02孵育96士12小時(shí)，然后用結(jié)晶紫的70%甲醇溶液染色。沖洗染色的板，然后計(jì)數(shù)。可接受的稀釋每孔有10-120噬斑，每次稀釋計(jì)數(shù)的所有孔的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<40%。ChimeriVax-JE噬斑分析噬斑分析用于評(píng)估凍干過程的病毒回收率和穩(wěn)定性研究。凍干的ChimeriVaXTM-JE樣品用注射用水(WFI)或0.9%氯化鈉注射液復(fù)溶。復(fù)溶的樣品用JEPFU培養(yǎng)基稀釋。稀釋液置于O-Vero板上，每孔100μ1，接種3χ105個(gè)細(xì)胞每孔。板37°C、5%CO2孵育1小時(shí)，然后用甲基纖維素膜覆蓋。板37°C、5%C02孵育96士12小時(shí)，然后用結(jié)晶紫的70%甲醇溶液染色。沖洗染色的板，然后計(jì)數(shù)?？山邮艿南♂尀?0-120個(gè)斑塊每孔，每次稀釋計(jì)數(shù)的所有孔的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<40%。穩(wěn)定性研究進(jìn)行了一些溫度的穩(wěn)定性研究。加速穩(wěn)定性研究在37°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行。樣品還保持在室溫(15-30°C)、25°C、2-8°C^n-2(rC。零時(shí)間樣品_80°C儲(chǔ)存。在一些例子中，于特定天數(shù)在提高的溫度下取樣，儲(chǔ)存在-80°C，日后分析。殘留水分分析樣品直接注射到卡爾費(fèi)休庫(kù)侖法水分測(cè)定儀中進(jìn)行殘留水分分析。該測(cè)試由Canton,MA的Acambis質(zhì)量控制小組(QualityControlgroup)按照US02-FRM-158-02完成。差示掃描量熱差示掃描量熱用TAInstrumentsQlOOO進(jìn)行。液體樣品冷卻到_70°C，然后溫度遞變至20°C。當(dāng)需要更高的分辨率時(shí)，使用調(diào)制方法。這些方法為制劑緩沖劑候選物產(chǎn)生玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。固體樣品從0°C溫度遞變至120°C。此方法用于評(píng)價(jià)凍干物質(zhì)的玻璃轉(zhuǎn)化溫度，并確定儲(chǔ)存條件。結(jié)果制劑開發(fā)概述基于下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)制劑·Tg'-冷凍材料的玻璃轉(zhuǎn)化溫度·凍干的餅的外觀·凍干回收率·凍干的物質(zhì)37°C穩(wěn)定性·凍干的物質(zhì)的殘留水分·Tg-凍干物質(zhì)的玻璃轉(zhuǎn)化溫度在早期制劑實(shí)驗(yàn)中評(píng)估了大量賦形劑。初篩的成分包括山梨醇、甘露醇、蔗糖、葡聚糖、乳糖、甘氨酸、羥乙基淀粉、噴他淀粉、PEG3350,PVP40K、氯化鈉、氯化鉀、Tween-80、組氨酸、丙氨酸、HEPES、TRIS、谷氨酸鉀、三聚磷酸鹽和磷酸鉀。一些無(wú)法得到可接受的餅的制劑凍干后，病毒回收率非常低(低于30%)。隨著HSA加入制劑中作為穩(wěn)定劑，病毒回收率開始改善。HSA試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)WNPD-021中，HSA首次用作穩(wěn)定劑。不同濃度的HSA加到兩種基礎(chǔ)制劑中。兩種制劑為·羥乙基淀粉、蔗糖、0.山梨醇和50mM谷氨酸鉀·4%乳糖、2%山梨醇、IOmM組氨酸、IOmM丙氨酸和50mM谷氨酸鉀，加入濃度為0%、0.2%、1%和2%的HSA。噬斑分析顯示通過用WFI復(fù)溶的下列得率。表5:ffNPD-021凍干得率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)驗(yàn)JEPD-018進(jìn)一步探討了HSA作為凍干制劑的穩(wěn)定劑的作用。本實(shí)驗(yàn)使用了4%乳糖、2%山梨醇、IOmM組氨酸、IOmM丙氨酸、50mM谷氨酸鉀制劑，并檢查0%、0.05%、0.1%、1%和2%的HSA濃度。凍干后，在加速穩(wěn)定性研究中樣品存放在37°C下。表6表明HSA的存在大大提高了凍干后的病毒得率。37°C儲(chǔ)存5、12和19天后測(cè)定效價(jià)的樣品顯示明顯良好的回收率(圖1)。HSA濃度超過0.1%，似乎沒有任何明顯改善，因此決定著重于使用0.1%HSA的制劑。表6=TEPD-018凍干收率和37°C加諫穩(wěn)定件數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>也評(píng)估重組穩(wěn)定劑，以探討是否有可能去除HSA。實(shí)驗(yàn)JEPD-080檢測(cè)DeltaBiologies的重組HSA和Fibrogen的重組人明膠(2株-野生型和基因工程的)的用途。重組人明膠重(rHG)產(chǎn)品的使用濃度為0.5%和1%。所有穩(wěn)定劑用于5%甘露醇、4%乳糖、IOmM組氨酸和50mM谷氨酸鉀的基礎(chǔ)制劑。重組HSA的表現(xiàn)比得上非重組的，但是明膠產(chǎn)品一般凍干回收率不好，37°C研究中穩(wěn)定性不好。表7:TEDP-080凍干收率和37°C加諫穩(wěn)定件數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>篩選緩沖組分組氨酸被選為緩沖組分，因?yàn)槠鋚K值接近ChimeriVax產(chǎn)品的最適pH值范圍。我們的目標(biāo)PH值范圍是7.9-8.1，組氨酸pK3’為8.97。實(shí)驗(yàn)WNPD-033測(cè)試5%蔗糖、0.1%HSA和50mM谷氨酸鉀，有或沒有IOmM組氨酸的制劑。將這些制劑凍干，進(jìn)行37°C加速穩(wěn)定性研究。所述兩種凍干的制劑經(jīng)復(fù)溶得率非常相似(有組氨酸為74%，沒有組氨酸為87%)，并顯示37°C下類似穩(wěn)定性分布(圖2)。盡管有沒有組氨酸分布都相似，但因其在目標(biāo)PH值范圍內(nèi)的緩沖容量，所以選作制劑組分。實(shí)驗(yàn)WNPD-045檢測(cè)有或沒有50mM谷氨酸鉀的5%甘露醇、4%乳糖、0.1%HSA和IOmM組氨酸的制劑。將這兩種制劑凍干，然后37°C孵育28天。37°C孵育過程中間隔7天取樣，得到如圖3所示的穩(wěn)定性分布。凍干后這兩種制劑有相當(dāng)?shù)牡寐?80%以上)。有50mM谷氨酸鉀的制劑37°C下比沒有谷氨酸鉀的穩(wěn)定性好。28天后，有谷氨酸鉀的制劑效價(jià)損失的對(duì)數(shù)為0.26。沒有谷氨酸鉀的損失的對(duì)數(shù)為0.56。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，確定制劑中包括50mM谷氨酸鉀。選擇填充劑在WNPD-021中，乳糖首次作為制劑組分進(jìn)行研究。此實(shí)驗(yàn)得到令人鼓舞的凍干得率，如表5所示。在JEPD-018中進(jìn)一步研究乳糖，在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中顯示非常有希望的結(jié)果(表6和圖1)。實(shí)驗(yàn)WNPD-029闡述了這些令人鼓舞的結(jié)果。此實(shí)驗(yàn)采用4%乳糖、2%山梨醇、IOmM組氨酸、IOmM丙氨酸和50mM谷氨酸鉀的基礎(chǔ)制劑。以下數(shù)據(jù)鞏固了使用HSA作為穩(wěn)定組分的益處。表8:ffNPD-029凍干得率和37°C加諫穩(wěn)定件數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>在實(shí)驗(yàn)JEPD-145中，乳糖濃度有變動(dòng)。濃度2%的乳糖、3%乳糖和4%乳糖都與5%甘露醇、0.HSAUOmM組氨酸和50mM谷氨酸鉀一起凍干。此實(shí)驗(yàn)表明，3%和4%乳糖表現(xiàn)相似，但在加速穩(wěn)定性研究中2%乳糖表現(xiàn)不夠好(圖4)。由于使用3%的乳糖沒有可覺察的優(yōu)勢(shì)，因此使用4%的乳糖濃度繼續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)WNPD-036比較下列三種制劑·4%乳糖、2%山梨醇、IOmM組氨酸、OmM丙氨酸、50mM谷氨酸鉀、0.1%HSA·4%乳糖、3%山梨醇、IOmM組氨酸、50mM谷氨酸鉀、0.1%HSA·4%乳糖、3%甘露醇、IOmM組氨酸、0.1%HAS表9:ffNPD-036凍干收率和37°C加諫穩(wěn)定件數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>該乳糖/甘露醇制劑表現(xiàn)良好。凍干后回收率很好，37°C兩星期后效價(jià)損失的對(duì)數(shù)僅有0.15。此制劑被選作進(jìn)一步研究的候選。人們希望，甘露醇的結(jié)晶性能可用于加快凍干周期。單一的糖制劑其他實(shí)驗(yàn)研究分別利用這些填充劑。WNPD-030檢查僅含甘露醇或蔗糖的制劑。在WNPD-047中檢測(cè)乳糖。將這些制劑與WNPD-045的含有5%甘露醇和4%乳糖的兩種糖組合的制劑比較。WNPD-045制劑(5%甘露醇、4%乳糖、0.人血清白蛋白、IOmM組氨酸，50mM谷氨酸鉀)的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了任何單一的糖制劑。所有單一的糖制劑顯示37°C14天后病毒效價(jià)損失的對(duì)數(shù)超過0.9。同一時(shí)期甘露醇/乳糖制劑損失的對(duì)數(shù)只有0.46。這在圖5中有說明。退火在兩次凍干實(shí)驗(yàn)JEPD-166和JEPD-172中嘗試退火。在這些實(shí)驗(yàn)中，瓶子_50°C冷凍，然后溫度遞變0.8°C/分鐘至-15°c，保持180分鐘退火。下一步降溫0.8°C//分鐘至-50°C，再保持120分鐘，然后開始一次干燥。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)得到很好的餅。退火使甘露醇結(jié)晶，餅的外觀是典型晶型甘露醇餅。但是與所有無(wú)退火生成餅的實(shí)驗(yàn)相比，退火的物質(zhì)表現(xiàn)出的穩(wěn)定性差。退火的樣品37°C儲(chǔ)存兩周后損失的對(duì)數(shù)近1.0，而非退火樣品通常同一時(shí)期損失的對(duì)數(shù)范圍為0.3-0.5(圖6)。這些數(shù)據(jù)加上來(lái)自單一糖體系的數(shù)據(jù)，得出這樣的結(jié)論結(jié)晶甘露醇不利于ChimeriVax產(chǎn)品的穩(wěn)定。差示掃描量熱法確認(rèn)結(jié)晶退火基本上使所有甘露醇結(jié)晶。圖7顯示了4%乳糖溶液的熱分析圖，其玻璃轉(zhuǎn)化溫度為-32.6°C。圖8顯示當(dāng)往制劑中加入5%甘露醇時(shí)，玻璃轉(zhuǎn)化溫度降低約6°C至_38°C。然而，退火使甘露醇結(jié)晶，并使玻璃轉(zhuǎn)化溫度恢復(fù)到僅乳糖的熱分析圖中所見的范圍。玻璃轉(zhuǎn)化溫度降低的消失證實(shí)甘露醇已完全結(jié)晶。可從這些數(shù)據(jù)得出另一結(jié)論。凍干時(shí)乳糖始終保持無(wú)定形狀態(tài)。制劑本身中的甘露醇將作為結(jié)晶物質(zhì)凍干，但是當(dāng)與其它糖類合并時(shí)，甘露醇可以是結(jié)晶或無(wú)定形的。之前的實(shí)驗(yàn)已表明下列情況中穩(wěn)定性不好·僅乳糖(4%)_其中乳糖為無(wú)定形·僅甘露醇(5%)_其中甘露醇為晶型·乳糖(4%)和甘露醇(5%)退火-其中甘露醇為晶型，乳糖為無(wú)定形良好的穩(wěn)定性僅體現(xiàn)在包括這兩種組分的制劑之一。當(dāng)乳糖(4%)和甘露醇(5%)無(wú)退火步驟凍干時(shí)，乳糖和甘露醇都保持無(wú)定形狀態(tài)。因此無(wú)論是無(wú)定形的甘露醇或無(wú)定形的甘露醇/乳糖組合都賦予凍干的ChimeriVax優(yōu)越的穩(wěn)定性。僅無(wú)定形乳糖已證明無(wú)效，正如任何類型的晶態(tài)甘露醇一樣。最終制劑的支持?jǐn)?shù)據(jù)正如上文所述，5%甘露醇、4%乳糖、0.1%HSAUOmM組氨酸和50mM谷氨酸鉀(pH7.9-8.1)被選做ChimeriVax疫苗的制劑緩沖劑。進(jìn)行了一系列試驗(yàn)鑒定制劑，并建立和優(yōu)化凍干周期。液體穩(wěn)定性可檢測(cè)WNPD-052、JEPD-072和JEPD-087的數(shù)據(jù)，以表明此制劑在實(shí)時(shí)_80°C儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)中有極好的穩(wěn)定性。由于儲(chǔ)存所致的無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著效價(jià)損失可以在這些實(shí)驗(yàn)中觀察到(圖9)。凍干前-80°C存儲(chǔ)時(shí)，此制劑使ChimeriVax產(chǎn)物足夠穩(wěn)定。差示掃描量熱法差示掃描量熱法(DSC)用于確定此制劑的玻璃轉(zhuǎn)變溫度(Tg')。圖10顯示了WNPD-045樣品的熱分析圖。這使用調(diào)制DSC分析，以改善分辨率。圖11是未使用調(diào)制掃描即顯示足夠分辨率的JEPD-172樣品。這兩個(gè)樣本顯示低玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(由中點(diǎn))，范圍是-38—40"C。水分分析37°C2周后，當(dāng)將殘留水分的量與疫苗穩(wěn)定性相比時(shí)，可以看到趨勢(shì)。圖12顯示從實(shí)驗(yàn)JEPD-072、JEPD-087、JEPD-145,JEPD-147和JEPD-151收集的數(shù)據(jù)，并顯示與殘留水分的百分比相比效價(jià)的損失。凍干參數(shù)表10中顯示的實(shí)驗(yàn)詳述了最終制劑凍干中使用的參數(shù)。還提供凍干后病毒得率、凍干餅的水分百分比、凍干餅的外觀，37°C1周和2周加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，以及37°C孵育最高時(shí)間點(diǎn)。表10最終制劑實(shí)駘的凍干參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*表示從穩(wěn)定性曲線外推出的數(shù)量根據(jù)這些數(shù)據(jù)，有必要確立可移交給合同制造商的凍干周期。JEPD-151凍干后有最高得率、37°C下2周后最好的穩(wěn)定性、最低的水分殘留，并產(chǎn)生一些美學(xué)角度最好的餅(圖13)。此實(shí)驗(yàn)的凍干周期作為提供給合同制造商的技術(shù)規(guī)范的模型。技術(shù)規(guī)范這些技術(shù)規(guī)范是根據(jù)JEPD-151，但延長(zhǎng)保持時(shí)間以彌補(bǔ)不同凍干機(jī)的可能的規(guī)模問題。這些規(guī)范被移交給WalterReedArmyInstituteofResearch，以滿足ChimeriVax-WN和ChimeriVax-JEPhaseI/II材料的合同。冷凍周期·凍干機(jī)擱板預(yù)冷至-500C一旦所有托盤都放置樣品，擱板保持_50°C120分鐘。一次干燥真空設(shè)為25mT·溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-40V，保持500分鐘·溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-35°C，保持500分鐘·溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-30V，保持500分鐘·溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度-25°C，保持800分鐘二次干燥真空保持在25mT·溫度遞變+0.1°C/分鐘至擱板溫度+20V，保持800分鐘·如果需要，產(chǎn)品可于+20°C、25mT另外保持最高24小時(shí)，然后加塞加塞用0.22μm過濾的干燥氮?dú)鈱?duì)室內(nèi)脫氣·真空設(shè)為800mbar(稍有真空)將塞子塞入小瓶材料和設(shè)備材料·WNPFU培養(yǎng)基-含10%FBS(Hyclone,Catalog#SH30070.03)和Ix青霉素/鏈霉素(Sigma，P4333)的M199培養(yǎng)基(Gibco,Catalog#12340-030).JEPFU培養(yǎng)基-含10%FBS(Hyclone,Catalog#SH30070.03)禾ΠIx青霉素/鏈霉素(Sigma，P4333)，IxL-谷氨酰胺(2福)(Gibco,Catalog#25030-018)和2OmMHEPES的EMEM培養(yǎng)基·甲基纖維素覆蓋膜-含5%或10%FBS(Hyclone,Catalog#SH30070.03)、IxL-谷氨酰胺(Gibco，Catalog#25030-018)，lx抗生素/殺真菌藥(Gibco，Catalog#15240-062)的甲基纖維素(按照S0P#502-066制備)設(shè)備·FTSDurastopMP凍干機(jī)·KineticsLyostarII^zFlZl·Orion卡爾費(fèi)休庫(kù)侖法水分測(cè)定儀modelAF7LC·TAInstrumentsDSCQ1000(ID#8769)·HeraeusHeracell240培養(yǎng)箱(ID#9055)·VWR低溫培養(yǎng)箱Model2005(ID#s8618和8617)·VWR冰箱(ID#8663)·FischerScientificIsotemp(ID#9059)‘RevcoUltimaII(ID#9061)結(jié)論/討論此實(shí)施例中出現(xiàn)的數(shù)據(jù)描述旨在ChimeriVax產(chǎn)品的凍干的制劑的選擇和開發(fā)。該制劑已徹底鑒定，并表現(xiàn)出足夠的液體形式的穩(wěn)定性，以及凍干后出色的回收率和穩(wěn)定性。凍干前，所配制的疫苗可以液體形式_80°C保存，對(duì)效價(jià)無(wú)任何重大影響。此實(shí)施例也進(jìn)行了3mL小瓶，0.5mL填充量的凍干周期的研發(fā)和最優(yōu)化。此周期應(yīng)生成有可接受外觀、高病毒回收率(>70%)、低水分殘留(<2%)的餅。提高的溫度下凍干產(chǎn)品表現(xiàn)出出色穩(wěn)定性，并且在<-10°C的儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存時(shí)沒有明顯效價(jià)損失。以上提及的所有出版物的內(nèi)容在此引作參考。其他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求組合物，其包含活的減毒黃病毒疫苗、一種或多種穩(wěn)定劑、一種或多種填充劑，以及一種或多種緩沖組分。2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述穩(wěn)定劑是人血清白蛋白(HSA)。3.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述人血清白蛋白是非重組人血清白蛋白(HSA)。4.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述人血清白蛋白是重組人血清白蛋白(rHA)。5.權(quán)利要求1所述的組合物，其包含乳糖作為填充劑。6.權(quán)利要求1所述的組合物，其包含甘露醇作為填充劑。7.權(quán)利要求1所述的組合物，其包含乳糖和甘露醇作為填充劑。8.權(quán)利要求1所述的組合物，其包含組氨酸作為緩沖組分。9.權(quán)利要求1所述的組合物，其包含谷氨酸鉀作為緩沖組分。10.權(quán)利要求1所述的組合物，其包含組氨酸和谷氨酸鉀作為緩沖組分。11.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述組合物中所述人血清白蛋白的濃度為約0.05-2.0%。12.權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述組合物中所述人血清白蛋白的濃度為約0.1%。13.權(quán)利要求5或7所述的組合物，其中所述組合物中所述乳糖的濃度為約2-10%。14.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述組合物中所述乳糖的濃度為約4%。15.權(quán)利要求6或7所述的組合物，其中所述組合物中所述甘露醇的濃度為約2-10%。16.權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述組合物中所述甘露醇的濃度為約5%。17.權(quán)利要求8或10所述的組合物，其中所述組合物中所述組氨酸的濃度為約l-20mMo18.權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述組合物中所述組氨酸的濃度為約10mM。19.權(quán)利要求9或10所述的組合物，其中所述組合物中所述谷氨酸鉀的濃度為約20-80mM。20.權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述組合物中所述谷氨酸鉀的濃度為約50mM。21.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述活的減毒黃病毒是嵌合黃病毒。22.權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述嵌合黃病毒包含第一黃病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和第二不同黃病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。23.權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述嵌合黃病毒包含所述第一黃病毒的膜和包膜蛋白，以及所述第二不同黃病毒的衣殼和非結(jié)構(gòu)蛋白。24.權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述第一和第二黃病毒獨(dú)立地選自黃熱病、日本腦炎、登革熱-1、登革_2、登革熱_3、登革熱_4、墨萊溪谷腦炎、圣路易腦炎、西尼羅、庫(kù)寧、羅西奧腦炎、Ilheus、中歐腦炎、西伯利亞腦炎、俄羅斯春夏腦炎、Kyasanur森林病、Alkhurma、咢β木其Jf克出血熱、跳躍病、Powassan、Negishi、Absettarov、Hansalova、Apoi禾口Hypr病毒。25.權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述第二黃病毒為黃熱病病毒。26.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述黃熱病病毒是YF17D。27.權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述第一黃病毒為日本腦炎病毒或西尼羅病毒。28.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物為凍干形式。29.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物的pH為7.9-8.1。30.組合物，其包含基于蛋白或病毒的藥物、人血清白蛋白、谷氨酸堿金屬鹽、一種或多種另外的氨基酸以及一種或多種糖或糖醇。31.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述人血清白蛋白是非重組人血清白蛋白。32.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述人血清白蛋白是重組人血清白蛋白。33.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述谷氨酸堿金屬鹽為谷氨酸鉀。34.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述一種或多種其他的氨基酸為組氨酸。35.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述一種或多種糖或糖醇是乳糖和/或甘露醇。36.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述組合物中所述人血清白蛋白的濃度為約0.05-2.0%。37.權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述組合物中所述人血清白蛋白的濃度為約0.1%。38.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述組合物中所述乳糖的濃度為約2-10%。39.權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述組合物中所述乳糖的濃度為約4%。40.權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述組合物中所述甘露醇的濃度為約2-10%。41.權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述組合物中所述甘露醇的濃度為約5%。42.權(quán)利要求34所述的組合物，其中所述組合物中所述組氨酸的濃度為約l-20mM。43.權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述組合物中所述組氨酸的濃度為約10mM。44.權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述組合物中所述谷氨酸鉀的濃度為約20-80mM。45.權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述組合物中所述谷氨酸鉀的濃度為約50mM。46.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述組合物為凍干形式。47.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述組合物的pH為7.9-8.1。48.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述基于病毒的藥物包含天花疫苗。49.權(quán)利要求48所述的組合物，其中所述天花疫苗包含牛痘病毒或減毒牛痘病毒。50.權(quán)利要求49所述的組合物，其中所述牛痘病毒或減毒牛痘病毒為ACAM1000、ACAM2000或改良安卡拉痘苗(MVA)。51.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述基于蛋白的藥物包含乙型肝炎病毒核心蛋白融合體。52.權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述乙型肝炎病毒核心蛋白融合體進(jìn)一步包含一種或多種流感M2e肽。53.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述基于蛋白的藥物包含艱難梭菌的毒素或類毒素。54.制備治療組合物的方法，所述方法包含使權(quán)利要求1或權(quán)利要求30所述的組合物經(jīng)凍干處理。55.權(quán)利要求54所述的方法，其中所述方法包含冷凍、一次干燥和二次干燥的步驟。56.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述凍干步驟包含約_50°C冷凍約120分鐘。57.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述一次干燥步驟包含溫度遞變步驟，其包括溫度遞變約+0.rc/分鐘至擱板溫度約-40°c，保持約500分鐘；溫度遞變約+0.rc/分鐘至擱板溫度約-35°C，保持約500分鐘；溫度遞變約+0.rc/分鐘至擱板溫度約-30°c，保持約500分鐘；以及溫度遞變約+0.I0C/分鐘至擱板溫度約_25°C，保持約800分鐘。58.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述二次干燥步驟包括溫度遞變步驟，其包括溫度遞變約+0.I0C/分鐘至擱板溫度約+20°C，保持約800分鐘。59.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述冷凍步驟包含約_40°C冷凍約60分鐘。60.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述一次干燥步驟包含溫度遞變步驟，其包括溫度遞變約+0.5°C/分鐘至擱板溫度約_5°C，保持約300分鐘；以及溫度遞變約-0.5°C/分鐘至擱板溫度約-0°C，保持約300分鐘。61.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述二次干燥步驟包含溫度遞變步驟，其包括溫度遞變約+0.20C/分鐘至擱板溫度約+30°C，保持約600分鐘；以及溫度遞變約-1.0°C/分鐘至擱板溫度約+5°C，保持約9999分鐘。62.預(yù)防或治療受試者疾病的方法，所述方法包含將權(quán)利要求1或權(quán)利要求30的組合物施用于受試者。63.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述受試者有黃病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)或有黃病毒感染。64.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述黃病毒感染是日本腦炎病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒或黃熱病病毒感染。65.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述受試者有天花感染的風(fēng)險(xiǎn)或有天花感染。66.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述受試者有流感感染的風(fēng)險(xiǎn)或有流感感染。67.權(quán)利要求62所述的方法，其中所述受試者有艱難梭菌感染的風(fēng)險(xiǎn)或有艱難梭菌感染。全文摘要本發(fā)明提供藥物組合物，例如疫苗，以及制備和使用這樣的組合物的方法。文檔編號(hào)C12N7/00GK101808657SQ200780049359公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2007年11月7日優(yōu)先權(quán)日2006年11月7日發(fā)明者D·C·韋洛姆,J·E·沃伊什維洛,P·德喬治,P·恰拉梅塔羅申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德生物制劑公司